PL218831B1 - Sposób przemysłowego otrzymywania preparatu lektynowego z ziaren fasoli oraz dodatek paszowy dla trzody chlewnej otrzymywany tym sposobem - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy przemysłowy sposób otrzymywania preparatu lektynowego przeznaczonego do stosowania jako dodatek paszowy dla trzody chlewnej. Opisywany sposób jest dostosowany do prowadzenia we wszystkich strefach klimatycznych i zróżnicowanych warunkach prowadzenia ekstrakcji oraz przechowywania w szczególności ekstraktu przed i po zagęszczeniu, a także pozwala na uzyskanie wysokich aktywności preparatu lektynowego w postaci proszku.

Znany z polskiego opisu zgłoszeniowego wynalazku nr P. 375476 „Sposób otrzymywania preparatu lektynowego, preparat lektynowy oraz sposób podawania preparatu lektynowego dla ssaków” zakładał stosowanie konserwantów w celu ochrony produktu w postaci proszku, nie wskazywał na konieczność stosowania konserwantów w fazie ekstrakcji i zatężania ekstraktu a w szczególności w okresie magazynowania zarówno ekstraktu jak i zagęszczonego ekstraktu w celu wykonania niezbędnych analiz aktywności jak i w okresie oczekiwanie na rozpoczęcie dalszych faz produkcji.

W określonych sytuacjach znany i przywołany powyżej opis wynalazku nr P.375476 dopuszczał konfekcjonowanie ekstraktu o określonej aktywności biologicznej wprost w pojemniki z dozownikiem, z pominięciem fazy suszenia. Wymagało to jednak standardowych procesów wprowadzenia konserwanta przed procesem rozlewu, nie miało żadnego wpływu ani na sposób prowadzenia ekstrakcji ani na jej wyniki.

Znane z literatury inne sposoby otrzymywania lektyny wykorzystywały techniki wielostopniowej ekstrakcji, zmiany pH ekstraktu i wielokrotnej filtracji, wysalania, dializy i liofilizacji jako podstawy procesu pozwalającego na uzyskanie produktu w postaci stałej.

Celem wynalazku jest dostarczenie nadającego się do przemysłowego stosowania sposobu otrzymywania z ziaren fasoli wysoce aktywnego preparatu lektynowego nadającego się do stosowania jako dodatek paszowy dla trzody chlewnej. Szczególnym celem jest uzyskanie wysokiej sprawności ekstrakcji, jednocześnie poprawiając trwałość i aktywność ekstraktu w dalszych fazach jego obróbki.

Przedmiotem wynalazku jest sposób przemysłowego otrzymywania preparatu lektynowego z ziaren fasoli, obejmujący kwaśną ekstrakcję w obecności antyutleniacza oraz wysuszenie preparatu charakteryzujący się tym, że z rozdrobnionych ziaren fasoli ekstrahuje się frakcję lektynową w układzie ekstrahującym zawierającym kwas octowy, antyutleniacz, oraz łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny lub jego sól, a następnie do uzyskanej frakcji PHA dodaje się trudnolotny konserwant i podaje się ją suszeniu rozpyłowemu uzyskując preparat lektynowy o zawartości aktywnych lektyn nie mniejszej niż 128 HU/100 mg preparatu, przy czym jako łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny lub jego sól stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: kwas mrówkowy, mrówczan sodu, mrówczan potasu, mrówczan wapnia, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas fumarowy, kwas propionowy, propionian sodu, propionian sodu, propionian potasu, propionian wapnia, a jako trudnolotny konserwant stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: N-propyl p-hydroksybenzoesanu sodu lub N-etyl p-hydroksybenzoesanu sodu.

Korzystnie, jako łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: kwas mrówkowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas fumarowy, kwas propionowy, przy czym korzystnie stosuje się kwas propionowy.

