BR112012009289B1 - método para purificar um anticorpo anti-il-13 a partir de uma mistura de amostra que compreende um anticorpo anti-il-13 e pelo menos uma proteína de célula hospedeira (hcp) - Google Patents

Abstract

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-IL-13 COM O USO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM PROTEÍNA A Trata-se de métodos para o isolamento e purificação de anticorpos anti -IL-13, em que o uso de uma etapa cromatográfica de afinidade resulta em uma composição de anticorpo suficientemente pura para usos farmacêuticos. Os métodos descritos no presente documento compreendem redução/inativação viral de pH, utrafiltração/diafiltração, cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A), cromatografia de troca iônica, e cromatografia hidrofóbica. Adicionalmente, a presente invenção está direcionada a composições farmacêuticas que compreendem um ou mais anticorpos da presente invenção.

Description

Referência cruzada ao pedido relacionado

[001]Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. no. serial 61/253.411, depositado em 20 de outubro de 2009, o qual está aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

Fundamentos da invenção

[002]A IL- 13 humano é uma glicoproteína 17-kDa clonada a partir de células T ativadas e é produzida por células T ativadas da linhagem Th2, ThO e Thl células T CD4+, células CD8+, e várias populações de células não-T, tais como mastócitos. (Zurawski e de Vries, 1994 Immunol Today, 15, 19-26). A IL-13 promove a comuta- ção do isotipo de imunoglobulina para IgE em células B humanas (Punnonen, Aver- sa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4) e suprime a produção de citocina inflamatória tanto em humanos como camundongos (de Waal Malefyt et al., 1993, J Immunol, 11,6370- 81 ; Doherty et al., 1993, J Immunol, 151, 7151 -60). A IL-13 se liga aos seus receptores de superfície de célula, IL-13Rα1 e IL-13Rα2. O IL-13Rα1 interage com a IL-13 com uma baixa afinidade (KD ~ 10 nM), seguido pelo recruta- mento de IL-4R para formar o complexo de receptor heterodimérico de sinalização de alta afinidade (KD ~ 0,4 nM) (Aman et al., 1996, J Biol Chem, 271,29265-70; Hil- ton et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 497-501). O complexo IL-4P/IL-13Rα1 é expresso em muitos tipos de células, tais como células B, monócito/macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais das vias aéreas e células do músculo liso das vias aéreas (Graber et al., 1998, Eur J Immunol, 28, 4286- 98; Murata et al., 1998, Int Immunol, 10, 1103-10; Akaiwa et al., 2001, Citocina, 13, 75-84). A ligação do complexo de receptor de IL- 13Rα1/IL-4R resulta na ativação de uma variedade de vias de transdução de sinal que incluem o transdutor de sinal e ativador de transcrição (ST AT6) e as vias de substrato de receptor de insulina 2 (IRS-2) (Wang et al, 1995, Blood, 864218-27; Ta- keda et al., 1996, J Immunol, 157, 3220-2). A cadeia de IL-13Rα2 sozinha tem uma alta afinidade (KD ~ 0,25 a 0,4 nM) para IL-13 e funciona tanto como um receptor de armadilha que regula negativamente a ligação de IL-13 (Donaldson et al., 1998, J Immunol, 161, 2317-24) como um receptor de sinalização que induz a síntese de TGF-β e fribose através da via AP-I em macrófagos e possivelmente outros tipos de célula (Fichtner- Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

[003]Vários estudos conduzidos em modelos de animal pré-clínicos para asma indicam que a IL-13 desempenha um papel importante na asma. Estes dados incluem a resistência à asma em camundongos nocaute de IL-13, assim como a ini- bição do fenótipo da asma com antagonistas de IL- 13 (receptores de IL-13 solúveis, anti-IL-13 mAbs, etc.) em diversos modelos de camundongo (Wills- Karp e Chiara- monte, 2003, Curr Opin Pulm Med, 9 21-7; Wills- Karp, 2004, Immunol Rev, 202 175- 90). Múltiplos estudos têm demonstrado que a administração farmacológica de IL- 13 recombinante aos pulmões de camundongos, assim como porquinhos-da-índia, induz a hipersecreção de muco das vias aéreas, eosinofilia e hiperresponsividade das vias aéreas ("AHR"; Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261-3; Wills-Karp et al., 1998, Science, 282, 2258-61; Kibe et al, 2003, Am J Respir Crit Care Med, 167, 50- 6; Vargaftig e Singer, 2003, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L260-9; Varga- ftig e Singer, 2003, Am J Respir Cell Mol Biol, 28, 410-9). Estes efeitos da IL-13 são reproduzidos em sistemas de camundongo transgênico com expressão constitutiva ou induzível da IL-13 (Zhu et al., 1999, J Clin Invest, 103, 779-88; Zhu et al., 2001, Am J Respir Crit Care Med, 164, S67- 70; Lanone et al., 2002, J Clin Invest, 110463- 74). A superexpressão transgênica crônica da IL- 13 também induz à fibrose subepi- telial e enfisema. Os camundongos deficientes na molécula de sinalização de IL- 13 (e IL- 4) STAT6 deixam de desenvolver AHR induzido por alergênio e superprodução de muco (Kuperman et al, 2002, Nat Med, 8, 885-9). Os estudos que utilizam a pro- teína de fusão de receptor de IL- 13 solúvel (sIL-13Rα2Fc) têm demonstrado o papel essencial desta citocina em doença das vias aéreas induzida por (OVA) ovalbumina de alergênio experimental (Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261-3; Wilis-Karp et al., 1998, Science, 282, 2258-61 ; Taube et al., 2002, J Immunol, 169, 6482-9). A eficácia do tratamento de anti-IL-13 também foi demonstrada em um modelo crônico de asma murídea. Em adição à exibição de características de hipersecreção de mu- co e AHR, este modelo de asma crônica demonstra vários atributos da doença hu- mana que estão ausente nos modelos mais agudos. Estes incluem a eosinofilia do tecido do pulmão localizado em espaços inter-epiteliais, assim como a fibrose de músculo liso, conforme medido pelos aumentos na deposição de colágeno. O mode- lo de asma crônica é induzido com provocações de aerossol repetidas com OVA em camundongos sensíveis à OVA 1x/semana por um total de 4 semanas. O anticorpo anti-IL-13 administrado para as 2 semanas finais de provocações de OVA (a partir do dia 36 com leituras de eficácia avaliadas no dia 53 do estudo) inibiu significante- mente a AHR, inflamação pulmonar, hiperplasia de célula caliciforme, hipersecreção de muco e fibrose das vias aéreas (Yang et al., 2005, J Pharmacol Exp Ther, 313, 8- 15). A IL- 13 está envolvida na patogênese de asma humana à medida que os níveis elevados de mRNA e proteína de IL- 13 têm sido detectados em pulmões de pacien- tes asmáticos, os quais se corelacionam com a severidade da doença (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94). Além disso, os polimorfismos genéticos de IL- 3 humana, os quais conduzem a níveis elevados de IL-13, têm sido identificados e es- tão associados com a asma e atopia (Heinzmann et al., 2000, Hum Mol Genet, 9, 549-59; Hoerauf et al, 2002, Microbes Infect, 4, 37-42; Vercelli, 2002, Curr Opin Al- lergy Clin Immunol, 2, 389-93; Heinzmann et al., 2003, J Allergy Clin Immunol, 112, 735-9; Chen et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 553-60; Vladich et al., 2005, J Clin Invest, 115, 747-54), e níveis elevados de IL- 13 têm sido detectados no pulmão de pacientes de asma (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94; Arima et al., 2002, J Allergy Clin Immunol, 109, 980-7; Berry et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 1106-9). Uma linhagem genética entre IL-13 e asma também tem sido demons- trada , à medida que os indivíduos com um polimorfismo no gene IL-13 que causa níveis de plasma de IL-13 maiores têm um risco aumentado para atropia e asma (Wills-Karp, 2000, Respir Res, 1, 19-23).

[004]Devido ao papel da IL- 13 humana em uma variedade de distúrbios humanos, têm sido projetadas estratégias terapêuticas para inibir ou neutralizar a atividade de IL-13. Em particular, tem sido procurado anticorpos que se ligam a, e neutralizam, a IL-13 como um meio para inibir a atividade de IL-13. No entanto, exis- te uma necessidade na técnica por métodos aperfeiçoados de produção e purifica- ção de tais anticorpos para o uso farmacêutico. A presente invenção se dirige a esta necessidade.

Sumário da invenção

[005]Em determinadas modalidades, a presente invenção está direcionada a anticorpos e fragmentos de anticorpo purificados, isolados que se ligam a IL-13, as- sim como composições farmacêuticas que compreendem tais anticorpos e fragmen- tos. Em determinadas modalidades, a invenção pertence a anticorpos isolados ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, que se ligam a IL-13 humana. Os anti- corpos anti-IL-13 isolados da presente invenção podem ser usados em um ambiente clínico, assim como em pesquisa e desenvolvimento. Em determinadas modalida- des, a presente invenção está direcionada a um anticorpo anti-IL-13 que compreen- de as sequências de cadeia leve e pesada identificadas na Figura 1.

[006]Determinadas modalidades da invenção estão direcionadas para méto- dos de purificação de anticorpos anti-IL-13, ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, a partir de uma matriz de amostra para fornecer os anticorpos substanci- almente livres de proteínas de célula hospedeira ("HCPs") e proteína A lixiviada. Em determinados aspectos, a matriz de amostra (ou simplesmente "amostra") compre- ende uma linha de célula empregada para produzir anticorpos anti-IL-13 da presente invenção. Em aspectos particulares, a amostra compreende uma linha de célula usada para produzir anticorpos anti-IL-13 humanos.

[007]Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece um méto- do de purificação de anticorpos de IL-13 que compreende uma etapa de recupera- ção primária para, entre outras coisas, remover células e fragmentos celulares. Em determinadas modalidades do método, a etapa de recuperação primária inclui uma ou mais etapas de filtração de profundidade ou centrifugação. Por exemplo, e não como forma de limitação, tais etapas de centrifugação podem ser executadas em aproximadamente 7000 x g a aproximadamente 11.000 x g. Além disso, determina- das modalidades do método descrito acima incluem uma etapa de filtração de pro- fundidade, tal como uma etapa de filtração de profundidade delipid (remoção de lipí- dios).

[008]Em determinadas modalidades, a amostra de recuperação primária é submetida a uma etapa de cromatografia de afinidade. A etapa de cromatografia de afinidade compreende submeter a amostra de recuperação primária a uma coluna que compreende um suporte cromatográfico de afinidade adequado. Os exemplos não limitadores de tais suportes cromatográficos incluem, mas não se limitam a, re- sina de proteína A, resina de proteína G, suportes de afinidade que compreendem o antígeno contra o qual o anticorpo de interesse foi destacado, e suportes de afinida- de que compreendem uma proteína de ligação Fc. A resina de proteína A é útil para a purificação de afinidade e isolamento de anticorpos (IgG). Em um aspecto, uma coluna de proteína A é equilibrada com um tampão adequado antes do carregamen- to de amostra. Um exemplo de um tampão adequado é um tampão de Tris/NaCl, pH em torno de 7,2. Após esta equilibração, a amostra pode ser carregada na coluna. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes com o uso, por exemplo, do tampão de equilíbrio. Outras lavagens que incluem as lavagens que empregam diferentes tampões podem ser usadas antes da eluição da coluna. A coluna de proteína A pode ser, então, eluída com o uso de um tampão de eluição adequado. Um exemplo de um tampão de eluição adequado consiste em um tampão de ácido acético/NaCl, pH em torno de 3,5. O eluído pode ser monitorado com o uso de técnicas bem conhecidas pelos elementos versados na técnica. Por exemplo, a absorbância em OD280 pode ser seguida. A(s) fração(ões) eluída(s) de interesse podem ser, então, preparadas para o processamento adicional.

[009]Em determinadas modalidades da presente invenção, uma etapa de ajuste de pH baixo segue a cromatografia de afinidade de proteína A. Em tais moda- lidades, o eluído de proteína A que compreende o suposto anticorpo anti-IL-13, ou parte de ligação de antígeno do mesmo, é submetido a um ajuste de pH para um pH de cerca de 3 a cerca de 4. Em determinados aspectos, o pH é ajustado para cerca de 3,5. O pH baixo, entre outras coisas, promove a redução e/ou inativação de vírus sensíveis ao pH que podem estar contaminando da amostra. Após um período de tempo adequado, o pH é ajustado para entre cerca de 4,5 e cerca de 6,0, que inclui, mas não se limita a, cerca de 5,0, e a amostra é submetida a etapas de purificação adicionais.

