BR112012030935B1 - método para a produção de ligantes de beta-amiloide marcados com f-18 - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LIGANTES DE BETA-AMILOIDE MARCADOS COM F-18. A presente invenção refere-se a métodos que fornecem acesso a derivados de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil amina fluoropeguilada com [F- 18].

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a métodos, que fornecem acesso a derivados de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil amina [F- 18]fluoropeguilada.
ANTECEDENTES
[0002] A Doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurodegene- rativo progressivo manifestado por perda de memória, cognição, e estabilidade comportamental. AD é patologicamente definida por placas senis extracelulares compreendidas de depósitos fibrilares do peptídeo beta-amiloide (Aβ) e emaranhados neurofibrilares compreendidos de filamentos helicoidais pareados de tau hiperfosforilado. Os aminoáci- dos 39 a 43 que compreendem peptídeos Aβ são derivados da proteína precursora de amiloide maior (APP). Na via amiloidogênica, os peptídeos Aβ são clivados a partir de APP pela proteólise sequencial por beta e gama-secretases. Os peptídeos Aβ são liberados como proteínas solúveis e são detectados em baixo nível no fluido cerebrospinal (CSF) em envelhecimento cerebral normal. Durante o progresso de AD, os peptídeos Aβ se agregam e formam depósitos amiloides no pa- rênquima e vasculatura do cérebro, esses podem ser detectados após a morte (post mortem)como placas difusas e senis e amiloide vascular durante o exame histológico (para uma análise recente consulte: Blen- now et al. Lancet. 2006 Jul 29;368(9533):387-403).
[0003] A doença de Alzheimer (AD) está se tornando um grande problema de saúde e económico-social em todo o mundo. Observou- se um grande esforço para desenvolver técnicas e métodos para a detecção precoce e tratamento eficaz da doença. Atualmente, o diagnóstico de AD em um ambiente clínico acadêmico de distúrbios de memó- ria é aproximadamente 85-90% preciso (Petrella JR et al. Radiology. 2003 226:315-36). Com base na exclusão de uma variedade de doenças que causam sintomas similares e o exame neurológico e psiquiátrico minucioso, bem como teste neuropsicológico.
[0004] A formação de imagens moleculares possui o potencial de detectar a progressão da doença ou eficácia terapêutica mais cedo do que a maioria dos métodos convencionais nos campos de neurologia, oncologia e cardiologia. Entre as várias tecnologias de formação de imagens moleculares promissoras, como imagem óptica, MRI, SPECT e PET, PET é de interesse particular para o desenvolvimento de fár- maco devido a sua alta sensibilidade e capacidade de fornecer dados quantitativos e cinéticos.
[0005] Por exemplo, isótopos emissores de positrons incluem, por exemplo, carbono, iodo, nitrogênio e oxigênio. Esses isótopos podem substituir suas contrapartes não radioativas em compostos almejados para produzir marcadores PET que possuem propriedades biológicas similares. Entre esses isótopos F-18 é um isótopo de marcação preferido devido à sua meia-vida de 110 min., isso permite a preparação de marcadores diagnósticos e estudo subsequente de processos bioquímicos. Ademais, a baixa energia β+ (634 keV) também é vantajosa.
[0006] A autópsia do cérebro ainda é o único diagnóstico específico de doença de Alzheimer. Assim, a detecção in vivo de uma característica patológica da doença - a deposição de agregado amiloide no cérebro - é vista como um forte impacto sobre a detecção precoce de AD e diferencia a mesma de outras formas de demência. Adicionalmente, a maioria das terapias modificadores de doença que está em desenvolvimento é voltada para a redução da carga amiloide no cérebro. Assim, a formação de imagens da carga amiloide no cérebro pode proporcionar uma ferramenta essencial para a estratificação de paciente e monitoramento de tratamento (para uma análise recente consul- te: Nordberg. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2008 Mar;35 Suppl 1 :S46- 50).
[0007] Ademais, os depósitos amiloides também são conhecidos por exercerem uma função em amiloidoses, em que as proteínas amiloides (por exemplo, tau) são anormalmente depositadas em órgãos e/ou tecidos diferentes, causando a doença. Para uma análise recente consulte Chiti et al.Annu Rev Biochem. 2006;75:333-66.
[0008] (Aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoropeguiladas com 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina e 4- [(E)-2-(6-{2-[2-(2-fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina foram marcadas com fluoreto F-18 e são tratadas pelos pedidos de patente W02006066104, WO2007126733 e elementos das famílias de patentes correspondentes.
Figure img0001
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina
Figure img0002
4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}piridin-3-il) vinil] -N-metilanilina
[0009] A utilidade desses radiomarcadores para a detecção de placas Aβ foi relatada na literatura (W. Zhang , Nuclear Medicine and Biology 32 (2005) 799-809; C. Rowe et a!., Lancet Neurology 7 (2008) 1 -7; S. R. Choi et al., The Journal of Nuclear Medicine 50 (2009) 1887-1894).
[00010] Para não limitar o uso desses diagnósticos marcados com F-18, são necessários processos que permitam uma fabricação forte e segura dos marcadores marcados com F-18. Adicionalmente, esses processos devem proporcionar alto rendimento da síntese total para permitir a produção de quantidades do diagnóstico para fornecer o ra- diomarcador, apesar da meia-vida de 110 min, a instalações sem ciclo- tron ou instalações de produção radiofarmacêutica.
[00011] A síntese de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoro- peguiladas marcadas com F-18 foi descrita anteriormente: 4-[(E)-2-(4-{2-f2-(2-fF181fluoroetóxi)etóxiletóxilfenil) vinill-N- metilanilina
Figure img0003
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina
a) W. Zhang et al., Nuclear Medicine and Biology 32 (2005) 799-809
[00012] 4 mg de precursor 2a (2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]fenóxi}etóxi)etóxi]etil metanos- sulfonato) em 0,2 ml de DMSO foram reagidos com o complexo fluore- to[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprote- gido com HCI e neutralizado com NaOH. A mistura foi extraída com acetato de etila. O solvente foi seco e evaporado. O resíduo foi dissolvido em acetonitrila e purificado por HPLC semipreparativa (acetonitri- la/5 mM de tampão dimetilglutarato pH 7 9/1). 20% (decaimento corrigido), 11 % (decaimento não corrigido) 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foram obtidos dentro de 90 min. Uma Reformulação adicional necessária para obter uma solução adequada para injeção em humanos não é descrita.
b) W02006066104
[00013] 4 mg de precursor 2a (2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]fenóxi}etóxi)etóxi]etil metanos- sulfonato) em 0,2 ml de DMSO foram reagidos com o complexo fluore- to[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprotegido com HCI e neutralizado com NaOH. A mistura foi extraída com acetato de etila. O solvente foi seco e evaporado, o resíduo foi dissolvido em acetonitrila e purificado por HPLC semipreparativa. 30% (decaimento corrigido), 17% (decaimento não corrigido) 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foram obtidos em 90 min. Uma Reformulação adicional necessária para obter uma solução adequada para injeção em humanos não é descrita.
c) C. C. Rowe et al., Lancet Neurology 7 (2008) 129-135
[00014] Após a radiomarcação, hidrólise acídica e purificação por HPLC semipreparativa, 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foi Formulada através de extração de fase sólida (SPE).
d) H. Wang et al., Nuclear Medicine and Biology 38 (201 1 ) 121-127
[00015] 5 mg (9,33 pmol) de precursor 2a (2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]fenóxi}etóxi)etóxi]etil metanos- sulfonato) em 0,5 ml de DMSO foram reagidos com o complexo fluore- to[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprotegido com HCI e neutralizado com NaOH. O produto cru foi diluído com acetonitrila / 0,1 M de formato de amónio (6/4) e purificado por HPLC semipreparativa. A fração de produto foi coletada, diluída com água, passada através de um cartucho C18 eluída com etanol, rendimento de 17% (decaimento não corrigido) 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina dentro de 50 min. No mesmo contexto, a conversão de um precursor de mesilato não protegido (é descrita: 5 mg (11,48 pmol]) de precursor de mesilato não protegido (2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4-(metilamino)fenil]vinil}fenóxi)etóxi]-etóxi}etil 4- metanossulfonato) em 0,5 ml_ de DMSO foram reagidos com o complexo fluoreto[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O produto cru foi diluído com acetonitrila / 0,1 M de formato de amónio (6/4) e purificado por HPLC semipreparativa. A fração de produto foi coletada, diluída com água, passada através de um cartucho C18 e eluída com etanol, rendimento de 23% (não corrigido para decaimento) 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina dentro de 30 min.