Korzystnie, jako antyutleniacz stosuje się kwas askorbinowy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest dodatek paszowy dla trzody chlewnej otrzymywany z ziaren fasoli zwyczajnej sposobem według wynalazku określonym powyżej, charakteryzujący się tym, że zawiera lektyny o aktywności nie mniejszej niż 128 HU/100 mg preparatu.

Istotą nowego sposobu otrzymywania preparatu lektynowego w postaci proszku jest stworzenie nowego, trójskładnikowego układu ekstrakcyjnego, przy czym wprowadzony do układu ekstrakcyjnego nowy związek wpływa istotnie na zwiększenie efektywności procesu ekstrakcji, jednocześnie zabezpieczając ekstrakt na wszystkich fazach produkcji przed rozwojem mikroorganizmów.

Wynalazek rozwiązuje jednocześnie problem efektywności (sprawności) ekstrakcji PHA z ziaren roślin strączkowych, tu fasoli zwyczajnej, i zapewnienia właściwej ochrony poszczególnych faz produkcji lektyny, poprzez zastosowanie co najmniej trójskładnikowego układu ekstrakcyjnego, korzystnie przez zastosowanie kwasu propionowego do ochrony ekstraktu we wszystkich fazach produkcji z wyłączeniem procesu suszenia rozpyłowego. W konsekwencji aktywność produktu gotowego w postaci proszku wzrasta co najmniej dwukrotnie, z 64 HU/100 mg do 128 HU/100 mg, a co za tym idzie, zmniejsza znacząco koszt otrzymania produktu w przeliczeniu na 1000 HU.

PL 218 831 B1

W procesie suszenia rozpyłowego następuje odparowanie kwasu propionowego a w produkcie pozostaje dodany bezpośrednio przed suszeniem inny, trudnolotny konserwant.

Zastosowanie N-propyl p-hydroksybenzoesanu sodu lub N-etyl p-hydroksybenzoesanu sodu pozwala na właściwą ochronę zarówno produktu w postaci proszku jak i zawiesiny ex tempore uzyskanej z tego proszku przygotowywanej przed podaniem jej zwierzętom.

Pierwotnym zamiarem było dobranie i wykorzystanie dwóch różnych konserwantów, o takich właściwościach, aby każdy z nich był właściwy dla warunków, w jakich jest używany, oraz aby pierwszy z konserwantów mógł być łatwo usunięty bez konieczności stosowania dodatkowych procesów technologicznych.

Nowy sposób otrzymywania preparatu lektynowego według wynalazku polega na tym, że w procesie ekstrakcji PHA z ziaren roślin strączkowych, tu ziaren fasoli, stosuje się nowy, trójskładnikowy układ ekstrahujący, a w całym procesie produkcji wykorzystuje się dwie grupy związków chemicznych, pełniących jednocześnie rolę konserwantów, dostosowanych ochrony dwóch różnych stanów skupienia i dwóch różnych odczynów - ekstrakt ma pH nie wyższe niż 5,0, zatężony ekstrakt jest również o odczynie kwaśnym, a otrzymany w procesie suszenia rozpyłowego proszek powinien być obojętny.

Do pierwszej grupy użytych związków chemicznych zaliczone zostały, po wstępnej analizie, kwasy krótko łańcuchowe lub ich sole, w tym kwas mrówkowy, mrówczan sodu, mrówczan potasu, mrówczan wapnia, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas fumarowy, kwas propionowy, propionian sodu, propionian sodu, propionian potasu, propionian wapnia i inne. Wprawdzie użyty w procesie ekstrakcji podstawowy składnik, kwas octowy jest sam środkiem konserwującym, ale w praktyce nie zabezpiecza ekstraktu dostatecznie przed rozwojem grzybów i bakterii, w szczególności, gdy ekstrakt magazynowany jest pomiędzy poszczególnymi fazami jego obróbki.