[0010]Em determinadas modalidades, um etapa de troca iônica segue a cromatografia de afinidade de proteína A ou uma etapa de ajuste de pH baixo. Esta etapa de troca iônica pode consistir em troca de cátion ou ânion ou uma combinação sequencial de ambas. Esta etapa pode consistir em um único procedimento de troca iônica ou pode incluir múltiplas etapas de troca iônica, tais como uma etapa de troca catiônica seguida por uma etapa de troca aniônica ou vice-versa. Em um aspecto, a etapa de troca iônica consiste em um procedimento de uma etapa. Em outro aspec- to, a etapa de troca iônica envolve um processo de troca iônica de duas etapas. Uma coluna de troca catiônica é uma coluna cuja fase estacionária compreende grupos aniônicos. Um exemplo de tal coluna é um Fractogel™ SO3-. Esta etapa de cromatografia de captura de troca iônica facilita o isolamento de anticorpos a partir de uma amostra. Uma coluna de troca aniônica adequada consiste em uma coluna cuja fase estacionária compreende grupos catiônicos. Um exemplo de tal coluna consiste em uma coluna Q Sepharose™. Uma alternativa é um cartucho de mem- brana Pall Mustang Q. Uma ou mais etapas de troca iônica isolam, adicionalmente, os anticorpos mediante a redução de impurezas, tais como, proteínas de célula hos- pedeira e DNA, e, onde aplicável, proteína de matriz de afinidade. Este procedimen- to de troca aniônica é um modo de fluxo contínuo de cromatografia em que os anti- corpos de interesse não interagem ou se ligam à resina de troca aniônica (ou fase sólida). No entanto, muitas impurezas não interagem e se ligam à resina de troca aniônica. Em um aspecto particular, a etapa de troca iônica consiste em cromatogra- fia de troca aniônica.

[0011]O eluído de cromatografia de afinidade é preparado para a cromato- grafia de troca iônica mediante o ajuste do pH e intensidade iônica do tampão da amostra. Por exemplo, o eluído de afinidade pode ser ajustado para um pH de cerca de 4,5 a cerca de 8,5 em um tampão de 1 M Tris. Antes do carregamento da amos- tra (o eluído de afinidade) na coluna de troca iônica, a coluna pode ser equilibrada com o uso de um tampão adequado. Um exemplo de um tampão adequado consiste em um tampão de Tris NaCl com um pH de cerca de 4,5 a cerca de 8. Após a equili- bração, a coluna pode ser carregada com o eluído de afinidade. Após o carregamen- to, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes com um tampão adequado. Um exemplo de um tampão adequado consiste no próprio tampão de equilibração. A coleta de fluxo contínuo pode começar, por exemplo: à medida que a absorbância (OD280) se eleva acima de cerca de 0,2 AU.

[0012]Em determinadas modalidades, uma primeira e segunda etapa de tro- ca iônica é executada após a recuperação primária ou, de outra forma, na ausência de uma etapa de cromatografia de afinidade. Em determinadas modalidades, a amostra de troca iônica é submetida a uma etapa de filtração intermediária, antes da primeira etapa de troca iônica, entre as duas etapas de troca iônica, ou ambas. Em determinados aspectos, esta etapa de filtração compreende a ultrafiltra- ção/diafiltração de captura ("UF/DF"). Entre outras coisas, tal filtração facilita a con- centração e troca de tampão de anticorpos anti-IL-13 e partes de ligação de antíge- no dos mesmos.

[0013]Determinadas modalidades da invenção fornecem um método que compreende uma ou mais etapas de cromatografia interativa hidrofóbica ("HIC"). Uma coluna de HIC adequada consiste em uma cuja fase estacionária compreende grupos hidrofóbicos. Um exemplo não limitador de tal coluna consiste em uma colu- na Fenil HP Sepharose™. Em determinadas circunstâncias, os anticorpos anti-IL-13 irão formar agregados durante o processo de isolamento/purificação. A inclusão de uma ou mais etapas de HIC facilita a redução ou eliminação de tais agregações. A HIC também ajuda na remoção de impurezas. Em determinadas modalidades, a etapa de HIC emprega um tampão de alto teor de sal para promover a interação dos anticorpos anti-IL-13 (ou agregações dos mesmos) com a coluna hidrofóbica. Os anticorpos anti-IL-13 podem ser, então, eluídos com o uso de concentrações meno- res de sal.

[0014]Em determinadas modalidades, o eluído de HIC é filtrado com o uso de um filtro de remoção viral, tal como, mas não se limita a, um filtro Ultipor DV50™ (Pall Corporation, East Hills, N.Y.). Os filtros alternativos, tais como filtros Viresol- ve™ (Millipore, Billerica, Mass.); filtros Zeta Plus VR™ (CUNO; Meriden, Conn.) e filtros Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, 111.), tam- bém podem ser usados em tais modalidades.

[0015]Em determinadas modalidades, a invenção está direcionada a uma ou mais composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-IL-13 isolado ou parte de ligação de antígeno do mesmo e um veículo aceitável. Em um aspecto, a composição compreende, adicionalmente, um ou mais anticorpos ou parte de liga- ção de antígeno dos mesmos em adição ao anticorpo anti-IL-13. Em outro aspecto, as composições compreendem, adicionalmente, um ou mais agentes farmacêuticos.

[0016]A pureza dos anticorpos de interesse no produto de amostra resultan- te pode ser analisada com o uso de métodos bem conhecidos pelos elementos ver- sados na técnica, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, ensaio de HPLC Poros™ A, HCP ELISA, proteína A ELISA, e análise de western blot.

Breve descrição dos desenhos

[0017]A Figura 1 apresenta as sequências de região variável de cadeia pe- sada e leve de um exemplo não limitador de um anticorpo anti-IL-13.

[0018]A Figura 2 apresenta um fluxograma de processo de cultura de célula exemplificador, que inclui pontos de ajuste, testes de controle durante o processo e limites de ação.

[0019]A Figura 3 apresenta uma comparação de estratégias de fluxo de pro- cesso de cultura de célula alternativas.

[0020]A Figura 4 apresenta um fluxograma do processo de cromatografia de captura de recuperação primária, que inclui pontos de ajuste, testes de controle du- rante o processo e limites de ação.

[0021]A Figura 5 apresenta uma comparação de estratégias de fluxo de cap- tura e recuperação primária alternativas.

[0022]A Figura 6 apresenta um fluxograma de processo de purificação fina, que inclui pontos de ajuste, testes de controle durante o processo e limites de ação.

[0023]A Figura 7 apresenta uma comparação de estratégias de fluxo de puri- ficação fina alternativas.

Descrição detalhada da invenção

[0024]A presente invenção está direcionada a anticorpos que se ligam a IL- 13. Em um aspecto, a invenção pertence a anticorpos isolados, ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, que se ligam a IL-13 humana. O anticorpo anti-IL-13 iso- lado da presente invenção pode ser usado em um ambiente clínico, assim como em pesquisa e desenvolvimento. A presente invenção também pertence a métodos para a purificação de anticorpos anti-IL- 13, ou partes de ligação de antígeno dos mes- mos. Os anticorpos anti-IL-13 adequados que podem ser purificados no contexto da presente invenção são apresentados no pedido PCT no. PCT US2007/019660, o qual está aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade, que incluem o anticorpo que tem sido subsequentemente identificado como ABT-308. As sequên- cias exemplificadoras de cadeia leve e pesada do anticorpo anti-IL-13 são apresen- tadas na Figura 1. A presente invenção também se refere a composições farmacêu- ticas que compreendem os anticorpos anti-IL-13 ou partes de ligação de antígeno dos mesmos descritos no presente documento. Para clareza e não como forma de limitação, esta descrição detalhada é di- vidida nas seguintes subpartes: 1. Definições; 2. Geração de anticorpo; 3. Produção de anticorpo; 4. Purificação de anticorpo; 5. Métodos de ensaio da pureza da amostra; 6. Modificações adicionais; 7. Composições farmacêuticas; e 8. Usos de anticorpo. 1. Definições

[0025]A fim de que a presente invenção possa ser mais prontamente com- preendida, determinados termos são definidos primeiro.

[0026]O termo "anticorpo" inclui uma molécula de imunoglobulina que com- preende quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreen- de uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicional- mente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determi- nação de complementaridade (CDRs), intercaldas com regiões que são mais con- servadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal ao carboxi-terminal na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0027]O termo "parte de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou "parte de anticorpo") inclui fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, hIL-13). Tem sido mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Os exemplos de fragmentos de ligação incluídos no termo "parte de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que compreende os domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fra- gmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab liga- dos por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que compreende os domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que compreende os do- mínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência), o qual compreende um domínio VH; e (vi) uma isolados região de determinação de complementaridade (CDR). Adicionalmente, embora os dois domí- nios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, com o uso de métodos recombinantes, por um ligante sintético que possibili- ta que os mesmos sejam feitos como uma única cadeia de proteína, na qual as regi- ões VL e VH se unem para formar moléculas monovalentes (conhecidos como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, cujas instruções inte- grais estão aqui incorporadas a título de referência). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a serem incluídos no termo "parte de ligação de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, também são incluídas. Os diacorpos consistem em anticorpos biespecíficos bivalen- tes, nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipep- tídeo, mas com o uso de um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios a parearem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação de antígeno (vide, por exemplo , Holliger, P., et al. ( 1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Estrutura 2: 1 121-1123, cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência). Além disso, um anticorpo ou parte de ligação de antígeno do mesmo pode ser parte de uma molécula de imunoa- desão maior, formada por associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou parte de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Os exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência) e o uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma marcação de polihistidina C-terminal para fazer moléculas de scFv bivalentes e bio- tiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31 : 1047-1058, cuja instru- ção integral está aqui incorporada a título de referência). As partes de anticorpo, tais como fragmento Fab e F(ab’)2, podem ser preparadas a partir de anticorpos totais com o uso de técnicas convencionais, tais como digestão pro papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos totais. Além disso, os anticorpos, partes de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidas com o uso de técnicas de DNA re- combinante padrão, conforme descrito no presente documento. Em um aspecto, as partes de ligação de antígeno consistem em domínios completos ou pares de domí- nios completos.

[0028]A frase "interleucina humana 13" (abreviada no presente documento como hIL-13, ou IL-13), para uso na presente invenção, se refere a uma glicoproteí- na 17-kDa clonada a partir de células T ativadas (Zurawski e de Vries, 1994 Immunol Today 15 19-26) e que é produzida por células T ativadas da linhagem Th2. As célu- las T ThO e Thl CD4+, células T CD8+, e várias populações de célula não-T, tais como mastócitos, também produzem IL-13 (Zurawski e de Vries, 1994 Immunol To- day 15 19-26). A função da IL-13 inclui a promoção da comutação do isotipo de imu- noglobulina para IgE em células B humanas (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4) e supressão da produção de citocina inflamatória tanto em humanos como em camundongos (de Waal et al., 1993 J Immunol 151 6370- 81; Doherty et al., 1993 J Immunol 151 7151-60). A IL-13 se liga aos receptores de su- perfície de célula identificados como IL-13Rα1 e IL-13Rα2. O receptor IL-13Rα1 inte- rage com a IL-13 com uma baixa afinidade (KD ~ 10 nM), seguido pelo recrutamento de IL-4R para formar o complexo de receptor heterodimérico de sinalização de alta afinidade (KD ~ 0,4 nM) (Aman et al., 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton et al., 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 497-501). O complexo IL-4R/IL-13Rα1 é expresso em muitos tipos de células, tais como células B, monócito/macrófagos, células den- dríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais das vias aéreas e células do músculo liso das vias aéreas (Graber et al, 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata et al., 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa et al., 2001 Cytokine 13 75-84). A ligação do complexo de receptor IL-13 Rα1/IL-4R resulta na ativação de uma variedade de vias de transdução de sinal que incluem transdutor de sinal e ativador de transcrição (ST AT6) e as vias de substrato de receptor de in- sulina-2 (IRS-2) (Wang et al., 1995 Blood 864218-27; Takeda et al., 1996 J Immunol 157 3220-2). A cadeia de IL-13Rα2 sozinha tem uma alta afinidade (KD ~ 0,25 a 0,4 nM) para IL-13 e funciona tanto como um receptor de armadilha que regula negati- vamente a ligação de IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1 98 J Immunol 161 2317-24), e como um receptor de sinalização que induz a síntese de TGF-b e fibrose através da via AP-I em macrófagos e possivelmente outros tipos de células (Fichtner-Feigl et al., 2006 Nat Med 12 99- 106). O ácido nucléico que codifica a IL-13 está disponível como número de acesso GenBank NM_002188 e a sequência do polipeptídeo está disponível como número de acesso GenBank NP_002179. O termo IL-13 humana se destina a incluir a IL-13 humana recombinante (rh IL-13), a qual pode ser preparada por métodos de expressão recombinante padrão.