[00016] Um processo em que o radiomarcador foi purificado apenas por SPE (sem HPLC), foi considerado para fornecer um produto com pureza radioquímica aceitável (>95%), entretanto, a pureza química é muito baixa, por exemplo, os subprodutos derivados do excesso de precursor não poderiam ser removidos,
e) US201001 13763
[00017] 2a (2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc-butóxicarbonil)(metil)amino]fe- niljvinil]- fenóxi}etóxi)etóxi]etil metanossulfonato) foi reagido com o reagente de fluoreto[F-18] em uma mistura de terc-álcool e acetonitrila. Após a fluoração, o solvente foi evaporado e uma mistura de HCI e acetonitrila foi adicionada. Após a desproteção (aquecimento a 100- 120 °C), a mistura de produto cru foi purificada por HPLC (C18, 60% de acetonitrila, 40% de 0,1 M de formato de amónio). Uma Reformulação adicional necessária para obter uma solução adequada para injeção em humanos não é descrita. 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il) vinil]-N- metilanilina
Figure img0004
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)piridin-3-il]-N-metilanilina
a) S. R. Choi et al., The Journal of Nuclear Medicine 50 (2009) 1887-1894.
[00018] 1 mg de precursor 2b (2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]piridin-2-il}oxi)etóxi]etóxi}etil 4- metilbenzenosulfonato) em 1 ml de DMSO foi reagido com o complexo fluoreto[F-18]/kriptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprotegido com HCI e neutralizado com NaOH. DMSO e componentes inorgânicos foram removidos por extração de fase sólida em cartucho SepPak light C18 (Waters). O produto cru foi purificado por HPLC semipreparativa (55% de acetonitrila, 45% de 20mM de NH4OAC + 0,5% p/v de ascorbato de sódio). A fração de produto foi diluída com água e passada através de um cartucho SepPak light C18. O radiomarcador foi eluído com etanol. O rendimento de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina foi de 10 a 30% (decaimento corrigido).
b) WO2010078370
[00019] 1,5 mg (2,45 pmol) de precursor 2b (2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4- [(terc-butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]piridin-2- il}oxi)etóxi]etóxi}etil 4-metilbenzenosulfonato) em 2 ml_ de DMSO foi reagido com o complexo fluoreto[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprotegido com HCI e eluído com 1 % de solução de NaOH para neutralização. A mistura foi carregada em um cartucho de fase reversa. O cartucho foi lavado com água (contendo 5% p/v de ascorbato de sódio). O produto cru foi eluído com acetonitrila em um reservatório contendo água + 5% p/v de ascorbato de sódio e solvente de HPLC. Após a purificação por HPLC semipreparativa, a fração de produto foi coletada em um reservatório contendo água + 0,5% p/v de ascorbato de sódio. A solução foi passada através de um cartucho C18, o cartucho foi lavado com água (contendo 0,5% p/v de ascorbato de sódio e o produto final foi eluído com etanol em um rendimento contendo 0,9% de solução de cloreto de sódio com 0,5% p/v de ascorbato de sódio, c) Y. Liu et a!., Nuclear Medicine and Biology 37 (2010) 917- 925.
[00020] 1 mg (1,63 pmol) de precursor 2b (2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4- [(terc-butóxicarbonil)(metil)amino]-fenil}vinil]piridin-2- il}oxy)etóxi]etóxi}etil 4-metilbenzenosulfonato) em 1 ml_ de DMSO foi reagido com o complexo fluoreto[F-18]/kryptofix/carbonato de potássio. O intermediário foi desprotegido com HCI e diluído com 1 % de solução de NaOH. A mistura foi carregada em um cartucho Oasis HLB. O cartucho foi lavado com água, seco sob um fluxo de argônio e o produto foi eluído com etanol em um frasco contendo uma solução salina. Embora as impurezas radioquímicas sejam removidas por esse procedimento, subprodutos não radioativos derivados de hidrólise do exces- so de precursor permaneceram na solução de produto final.
[00021] O rendimento de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina foi de 34% (decaimento não corrigido) dentro de 50 min. em um nível radioativo de 10 a 100 mCi (370 a 3700 MBq) de fluoreto[F-18],
d) L. Silva et al.,Abstract/Poster EANM 2010
[00022] Uma plataforma IBA Synthera foi adaptada para a síntese de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N- metilanilina.
[00023] Adicionalmente, um sistema de HPLC semipreparativa e um módulo Synthera adicional para a Reformulação foram integrados.
e) G. Casale et al. World Journal of Nuclear Medicine, 9 S1 (2010), S-174 (Abstract of 10th Congress of WFNMB, Cape Town, South Africa, 18-23 September 2010)
[00024] A fabricação de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina foi realizada pelo uso de um módulo de síntese IBA Synthera, combinado com um sistema de purificação HPLC semipreparativa e um módulo adicional para a Formulação (diluição de fração de HPLC, captura em um cartucho C18, lavagem e eluição com etanol).
[00025] Embora os processos de purificação baseados em cartuchos tenham sido investigados, uma ótima qualidade de produto referente à pureza radioquímica e separação de subprodutos não radioativos foi demonstrada e adaptada apenas para purificação de HPLC. Até agora, (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoropeguiladas marcadas com F-18 foram purificadas por HPLC utilizando sistemas de solvente que consistem em acetonitrila e tampão aquoso. Obviamente, as frações de produtos coletadas não podem ser diretamente usadas para administração no paciente. Acetonitrila e compostos adicionais dos sistemas de solvente que não são tolerados para injeção em hu- manos devem ser removidos. Isso poderia ser realizado por evaporação ou por extração de fase sólida (por exemplo, captura em cartucho de extração de fase sólida C18 e eluição com etanol, veja a figura 1 : cartucho de extração de fase sólida final C3, eluição com etanol de V8; veja também a figura 7, cartucho de extração de fase sólida final 11 , eluição com etanol de um dos frascos 9).
[00026] Entretanto, especialmente em níveis superiores de radioatividade, a decomposição do radiomarcador devido a processos de ra- diólise pode ser um problema. Esse problema é bem conhecido, para impedir a radiólise durante a purificação de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina, ascorbato de sódio (como um sequestrador de radicais) foi adicionado ao solvente HPLC e a soluções de lavagem (S. R. Choi et al,WO2010078370). Entretanto, a concentração do radiomarcador após HPLC por evaporação ou por extração de fase sólida é uma etapa importante da fabricação. Em experimentos de transferência de escala, purezas radio- químicas maiores de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoropegui- ladas marcadas com F-18 podem ser encontradas após HPLC, antes da extração de fase sólida comparado com a composição após a extração de fase sólida.
[00027] A configuração geral do processo de fabricação de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoropeguiladas marcadas com F-18 como anteriormente descrito é ilustrada na figura 7. O processo de fabricação pode ser dividido em três partes principais: A) Síntese B) Purificação por HPLC C) Formulação
[00028] As etapas de fabricação de secagem de fluoreto[F-18], ra- diomarcação da molécula precursora e desproteção são realizadas na parte A do dispositivo de síntese (figura 7). A mistura de produto cru é transferida para a segunda parte B para purificação por HPLC (em gel de sílica em fase reversa utilizando acetonitrila/tampão de eluente). Para obter o radiomarcador em uma Formulação, adequado para a injeção em humanos. O solvente (acetonitrila) presente na fração de produto precisa ser removido e trocado por uma composição que seja apropriada para a fabricação de um medicamento. Tipicamente (e descrita nas referências acima), a fração de produto é diluída com água (recipiente "8", figura 7, parte C) e então passada através de um cartucho em fase reversa ("11", figura 7, parte C). O cartucho é lavado com uma solução aquosa de um dos reservatórios 9 (figura 7, parte C) e, por fim, eluída a partir do cartucho com uma solução etanólica (ou etanol) de outro reservatório 9 no frasco de produto, que compreende opcionalmente partes adicionais e excipientes da Formulação final. É óbvio para os elementos versados na técnica que a ilustração na figura 7 é uma simplificação do processo e equipamento e que partes adicionais como válvulas, frascos, tubo, ect. podem ser parte desse processo ou equipamento.