Istotą doboru konserwantów są ich własności fizykochemiczne a w szczególności temperatura wrzenia i prężność par, oraz w przypadku konserwantów stosowanych w pierwszej fazie istotne jest, aby wobec wysokiego stopnia zagęszczenia nie obciążać zatężonego roztworu oraz, w konsekwencji, produktu w postaci proszku nadmiernym ładunkiem kationów (sodu, potasu, czy wapnia).

W korzystnej realizacji zawężono krąg wyżej wymienionych związków do wolnych kwasów, ponieważ zastosowanie ich soli, np. propionianu sodu, propionianu potasu czy propionianu wapnia i odpowiednio mrówczanu sodu, potasu czy wapnia itd. powodowało obciążenie ekstraktu dodatkowym ładunkiem sodu, potasu czy wapnia. O ile w procesie suszenia, w szczególności rozpyłowego, łatwolotne, krótkołańcuchowe kwasy organiczne zostaną usunięte z roztworu i nie obciążają produktu gotowego w postaci proszku, to cały ładunek kationów pozostanie w suchym produkcie.

W procesie obróbki ekstraktu od ekstrakcji do przygotowania roztworu do suszenia nie stosuję się technologii, w których mogłoby dochodzić do odparowania łatwolotnych związków, natomiast dochodzi do wyraźnego zagęszczenia.

Zastosowanie w wariancie alternatywnym zatężania w układzie wyparek próżniowych, cienkowarstwowych, czy wyparek rozprężnych spowoduje obniżenie zawartości łatwolotnych związków, prowadzą do podobnego stopnia zagęszczenia i podobnej koncentracji kationów i związków trudnolotnych.

Zastosowanie innego, np. trudnolotnego konserwanta od początku procesu, bez względu na sposób zatężania ekstraktu, spowodowałoby bądź to niedostateczną ochronę w pierwszych fazach obróbki ekstraktu, jeśli ilość użytego konserwanta policzona by była na końcową objętość ekstraktu, bądź to, przy pełnej ochronie pierwszych faz obróbki ekstraktu, niedopuszczalny nadmiar konserwanta w fazach końcowych.

W procesie suszenia rozpyłowego, po dodaniu do zagęszczonego ekstraktu odpowiedniej ilości np. maltodekstryny jako nośnika, otrzymujemy produkt w postaci proszku, z którego wytwarza się następnie zawiesinę o niemal takiej samej objętości, jak roztwór kierowany do suszenia. Można zatem łatwo policzyć, jaką ilość trudnolotnego konserwanta użyć w procesie suszenia, aby zabezpieczał on zarówno postać proszku jak i przede wszystkim, przygotowany z niego preparat.

Zastosowanie dwóch konserwantów o znacząco różnych temperaturach wrzenia pozwala nie tylko na łatwą wymianę pierwszego konserwanta na drugi w procesie suszenia rozpyłowego, zatem bez konieczności stosowania jakichkolwiek dodatkowych procesów technologicznych, lecz także na stosowanie stężeń w pełni zabezpieczających każdą z faz produkcji, bez obawy znacznego przekroczenia zalecanej koncentracji w produkcie gotowym.

PL 218 831 B1

Zarówno produkt jak i fazy pośrednie kontrolowane są poprzez oznaczanie aktywności hemaglutynacyjnej (HU), zdefiniowanej jako ilość materiału wyrażonego w mg/ml w ostatnim rozcieńczeniu powodującym 50% aglutynację 2% zawiesiny erytrocytów w temperaturze +25° C według metody Pusztai i Watt, 1974 z modyfikacją,

W toku prac nad przygotowaniem preparatu oraz technologii dla stref podzwrotnikowych i zwrotnikowych oraz dla zróżnicowanych warunków prowadzenia ekstrakcji i przechowywania w szczególności ekstraktu przed i po zagęszczeniu, nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie odpowiednich środków konserwujących dodanych jako trzeci składnik układu ekstrakcyjnego, zamiast jednego konserwanta dla wszystkich faz procesu produkcji, nie tylko poprawia trwałość samego proszku i otrzymywanej z niego zawiesiny, lecz także poprawia warunki ekstrakcji PHA z masy ziaren roślin strączkowych, tu ziaren fasoli, co uwidacznia się w podwyższonej aktywności hemaglutynacyjnej proszku, podstawową wartością aktywności biologicznej proszku według poprzedniej metody jest 64 HU/100 mg podczas, gdy według nowej technologii według wynalazku aktywność ta jest nie mniejsza niż 128 HU/100 mg.