[0029]Os termos "numeração de Kabat", "definições de Kabat" e "rotulação de Kabat" são usados de maneira intercambiável no presente documento. Estes termos, os quais são reconhecidos na técnica, se referem a um sistema de numera- ção de resíduos de aminoácido que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácido na região variável de cadeia leve e pesada de um anticorpo, ou uma parte de ligação de antígeno do mesmo (Kabat et al. ( 1971 ) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 e, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Servi- ces, publicação NIH no. 91-3242, cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência). Para a região variável de cadeia pesada, a região hipervariá- vel se situa na faixa a partir de posições de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posi- ções de aminoácido 50 a 65 para CDR2 e posições de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para a região variável de cadeia leve, a região hipervariável se situa na faixa a partir de posições de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácido 50 a 56 para CDR2 e posições de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

[0030]O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos que têm regiões variável e constante que correspondem às sequências de imunoglobulina de linha germinati- va humana, conforme descrito por Kabat et al. (Vide Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, publicação NIH no. 91-3242). Os anticorpos humanos da invenção podem incluir os resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imuno- globulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mu- tagênese de local específico ou aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. As mutações podem ser introduzidas com o uso da "abordagem de mutagênese seletiva". O anticorpo humano pode ter ao menos uma posição substituída por um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de aminoácido de aumento de atividade que não é codificado pela sequên- cia de imunoglobulina de linha germinativa humana. O anticorpo humano pode ter até vinte posições com resíduos de aminoácido que não são parte da sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em outras modalidades, até dez, até cinco, até três ou até duas posições são substituídas. Em uma modalidade, estas substituições estão dentro das regiões CDR. No entanto, o termo "anticorpo huma- no", para uso na presente invenção, não se destina a incluir anticorpos em que as sequências CDR derivadas a partir da linha germinativa de outra espécie de mamífe- ro, tal como um camundongo, têm sido enxertadas em sequências de estrutura hu- mana.

[0031]A frase "abordagem de mutagênese seletiva" inclui um método de aperfeiçoamento da atividade de um anticorpo mediante a seleção e mutação de forma individual de aminoácidos CDR em ao menos uma posição de mutagênese seletiva adequada, posição de hipermutação e/ou de contato. Um anticorpo humano "seletivamente mutante" consiste em um anticorpo que compreende uma mutação em uma posição selecionada com o uso de uma abordagem de mutagênese seleti- va. Em outro aspecto, a abordagem de mutagênese seletiva se destina a fornecer um método de mutação de preferência de resíduos de aminoácido individuais sele- cionados na CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada (mais adi- ante neste documento H1, H2 e H3, respectivamente), ou a CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia leve (mais adiante neste documento mencionado como L1, L2 e L3, respectivamente) de um anticorpo. Os resíduos de aminoácido podem ser selecionados a partir de posições de mutagênese seletiva, posições de contato ou posições de hipermutação. Os aminoácidos individuais são selecionados com base em sua posição na região variável de cadeia pesada ou leve. Deve-se compre- ender que uma posição de hipermutação também pode consistir em uma posição de contato. Em um aspecto, a abordagem de mutagênese seletiva consiste em uma "abordagem direcionada". A linguagem "abordagem direcionada" se destina a incluir um método de mutação de resíduos de aminoácido individuais selecionados na CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ou na CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia leve de um anticorpo de uma maneira direciona- da, por exemplo, uma "abordagem direcionada ao grupo" ou "abordagem direciona- da a CDR". Na "abordagem direcionada ao grupo", os resíduos de aminoácido indi- viduais, em particular, grupos, são direcionados para mutações seletivas que inclu- em os grupos I (que incluem L3 e H3), II (que incluem H2 e L1) e III (que incluem L2 e H1), sendo que os grupos são relacionados em ordem de preferência para direcio- namento. Na "abordagem direcionada a CDR", os resíduos de aminoácido individu- ais, em particular, CDRs, são direcionados para mutações seletivas com a ordem de preferência para o direcionamento conforme exposto a seguir: H3, L3, H2, L1, H1 e L2. O resíduo de aminoácido selecionado é submetido à mutação, por exemplo, a ao menos dois outros resíduos de aminoácido, e o efeito da mutação sobre a atividade do anticorpo é determinado. A atividade é medida como uma alteração na especifici- dade/afinidade de ligação do anticorpo, e/ou potência de neutralização do anticorpo. Deve-se compreender que a abordagem de mutagênese seletiva pode ser usada para a otimização de qualquer anticorpo derivado a partir de qualquer fonte que in- clui animais transgênicos de exposição em fago (phage display) com genes de linha germinativa de IgG humana, anticorpos humanos isolados a partir de células B hu- manas. A abordagem de mutagênese seletiva pode ser usada em anticorpos que não podem ser otimizados adicionalmente com o uso da tecnologia de exposição em fago. Deve-se compreender que anticorpos a partir de qualquer fonte que incluem animais transgênicos de exposição em fago (phage display) com genes de linha germinativa de IgG humana, anticorpos humanos isolados a partir de células B hu- manas podem ser submetidos à retromutação antes ou após a abordagem de muta- gênese seletiva.

[0032]A frase "anticorpo humano recombinante" inclui anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tal co- mo anticorpos expressos com o uso de um vetor de expressão recombinante trans- fectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpo humano combinatório recombinante, anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglo- bulina humana (vide, por exemplo, Taylor, L, D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve a junção (splicing) e sequências de gene de imunoglobulina humana a ou- tras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões vari- ável e constante derivadas a partir de sequências de imunoglobulina de linha germi- nativa humana (vide, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, pub- licação NIH no. 91-3242). Em determinadas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usados, mutagênese somática in vivo) e, deste modo, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anti- corpos recombinantes são sequências que, embora derivadas a partir de e relacio- nadas a sequências de VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vivo. Em determinadas modalidades, no entanto, tais anticorpos recombinantes são o re- sultado da abordagem de mutagênese seletiva ou retromutação, ou ambas.

[0033]Um "anticorpo isolado" inclui um anticorpo que é substancialmente li- vre de outros anticorpos que tem diferentes especificidades antigênicas (por exem- plo, um anticorpo isolado que liga especificamente hIL-13 é substancialmente livre de anticorpos que ligam especificamente antígenos além de hIL-13). Um anticorpo isolado que liga especificamente hIL-13 pode ligar moléculas de IL-13 a partir de ou- tras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

[0034]Um "anticorpo neutralizante" (ou um "anticorpo que neutralizou a ativi- dade de hIL-13 ") inclui um anticorpo cuja ligação a hIL- 13 resulta na inibição da atividade biológica de hIL-13. Esta inibição da atividade biológica de hIL-13 pode ser avaliada mediante a medição de um ou mais indicadores da atividade biológica de hIL-13. Estes indicadores da atividade biológica de hIL-13 podem ser avaliados por meio de um ou mais dentre vários ensaios in vitro ou in vivo padrão conhecidos na técnica.

[0035]O termo "atividade" inclui as atividades, tais como, a especificida- de/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno, por exemplo, um anticor- po anti-hIL-13 que se liga a um antígeno IL-13 e/ou a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti- hIL-13 cuja ligação a hIL-13 inibe a atividade biológica de hIL-13.

[0036]A frase "ressonância de plasmon de superfície" inclui um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real mediante a detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz de bi- osensor, por exemplo, com o uso do sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.). Para descrições adicionais, vide Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 :19- 26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11 :620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268- 277, cujas instruções integrais estão aqui incor- poradas.

[0037]O termo "off”, para uso na presente invenção, se destina a se referir à constante de taxa de dissociação para dissociação de um anticorpo a partir do com- plexo de anticorpo/antígeno.

[0038]O termo "Kd", para uso na presente invenção, se destina a se referir à constante de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.

[0039]A frase "molécula de ácido nucléico" inclui moléculas de DNA e molé- culas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de filamento único ou fila- mento duplo, mas em um aspecto consiste em DNA de filamento duplo.

[0040]A frase "molécula de ácido nucléico isolada", para uso na presente in- venção com referência a ácidos nucléicos que codificam anticorpos ou parte de anti- corpos (por exemplo, VH, VL, CDR3), por exemplo, aqueles que ligam hIL-13 e in- cluem uma molécula de ácido nucléico na qual as sequências de nucleotídeo que codificam o anticorpo ou parte de anticorpo são livres de outras sequências de nu- cleotídeo que codificam anticorpos ou parte de anticorpos que ligam antígenos além da hIL-13, tais outras sequências podem flanquear naturalmente o ácido nucléico em DNA genômico humano. Deste modo, por exemplo, um ácido nucléico isolado da invenção que codifica uma região VH de um anticorpo anti-hIL-13 não contém outras sequências que codificam outras regiões VH que ligam antígenos além, por exem- plo, da hIL-13. A frase "molécula de ácido nucléico isolada" também se destina a incluir sequências que codificam anticorpos biespecíficos bivalentes, tais como dia- corpos, nos quais as regiões VH e VL não contêm outras sequências além das se- quências do diacorpo.

[0041]A frase "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") inclui uma célula na qual um vetor de expressão recombinante tem sido introduzido. Deve-se compreender que tais termos são destinados a se referir não somente à presente célula particular, mas à progênie de tal célula. Devido ao fato de que determinadas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à cé- lula pai, mas ainda estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira", para uso na presente invenção.

[0042]O termo "modificação", para uso na presente invenção, se destina a se referir à alteração de um ou mais aminoácidos nos anticorpos ou partes de liga- ção de antígeno dos mesmos. A alteração pode ser produzida mediante a adição, substituição ou apagamento de um aminoácido em uma ou mais posições. A altera- ção pode ser produzida com o uso de técnicas conhecidas, tais como mutagênese PCR.

[0043]O termo "cerca de", para uso na presente invenção, se destina a se referir a faixas aproximadamente 10 a 20% maiores ou menores do que o valor mencionado. Em determinadas circunstâncias, um elemento versado na técnica irá reconhecer que, devido à natureza do valor mencionado, o termo "cerca de" pode significar mais ou menos do que um desvio de 10 a 20% deste valor.

[0044]A frase "redução/inativação viral", para uso na presente invenção, se destina a se referir a uma diminuição no número de partículas virais em uma amos- tra particular ("redução"), assim como uma diminuição na atividade, por exemplo, mas não se limita a, na infectividade ou capacidade de replicar, de partículas virais e uma amostra particular ("inativação"). Tais diminuições no número e/ou atividade das partículas virais podem ser na ordem de cerca de 1% a cerca de 99%, que inclui cerca de 20% a cerca de 99%, que inclui cerca de 30% a cerca de 99%, que inclui cerca de 40% a cerca de 99%, que inclui cerca de 50% a cerca de 99%, que inclui cerca de 60% a cerca de 99%, que inclui cerca de 70% a cerca de 99%, que inclui cerca de 80% to 99%, e que inclui cerca de 90% a cerca de 99%. Em determinadas modalidades não limitadoras, a quantidade de vírus, se existir algum, no produto de anticorpo purificado é menor do que o ID50 (a quantidade de vírus que irá infectar 50 por cento de uma população alvo) para aquele vírus, isto é ao menos 10 vezes me- nor do que o ID50 para aquele vírus, ou ao menos 100 vezes menor do que o ID50 para aquele vírus, ou ao menos 1000 vezes menor do que o ID50 para aquele vírus.

[0045]A frase "posição de contato" inclui uma posição de aminoácido na CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ou da região variável de cadeia leve de um anticorpo que é ocupada por um aminoácido que entra em conta- to com o antígeno em uma das vinte e seis estruturas de anticorpo-antígeno conhe- cidas. Se um aminoácido CDR em qualquer uma das vinte e seis estruturas resolvi- das conhecidas de complexos de anticorpo-antígeno entra em contato com o antí- geno, então, este aminoácido pode ser considerado como ocupante de uma posição de contato. As posições de contato têm uma probabilidade maior de serem ocupa- das por um aminoácido que entra em contato com antígenos do que em uma posi- ção de não-contato. Em um aspecto, uma posição de contato consiste em uma posi- ção de CDR que contém um aminoácido que entra em contato com o antígeno em mais do que 3 das 26 estruturas (>1,5%). Em outro aspecto, uma posição de contato consiste em uma posição de CDR que contém um aminoácido que entra em contato com antígeno em mais do que 8 das 25 estruturas (>32%). 2. Geração de anticorpo

[0046]O termo "anticorpo", para uso nesta seção, se refere a um anticorpo intato ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[0047]Os anticorpos da presente descrição podem ser gerados por uma va- riedade de técnicas, que incluem imunização de um animal com o antígeno de inte- resse, seguida por metodologias convencionais de anticorpo monoclonal, por exem- plo, uma técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. -Embora os procedimentos de hibridização de célula somá- tica sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para a produção de anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogêni- cas de linfócitos B.