[00029] Um processo de fabricação "GMP compliant"de 4-[(E)-2-(6- {2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina é descrito em WO2010078370 e C.-H. Yao et al., Applied Radiation and Isotopes 68 (2010) 2293-2297. Para impedir a decomposição de 4- [(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}piridin-3-il)vinil]-N- metilanilina, ascorbato de sódio foi adicionado ao solvente HPLC (45% de acetonitrila, 55% 20 mM de acetato de amónio contendo 0,5% (p/v) de ascorbato de sódio) e a Formulação final (0,5% (p/v) de ascorbato de sódio). O processo proporcionou até 18,5 GBq (25,4 +- 7,7%, decaimento corrigido) 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etó- xi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina. A pureza radioquímica foi 95,3 +- 2,2%.
[00030] Embora ascorbato/ácido ascórbico seja adicionado a sol- ventes envolvidos na purificação, a pureza radioquímica é apenas cerca de 95,3 +- 2,2% em níveis de atividade de produto de até 18,5 GBq (Yao et al.) - provavelmente devido à decomposição por radiólise.
[00031] Em níveis de atividade de produto superiores, uma variação ainda maior de pureza radioquímica foi encontrada na fabricação de 4- [(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina (Exemplo 7, figura 9, método A).
[00032] Além da variação de pureza radioquímica, a reformulação durante o processo atual (conversão do radiomarcador de meio HPLC media em uma solução injetável) exige tempo de processo adicional e demanda um equipamento mais complexo. Por exemplo, o processo para a síntese de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}pi- ridin-3-il)vinil]-N-metilanilina descrito por Silva et al.e Casale et al. demanda três módulos para o procedimento de fabricação total. A Síntese do produto cru (esquematicamente ilustrada na figura 7, Parte A) foi realizada em um módulo IBA Synthera, um sistema de HPLC semipre- parativa foi usado para a purificação (esquematicamente ilustrado na figura 7, Parte B) e um módulo de síntese adicional IBA Synthera foi usado para a reformulação (esquematicamente ilustrada na figura 7, Parte C).
[00033] O problema que será resolvido pela presente invenção é proporcionar um processo de purificação HPLC aprimorado para (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoropeguiladas marcadas com F-18 que forneça altas purezas químicas e radioquímicas do radiomarcador, evitando uma concentração do produto marcado após a purificação para impedir a radiólise, especialmente níveis superiores de radioatividade. Esse processo deve ser adequado para a fabricação de quantidades maiores (radioatividade) do radioamarcador para permitir uma distribuição de instalações de formação de imagens sem a própria produção radiofarmacêutica. Até então a atividade máxima de uma (aril/heteroaril vinil)-fenil metil amina fluoropeguilada marcada com F-18 foi relatada como 18,5 GBq (Yao et al.). Entretanto, rendimentos ainda maiores poderiam ser favoráveis para um uso geral e disponibilidade do radiomarcador. Um pré-requisito para o novo método de fabricação deve ser uma alta pureza radioquímica (por exemplo, > 95%) dentro de uma ampla gama de radioatividade. Mais precisamente, esse processo deve ser adequado para a fabricação de níveis de atividade maiores do radiomarcador do que anteriormente descrito (por exemplo, > 20 GBq, ou ainda > 50 GBq, ou ainda >100 GBq) com purezas radioquímicas confiavelmente >= 95%. Como um recurso adicional, esse processo deve ser menos complexo do que os processos anteriormente descritos.
[00034] Os problemas descritos acima foram solucionados por um procedimento de purificação modificado. Para simplificar a configuração geral de fabricação, a composição de solvente para purificação HPLC foi modificada. Em vez de uma mistura de acetonitrila/tampão, uma mistura de etanol/tampão é usada. Uma vantagem da nova mistura de solvente HPLC é que todos os constituintes do solvente HPLC - ao contrário de composições anteriormente descritas - são bem tolerados como parte de uma Formulação, desse modo, adequados para a injeção em humanos. Portanto, uma reformulação para remover os constituintes do solvente HPLC (como ilustrado na figura 7, Parte C) não é mais exigida. Essa vantagem adicional do novo processo - a configuração simplificada - é esquematicamente ilustrada na figura 8. (Obviamente, essa ilustração é uma simplificação que mostra uma configuração geral do novo método descrito aqui). Ao acompanhar o desenho na figura 8, a fração de produto é diretamente coletada (pela válvula comutadora "7") no frasco do produto (que poderia conter partes adicionais da Formulação final). Devido à complexidade reduzida, o tempo de fabricação total utilizando o novo método descrito aqui é mais curto, contribuindo diretamente para maiores rendimentos de decaimento não corrigido comparados com o processo anteriormente usado em que uma purificação HPLC com reformulação adicional (demorada) em um cartucho de fase sólida (SPE) é usada.
[00035] A principal vantagem do novo método descrito aqui é a alta pureza radioquímica das (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluoro- peguiladas marcadas com F-18 sintetizadas pelo novo método. No Exemplo 7 e figura 9, a pureza radioquímica em dependência do método de purificação e quantidade (radioatividade) de produto radiomar- cado no final da síntese é demonstrada. Os pontos/quadrados (cada um representando um experimento individual) e as linhas de tendência na figura 9 demonstram claramente que a pureza radioquímica obtida após HPLC com reformulação por SPE varia significativamente (figura 9, quadrados vazios). Especialmente em níveis de radioatividade superiores (> 20 GBq), a pureza radioquímica geralmente é ainda <95%. Em contrapartida, a variabilidade de purezas radioquímicas obtida pelo novo método da presente invenção é muito menor e altas purezas radioquímicas >95% foram obtidas, mesmo em níveis de radioatividade do produto maiores do que 50 GBq ou ainda maiores do que 100 GBq (figura 9, pontos preenchidos). SUMÁRIO DA INVENÇÃO - A presente invenção proporciona um método para a produção de composto radiomarcado da Fórmula I e sais adequados de um ácido inorgânico ou orgânico desse, hidratos, complexos, ésteres, amidas, solvatos e pró-fármacos desses e opcionalmente um veículo, diluente, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00036] O método compreende as etapas de: - Radiofluoração do composto da Fórmula II - Opcionalmente, clivagem de um grupo de proteção - Purificação e Formulação de composto da Fórmula I por HPLC utilizando um sistema de solvente que pode ser parte de uma Formulação injetável
Figure img0005
[00037] O Método proporcionado pela presente invenção é esquematicamente ilustrado na figura 8. A radiofluoração do composto da Fórmula II e opcionalmente, a clivagem de um grupo de proteção são realizadas na parte do lado esquerdo do equipamento (figura 8, parte A). A purificação do composto da Fórmula I é realizada de modo que a fração de produto obtida por HPLC (figura 8, parte B) possa ser diretamente transferida para o frasco de produto, em que o frasco de produto contém ainda opcionalmente veículos, diluentes, adjuvantes ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Uma parte adicional do processo e equipamento como ilustrado na figura 7 (Parte C) não é mais exigida pelo Método da presente invenção. • A presente invenção também proporciona composições que compreendem um composto radiomarcado da Fórmula I ou sais adequados de um ácido inorgânico ou orgânico desse, hidratos, complexos, ésteres, amidas, solvatos e pró-fármacos desse e opcionalmente um veículo, diluente, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável. • A presente invenção também proporciona um Kit para preparar uma preparação radiofarmacêutica pelo processo descrito aqui, sendo que o dito Kit compreende um frasco vedado contendo uma quantidade predeterminada do composto da Fórmula II.