Nieoczekiwanie okazało się, że wprowadzenie do układu ekstrahującego odpowiedniego związku, który w pierwotnym założeniu miał spełniać wyłącznie rolę konserwanta, znacznie poprawia sprawność ekstrakcji, co w efekcie umożliwia i gwarantuje uzyskanie produktu o minimum dwukrotnie większej aktywności biologicznej w stosunku do znanych i opisanych w literaturze metod otrzymywania PHA.

Zastosowanie właściwych postaci wybranych związków dla ochrony ekstraktu przed i po zagęszczeniu nie obciąża zagęszczonego ekstraktu i w konsekwencji postaci proszku ładunkiem kationów sodu, potasu lub wapnia. Poniżej podano przykłady ekstrakcji PHA z ziaren fasoli:

P r z y k ł a d 1. Ekstrakcja PHA z ziaren fasoli i otrzymywanie gotowego produktu sposobem według wynalazku.

Przygotowanie ziaren fasoli zwyczajnej.

Ziarna fasoli zwyczajnej zostały zmielone w młynie z chłodzenia wewnętrznym i kontrola temperatury mielenia. Temperatura procesu mielenia wahała się pomiędzy +34°C do 40°C. Średnicę przemiału ustawiono na ziarna o średnicy 1 mm, co w praktyce dało 98% frakcji o średnicach ziaren 0,98 - 1,02 mm. Przygotowanie roztworu do ekstrakcji:

W ekstraktorze z wolnoobrotowym mieszadłem przygotowuje się roztwór kwasu octowego rozcieńczając kwas octowy lodowaty w wodzie w stosunku 1,1 g kwasu octowego w 1000 ml roztworu. Do tego roztworu dodaje się kwas askorbinowy w ilości 0,1 g kwasu na każdy litr roztworu oraz kwas propionowy w ilości 0,1 g na litr roztworu.

Ilość roztworu ekstrakcyjnego sporządza się w zależności od masy zmielonych ziaren fasoli użytych do ekstrakcji. Zalecany stosunek 10:1.

Proces ekstrakcji:

Do ekstraktora wprowadza się odmierzoną ilość zmielonych ziaren fasoli zwyczajnej i rozpoczyna mieszanie.

Po 10 minutach rozpoczyna się kontrolę pH procesu ekstrakcji. Zalecane pH procesu ekstrakcji 5,0±0,07. Ewentualną korektę pH należy prowadzić po minimum 30 min ekstrakcji, ponieważ po tym czasie można mówić o stabilizacji odczyny układu w ekstraktorze. Proces ekstrakcji nie wymaga ostrych reżimów temperaturowych, proces nie jest istotnie egzoenergetyczny. Temperatura ekstrakcji w zakresie +16°C do +25°C. Mieszanie trwa 4 godziny, po czym odstawia się zawartość, bez mieszania na kolejne 4 godziny.

Wirowanie ekstraktu:

Proces oddzielenia części stałych odbywa się na szybkoobrotowych wirówkach bębnowych, przystosowanych od separacji osadów białkowych. Średnica bębna 200 mm, szybkość obrotowa 18.000obr/min. Proces jest procesem periodycznym, cykl jest determinowany pojemnością bębna.

Oddzielone pozostałości poekstrakcyjne, bogaty w białko produkt, podlega osobnemu procesowi obróbki w kierunku przygotowania go do użycia w żywieniu zwierząt.

Dalsza obróbka ekstraktu:

Sklarowany ekstrakt poddaje się procesowi zagęszczania z wykorzystaniem procesów odwróconej osmozy.