[0048]Um sistema de animal para a preparação de hibridomas consiste no sistema murídeo. A produção de hibridoma é um procedimento muito bem estabele- cido. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murídeas) e os procedimentos de fusão também são conhecidos.

[0049]Um anticorpo pode ser um anticorpo humano, quimérico ou humani- zado. Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente descrição podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal não-humano pre- parado conforme descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido a partir do hibridoma não-humano de interesse e pro- jetado para conter sequências de imunoglobulina não-murídea (por exemplo, huma- na) com o uso de técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murídeas podem ser ligadas a regiões constantes humanas com o uso de métodos conhecidos na técnica (vide, por exem- plo, patente U.S. no. 4.816.567 a Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murídeas podem ser inseridas em uma estrutura humana com o uso de métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, patente U.S. no. 5.225.539 a Winter, e patente U.S. nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 a Queen et al).

[0050]Em uma modalidade não limitadora, os anticorpos desta descrição são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direciona- dos contra IL-13 podem ser gerados com o uso de camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humano em vez do sis- tema de camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos in- cluem camundongos mencionados no presente documento como o HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.), e XenoMouse® (Amgen).

[0051]Além disso, os sistemas de animal transcromossômico alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para construir anticorpos desta descrição, tais como os anticor- pos anti-IL-13. Por exemplo, podem ser usados os camundongos que carregam tan- to um transcromossomo humano de cadeia pesada como um transcromossomo hu- mano de cadeia leve, mencionados como "camundongos TC"; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Adi- cionalmente, vacas que carregam transcromossomos humanos de cadeia leve e pe- sada têm sido descritas na técnica (por exemplo, Kuroiwa et al. (2002) Nature Bio- technology 20:889-894 e pedido PCT no. WO 2002/092812) e podem ser usados para construir os anticorpos anti-IL-13 desta descrição.

[0052]Os anticorpos humanos recombinantes da invenção, que incluem, mas não se limitam a, anticorpos anti-IL-13, um parte de ligação de antígeno dos mes- mos, ou anticorpos relacionados a anti-IL-13 apresentados no presente documento podem ser isolados mediante a triagem de uma biblioteca de anticorpo combinatório recombinante, por exemplo, uma biblioteca de exposição em fago (phage display) de scFv, preparados com o uso de cDNAs humanos VL e VH preparados a partir de mRNA derivado a partir de linfócitos humanos. As metodologias para a preparação e triagem de tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Em adição aos kits comerci- almente disponíveis para a geração de bibliotecas de exposição em fago (phage display) (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit de exposição em fago (phage display) Stratagene Sur- fZAPTM, catálogo no. 240612, cujas instruções integrais estão aqui incorporadas), os exemplos de métodos e reagentes particularmente acessíveis para o uso na geração e triagem de bibliotecas de exposição de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, em Ladner et al., patente U.S. no. 5.223.409; Kang et al. publicação PCT no. WO 92/18619; Dower et al. publicação PCT no. WO 91/17271; Winter et al. publi- cação PCT no. WO 92/20791; Markland et al. publicação PCT no. WO 92/15679; Breitling et al. publicação PCT no. WO 93/01288; McCafferty et al. publicação PCT no. WO 92/01047; Garrard et al. publicação PCT no. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370- 1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hibridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281 ; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. 1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenbo- om et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978- 7982; cujas instruções integrais estão aqui incorporadas.

[0053]Os anticorpos monoclonais humanos desta descrição também podem ser preparados com o uso de camundongos SCID, nos quais as células imunes hu- manas têm sido reconstruídas de tal modo que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada sob a imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 5.476.996 e 5.698.767 a Wilson et al.

[0054]Em determinadas modalidades, os métodos da invenção incluem anti- corpos anti-IL-13 e parte de anticorpos, anticorpos relacionados a anti-IL-13 e parte de anticorpos, e anticorpos humano e parte de anticorpos com propriedades equiva- lentes aos anticorpos anti-IL-13, tais como ligação de alta afinidade a hIL-13 com baixa cinética de dissociação e alta capacidade de neutralização. Em um aspecto, a invenção fornece o tratamento com um anticorpo humano isolado, ou uma parte de ligação de antígeno do mesmo, que se dissocia a partir de hIL-13 com um Kd de cerca de 1 x 10-8 M ou menos e uma constante de taxa de dissociação de 1 x 10-3 s- 1 ou menos, ambos determinados pela ressonância de plasmon de superfície. Em modalidades não limitadoras específicas, um anticorpo anti-IL-13 purificado de acor- do com a invenção inibe de forma competitiva a ligação de ABT-308 a IL-13 sob condições fisiológicas.

[0055]Em mais outra modalidade da invenção, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos, tais como, mas não se limitam a, anticorpos anti-IL-13 ou fragmentos dos mesmos, podem ser alterados, em que a região constante do anticorpo é modi- ficada para reduzir ao menos uma função efetora biológica mediada por região cons- tante em relação a um anticorpo não modificado. Para modificar um anticorpo da invenção de tal modo que exiba ligação reduzida ao receptor Fc, o segmento de re- gião constante da imunoglobulina do anticorpo pode ser submetido à mutação em regiões particulares necessárias para as interações do receptor Fc (FcR) (vide, por exemplo, Canfield e Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491 ; e Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662, cujas instruções integrais estão aqui incorpo- radas). A redução na capacidade de ligação de FcR do anticorpo também pode re- duzir outras funções efetoras que dependem das interações de FcR, tais como op- sonização e fagocitose e citotoxicidade celular dependente de antígeno. 3. Produção de anticorpo 3.1 Estratégias gerais de produção

[0056]Para expressar um anticorpo da invenção, os DNAs que codificam ca- deias pesada e leve de comprimento total ou parcial são inseridos em um ou mais vetores de expressão, de tal modo que os genes sejam ligados de maneira operativa a sequências de controle transcricional e translacional. (Vide, por exemplo, patente U.S. no. 6.914.128, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referên- cia.) Neste contexto, o termo "ligado de maneira operativa" se destina a significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de tal modo que as sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor satisfaçam sua função preten- dida de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expres- são e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatí- veis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve do anti- corpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em um vetor se- parado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de ex- pressão. Os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão por meio de métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição complementar no vetor e fragmento do gene de anticorpo, ou ligação de extremidade cega se os locais de restrição não estiverem presentes). Antes da inserção do anticorpo ou sequên- cias de cadeia pesada ou leve relacionadas ao anticorpo, o vetor de expressão já pode carregar as sequências de região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter o anticorpo anti-IL-13 ou sequências VH e VL relaciona- das ao anticorpo anti- IL-13para genes de anticorpo de comprimento total consiste em inserir os mesmos em vetores de expressão que já codificam as regiões constan- tes de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente, de tal modo que o segmento VH seja ligado de maneira operativa ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o seg- mento VL seja ligado de maneira operativa ao segmento CL dentro do vetor. Adicio- nal ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um pep- tídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene de cadeia do anticorpo pode ser clonada no vetor de tal modo que o peptídeo de sinal seja ligado em estrutura ao amino terminal do gene de ca- deia do anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglo- bulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal a partir de uma proteína de não-imunoglobulina).

[0057]Em adição aos genes de cadeia do anticorpo, um vetor de expressão recombinante da invenção pode carregar uma ou mais sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" se destina a incluir promotores, otimizadores e ou- tros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos genes de cadeia do anticorpo. Tais se- quências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência. Os elementos versados na técnica irão observar que o projeto do vetor de expressão, que inclui a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejado, etc. As sequências reguladoras adequadas para a expressão de célula hospedeira mamífera incluem os elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas, tais como promotores e/ou otimizadores derivados a partir de citomegalovírus (CMV) (tal como, o promotor/otimizador de CMV), Vírus símio 40 (SV40) (tal como, o promotor/otimizador de SV40), adenovírus, (por exem- plo, o promotor principal tardio de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicionais de elementos reguladores virais, e sequências dos mesmos, vide, por exemplo, patente U.S. no. 5.168.062 por Stinski, patente U.S. no. 4.510.245 por Bell et al. E patente U.S. no. 4.968.615 por Schaffner et al., cujas instruções integrais es- tão aqui incorporadas a título de referência.

[0058]Em adição aos genes de cadeia do anticorpo e sequências regulado- ras, um vetor de expressão recombinante da invenção pode carregar uma ou mais sequências adicionais, tais como uma sequência que regula a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e/ou um gene marca- dor selecionável. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospe- deiras nas quais o vetor tem sido introduzido (vide, por exemplo, patentes U.S. nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al., cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tais como G418, higromici- na ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor tem sido introduzido. Os genes marcadores selecionáveis adequados incluem o gene de dihidrofolato re- dutase (DHFR) (para o uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para seleção de G418).

[0059]Um anticorpo, ou parte de anticorpo, da invenção pode ser preparado por meio da expressão recombinante de genes de cadeia pesada e leve de imuno- globulina em uma célula hospedeira. Para expressar um anticorpo de maneira re- combinante, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de ex- pressão recombinantes que carregam fragmentos de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da imunoglobulina do anticorpo, de tal modo que as cadeias pesada e leve sejam expressas na célula hospedeira e secretadas no meio em que as células hospedeiras são cultivadas, a partir de tal meio dos anticorpos podem ser recupera- dos. As metodologias de DNA recombinante padrão são usadas para se obter genes de cadeia leve e pesado do anticorpo, incorporar estes genes em vetores de expres- são recombinantes e introduzir os vetores em células hospedeiras, tais como aque- las descritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Labora- tory Manual, Segunda edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) e nas patentes U.S. nos. 4.816.397 & 6.914.128, cujas instruções integrais estão aqui in- corporadas.

[0060]Para a expressão das cadeias pesada e leve, o(s) vetor(es) de ex- pressão que codificam as cadeia leve e pesada é(são) transfectados em uma célula hospedeira por meio de técnicas padrão. As diversas formas do termo "transfecção" são destinadas a incluir uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE- dextrano, e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anti- corpos em células eucarióticas, tais como células hospedeiras mamíferas, é ade- quada devido ao fato de que tais células eucarióticas, e em particular células mamí- feras, são propensas do que as células procarióticas a reunir e secretar um anticor- po imunologicamente ativo e adequadamente dobrado. A expressão procariótica de genes do anticorpo tem sido relatada como ineficaz para a produção de altos rendi- mentos de anticorpo ativo (Boss e Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência).

[0061]As células hospedeiras adequadas para clonagem e expressão do DNA nos vetores no presente documento consistem nas células eucariotas superio- res, leveduras ou procariotas descritas acima. As procariotas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativo ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobac- ter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli, tal como B. subtilis r B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P apresentado em DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aerugino- sa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli adequado consiste em E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27,325) sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitadores.

[0062]Em adição a procariotas, os micróbios eucarióticos, tais como levedu- ra ou fungos filamentosos são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para polipeptídeo que codifica vetores. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padaria comum, é o mais comumente usado entres os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, uma série de outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e são úteis no presente documento, tais como Schizo- saccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces, tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotole- rans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Cândida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neu- rospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus, tais como A. nidu- lans e A. niger.

[0063]As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados são derivadas a partir de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrado incluem células de vegetal e inseto. Inúmeras cepas baculo- virais, variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes a par- tir de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mos- quito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori têm sido identificadas. Uma variedade de cepas virais para a transfec- ção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-1 de Autographa cali- fornica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o vírus no presente documento, de acordo com a presente invenção, particu- larmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de cé- lulas vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também po- dem ser utilizadas como hospedeiros.

[0064]As células hospedeiras mamíferas adequadas para a expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de hamister chinês (células de CHO) (que incluem células de CHO dhfr, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável DHFR, por exem- plo, conforme descrito em Kaufman e Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência), células de mi- eloma NS0, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombi- nantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos células hospedeiras ma- míferas, os anticorpos são produzidos mediante a cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas célu- las hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras estão se desenvolvendo. Outros exemplos de linha de células hospe- deiras mamíferas úteis consistem em linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônico humano (293 ou 293 célu- las subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol: 36:59 m (1977)); células de rim de hamster recém-nascido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humana (Hep G2), cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência.