Descrição da Invenção
[00038] Em um primeiro aspecto a presente invenção se refere a um Método para produzir um composto da Fórmula I
Figure img0006
que compreende as etapas de:
[00039] Etapa 1: Composto de radiomarcação da Fórmula II com um agente de fluoração F-18, para obter o composto da Fórmula I, se R = H ou para obter o composto da Fórmula III, se R = PG
Figure img0007
[00040] Etapa 2: Opcionalmente, se R = PG, divagem do grupo de proteção PG para obter o composto da Fórmula I
[00041] Etapa 3: Purificação e Formulação do composto da Fórmula I em que: n = 1 -6, de preferência, 2-4, com mais preferência, 3.
[00042] X é selecionado a partir do grupo que compreende a) CH, b)N.
[00043] Em uma modalidade preferida, X = CH.
[00044] Em outra modalidade preferida, X = N.
[00045] R é selecionado a partir do grupo que compreende a) H, b) PG.
[00046] PG é um "grupo de proteção amina".
[00047] Em uma modalidade preferida, PG é selecionado a partir do grupo que compreende: a) Boc, b) Tritila e c) 4- Metóxitritila.
[00048] Em uma modalidade mais preferida, R é H.
[00049] Em outra modalidade mais preferida, R é Boc.
[00050] LG é um Grupo de saída.
[00051] Em uma modalidade preferida, LG é selecionado a partir do grupo que compreende: a) Halogênio e b) Sulfoniloxi.
[00052] Halogênio é cloro, bromo ou iodo. De preferência, Halogênio é bromo ou cloro.
[00053] Em uma modalidade preferida, Sulfoniloxi é selecionado a partir do grupo que consiste em
[00054] Metanosulfoniloxi, p-Toluenosulfoniloxi, Trifluormetilsulfo- niloxi, 4-Cianofenilsulfoniloxi, 4-Bromofenilsulfoniloxi, 4- Nitrofenilsulfoniloxi, 2-Nitrofenilsulfoniloxi, 4-lsopropil-fenilsulfoniloxi, 2,4,6-Tri-isopropil-fenilsulfoniloxi, 2,4,6-Trimetilfenilsulfoniloxi, 4-terc- Butil-fenilsulfoniloxi, 4-Adamantilfenilsulfoniloxi e 4- Metóxifenilsulfoniloxi.
[00055] Em uma modalidade mais preferida, Sulfoniloxi é selecionado a partir do grupo que compreende: a) Metanosulfoniloxi, b) p-Toluenosulfoniloxi, c) (4-Nitrofenil)sulfoniloxi, d) (4-Bromofenil)sulfoniloxi.
[00056] Em uma modalidade ainda mais preferida, LG é Metanosulfoniloxi.
[00057] Em outra modalidade ainda mais preferida, LG é p- Toluenosulfoniloxi.
[00058] Um composto preferido da Fórmula I é:
Figure img0008
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]f I uoroetóxi )etóxi]etóxi}fe n i I )vi n i l]-N- metilanilina.
[00059] Outro composto preferido da Fórmula I é:
Figure img0009
4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]etóxi}piridin-3- il)vinil]-N- metilanilina.
[00060] Um composto preferido da Fórmula II é:
Figure img0010
2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]fenil}vinil]fenóxi}-etóxi)etóxi]etil metanos- sulfonato.
[00061] Outro composto preferido da Fórmula II é:
Figure img0011
2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]fenil}vinil]fenóxi}-etóxi)etóxi]etil 4- metilbenzenosulfonato
[00062] Outro composto preferido da Fórmula II é:
Figure img0012
2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4- (metilamino)fenil]vinil}fenóxi)etóxi]etóxi}etil 4- metilbenzenossulfonato
[00063] Outro composto preferido da Fórmula II é:
Figure img0013
2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4- (metilamino)fenil]vinil}fenóxi)etóxi]etóxi}etil 4-metilbenzenossulfonato
[00064] Outro composto preferido da Fórmula II é:
Figure img0014
2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(terc- butóxicarbonil)(metil)amino]fenil}vinil]piridin-2-il}oxi)etóxi]etóxi}etil 4- metilbenzenosulfonato
[00065] A Etapa 1 compreende uma reação de marcação direta com [F-18]fluoro de compostos da Fórmula II para obter o composto da Fórmula I (se R = H) ou o composto da Fórmula III (se R = PG).
[00066] O método de radiomarcação compreende a etapa de reagir um composto da Fórmula II com um agente de fluoração F-18 para obter um composto da Fórmula III ou composto da Fórmula I. Em uma modalidade preferida, o derivado de fluoreto [F-18] é 4,7,13,16,21,24- Hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]-hexacosano K[F-18]F (Kryptofix K[F- 18]F), K[F-18]F, H[F-18]F, KH[F-18]F2, Cs[F-18]F, Na[F-18]F ou sal de tetra-alquil amónio de [F-18]F (por exemplo, fluoreto [F-18] de tetrabu- tilamônio). Com mais preferência, o agente de fluoração é K[F-18]F, H[F-18]F, fluoreto[F- 18] de tetrabutilamônio, Cs[F-18]F ou KH[F- 18]F2, com mais preferência, K[F- 18], Cs[F-18]F ou fluoreto[F- 18] de tetrabutilamônio.
[00067] Um agente de fluoração F-18 ainda mais preferido é krypto- fix/fluoreto de potássio [F-18], de preferência, gerado de fluoreto[F-18], kryptofix e carbonato de potássio.
[00068] As reações de radiofluoração são realizadas em acetonitrila, sulfóxido de dimetila ou dimetilformamida ou uma mistura desses. Porém, outros solventes que também podem ser usados são bem conhecidos por um elemento versado na técnica. Água e/ou álcoois podem estar envolvidos nessa reação como um cosolvente. As reações de radiofluoração são conduzidas em menos de 60 minutos. Os tempos de reação preferidos são menos de 30 minutos. Os tempos de reação adicionalmente preferidos são menos de 15 minutos. Essas e outras condições para tal radiofluoração são conhecidas por elementos versados na técnica (Coenen, Fluorine-18 Labeling Methods: Features and Possibilities of Basic Reactions, (2006), in: Schubiger P.A., Friebe M., Lehmann L, (eds), PET-Chemistry - The Driving Force in Molecular Imaging. Springer, Berlin Heidelberg, pp.15-50).
[00069] Em uma modalidade, 7,5 a 75 pmol, de preferência, 10 a- 50 pmol, com mais preferência, 10 a 30 pmol e com ainda mais preferência, 12 a 25 pmol e com ainda mais preferência, 13 a 25 pmol de composto da Fórmula II são usados na Etapa 1.
[00070] Em outra modalidade, mais de 7,5 pmol, de preferência, mais de 10 pmol, e com ainda mais preferência, mais de 12 pmol e com ainda mais preferência, mais de 13 pmol de composto da Fórmula II são usados na Etapa 1.
[00071] Em outra modalidade, mais de 5 mg, de preferência, mais de 6 mg e com mais preferência, mais de 7 mg de composto da Fórmula II são usados na Etapa 1.
[00072] Em outra modalidade, 7 mg de composto da Fórmula II são usados na Etapa 1.
[00073] Em outra modalidade, 8 mg de composto da Fórmula II são usados na Etapa 1.
[00074] Em uma modalidade preferida, a Radiofluoração do composto da Fórmula II é realizada em acetonitrila ou em uma mistura de acetonitrila e cosolventes, em que a porcentagem de acetonitrila é pelo menos 50%, com mais preferência, pelo menos 70%, com ainda mais preferência, pelo menos 90%.
[00075] Opcionalmente, se R = PG, a Etapa 2 compreende a desproteção do composto da Fórmula III para obter o composto da Fórmula I. As condições de reação são conhecidas ou óbvias para o elemento versado na técnica, essas são selecionadas, porém não limitadas àquelas descritas no compêndio Greene and Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis, terceira edição, página 494-653, incluído aqui a título de referência.
[00076] As condições de reação preferidas são a adição de um ácido e agitação a 0°C a 180°C; a adição de uma base e aquecimento a 0°C a 180°C; ou uma combinação desses.
[00077] De preferência, a etapa 1 e etapa 2 são realizadas no mesmo recipiente de reação.