Zagęszczony roztwór analizuje się w kierunku aktywności hemaglutynacyjnej i zawartości suchej masy.

PL 218 831 B1

Bezpośrednio przed procesem suszenia rozpyłowego do zagęszczonego ekstraktu dodaje się odpowiednią, wyliczoną ilość maltodekstryny i alternatywnie N-propyl p-hydroksybenzoesanu sodu lub N-etyl p-hydroksybenzoesanu sodu. Proces suszenia w suszarni rozpyłowej prowadzi się przy temperaturze wlotowej powietrza nie wyższej niż +180°C.

Produkt analizuje się w kierunku oznaczenia aktywności biologicznej, formułuje się partię materiału, dla której wykonuje się analizy zgodnie z wymaganiami EU stawianymi dodatkom paszowym.

Uzyskany produkt ma postać jasnego (białego do kremowego) proszku o dużej sypkości, nie mającego tendencji do zbrylania, łatwo tworzącego z wodą zawiesinę. Proszek w pełni nadaje się do mechanicznego rozsypu w powszechnie stosowanych maszynach.

Aktywność hemaglutynacyjną nie mniejszą niż 128 HU/100 mg, Zawartość Hg, As, Pb, Cd znacznie poniżej norm EU, czystość mikrobiologiczna zgodna z wymaganiami, trwałość 3 lata od dnia produkcji.

Test hemaglutynacji do oznaczania aktywności preparatu Suilektin - procedury.

Przygotowanie erytrocytów ml krwi pobranej od szczura rasy Wistar (z 1 kroplą heparyny) rozcieńczano 1:20 w soli fizjologicznej (0.9% NaCI), a następnie wirowano (2000 rpm, 15 min, 4°C). Supernatant wylewano wraz z interfazą. Erytrocyty zawieszano ponownie w soli fizjologicznej i przemywano jak opisano wyżej 3 razy. Następnie sporządzano 2% roztwór erytrocytów (rozcieńczenie 1:50).

Przygotowanie preparatu

Do analizy brano 200 mg preparatu w postaci proszku, który rozpuszczano w 8 ml soli fizjologicznej. Stężenie końcowe - 25 mg/ml.

Przygotowywano szereg dwukrotnie wzrastających rozcieńczeń:

Rozcieńczenia: 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x 128x 256x

Wykonanie testu

Test wykonywano jednocześnie w próbówkach Ependorfa oraz na szkiełkach mikroskopowych podstawowych (nieodtłuszczonych!).

Mieszanina reakcyjna w probówkach Ependorfa zawiera:

100 μΐ soli fizjologicznej

100 μΐ erytrocytów 2%

100 μΐ roztworu badanego (odpowiednie rozcieńczenie)

Po dokładnym wymieszaniu składników pobiera się 50 μl z każdej badanej próbki i nakłada na szkiełka podstawowe i inkubuje w temperaturze pokojowej ok 30 minut do godziny (należy zwrócić uwagę aby krople nie wysychały). Pozostała część mieszaniny inkubuje się w zamkniętych probówkach Ependorfa (nie mniej niż 1 godz., przedłużenie czasu nie powoduje zmian w odczycie). Po okresie inkubacji miesza się zawartość probówek Ependorfa pipetą tak aby uwolnić osad z dna i ścian probówki, następnie pobierany 50 μl i nakładamy na szkiełko podstawowe.

Test wykonuje się w obecności kontroli negatywnej:

200 μΐ soli fizjologicznej

100 μl erytrocytów 2%

Wynik testu odczytuje się pod mikroskopem przy powiększeniu 250x. Wyniki zapisuje się używając oznaczeń, +, +/-, -, gdzie ++ oznacza obecność hemaglutynacji erytrocytów a - jej brak.

Dla ułatwienia można zrezygnować z inkubacji na szkiełkach podstawowych, wystarczająco dobre wyniki uzyskuje się inkubując mieszaninę w zamkniętych probówkach Ependorfa.