[0065]As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expres- são oi clonagem descritos acima para a produção de anticorpo e cultivadas em mei- os de nutriente convencionais modificados conforme adequado para induzir promo- tores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

[0066]As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis, tais como Ham's F10™ (Sigma), Minimal Essential Medium™ ((MEM), (Sigma), RPMI- 1640 (Sigma) e Dulbecco's Modificados Eagle's Medium™ ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al, Anal. Bio- chem. 102:255 (1980), patentes U.S. nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U.S. no. Re. 30.985, pode ser usado como meio de cultura para as células hospedeiras, cujas instruções integrais estão aqui incorporadas a título de referência. Qualquer um des- tes meios podem ser suplementados, conforme necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como, insulina, transferrina ou fator de cresci- mento epidérmico), sais (tais como, cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como, HEPES), nucleotídeos (tais como, adenosina e timidina), anti- bióticos (tais como, fármaco de gentamicina), elementos residuais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa mi- cromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suple- mentos necessários também podem ser incluídos em concentrações adequadas que seriam conhecidas pelos elementos versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, H, e similares, consistem naquelas anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para os elementos versados na técnica.

[0067]As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir par- tes de anticorpos intatos, tais como fragmentos Fab ou moléculas de scFv. Compre- ende-se que as variações sobre o procedimento acima estão incluídas no escopo da presente invenção. Por exemplo, em determinadas modalidades, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo desta invenção. A tecnologia DNA re- combinante também pode ser usada para remover alguma parte ou todo o DNA que codifica cada uma ou ambas as cadeias pesada e leve que não é necessário para a ligação à IL- 13 , especificamente, hIL- 13. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção. Além disso, podem ser produzidos os anticorpos bifucionais em que uma cadeia leve e uma cadeia pesada consistem em um anticorpo da invenção e as outras cadeias leve e pesada são específicas para um antígeno além da IL-13 mediante a reticula- ção de um anticorpo da invenção a um segundo anticorpo por meio de métodos de reticulação química padrão.

[0068]Em um sistema adequado para a expressão recombinante de um anti- corpo, ou parte de ligação de antígeno do mesmo, da invenção, um vetor de expres- são recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo como a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO por meio da transfecção medi- ada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, cada um dos genes de cadeia pesada e leve do anticorpo é ligado de maneira operativa aos ele- mentos reguladores otimizador de CMV/promotor de AdMLP para conduzir altos ní- veis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, o qual permite a seleção de células CHO que têm sido transfecta- das com o vetor com o uso de seleção/amplificação de metotrexato. As células hos- pedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias leve e pesada do anticorpo e o anticorpo intato é recuperado do meio de cultura. As técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar para transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura.

[0069]Quando se utiliza técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser pro- duzido de forma intracelular, no espaço periplásmico, ou diretamente secretado no meio. Em um aspecto, se o anticorpo for produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os fragmentos de particulado, células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, que resultam a partir da homogeneização), podem ser removidos, por exemplo, por meio de centrifugação ou ultrafiltração. Onde o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes a partir de tais sistemas de expressão podem ser primei- ro concentrados com o uso de um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon™ ou Millipore Pelli- con™.

[0070]Antes do processo da invenção, os procedimentos para a purificação de anticorpos a partir de fragmentos de célula dependem inicialmente do local de expressão do anticorpo. Alguns anticorpos podem ser secretados diretamente a par- tir da célula no meio de crescimento circundante; outros são feitos de forma intrace- lular. Para os últimos anticorpos, a primeira etapa de um processo de purificação envolve tipicamente: lise da célula, o qual pode ser feitos por uma variedade de mé- todos, que incluem cisalhamento mecânico, choque osmótico ou tratamentos enzi- máticos. Tal rompimento libera todos os conteúdos da célula no homogenato, e, além disso, produz fragmentos subcelulares que são difíceis de remover devido a seu pequeno tamanho. Estes são geralmente removidos por centrifugação diferenci- al ou por meio de filtração. Onde o anticorpo é secretado, os sobrenadantes a partir de tais sistemas de expressão são geralmente concentrados primeiro com o uso de um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon™ ou Millipore Pellicon™. Onde o anticorpo é secre- tado no meio, as células hospedeiras recombinantes também podem ser separadas a partir do meio de cultura de célula, por exemplo, por filtração de fluxo tangencial. Os anticorpos podem ser adicionalmente recuperados a partir do meio de cultura com o uso dos métodos de purificação de anticorpo da invenção. 3.2 . Estratégia de produção exemplificadora

[0071]Em determinadas modalidades, a etapa inicial de produção do anti- corpo anti-IL-13 envolve o uso de operações de frasco centrifugador e bolsa Biowa- ve para expandir as células CHO que expressam o anticorpo anti-IL-13 a partir de um único frasco congelado à biomassa desejada para a inoculação de um biorreator de sementes de 110 L. Um frasco congelado de células CHO do banco de células primário é derretido e colocado no meio de crescimento (SR-512) e centrifugado. As células são suspensas novamente no meio de crescimento e expandida a 37°C e CO2 a 5% em frascos centrifugadores descartáveis, frascos agitadores e/ou bolsas Biowave de volume crescente. As bolsas Biowave de 20 L duplicadas são usadas para maximizar a expansão de célula final antes da inoculação no biorreator de se- mentes. Quando a densidade celular atinge > 2,0 x 106 células viáveis/mL a partir de ambas as bolsas Biowave de 20 L em aproximadamente 15 a 17 dias, a cultura é transferida para um biorreator de sementes de 110 L carregado com o meio de cres- cimento SR-520 para expansão adicional. Após a inoculação, a temperatura alvo é de 37°C e o pH é ajustado em um alvo de 7,1 e controlado mediante a adição de NaOH e aspersão de CO2. O oxigênio dissolvido (DO) no biorreator é controlado em valor alvo de 40% mediante a aspersão com ar e oxigênio. Uma vez que a densida- de celular alcança > 2,6 x 106 células viáveis/mL após aproximadamente 2 a 4 dias, a cultura é transferida para um biorreator de produção de 3000 L.

[0072]Em determinadas modalidades, uma carga parcial de um biorreator de produção de 3000 L é usada para expandir adicionalmente a cultura de célula. Inici- almente, o reator é carregado com o meio de crescimento (SR-520) e inoculado com o lote a partir do biorreator de semente de 110 L. Durante este estágio de enchimen- to curto, a temperatura, oxigênio dissolvido e pH são controlados a 37°C, 40% e 7,1, respectivamente. O pH da cultura é controlado com aspersão de CO2 e adição de NaOH. Tipicamente, as células cresceram por 2 a 4 dias antes de alcançar a densi- dade do estágio de produção de > 1,6 x 106 células viáveis/mL.

[0073]O meio de produção SR-521 (1950 L) é adicionado à cultura de célula no biorreator de 3000 L para iniciar o estágio de produção. O anti-espumante C é adicionado para diminuir a formação de espuma. O pH da cultura é controlado em um valor alvo de 6,9 com aspersão intermitente de CO2 e adição de NaOH. A tempe- ratura e o oxigênio dissolvido são controlados em valores alvo de 35°C e 40%, res- pectivamente. O DO no biorreator é inicialmente controlado no valor desejado medi- ante a aspersão de ar e suplementado com oxigênio puro se necessário. Em deter- minadas modalidades, a temperatura é reduzida a um valor alvo de 33°C, quando a densidade de célula viável alcança > 3,0 x 106 células/mL, e o pH e o DO são manti- dos em valores alvo de 6,9 e 40%, respectivamente, enquanto que em outras moda- lidades o valor alvo de 35°C é mantido. A glicose (SR-334) é adicionada conforme necessário. As culturas são coletadas e purificadas conforme descrito abaixo, quan- do a viabilidade de célula cai para < 50%. 4. Purificação de anticorpo 4.1 Purificação de anticorpo em geral

[0074]A invenção fornece métodos para a produção de uma preparação de anticorpo purificada (ou "HCP reduzida") a partir de uma mistura que compreende um anticorpo e ao menos uma HCP. A presente invenção também fornece métodos em que a preparação purificada final é reduzida em proteína A lixiviada. O processo de purificação da invenção começa na etapa de separação quando o anticorpo tem sido produzido com o uso de métodos descritos acima e métodos convencionais na técnica. A Tabela 1 resume uma modalidade de um esquema de purificação. As va- riações deste esquema, que incluem, mas não se limitam a, variações onde a etapa de cromatografia de afinidade de proteína A é omitida ou a ordem das etapas de tro- ca iônica é invertida, são consideradas e se incluem no escopo desta invenção. Tabela 1 Etapas de puril icação com seu propósito associado

[0075]Uma vez que a solução ou mistura clarificada que compreende o anti- corpo tem sido obtida, a separação do anticorpo a partir das outras proteínas produ- zidas pela célula, tais como HCPs, é executada com o uso de uma combinação de diferentes técnicas de purificação, que incluem etapa(s) de separação de troca iôni- ca e etapa(s) de separação interação hidrofóbica. As etapas de separação separam as misturas de proteínas com base em sua carga, grau de hidrofobicidade ou tama- nho. Em um aspecto da invenção, a separação é executadas com o uso de croma- tografia, que inclui catiônica, aniônica e interação hidrofóbica. Várias diferentes resi- nas de cromatografia estão disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo a adequação precisa do esquema de purificação à proteína particular envolvida. A es- sência de cada um dos métodos de separação é que as proteínas podem ser provo- cadas a atravessar em diferentes taxas abaixo uma coluna, alcançando uma sepa- ração física que aumenta à medida que passam mais abaixo da coluna, ou aderir seletivamente ao meio de separação, sendo, então, eluídas de forma diferencial por diferentes solventes. Em alguns casos, o anticorpo é separado a partir de impure- zas, quando as impurezas especificamente se aderem à coluna e o anticorpo não, isto é, o anticorpo está presente no fluxo passante.

[0076]Conforme observado acima, a adequação precisa de um esquema de purificação depende da consideração da proteína a ser purificada. Em determinadas modalidades, as etapas de separação da presente invenção são empregadas para separar um anticorpo a partir de uma ou mais HCPs. Os anticorpos que podem ser purificados com sucesso com o uso dos métodos descritos no presente documento incluem, mas não se limitam a, anticorpos IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM humanos. Em determinadas modalidades, as estratégias de purificação da presente invenção excluem o uso de cromatografia de afinidade de proteína A, por exemplo, no contexto da purificação de anticorpos IgG3, à medida que os anticorpos IgG3 se ligam à proteína A de maneira ineficaz. Outros fatores que permite a ade- quação específica de um esquema de purificação incluem, mas não se limitam a: a presença ou ausência de uma região Fc (por exemplo, no contexto do anticorpo de comprimento total, conforme comparado com um fragmento Fab do mesmo) devido ao fato de que a proteína A se liga à região Fc; as sequências de linha germinativa particulares empregadas na geração do anticorpo de interesse; e a composição de aminoácido do anticorpo (por exemplo, a sequência primária do anticorpo, assim como a hidrofobicidade/carga geral da molécula). Os anticorpos que compartilham uma ou mais características podem ser purificados com o uso de estratégias de puri- ficação adequadas para aproveitar estas características. 4.2 Recuperação primária

[0077]As etapas iniciais dos métodos de purificação da presente invenção envolvem a primeira fase de clarificação e recuperação primária de anticorpo a partir de uma matriz de amostra. Além disso, o processo de recuperação primária também pode consistir em um ponto em que se reduz ou inativa vírus que podem estar pre- sentes na matriz de amostra. Por exemplo, qualquer um ou mais dentre uma varie- dade de métodos de redução/inativação viral pode ser usado durante a fase de re- cuperação primária de purificação que inclui inativação por calor (pasteurização), inativação de pH, tratamento de solvente/detergente, irradiação de raio gama e UV e a adição de determinados agentes de inativação química, tais como β- propiolactona ou, por exemplo, fenantrolina de cobre, conforme na patente U.S. no. 4.534.972, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência. Em determinadas mo- dalidades da presente invenção, a matriz de amostra é exposta à redução/inativação viral de pH durante a fase de recuperação primária.

[0078]Os métodos de redução/inativação viral de pH incluem, mas não se limitam a, incubar a mistura por um período de tempo em pH baixo e, subsequente- mente, neutralizar o pH e remover particulados por meio de filtração. Em determina- das modalidades, a mistura será incubada em um pH entre cerca de 2 e 5, em um pH entre cerca de 3 e 4, que inclui, mas não se limita a, em um pH de cerca de 3,5. O pH da mistura de amostra pode ser reduzido por qualquer ácido adequado que inclui, mas não se limita a, ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico ou outros áci- dos adequados. A escolha do nível de pH depende muito do perfil de estabilidade do produto de anticorpo e componentes de tampão. Sabe-se que a qualidade do anti- corpo alvo durante a redução/inativação de vírus de pH baixo é afetada pelo pH e pela duração da incubação de pH baixo. Em determinadas modalidades, a duração da incubação de pH baixo será a partir de 0,5 h a 2 h, que inclui, mas não se limita a, 0,5 h a 1,5 h, e que inclui, mas não se limita a, durações de cerca de 1 hora. A redução/inativação de vírus é dependente destes mesmos parâmetros em adição à concentração de proteína, a qual pode limitar a redução/inativação em altas concen- trações. Deste modo, os parâmetros adequados da concentração de proteína, pH e duração da redução/inativação podem ser selecionados para se alcançar o nível de- sejado de redução/inativação viral.