[00078] A etapa 3 compreende a purificação e Formulação do composto da Fórmula I utilizando um sistema de separação HPLC, em que o eluente de solvente HPLC (por exemplo, misturas de etanol e tampões aquosos) pode ser parte da Formulação injetável do composto da Fórmula I. A fração de produto coletada pode ser diluída ou mistura com outras partes da Formulação.
[00079] Em uma modalidade preferida, a mistura de solvente HPLC consiste em etanol ou um tampão aquoso ou uma mistura de eta- nol/tampão aquoso, em que o tampão aquoso consiste em componentes ou excipiente que podem ser injetados em humanos. Exemplos desse tampão aquoso são soluções de cloreto de sódio, tampão fosfato de sódio, ácido ascórbico, tampão de ascorbato ou misturas desses.
[00080] Em uma modalidade preferida, o método de fabricação do composto da Fórmula I é realizado pelo uso de um módulo (análise: Krasikowa, Synthesis Modules and Automation in F-18 labeling (2006), in: Schubiger P.A., Friebe M., Lehmann L, (eds), PET-Chemistry - The Driving Force in Molecular Imaging. Springer, Berlin Heidelberg, pp. 289-316) que permite uma síntese automática. Com mais preferência, o Método é realizado pelo uso de um módulo em uma única etapa (one-pot). Com ainda mais preferência, o Método é realizado em módulos do tipo não cassete conhecidos (por exemplo, Ecker&Ziegler Modular-Lab, GE Tracerlab FX, Raytest SynChrom) e módulos do tipo cassete (por exemplo, GE Tracerlab MX, GE Fastlab, IBA Synthera, Eckert&Ziegler Modular-Lab PharmTracer), opcionalmente, um equipamento adicional como HPLC ou dispositivos de aplicação são anexados aos ditos módulos.
[00081] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere diretamente a um Método completamente automático e/ou controlado remotamente para a produção do composto da Fórmula I em que os compostos da Fórmula I, II e III e Etapas 1, 2 e 3 são descritos acima.
[00082] Em uma modalidade preferida esse método é um processo completamente automático, compatível com as diretrizes GMP, o mesmo proporciona uma Formulação da Fórmula I para o uso de ad-ministração (injeção) em humanos.
[00083] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a um Kit para a produção de uma composição farmacêutica do composto da Fórmula I.
[00084] Em uma modalidade, o Kit que compreende um frasco vedado contendo uma quantidade predeterminada do composto da Fórmula II. De preferência, o Kit contém 1,5 a 75 pmol, de preferência, 7,5 a 50 pmol, com mais preferência, 10 a 50 pmol e com ainda mais preferência, 12 a 25 pmol e com ainda mais preferência, 12 a 25 pmol e com ainda mais preferência, 13 a 25 pmol do composto da Fórmula II.
[00085] Em outra modalidade, o Kit contém mais de 7,5 pmol, de preferência, mais de 10 pmol e com ainda mais preferência, mais de 12 pmol e com ainda mais preferência, mais de 13 pmol do composto da Fórmula II.
[00086] Em outra modalidade, o Kit contém mais de 5 mg, de preferência, mais de 6 mg e com mais preferência, mais de 7 mg do composto da Fórmula II.
[00087] Em outra modalidade, o Kit contém 7 mg do composto da Fórmula II.
[00088] Em outra modalidade, o Kit contém 8 mg do composto da Fórmula II.
[00089] O kit também contém um solvente ou mistura de solventes ou os componentes do solvente (mistura) para purificação HPLC, em que esse solvente, mistura de solventes ou componentes são apropriados para o uso direto para injeção em pacientes.
[00090] Opcionalmente, o Kit contém componentes adicionais para a fabricação do composto da Fórmula I, como cartuchos de extração de fase sólida, reagente de fluoração (como descrito acima), acetonitri- la ou acetonitrila e um cosolvente, reagente de clivagem de grupo de desproteção, solvente ou misturas de solventes para purificação, sol-ventes e excipiente da Formulação.
[00091] Em uma modalidade, o Kit contém uma plataforma (por exemplo, cassete) para um "módulo do tipo cassete" (como Tracerlab MX ou IBA Synthera).
DEFINIÇÕES
[00092] No contexto da presente invenção, os sais preferidos são sais farmaceuticamente adequados dos compostos de acordo com a invenção. A invenção também compreende sais que para sua parte não são adequados para aplicações farmacêuticas, porém esses podem ser usados, por exemplo, para isolar ou purificar os compostos de acordo com a invenção.
[00093] Os sais farmaceuticamente adequados dos compostos de acordo com a invenção incluem sais de adição de ácido de ácidos minerais, ácidos carboxílicos e ácidos sulfônicos, por exemplo, sais de ácido hidroclórico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido toluenossulfôni- co, ácido benzenossulfônico, ácido naftaleno dissulfônico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido tartári- co, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico e ácido benzoico.
[00094] Sais farmaceuticamente adequados dos compostos de acordo com a invenção também incluem sais de bases de uso costumeiro, como, através de exemplo e a título de preferência, sais de metal álcali (por exemplo, sais de sódio e sais de potássio), sais de metais alcalino-terrosos (por exemplo, sais de cálcio e sais de magnésio) e sais de amónio, derivados de amónia ou aminas orgânicas que possuem 1 a 16 átomos de carbono, como, através de exemplo e a título de preferência, etilamina, dietilamina, trietilamina, etildi-isopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, dicicloexilamina, di- metilaminoetanol, procaina, dibenzilamina, N metilmorfolina, arginina, lisina, etilenodiamina e N metilpiperidina.
[00095] O termo Halogênio ou halo se refere a Cl, Br, F ou I.
[00096] O termo "grupo de proteção amina" como empregado aqui por si só ou como parte de outro grupo é conhecido ou óbvio para um elemento versado na técnica, esse é selecionado, porém sem caráter limitativo, a partir de uma classe de grupos de proteção, ou seja, car- bamatos, amidas, imidas, N-alquil aminas, N-aril aminas, iminas, ena- minas, boranos, grupos de proteção N-P, N-sulfenila, N-sulfonila e N- silila, e esse é selecionado, porém não limitado àqueles descritos no compêndio Greene and Wuts, Protecting groups in Organic Synthesis, terceira edição, página 494-653, incluído aqui a título de referência. O grupo de proteção amina é, de preferência, Carbobenziloxi (Cbz), p- Metóxibenzil carbonila (Moz ou MeOZ), terc-Butiloxicarbonila (BOC), 9- Fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), Bienzila (Bn), p-Metóxibenzila (PMB), 3,4-Dimetóxibenzila (DMPM), p-metóxifenila (PMP) ou o grupo amino protegido é um 1,3-dioxo-1,3-di-hidro-2H-isoindol-2-il (ftalimido) ou um grupo azido.
[00097] O termo "Grupo de saída" como empregado aqui por si só como parte de outro grupo é conhecido ou óbvio para um elemento versado na técnica, e significa que um átomo ou grupo de átomos é separável de uma substância química por um agente nucleofílico. Exemplos são fornecidos, por exemplo, em Synthesis (1982), p. 85- 125, tabela 2 (p. 86; (a última entrada dessa tabela 2 precisa ser corrigida: "n-C4FgS(O)2-O-nonaflat" em vez de "n-C4H9S(O)2-O- nonaflat"), Carey and Sundberg, Organische Synthese, (1995), página 279-281, tabela 5.8; ou Netscher, Recent Res. Dev. Org. Chem., 2003, 7, 71 - 83, esquema 1,2, 10e15e outros). (Coenen, Fluorine- 18 Labeling Methods: Features and Possibilities of Basic Reactions, (2006), in: Schubiger P.A., Friebe M., Lehmann L., (eds), PET-Chemistry – The Driving Force in Molecular Imaging. Springer, Berlin Heidelberg, pp.15- 50, explicitamente: esquema 4 pp. 25, esquema 5 pp 28, tabela 4 pp 30, figura 7 pp 33).