Określenie ilości jednostek hemaglutynacyjnych w preparacie

Jedna jednostka hemaglutynacji (1HU) to właściwość 1 mg preparatu lektynowego, którego roztwór o stężeniu 1 mg/ml powoduje hemaglutynację co najmniej 50% erytrocytów, zgodnie z opisaną wyżej procedurą oceny stopnia hemaglutynacji. Aktywność powyższego preparatu wynosi 1 HU/mg.

Ilość jednostek hemaglutynacyjnych (HU) 1 mg badanego preparatu lektynowego określa się jako odwrotność stężenia roztworu (wyrażonego w mg/ml) w kolejnym rozcieńczeniu, przy którym obserwuje się jeszcze hemaglutynację co najmniej 50% erytrocytów.

Dla preparatu według wynalazku aktywność wyrażoną w jednostkach hemaglutynacji podaje się zwyczajowo w przeliczeniu na 100 mg preparatu.

Przykłady porównawcze

P r z y k ł a d 2.

Rozdrobnienie ziaren fasoli - 1 mm

Ciecz ekstrahująca: 0,02 M roztwór kwasu octowego z dodatkiem 0,01% kwasu askorbinowego.

PL 218 831 B1

Stosunek masy ziaren do roztworu ekstrahującego: 1:10 pH procesu ekstrakcji: 5, kolejno wirowania przy różnych wartościach pH.

Ekstrakt został poddany procesom dializy i suszeniu w liofilizatorze.

Postać produktu gotowego: ciało stałe o włóknistej strukturze.

Aktywność: 64 HU/100 mg.

P r z y k ł a d 3.

Rozdrobnienie ziaren fasoli - 0,9 - 1,1 mm

Ciecz ekstrahująca: 0,02 M roztwór kwasu octowego z dodatkiem 0,01% kwasu askorbinowego. Stosunek masy ziaren do roztworu ekstrahującego: 1:10 pH procesu ekstrakcji: 5,0 Postać produktu gotowego: proszek o dobrej sypkości.

Proces otrzymywania produktu gotowego identyczny z opisanym w przykładzie 1.

Produkt ten był użyty w badaniach na 5 polskich fermach trzody chlewnej, aktywność proszku:

HU/100 mg.

Claims (4)

1. Sposób przemysłowego otrzymywania preparatu lektynowego z ziaren fasoli, obejmujący kwaśną ekstrakcję w obecności antyutleniacza oraz wysuszenie preparatu, znamienny tym, że z rozdrobnionych ziaren fasoli ekstrahuje się frakcję lektynową w układzie ekstrahującym zawierającym kwas octowy, antyutleniacz, oraz łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny lub jego sól, a następnie do uzyskanej frakcji PHA dodaje się trudnolotny konserwant i podaje się ją suszeniu rozpyłowemu uzyskując preparat lektynowy o zawartości aktywnych lektyn nie mniejszej niż 128 HU/100 mg preparatu, przy czym jako łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny lub jego sól stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: kwas mrówkowy, mrówczan sodu, mrówczan potasu, mrówczan wapnia, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas fumarowy, kwas propionowy, propionian sodu, propionian sodu, propionian potasu, propionian wapnia, a jako trudnolotny konserwant stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: N-propyl p-hydroksybenzoesanu sodu lub N-etyl p-hydroksybenzoesanu sodu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako łatwolotny krótkołańcuchowy kwas organiczny stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: kwas mrówkowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas fumarowy, kwas propionowy, przy czym korzystnie stosuje się kwas propionowy.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako antyutleniacz stosuje się kwas askorbinowy.

4. Dodatek paszowy dla trzody chlewnej otrzymywany z ziaren fasoli zwyczajnej sposobem określonym w zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że zawiera lektyny o aktywności nie mniejszej niż 128 HU/100 mg preparatu.