[0079]Em determinadas modalidades, a redução/inativação viral pode ser al- cançada através do uso de filtros adequados. Um exemplo não limitador de um filtro adequado consiste no filtro Ultipor DV50™ disponível junto a Pall Corporation. Em- bora determinadas modalidades da presente invenção empreguem tal filtração du- rante a fase de recuperação primária, em outras modalidades, é empregada em ou- tras fases do processo de purificação, que incluem como a penúltima ou etapa final de purificação. Em determinadas modalidades, são empregados filtros alternativos para a redução/inativação viral, tais como, mas não se limita a, filtros Viresolve™ (Millipore, Billerica, Mass.); filtros Zeta Plus VR™ (CUNO; Meriden, Conn.); e filtros Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, 111.).

[0080]Naquelas modalidades onde a redução/inativação viral é empregada, a mistura de amostra pode ser ajustada, conforme necessário, para as etapas de purificação adicionais. Por exemplo, após a redução/inativação viral de pH baixo, o pH da mistura de amostra é tipicamente ajustado para um pH mais neutro, por exemplo, a partir de cerca de 4,5 a cerca de 8,5, e que inclui, mas não se limita a, cerca de 4,9, antes de continuar o processo de purificação. Adicionalmente, a mistu- ra pode ser lavada com água para injeção (WFI) para obter uma condutividade dese- jada.

[0081]Em determinadas modalidades, a recuperação primária irá incluir uma ou mais etapas de centrifugação para clarificar adicionalmente a matriz de amostra e, assim, auxiliar a purificação dos anticorpos anti-IL-13. A centrifugação da amostra podem ser executada, por exemplo, mas não como forma de limitação, a 7.000 x g a aproximadamente 12.750 x g. No contexto da purificação de grande escala, tal cen- trifugação pode ocorrer em linha com uma taxa de fluxo ajustada para alcançar, por exemplo, mas não como forma de limitação, um nível de turvação de 150 NTU no sobrenadante resultante. Tal sobrenadante pode ser, então, coletado para purifica- ção adicional.

[0082]Em determinadas modalidades, a recuperação primária irá incluir o uso de uma ou mais etapas de filtração de profundidade para clarificar adicionalmen- te a matriz de amostra e, assim, auxiliar na purificação dos anticorpos da presente invenção. Os filtros de profundidade contêm meios de filtração media que têm uma densidade graduada. Tal densidade graduada permite que partículas maiores sejam capturadas próximo à superfície do filtro, enquanto que as partículas menores que penetram nas áreas abertas maiores na superfície do filtro, somente sejam captura- das nas aberturas menores mais próximas ao centro do filtro. Em determinadas mo- dalidades, a etapa de filtração de profundidade pode consistir em uma etapa de fil- tração de profundidade delipid. Embora determinadas modalidades empreguem as etapas de filtração de profundidade somente durante a fase de recuperação primá- ria, outras modalidades empregam filtros de profundidade, que incluem filtros de pro- fundidade delipid, durante uma ou mais fases adicionais de purificação. Os exem- plos não limitadores de filtros de profundidade que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem os filtros de profundidade Cuno™ modelo 30/60ZA (3M Corp.), e cartuchos de filtro de bicamada 0,45/0,2μm Sartopore™. 4.3 Cromatografia de afinidade

[0083]Em determinadas modalidades, a amostra de recuperação primária é submetida à cromatografia de afinidade para purificar adicionalmente o anticorpo de interesse longe das HCPs. Em determinadas modalidades, o material cromatográfico é capaz de se ligar de maneira seletiva ou específica ao anticorpo de interesse. Os exemplos não limitadores de tal material cromatográfico incluem: proteína A, proteí- na G, material cromatográfico que compreende o antígeno ligado pelo anticorpo de interesse, e o material cromatográfico que compreende uma proteína de ligação Fc. Em modalidades específicas, a etapa de cromatografia de afinidade envolve subme- ter a amostra de recuperação primária a uma coluna que compreende uma resina de proteína A adequada. A resina de proteína A é útil para a purificação de afinidade e isolamento de uma variedade de isotipos de anticorpo, particularmente, IgG1 IgG2 e IgG4. A proteína A é uma proteína de parede de célula bacteriana que se liga a IgGs mamíferas principalmente através de suas regiões Fc. Em seu estado nativo, a pro- teína A tem cinco domínios de ligação de IgG, assim como outros domínios de fun- ção desconhecida.

[0084]Existe diversas fontes comerciais para a resina de proteína A. As re- sins adequadas incluem, mas não se limitam a, MabSelect™ disponível junto a GE Healthcare e ProSep Ultra Plus™ junto a Millipore. Um exemplo não limitador de uma coluna adequada embalada com MabSelect™ consiste em uma coluna de cer- ca de 1,0 cm de diâmetro x cerca de 21,6 cm de comprimento (~17 mL de volume de leito). Este tamanho de coluna pode ser usado para purificações de pequena escala e pode ser comparado com outras colunas usadas para escala maiores. Por exem- plo, uma coluna de 20 cm x 21 cm cujo volume de leito é de cerca de 6,6 L pode ser usada para purificações maiores. Independente da coluna, a coluna pode ser emba- lada com o uso de uma resina adequada, tal como MabSelect™ ou ProSep Ultra Plus™ .

[0085]Em determinadas modalidades, será vantajoso identificar a capacida- de de ligação dinâmica (DBC) da resina de proteína A, a fim de adequar a purifica- ção ao anticorpo de interesse particular. Por exemplo, mas não como forma de limi- tação, a DBC de uma coluna de MabSelect™ ou ProSept Ultra Plus™ pode ser de- terminada por uma única carga de taxa de fluxo ou estratégia de carga de fluxo du- pla. A carga de taxa de fluxo única pode ser avaliada em uma velocidade de cerca de 300 cm/h por todo o período de carregamento. A estratégia de carga de taxa de fluxo dupla pode ser determinada pelo carregamento da coluna até cerca de 35 mg de proteína/mL de resina em uma velocidade linear de cerca de 300 cm/h, então, reduzindo a velocidade linear na metade para permitir o tempo de permanência mai- or para a última parte da carga.

[0086]Em determinadas modalidades, a coluna de proteína A pode ser equi- librada com um tampão adequado antes do carregamento de amostra. Um exemplo não limitador de um tampão adequado consiste em um tampão de Tris/NaCl, pH de cerca de 7,2. Um exemplo não limitador de condições de equilibração adequadas consiste em 25 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH de cerca de 7,2. Após esta equili- bração, a amostra pode ser carregada na coluna. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes com o uso, por exemplo, do tampão de equilíbrio. Outras lavagens, que incluem as lavagens que empregam diferentes tampões, podem ser empregadas para eluir a coluna. Por exemplo, a coluna pode ser lavada com o uso de um ou mais volumes de coluna de 20 mM de ácido cítri- co/citrato de sódio, 0,5 M de NaCl em pH de cerca de 6,0. Esta lavagem pode ser opcionalmente seguida por uma ou mais lavagens com o uso do tampão de equilí- brio. A coluna de proteína A pode ser, então, eluída com o uso de um tampão de eluição adequado. Um exemplo não limitador de um tampão de eluição adequado consiste em um tampão de ácido acético/NaCl, pH de cerca de 3,5. As condições adequadas consistem, por exemplo, em 0,1 M de ácido acético, pH de cerca de 3,5. O eluído pode ser monitorado com o uso de técnicas bem conhecidas pelos elemen- tos versados na técnica. Por exemplo, a absorbância em OD280 pode ser seguida. O eluído da coluna pode ser coletado começando com uma deflexão inicial de cerca de 0,5 AU a uma leitura de cerca de 0,5 AU na borda posterior do pico de eluição. A(s) fração(ões) de eluição de interesse podem ser, então, preparadas para o processa- mento adicional. Por exemplo, a amostra coletada pode ser submetida a titulação a um pH de cerca de 5,0 com o uso de Tris (por exemplo, 1,0 M) em um pH de cerca de 10. Opcionalmente, esta amostra titular pode ser filtrada e adicionalmente pro- cessada. 4.4 Cromatografia de troca iônica

[0087]Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece métodos para a produção de uma preparação de anticorpo de HCP reduzida a partir de uma mistura que compreende um anticorpo e ao menos uma HCP ao submeter a mistura a ao menos uma etapa de separação de troca iônica de tal modo que um eluído que compreende o anticorpo seja obtido. A separação de troca iônica inclui qualquer mé- todo por meio do qual duas substâncias são separadas com base na diferença em suas respectivas cargas iônicas e podem empregar material de troca catiônica ou material de troca aniônica.

[0088]O uso de um material de troca catiônica versus um material de troca aniônica é com base na carga total da proteína. Portanto, se inclui no escopo desta invenção empregar uma etapa de troca aniônica antes do uso de uma etapa de troca catiônica, ou uma etapa de troca catiônica antes do uso de uma etapa de troca aniô- nica. Adicionalmente, se inclui no escopo desta invenção empregar somente uma etapa de troca catiônica, somente uma etapa de troca aniônica ou qualquer combi- nação serial das duas.

[0089]Na execução da separação, a mistura de anticorpo inicial pode ser co- locada em contato com o material de troca iônica com o uso de qualquer uma dentre uma variedade de técnicas, por exemplo, com o uso de uma técnica de purificação de lote ou uma técnica cromatográfica.

[0090]Por exemplo, no contexto da purificação de lote, o material de troca iônica é preparado, ou equilibrado a, no tampão de partida desejado. Sob a prepara- ção, ou equilibração, uma pasta fluida do material de troca iônica é obtida. A solução de anticorpo é colocada em contato com a pasta fluida para absorver o anticorpo a ser separado ao material de troca iônica. A solução que compreende a(s) HCP(s) que não se ligam ao material de troca iônica é separada da pasta fluida, por exem- plo, ao deixar a pasta fluida se assentar e removendo o sobrenadante. A pasta fluida pode ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejado, a pasta fluida pode ser colocada em contato com uma solução de condutividade maior para des- sorver as HCPs que têm se ligado ao material de troca iônica. Com a finalidade de eluir os polipeptídeos ligados, a concentração de sal do tampão pode ser aumenta- da.

[0091]A cromatografia de troca iônica também pode ser usada como uma técnica de separação de troca iônica. A cromatografia de troca iônica separa as mo- léculas com base nas diferenças entre a carga total das moléculas. Para a purifica- ção de um anticorpo, o anticorpo precisa ter uma carga oposta àquela do grupo fun- cional fixado ao material de troca iônica, por exemplo, resina, a fim de se ligar. Por exemplo, os anticorpos, os quais têm geralmente uma carga positiva total no pH de tampão abaixo de seu pI, irão se ligar bem ao material de troca catiônica, o qual con- tém grupos funcionais negativamente carregados.

[0092]Na cromatografia de troca iônica, as camadas carregadas sobre a su- perfície do soluto são atraídas por cargas opostas fixadas a uma matriz de cromato- grafia, desde que a intensidade iônica do tampão circundante seja baixa. A eluição é geralmente alcançada mediante o aumento da intensidade iônica (isto é, condutivi- dade) do tampão para competir com o soluto para os locais carregados da matriz de troca iônica. A alteração do pH e, assim, a alteração da carga do soluto consiste em outra forma de se alcançar a eluição do soluto. A alteração em condutividade ou pH pode ser gradual (eluição gradiente) ou por etapas (eluição por etapa).

[0093]Os substituintes aniônicos ou catiônicos podem ser fixados a matrizes a fim de formar suportes aniônicos ou catiônicos para cromatografia. Os exemplos não limitadores de substituintes de troca aniônica incluem grupos dietilaminoetil (DEAE), aminoetil quaternário (QAE) e amina quaternária (Q). Os substituintes ca- tiônicos incluem carboximetil (CM), sulfoetil(SE), sulfopropil(SP), fosfato(P) e sulfo- nato(S). As resina de troca iônica de celulose, tais como DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM- 32™ e CM-52™, estão disponíveis junto a Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. Os trocadores iônicos reticulados e à base de SEPHADEX® também são conhecidos. Por exemplo, DEAE-, QAE-, CM- e SP- SEPHADEX® e DEAE-, Q-, CM e S-SEPHAROSE® e SEPHAROSE® De fluxo rápido estão todos disponíveis junto a Pharmacia AB. Adicionalmente, tanto o copolímero de metacrilato de etileno glicol derivado de DEAE como de CM, tal como TOYOPEARL™ DEAE-650S ou M e TOYOPEARL™ CM-650S ou M estão disponíveis junto a Toso Haas Co., Filadélfia, Pa. Em determinadas modalidades, uma etapa de troca aniônica é concluída com o uso de um cartucho de membrana Pall Mustang Q.