[00098] O termo Sulfoniloxi se refere a -O-S(O)2-Q em que Q é op-cionalmente arila substituída ou opcionalmente alquila substituída. O termo "alquila"como empregado aqui por si só ou como parte de outro grupo se refere a um grupo alquila C1-C10 de cadeia linear ou ramificada como, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, isopentila, neopentila, heptila, hexila, decila ou adamantila. De preferência, alquila é alquila Ci-Ce de cadeia linear ou ramificada ou alquila C7-C10 de cadeia linear ou ramificada. Alquila in-ferior é uma alquila Ci-Cβ de cadeia linear ou ramificada.
[00099] O termo "arila" como empregado aqui por si só ou como parte de outro grupo se refere a grupos aromáticos monocíclicos ou bicíclicos contendo de 6 a 10 carbonos na porção de anel, como fenila, naftila ou tetraidronaftila.
[000100] Sempre que o termo "substituído" for usado, deve indicar que um ou mais hidrogénios no átomo indicado na expressão utilizando "substituído" é/são substituído(s) por uma ou múltiplas porções do grupo que compreende halogênio, nitro, ciano, trifluorometila, alquila e O-alquila, desde que a valência regular do respectivo átomo não seja excedida, e que a substituição resulte em um composto quimicamente estável, ou seja, um composto que é suficientemente forte para suportar o isolamento a um grau útil de pureza de uma mistura de reação.
[000101] Exceto onde especificado em contrário, quando se faz referência aos compostos da Fórmula, a presente invenção por si mesma bem como qualquer composição farmacêutica dessa inclui todos os hidratos, sais, e complexos.
[000102] O termo "F-18" significa isótopo de flúor 18F. O termo"F-19" significa isótopo de flúor 19F.
EXEMPLOS Determinação de pureza radioquímca ou química
[000103] As purezas radioquímicas e químicas de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina e 4-[(E)-2-(4- {2- [2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foram determinadas por HPLC analítica (coluna: Atlantis T3; 150x4.6 mm, 3 pm, Waters; solvente A: 5 mM de K2HPO4 pH 2,2; solvente B: acetoni- trila; fluxo: 2 mL/min., gradiente: 0:00 min. 40% B, 0:00-05:50 min. 40- 90% B, 05:50-05:60 min. 90-40% B, 05:60- 09:00 min. 40% B). Tempo de retenção de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)-vinil]-N-metilanilina: 3,5-3,9 min. de-pendendo do sistema HPLC usado para o controle de qualidade. Devido ao equipamento diferente (por exemplo, tubo) uma diferença no tempo de retenção é observada entre os diferentes sistemas HPLC. A identidade de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foi adaptada por coinjeção com a referência não radioativa 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-19]fluoroetóxi)etóxi]- etó- xi}fenil)vinil]-N-metilanilina. Tempo de retenção de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina: 3,47 min. A identidade de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}piridin-3- il)vinil]-N-metilanilina foi adaptada por coeluição com a referência não rad ioati va -[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-19]f I uoroetóxi )etóxi ]-etóxi} p i rid i n-3- il)vinil]-N-metilanilina. Exemplo 1 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em Ec- kert&Ziegler modular lab
Figure img0015
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina
[000104] A síntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18])fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina foi realizada em um sintetizador Ec- kert&Ziegler modular lab. Fluoreto[F-18] (60362 MBq) foi capturado em um cartucho QMA. A atividade foi eluída com uma mistura de mesilato de potássio/kryptofix/n-Bu4NHCO3/metanol no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila. Uma solução de 4 mg de 2a em 1 ml de terc-amilálcool/acetonitrila (9:1) foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 20 min. a 120°C. Durante o aquecimento, o exaustor do reator foi aberto para permitir a evaporação do solvente. Uma mistura de 2,2 ml 1,5M de HCI, 1,1 ml_ de acetonitrila e 30 mg de ascorbato de sódio foi adicionada e o reator foi aquecido a 100°C durante 10 minutos. O produto cru foi neutralizado (1,5 ml_ 2M de NaOH + 0,3 ml_ de tampão) e transferido para uma coluna HPLC semipreparativa (Synergy Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% de etanol e 40% de tampão ascorbato (pH 7,0) foi lavada através da coluna com 3 mL/min. A fração de produto em «18 min. (figura 2) foi diretamente coletada no frasco de produto contendo 8,5 mL de base de Formulação (tampão fosfato, ácido ascórbico, PEG400). A HPLC analítica do produto final (figura 3) mostrou excelente pureza radioquímica e química. Apenas 4- [(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N- metilanilina fria foi detectada no cromatograma UV (figura 3, parte inferior), todas as impurezas não radioativas foram separadas. A pureza radioquímica foi determinada como 99,6%.
Exemplo 2 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em Tra- cerlab FXN
[000105] Um sintetizador Tracerlab FXN foi adotado para a "abordagem de HPLC de corte direto" (figura 4).
[000106] Fluoreto[F-18] (3700 MBq) foi capturado em um cartucho QMA. A atividade foi eluída com uma mistura de carbonato de potás- sio/kryptofix/acetonitrila/água no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila. Uma solução de 7 mg de 2a em 1 ml de acetonitrila foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 8 min. a 120°C. Após o resfriamento a 60°C, uma mistura de 0,5 mL 2M de HCI, e 0,5 mL de acetonitrila foi adicionada e o reator foi aquecido a 110°C durante 4 minutos. O produto cru foi neutralizado (1 mL 1 M de NaOH + 2 mL de tampão) e transferido para uma coluna HPLC semipreparativa (Synergy Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% etanol e 40% de tampão ascorbato (pH 7,0) foi lavada através da coluna com 3 mL/min. A fração de produto em «16 min. (figura 2) foi diretamente coletada no frasco de produto contendo 8,5 mL de base de Formulação (tampão fosfato, ácido ascórbico, PEG400). A pureza radioquímica foi determinada como >99%.
Exemplo 3 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em Tra- cerlab MX e unidade de Purificação Eckert&Ziegler
[000107] Um Kit foi montado para a síntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina (Tabela 1). Tabela 1 Composição de Kit para a fabricação de 4-[(E)- 2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em tracerlab MX e unidade de Purificação Eckert&Ziegler
Figure img0016
[000108] O desenho do cassete Tracerlab MX foi adotado (figura 5). Fluoreto[F-18] foi capturado no cartucho QMA. A atividade foi eluída com uma mistura de carbonato de potássio/kryptofix/acetonitrila/água (de "frasco de eluente") no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila. Uma solução de 8 mg de 2a em 1,8 ml de acetonitrila (acetonitrila de "frasco de tampa azul" foi adicionado a 2a sólido no "frasco de tampa vermelha" durante a sequência) foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120°C. 1,5M de HCI (do "frasco de tampa verde") foi adicionado e o reator foi aquecido a 110°C durante 5 minutos. O produto cru foi neutralizado (1 mL 1M de NaOH + 0,3 mL de tampão, de "seringa de 2 mL") e transferido para a válvula de injeção da HPLC Eckert&Ziegler (figura 6) pela bomba de seringa esquerda do módulo MX. O produto cru foi purificado em uma coluna HPLC Synergy Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex utilizando uma mistura de 60% de etanol e 40% de tampão ascorbato (pH 7,0). A fração de produto em «17,5 min. (figura 2) foi diretamente coletada no frasco de produto contendo 8,5 mL de base de Formulação (tampão fosfato, ácido ascórbico, PEG400).
Exemplo 4 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em Ec-kert&Ziegler modular lab
[000109] A síntese foi realizada em um sintetizador Eckert&Ziegler ModularLab utilizando acetonitrila como solvente para fluoração. A configuração do sintetizador e os resultados são resumidos na Tabela 2. Fluoreto[F-18] foi capturado em um cartucho QMA (C1). A atividade foi eluída com uma mistura de kryptofix (de "V1") no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de 100 pL de acetonitrila (de "V2"). A solução de precursor 2a (de "V3") foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120°C. Após o resfriamento a 40°C, 2 ml_ 1,5M de HCI (de "V4") foram adicionados e a solução foi aquecida durante 5 min. a 110°C.
[000110] A mistura de produto cru foi diluída com 1,2 ml_ 2M de Na- OH e 0,8 ml_ de formato de amónio (1 M) de frasco "V5" e então transferida para o frasco HPLC ("Frasco de Mistura") contendo anteriormente 1 mL de acetonitrila e 0,5 mL de etanol.
[000111] A mistura foi transferida para o sistema de injeção de amostra de 10 mL da HPLC semipreparativa utilizando uma sobrepressão de nitrogênio no frasco HPLC ("Frasco de Mistura") e através de um sensor de líquido que controla o final do carregamento. A mistura é carregada na coluna HPLC semipreparativa (Synergi Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% de etanol e 40% de tampão ascorbato foi lavada através da coluna com 6 mL/min. A fração de produto em « 7 min. foi diretamente coletada no frasco de produto contendo 15 mL de base de Formulação (que consiste em tampão fosfato, PEG400 e ácido ascórbico). A HPLC analítica do produto final mostrou excelente pureza radioquímica e química. Nenhuma impureza maior do que 0,3 pg/mL foi quantificada. Tabela 2
Figure img0017
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Exemplo 5 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em tra- cerlab MX e unidade de purificação Eckert&Ziegler
[000112] A síntese foi realizada em um sintetizador GE TracerLab MX, a purificação de 4 foi realizada na Unidade de Purificação Eckert &Ziegler. O carregamento do sistema de injeção da HPLC foi controlado utilizando a seringa do módulo MX. A configuração de autômatos e os resultados estão resumidos na Tabela abaixo. Fluoreto[F-18] foi capturado em um cartucho QMA (C1). A atividade foi eluída com uma mistura de kryptofix (de "V1") no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila (de "V2"). A solução de precursor 2a (de "V3") foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120°C. Após o resfriamento a 40°C, 2 mL 1,5M de HCI (de "V4") foram adicionados e a solução foi aquecida durante 5 min. a 110°C.
[000113] A mistura de produto cru foi diluída com 1,2 mL 2M de NaOH e 0,8 mL de formato de amónio (1 M) de seringa "S1 " e então transferida para o frasco HPLC ("Frasco de Mistura ") em que 1 mL de acetonitrila (de "V2") e 0,5 mL de etanol (de "V5") são adicionados separadamente.
[000114] A mistura média de 6 a 7 mL foi transferida para uma seringa de 30 mL que então introduziu a totalidade do volume no sistema de injeção de amostra de 10 mL da HPLC semipreparativa. A mistura é carregada na coluna HPLC semipreparativa (Synergi Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% de etanol e 40% de tampão ascorbato foi lavada através da coluna com 6 mL/min. A fração de produto em « 9 min. foi coletada durante 50 seg. diretamente no frasco de produto contendo 15 mL de base de Formulação (que consiste em tampão fosfato, PEG400 e ácido ascórbico). A HPLC analítica do produto final mostrou excelente pureza radioquímica e química. Nenhuma impureza maior do que 0,5 pg/mL foi quantificada. Tabela 3
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Exemplo 6 Síntese de radiossíntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em tra- cerlab MX e unidade de Purificação Eckert&Ziegler
[000115] A síntese foi realizada em um sintetizador GE TracerLab MX, a purificação de 4 foi realizada na unidade de Purificação Eckert &Ziegler. O carregamento do sistema de injeção da HPLC foi controlado por um detector de fluido da unidade de Purificação Eckert&Ziegler. A configuração de ambos os autômatos e os resultados estão resumidos na Tabela abaixo. Fluoreto[F-18] foi capturado em um cartucho QMA (C1). A atividade foi eluída com uma mistura de kryptofix (de "V1") no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila (de "V2"). A solução de precursor 2a (de "V3") foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120°C. Após o resfriamento a 40°C, 2 mL 1,5M de HCI (de "V4") foram adicionados e a solução foi aquecida durante 5 min. a 110°C.
[000116] A mistura de produto cru foi diluída com 1,2 mL 2M de Na- OH e 0,8 mL de formato de amónio (1 M) de seringa "S1. 1 ml de acetonitrila (de "V2") e 0,5 mL de etanol (de "V5") são adicionados separadamente à mistura e então transferidos para a seringa do lado direito do autômato GE TracerLab MX.
[000117] A mistura foi transferida para o sistema de injeção de amostra de 10 mL da HPLC semipreparativa utilizando a seringa do lado direito do autômato GE TracerLab MX através de um sensor de líquido que contra o final do carregamento. A mistura foi carregada na coluna HPLC semipreparativa (Synergi Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% de etanol e 40% de tampão ascorbato foram lavados através da coluna com 6 mL/min. A fração de produto em * 9 min. foi diretamente coletada durante 50 seg. no frasco de produto contendo 15 mL de base de Formulação (que consiste em tampão fosfato, PEG400 e ácido ascórbico). A HPLC analítica do produto final mostrou excelente pureza radioquímica e química. Nenhuma impureza maior do que 0,7 pg/mL foi quantificada. Tabela 4
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Exemplo 7 Influência de método de purificação sobre a pureza radioquímica
[000118] Uma série de sínteses de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N- metilanilina foi realizada em dois sintetizadores diferentes (Eckert &Ziegler modular lab e GE tra- cerlab MX) como geralmente descrito nos Exemplos 1, 3-6. As radio- marcações foram realizadas utilizando 4 a 10 mg de precursor 2a em acetonitrila bem como em uma mistura de terc-amilálcool/acetonitrila a 100-120°C durante 10 a 20 min. (no caso de radiomarcações em terc- amilálcool, o solvente foi evaporado antes da desproteção). O grupo de proteção N-Boc foi removido por aquecimento com HCI (1,5M - 2M).
[000119] As misturas de produto cru foram individualmente purificadas por um dos dois métodos A) ou B).
Método A):
[000120] A mistura de produto cru obtida após a desproteção é neu-tralizada com uma mistura de 2M de NaOH e 0,1 M de formato de amónio e injetada em uma HPLC semipreparativa (por exemplo, coluna: Gemini C18, 10x250mm, 5pm, Phenomenex; solvente: 70% de acetonitrila, 30% de tampão formato de amónio 0,1 M com 5 mg/mL de ascorbato de sódio, taxa de fluxo 3 mL/min). A fração de produto é coletada em um frasco contendo aproximadamente 160 mL de água com 10 mg/mL de ascorbato de sódio. A mistura é passada através de um cartucho C18 (tC18 SepPak environmental, Waters). O cartucho é la- vado com aproximadamente. 8-10 mL 20% de EtOH em água (contendo 10 mg/mL de ascorbato de sódio). Por fim, o produto é eluído com 1,5 a 3 mL de etanol em um frasco contendo 8,5 a 17 mL de "base de Formulação" (compreendendo PEG400, tampão fosfato e ácido ascór- bico).
Método B):
[000121] A mistura de produto cru obtida após a desproteção é neu-tralizada com uma mistura de 2M de NaOH e 0,1 M de formato de amónio e injetada em uma HPLC semipreparativa (por exemplo, coluna: Gemini C18, 10x250mm, 5pm, Phenomenex ou Synergi Hydro-RP, 250x10mm, 10 pm 80A, Phenomenex ou Synergi Hydro-RP, 250x10mm, 4 pm 80A, Phenomenex; solvente: 60-70% de etanol, 40- 30% de tampão ascorbato « 5 mg/mL de ascorbato; fluxo 3 mL/min ou 4 mL/min ou 6 mL/min). A fração de produto é diretamente coletada em um frasco contendo a "base de Formulação" (que compreende PEG400, tampão fosfato e ácido ascórbico) para obter 10 a 24 mL da Formulação final. O tempo de corte de pico foi ajustado no software para obter uma Formulação que compreende 15% de EtOH.
[000122] Cada quadrado vazio (cada resultado de uma síntese que compreende uma purificação por método A, 110 experimentos) e cada ponto preenchido (cada resultado de uma síntese que compreende uma purificação por método B, 105 experimentos) na figura 9 representa um experimento individual para a fabricação de 4-[(E)-2-(4-{2-[2- (2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]-etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina. A tendência de pureza radioquímica em correlação com a radioatividade do produto final é ilustrada por linhas de tendência lineares.