[0094]Uma mistura que compreende um anticorpo e impurezas, por exem- plo, HCP(s), é carregada em uma coluna de troca iônica, tal como uma coluna de troca catiônica. Por exemplo, mas não como forma de limitação, a mistura pode ser carregada em uma carga de cerca de 80 g proteína/L de resina, dependendo da co- luna usada. Um exemplo de uma coluna de troca catiônica adequada consiste em uma coluna de 80 cm de diâmetro x 23 cm de comprimento, cujo volume de leito é de cerca de 116 L. A mistura carregada nesta cátion coluna pode ser subsequente- mente lavada com tampão de lavagem (tampão de equilibração). O anticorpo é, en- tão, eluído a partir da coluna e um primeiro eluído é obtido.

[0095]Esta etapa de troca iônica facilita a captura do anticorpo de interesse, enquanto que reduz as impurezas, tais como HCPs. Em determinados aspectos, a coluna de troca iônica consiste em uma coluna de troca catiônica. Por exemplo, mas não como forma de limitação, uma resina adequada para tal coluna de troca catiôni- ca consiste na resina CM HyperDF™. Estas resinas estão disponíveis a partir de fontes comerciais, tais como, Pall Corporation. Este procedimento de troca catiônica pode ser realizado em ou em torno da temperatura ambiente. 4.5 Ultrafiltração/Diafiltração

[0096]Determinadas modalidades da presente invenção empregam as eta- pas de ultrafiltração e/ou diafiltração para purificar e concentrar, adicionalmente, a amostra de anticorpo. A ultrafiltração é descrita em detalhes em: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman e A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1996); e um: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN no. 87762-456-9). Um processo de filtração con- siste na filtração de fluxo tangencial conforme descrito no catálogo Millipore intitula- do "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). A ultrafiltração é geralmente considerada como a filtração com o uso de filtros com um tamanho de poro menor que 0,1 μm. Mediante o emprego de filtros com tal tamanho de poro pequeno, o volume da amostra pode ser reduzido através da permeação do tampão da amostra através do filtro, enquanto que os anticorpos são retidos atrás do filtro.

[0097]A diafiltração é um método de uso de ultrafiltros para remover e trocar sais, açucares e solventes não aquosos, para separar espécies livres de espécies ligadas, para remover material de baixo peso molecular e/ou para causar a rápida alteração de ambientes iônicos e/ou pH. Os microssolutos são removidos de forma mais eficaz mediante a adição de solvente à solução que é ultrafiltrada em uma taxa aproximadamente igual à taxa de ultratfiltração. Isto lava as microespécies a partir da solução em volume constante, purificando de maneira eficaz o anticorpo retido. Em determinadas modalidades da presente invenção, uma etapa de diafiltração é empregada para trocar os diversos tampões usados em conexão com a presente invenção, opcionalmente, antes da cromatografia adicional ou outras etapas de puri- ficação, assim como para remover as impurezas a partir das preparações de anti- corpo. 4.6 Cromatografia de interação hidrofóbica

[0098]A presente invenção também apresenta métodos para a produção de uma preparação de anticorpo de HCP reduzida a partir de uma mistura que compre- ende um anticorpo e ao menos uma HCP que compreende, adicionalmente, uma etapa de separação de interação hidrofóbica. Por exemplo, um primeiro eluído obti- do a partir de uma coluna de troca iônica pode ser submetido a um material de inte- ração hidrofóbica de tal modo que um segundo eluído que tem um nível reduzido de HCP seja obtido. As etapas de cromatografia de interação hidrofóbica, tais como aquelas apresentadas no presente documento, são geralmente executadas para re- mover os agregados de proteína, tais como agregados de anticorpo e impurezas relacionadas ao processo.

[0099]Na execução da separação, a mistura de amostra é colocada em con- tato com o material de HIC, por exemplo, com o uso de uma técnica de purificação de lote ou com o uso de uma coluna. Antes da purificação de HIC, pode ser desejá- vel remover quaisquer agentes caotrópicos ou substâncias muito hidrofóbicas, por exemplo, mediante a passagem da mistura através de uma pré-coluna.

[00100]Por exemplo, no contexto da purificação de lote, o material de HIC é preparado ou equilibrada ao tampão de equilibração desejado. Uma pasta fluida do material de HIC é obtida. A solução de anticorpo é colocada em contato com a pasta fluida para absorver o anticorpo a ser separado ao material de HIC. A solução que compreende as HCPs que não se ligam ao material de HIC é separada da pasta flu- ida, por exemplo, ao deixar a pasta fluida assentar e removendo o sobrenadante. A pasta fluida pode ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejado, a pasta fluida pode ser colocada em contato com uma solução de condutividade me- nor para dessorver os anticorpos que têm se ligado ao material de HIC. A fim de elu- ir os anticorpos ligados, a concentração de sal pode ser diminuída.

[00101]Enquanto que a cromatografia de troca iônica depende das cargas dos anticorpos para isolá-los, a cromatografia de interação hidrofóbica utiliza as pro- priedades hidrofóbicas dos anticorpos. Os grupos hidrofóbicos no anticorpo intera- gem com os grupos hidrofóbicos na coluna. Quanto mais hidrofóbica é uma proteína mais forte irá interagir com a coluna. Deste modo, a etapa de HIC remove as impu- rezas derivadas da célula hospedeira (por exemplo, DNA e outras espécies relacio- nadas a produto de baixo e alto peso molecular).

[00102]As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta intensidade iônica, portanto, esta forma de separação é convenientemente executada após as precipi- tações de sal ou procedimentos de troca iônica. A absorção do anticorpo em uma coluna de HIC é favorecida por altas concentrações de sal, mas as concentrações reais podem variar sobre uma ampla faixa dependendo da natureza do anticorpo e o ligante de HIC particular escolhido. Diversos íons podem ser dispostos em uma chamada série solufóbica dependendo de se promovem interações hidrofóbicas (efeitos de precipitação por sal (salting-out)) ou rompem a estrutura da água (efeito caotrópico) e conduzem ao enfraquecimento da interação hidrofóbica. Os cátions são classificados em termos de efeito de precipitação por sal crescente como Ba++; Ca++; Mg++; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+, enquanto que os ânions podem ser classificados em termos de efeito caotrópico crescente como P0---; S04--; CH3C03 -; CI-; Br-; N03-; ClO4-; I-; SCN-.

[00103]Em geral, os sulfatos de Na, K ou NH4 promovem de maneira eficaz a interação de ligante-proteína em HIC. Podem ser formulados os sais que influenci- am a intensidade da interação, conforme dado pela seguinte relação: (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN. Em geral, as concentrações de sal entre cerca de 0,75 e cerca de 2 M de sulfato de amônio ou entre cerca de 1 e 4 M de NaCl são úteis.

[00104]As colunas de HIC compreendem geralmente uma matriz base (por exemplo, agarose reticulada ou material de copolímero sintético) a qual os ligantes hidrofóbicos (por exemplo, grupos alquila e arila) são acoplados. Uma coluna de HIC adequada compreende uma resina de agarose substituída por grupos fenila (por exemplo, uma coluna de Fenil Sepharose™). Muitas colunas de HIC estão comerci- almente disponíveis. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, coluna de Fenil Sepharose™ 6 De fluxo rápido com baixa ou alta substituição (Pharmacia LKB Bio- technology, AB, Suécia); coluna de Fenil Sepharose™ De alto desempenho (Phar- macia LKB Biotechnology, AB, Suécia); coluna de Octil Sepharose™ De alto de- sempenho (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); colunas de Fractogel™ EMD Propil ou Fractogel™ EMD Fenil (E. Merck, Alemanha); suportes de Macro- Prep™ Meil ou Macro-Prep™ t-Butil (Bio-Rad, Califórnia); coluna de WP Hl-Propil (C3)™ (J. T. Baker, Nova Jersey); e colunas de Toyopearl™ éter, fenil ou butil (To- soHaas, PA). 4.7 Estratégias de purificação exemplificadoras

[00105]Em determinadas modalidades, a recuperação primária prossegue mediante o emprego inicial de etapas de centrifugação e filtração para remover célu- las e fragmentos de célula (que incluem HCPs) a partir da coleta do biorreator de produção. Por exemplo, mas não como forma de limitação, uma cultura que com- preende anticorpos, meios e células pode ser submetida à centrifugação em aproxi- madamente 7000 x g a aproximadamente 11.000 x g. Em determinadas modalida- des, o sobrenadante da amostra resultante é, então, passado através de um conjun- to de filtro que compreende múltiplos filtros de profundidade. Em determinadas mo- dalidades, o conjunto de filtro compreende em torno de doze filtros de profundidade de 40,64 centímetros (16 polegadas) Cuno™ modelo 30/60ZA (3M Corp.) e em torno de três alojamentos de filtro redondos equipados com três cartuchos de filtro de 76,2 centímetros (30 polegadas) 0,45/0,2 μm Sartopore™ 2 (Sartorius). O sobrenadante clarificado é coletado em um vaso, tal como um vaso de coleta pré-esterilizado, e mantido a aproximadamente 8°C. Esta temperatura é, então, ajustada para o apro- ximadamente 20°C antes da etapa ou etapas de cromatografia de captura descritas abaixo. Deve-se observar que um elemento versado na técnica pode variar as con- dições mencionadas acima e ainda serão incluídas no escopo da presente invenção.

[00106]Em determinadas modalidades, a recuperação primária será seguida pela cromatografia de afinidade com o uso da resina de proteína A. Existem diversas fontes comerciais para a resina de proteína A. Uma resina adequada consiste em MabSelect™ disponível junto a GE Healthcare. Um exemplo de uma coluna ade- quada embalada com MabSelect™ consiste em uma coluna de cerca de 1,0 cm de diâmetro x cerca de 21,6 cm de comprimento (~ 17 mL de volume de leito). Este ta- manho de coluna pode ser usado para escala de bancada. Isto pode ser comparado com outras colunas usadas para escalas ampliadas. Por exemplo, uma coluna de 20 cm x 21 cm cujo volume de leito é de cerca de 6,6 L pode ser usada para a produ- ção comercial. Independente da coluna, a coluna pode ser embalada com o uso de uma resina adequada, tal como MabSelect™.

[00107]Em determinados aspectos, a coluna de proteína A pode ser equili- brada com um tampão adequado antes do carregamento da amostra. Um exemplo de um tampão adequado consiste em um tampão de Tris/NaCl, pH de cerca de 6 a 8, que inclui, mas não se limita a, cerca de 7,2. Um exemplo específico de condições adequadas consiste em 25 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,2. Após esta equili- bração, a amostra pode ser carregada na coluna. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes com o uso, por exemplo, do tampão de equilíbrio. Outras lavagens que incluem as lavagens que empregam diferentes tampões podem ser usadas antes da eluição da coluna. Por exemplo, a coluna pode ser lavada com o uso de um ou mais volumes de coluna de 20 mM de ácido cítri- co/citrato de sódio, 0,5 M de NaCl em pH de cerca de 6,0. Esta lavagem pode ser opcionalmente seguida por uma ou mais lavagens com o uso do tampão de equilí- brio. A coluna de proteína A pode ser, então, eluída com o uso de um tampão de eluição adequado. Um exemplo de um tampão de eluição adequado consiste em um tampão de ácido acético/NaCl, pH em torno de 3,5. As condições adequadas são, por exemplo, 0,1 M de ácido acético, pH 3,5. O eluído pode ser monitorado com o uso de técnicas bem conhecidas pelos elementos versados na técnica. Por exemplo, a absorbância em OD280 pode ser em seguida. O eluído da coluna podem ser cole- tado começando com uma deflexão inicial de cerca de 0,5 AU a uma leitura de cerca de 0,5 AU na borda posterior do pico de eluição. A(s) fração(ões) de eluição de inte- resse podem ser, então, preparadas para o processamento adicional. Por exemplo, a amostra coletada pode ser submetida a titulação a um pH de cerca de 5,0 com o uso de Tris (por exemplo, 1,0 M) em um pH de cerca de 10. Opcionalmente, esta amostra titular pode ser filtrada e adicionalmente processada.