[000123] A pureza radioquímica obtida após a HPLC com a reformulação por SPE (método A) varia significativamente (figura 9, quadrados vazios). Especialmente em níveis radioativos superiores (>20 GBq), a pureza radioquímica geralmente é ainda <95%.
[000124] Em contrapartida, a variabilidade é muito menor no método B). Purezas radioquímicas consistentemente altas >95% foram obtidas em níveis de radioatividade do produto maiores do que 50 GBq e ainda maiores do que 100 GBq (figura 9, pontos preenchidos). Exemplo 8 Síntese de 4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina em Tra- cerlab FXN
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4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)piridin-3-il]-N-metilanilina
[000125] Um sintetizador Tracerlab FXN foi adotado para a "abordagem de HPLC de corte direto" (figura 4).
[000126] Fluoreto[F-18] (10 GBq) foi capturado em um cartucho a QMA. A atividade foi eluída com uma mistura de carbonato de potás- sio/kryptofix/acetonitrila/água no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila. Uma solução de 8 mg de 2b em 1,5 ml de acetonitrila foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120 °C. Após o resfriamento a 60 °C, 1 mL 1,5M de HCI foi adicionada e o reator foi aquecido a 110 °C durante 5 minutos. O produto cru foi neutralizado (1 mL 1 M de Na- OH/formato de amónio) e diluído (com 0,5 mL de EtOH e 1,5 mL de MeCN) e transferido para uma coluna HPLC semipreparativa (Synergy Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% etanol e 40% de tampão ascorbato (5 g/l de ascorbato de sódio e 50 mg/. De ácido ascórbico, pH 7,0) foi lavada através da coluna com 3 mL/min. A fração de produto em «10 min. (veja figura 10) foi diretamente coletada durante 100 seg. e misturada com 15 mL de base de Formulação (tampão fosfato, ácido ascórbico, PEG400).
[000127] 4,2 GBq (42% não corrigidos para decaimento) foram obtidos em um tempo de síntese total de 61 minutos. A pureza radioquímica (determinada por HPLC, tR = 3,42 min) foi determinada como > 99%. Exemplo 9 Síntese de 4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F- 18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina em Tracerlab FXN
Figure img0024
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]fluoroetóxi)etóxi]- etóxi}fenil)vinil]-N-metilanilina
[000128] Um sintetizador Tracerlab FXN foi adotado para a "abordagem de HPLC de corte direto" (figura 4).
[000129] Fluoreto[F-18] (10 GBq) foi capturado em um cartucho a QMA. A atividade foi eluída com uma mistura de carbonato de potás- sio/kryptofix/acetonitrila/água no reator. O solvente foi removido enquanto aquecido sob fluxo de nitrogênio moderado e vácuo. A secagem foi repetida após a adição de acetonitrila. Uma solução de 8 mg de 2c em 1,5 ml de acetonitrila foi adicionada ao resíduo seco e a mistura foi aquecida durante 10 min. a 120 °C. Após o resfriamento a 60°C, o produto cru foi diluído com 4 mL de eluente de HPLC e transferido para uma coluna HPLC semipreparativa (Synergy Hydro-RP, 250x10mm, Phenomenex). Uma mistura de 60% etanol e 40% de tampão ascorbato (5 g/l de ascorbato de sódio e 50 mg/. De ácido as- córbico, pH 7,0) foi lavada através da coluna com 3 mL/min. A fração de produto em «12 min. foi diretamente coletada durante 100 seg. e misturada com 15 mL de base de Formulação (tampão fosfato, ácido ascórbico, PEG400).
[000130] 2,54 GBq (37% não corrigidos para decaimento) foram obtidos em um tempo de síntese total de 53 minutos. A pureza radioquímica (determinada por HPLC, tR = 3,78 min) foi determinada como > 99%.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[000131] Figura 1 Configuração de Tracerlab FXN para purificação com a reformulação (adotada pelo software tracerlab).
[000132] Figura 2 Cromatograma de purificação utilizando a coluna Synergy em Eckert&Ziegler modular lab (Canal de radioatividade).
[000133] Figura 3 HPLC analítica de produto radiomarcado (canal de radioatividade superior, canal UV inferior).
[000134] Figura 4 Configuração de Tracerlab FXN para purificação sem a reformulação (adotada pelo software tracerlab).
[000135] Figura 5 Configuração de Tracerlab MX (adotada pelo software Coincidence FDG).
[000136] Figura 6 Configuração de unidade de purificação Ec- kert&Ziegler (adotada pelo software Modular-Lab).
[000137] Figura 7 Ilustração esquemática de processo e equipamento para a fabricação de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluorope- guiladas marcadas com F-18 que compreendem três partes: A) Síntese, B) HPLC, C) Formulação; inclusive (1) frascos para reagentes e solventes, (2) um recipiente de reação, (3) linha de destino para F-18, opcionalmente linhas de gases, ect. de vácuo, (4) opcionalmente detector de fluido ou ect. do filtro., (5) válvula de injeção, (6) coluna HPLC, (7) válvula para corte de pico, (W) linha(s) residual(is), (8) recipiente para coleta/diluição de fração HPLC, (9) frascos de solvente para lavagem e eluição, (10) válvula, (11) cartucho, por exemplo, cartucho C18 para captura do produto, (12) válvula.
[000138] Figura 8 ilustração esquemática de processo e equipamento para a fabricação de (aril/heteroaril vinil)-fenil metil aminas fluorope- guiladas marcadas com F-18 que compreendem duas partes: A) Síntese, B) HPLC; inclusive (1) frascos para reagentes e solventes, (2) um recipiente de reação, (3) linha de destino para F-18, opcionalmente linhas de gases, ect. de vácuo , (4) opcionalmente detector de fluido ou ect. do filtro, (5) válvula de injeção, (6) coluna HPLC, (7) válvula para corte de pico.
[000139] Figura 9 Influência de método de purificação sobre a pureza radioquímica.
[000140] Figura 10 Cromatograma de purificação de 4-[(E)-2-(6-{2-[2- (2-[F-18]fluoro-etóxi)etóxi]etóxi}piridin-3-il)vinil]-N-metilanilina em Ec-kert&Ziegler modular lab (Canal de radioatividade).

Claims (10)

1. Método para a produção de um composto da Fórmula I
Figure img0025
i caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: Etapa 1: radiomarcação de composto da Fórmula II com um agente de fluoração F-18, para obter o composto da Fórmula I, se R = H ou para obter o composto da Fórmula III, se R = PG
Figure img0026
Etapa 2: se R = PG, clivagem do grupo de proteção PG para obter o composto da Fórmula I Etapa 3: Purificação e Formulação do composto da Fórmula I em que: n = 1-6, X é selecionado dentre o grupo que consiste em (a) CH, (b)N, R é selecionado dentre o grupo que consiste em (a)H, (b) PG, PG é um "grupo de proteção amina", LG é um grupo de saída, em que na etapa 3 um método de HPLC é usado, em que o solvente para HPLC ou mistura de solventes é parte de uma formulação injetável do composto I adequada para injeção em humanos, em que o solvente para HPLC é selecionado dentre o grupo consistindo em etanol, um tampão aquoso ou uma mistura de etanol/tampão aquoso.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que PG é selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) Boc, (b) Tritila e (c) 4-Metoxitritila.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que LG é selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) Halogênio e (b) Sulfoniloxi, Halogênio é cloro, bromo ou iodo.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que Sulfoniloxi é selecionado dentre o grupo que compreende: (a) Metanosulfoniloxi, (b) p-Toluenosulfoniloxi, (c) (4-Nitrofenil)sulfoniloxi, (d) (4-Bromofenil)sulfoniloxi.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que n = 3 e X = CH.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que n = 3, X = CH, R = Boc, e LG = Metanosulfoniloxi.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o tampão aquoso é selecionado dentre o grupo de soluções de cloreto de sódio, tampão fosfato de sódio, ácido ascórbico, tampão ascorbato, ou misturas desses.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o solvente para HPLC é selecionado dentre o grupo que consiste em etanol e um tampão aquoso compreendendo ácido ascórbico ou tampão ascorbato ou misturas desses.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que 10-50 pmol de um composto da Fórmula II são usados.
10.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o método é realizado como um processo completamente automático.
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