[00108]A capacidade de ligação dinâmica (DBC) da coluna de MabSelect™ pode ser determinada por uma única carga de taxa de fluxo ou estratégia de carga de fluxo dupla. A carga de taxa de fluxo única pode ser avaliada em uma velocidade de cerca de 300 cm/h por todo o período de carregamento. A estratégia de carga de taxa de fluxo dupla pode ser determinada pelo carregamento da coluna até cerca de 35 mg de proteína/mL de resina em uma velocidade linear de cerca de 300 cm/h, então, reduzindo a velocidade linear pela metade para permitir tempo de permanên- cia maior para a última parte da carga.

[00109]O eluído de proteína A pode ser, então, adicionalmente purificado ao empregar uma etapa de redução/inativação de vírus mediada por pH. Em determi- nadas modalidades, esta etapa irá envolver o ajuste do pH do eluído para entre cer- ca de 3 e cerca de 5, que inclui, mas não se limita a, cerca de 3,5, por aproximada- mente 1 hora. A redução de pH pode ser facilitada com o uso de preparações de ácido conhecidas, tais como ácido cítrico, por exemplo, 3 M de ácido cítrico. A expo- sição ao pH ácido reduz, se não elimina completamente, os contaminantes virais sensíveis a pH e precipita alguns contaminantes do meio/célula. Após esta etapa de redução/inativação viral, o pH é ajustado para cerca de 4,9 ou 5,0 com o uso de uma base, tal como hidróxido de sódio, por exemplo, 3 M de hidróxido de sódio, por cerca de vinte a cerca de quarenta minutos. Este ajuste pode ocorrer em torno de 20°C.

[00110]Em determinadas modalidades, a cultura de pH ajustado é adicio- nalmente purificada com o uso de uma coluna de troca aniônica. Um exemplo não limitador de uma coluna adequada para esta etapa consiste em uma coluna 60 cm de diâmetro x 30 cm de comprimento, cujo volume de leito é de cerca de 85 L. A co- luna é embalada com uma resina de troca aniônica, tal como Q Sepharose™ De flu- xo rápido disponível junto a GE Healthcare. A coluna pode ser equilibrada com o uso de cerca de sete volumes de coluna de um tampão adequado, tal como Tris/cloreto de sódio. Um exemplo de condições adequadas consiste em 25 mM de Tris, 50 mM de cloreto de sódio em pH 8,0. Um elemento versado na técnica pode variar as con- dições, mas continuam incluídas no escopo da presente invenção. A coluna é carre- gada com a amostra coletada a partir da etapa de purificação de proteína A descrita acima. Em outro aspecto, a coluna é carregada a partir do eluído coletado durante a troca catiônica. Após o carregamento da coluna, a coluna é lavada com o tampão de equilibração (por exemplo, o tampão de Tris/cloreto de sódio). O fluxo contínuo que compreende os anticorpos pode ser monitorado com o uso de um espectrofotômetro UV em OD280nm. Esta etapa de troca aniônica reduz as impurezas relacionadas ao processo, tais como ácidos nucléicos como DNA e proteínas de célula hospedeira. A separação ocorre devido ao fato de que os anticorpos de interesse não interagem substancialmente com nem se ligam à fase sólida da coluna, por exemplo, a Q Sepharose™, mas muitas impurezas interagem com e se ligam à fase sólida da co- luna. A troca aniônica pode ser executada a cerca de 12°C.

[00111]Em determinadas modalidades, a cultura de pH ajustado é, então, adicionalmente, purificada com o uso de uma coluna de troca catiônica. Em determi- nadas modalidades, o tampão de equilíbrio usado na coluna de troca catiônica con- siste em um tampão que tem um pH de cerca de 5,0. Um exemplo de um tampão adequado consiste em cerca de 210 mM de acetato de sódio, pH 5,0. Após a equili- bração, a coluna é carregada com a amostra preparada a partir da etapa de recupe- ração primária acima. A coluna é embalada com uma resina de troca catiônica, tal como CM Sepharose™ De fluxo rápido disponível junto a GE Healthcare. A coluna é, então, lavada com o uso do tampão de equilíbrio. A coluna é, em seguida, subme- tida a uma etapa de eluição com o uso de um tampão que tem uma intensidade iôni- ca maior, conforme comparado com o tampão de lavagem ou equilibração. Por exemplo, um tampão de eluição adequado pode ser de cerca de 790 mM de acetato de sódio, pH 5,0. Os anticorpos serão eluídos e podem ser monitorados com o uso de um espectrofotômetro UV ajustado em OD280nm. Em um exemplo particular, a co- leta de eluição pode ser a partir do lado superior 3 OD280nm ao lado inferior 8 OD280nm. Deve-se compreender que um elemento versado na técnica pode variar as condições e ainda se incluírem no escopo da invenção.

[00112]Em determinadas modalidades, a cultura de pH ajustado, o eluído de troca catiônica ou o eluído de troca aniônica, é filtrada com o uso, por exemplo, de um filtro delipid de 40,64 centímetros (16 polegadas) Cuno™. Esta filtração, com o uso do filtro delipid, pode ser acompanhada, por exemplo, por um cartucho de filtro de bicamada de 76,2 centímetros (30 polegadas) 0,45/0,2 μm Sartopore™. O tam- pão de eluição de troca iônica pode ser usado para lavar o volume residual rema- nescente nos filtros e preparado para a ultrafiltração/diafiltração.

[00113]Com a finalidade de completar a etapa de ultratfiltração/diafiltração, o meio de filtração é preparado em um tampão adequado, por exemplo, 20 mM de fos- fato de sódio, pH 7,0. Um sal, tal como cloreto de sódio, pode ser adicionado para aumentar a intensidade iônica, por exemplo, 100 mM de cloreto de sódio. Esta etapa de ultratfiltração/diafiltração serve para concentrar os anticorpos anti-IL-13, remover o acetato de sódio e ajustar o pH. Os filtros comerciais estão disponíveis para efetu- ar esta etapa. Por exemplo, a Millipore fabrica um cassete de membrana de ultrafiltro de celulose de peso molecular de corte de 30 kD (MWCO). Este procedimento de filtração pode ser conduzido em ou em torno da temperatura ambiente.

[00114]Em determinadas modalidades, a amostra a partir da etapa de filtra- ção de captura acima é submetida a uma segunda etapa de separação de troca iô- nica. Esta segunda separação de troca iônica irá, em determinadas modalidades, envolver a separação com base na carga oposta da primeira separação de troca iô- nica. Por exemplo, se uma etapa de troca aniônica for empregada após a recupera- ção primária, a segunda etapa cromatográfica de troca iônica pode consistir em uma etapa de troca catiônica. De modo oposto, se a etapa de recuperação primária for seguida por uma etapa de troca catiônica, esta etapa será seguida por uma etapa de troca aniônica. Em determinadas modalidades, o primeiro eluído de troca iônica po- de ser submetido diretamente à segunda etapa cromatográfica de troca iônica onde o primeiro eluído de troca iônica é ajustado às condições de tampão adequadas. As condições e materiais de separação aniônica e catiônica adequados são descritos acima.

[00115]Em determinadas modalidades da presente invenção, a amostra que contém anticorpos será adicionalmente processada com o uso de uma etapa de inte- ração hidrofóbica de separação. Um exemplo não limitador de uma coluna adequada para tal etapa consiste em uma coluna de 80 cm de diâmetro x 15 cm de compri- mento, cujo volume de leito é de cerca de 75 L, a qual é embalada com uma resina adequada usada para HIC, tal como, mas não se limita a, Fenil HP Sepharose™ disponível junto a Amersham Biosciences, Upsala, Suécia. A preparação de fluxo contínuo obtida a partir da etapa cromatográfica de troca aniônica anterior que com- preende os anticorpos de interesse pode ser diluída com um volume igual em torno de 1,7 M de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. Isto pode, então, ser submetido à filtração com o uso de um filtro de bicamada 0,45/0,2 μm Sartopo- re™ 2 ou seu equivalente. Em determinadas modalidades, o procedimento de cro- matografia hidrofóbica envolve dois ou mais ciclos.

[00116]Em determinadas modalidades, a coluna de HIC é primeiro equilibra- da com o uso de um tampão adequado. Um exemplo não limitador de um tampão adequado consiste em 0,85 M de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. Um elemento versado na técnica pode variar o tampão de equilíbrio e permane- cer no escopo da presente invenção, mediante a alteração das concentrações dos agentes de tamponamento e/ou mediante a substituição de tampões equivalentes. Em determinadas modalidades, a coluna é, então, carregada com uma amostra de fluxo contínuo de troca aniônica e lavada múltiplas vezes, por exemplo, três vezes, com um sistema de tampão adequado, tal como sulfato de amônio/fosfato de sódio. Um exemplo de um sistema de tampão adequado inclui o tampão de 1,1 M de sulfa- to de amônio, 50 mM de fosfato de sódio com um pH de em torno de 7,0. Opcional- mente, a coluna pode passar por ciclos de lavagem adicionais. Por exemplo, um se- gundo ciclo de lavagem pode incluir múltiplas lavagens de coluna, por exemplo, uma a sete vezes, com o uso de um sistema de tampão adequado. Um exemplo não limi- tador de um sistema de tampão adequado inclui 0,85 M de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. Em um aspecto, a coluna carregada ainda passa por uma terceira lavagem com o uso de um sistema de tampão adequado. A coluna pode ser lavada múltiplas vezes, por exemplo, uma a três vezes, com o uso de um sistema de tampão, tal como 1,1 M de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de sódio em um pH em torno de 7,0. Novamente, um elemento versado na técnica pode vari- ar as condições de tamponamento e continuar dentro do escopo da presente inven- ção.

[00117]A coluna é eluída com o uso de um tampão de eluição adequado. Um exemplo adequado de tal tampão de eluição consiste em 0,5 M de sulfato de amônio, 15 mM de fosfato de sódio em um pH em torno de 7,0. Os anticorpos de interesse podem ser detectados e coletados com o uso de um espectrofotômetro convencional a partir do lado superior em 3 OD280nm ao lado inferior do pico em 3 OD280nm.

[00118]Em determinados aspectos da invenção, o eluído a partir da etapa de cromatografia hidrofóbica é submetido à filtração para a remoção de partículas vi- rais, que incluem vírus intatos, se presentes. Um exemplo não limitador de um filtro adequado consiste no filtro Ultipor DV50™ disponível junto a Pall Corporation. Ou- tros filtros virais podem ser usados nesta etapa de filtração e são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. O eluído de HIC é passado através de um fil- tro pré-umedecido de cerca de 0,1 μm e um conjunto de filtro de 5,08 x 76,2 centí- metros (2 x 30 polegadas) Ultipor DV50™ a em torno de 34 psig. Em determinadas modalidades, após o processo de filtração, o filtro é lavado com o uso, por exemplo, do tampão de eluição de HIC a fim de remover quaisquer anticorpos retidos no alo- jamento do filtro. O filtrado pode ser armazenado em um recipiente pré-esterilizado a em torno de 12°C.

[00119]Em determinadas modalidades, o filtrado acima é novamente subme- tido à ultrafiltração/diafiltração. Esta etapa é importante se uma finalidade do profis- sional consistir no uso do anticorpo, por exemplo, em uma formulação farmacêutica. Este processo, se empregado, pode facilitar a concentração do anticorpo, remoção de sais de tamponamento anteriormente usados e substituí-los por um tampão de formulação particular. Em determinadas modalidades, é executada a diafiltração contínua com múltiplos volumes, por exemplo, dois volumes, de um tampão de for- mulação. Um exemplo não limitador de um tampão de formulação adequado consis- te no tampão de 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0,5% de sucrose, pH 5,9 (sem Tween). Sob a completação desta troca de diavolume, os anticorpos são concentra- dos. Uma vez que uma concentração predeterminada de anticorpo tenha sido alcan- çada, então, um profissional pode calcular a quantidade de Tween a 10% que deve- ria ser adicionada para se chegar a uma concentração final de Tween de cerca de 0,005% (em volume).

[00120]Determinadas modalidades da presente invenção irão incluir etapas de purificação adicionais. Os exemplos de procedimentos de purificação adicionais que podem ser executados antes, durante ou após o método de cromatografia de troca iônica incluem precipitação de etanol, focalização isoelétrica, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose™, cromato- grafia de troca aniônica adicional e/ou cromatografia de troca catiônica adicional, cromatofocalizaão, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade (por exem- plo, com o uso de proteína G, um anticorpo, um substrato, ligante ou antígeno espe- cífico como reagente de captura).

[00121]Em determinadas modalidades da presente invenção, o anticorpo an- ti-IL-13 consiste em um anticorpo de isotipo IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgM que compreende as sequências de região variável de cadeia pesada e leve descritas na Figura 1. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 consiste em um anticorpo de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende as sequências de região variável de cadeia pesada e leve descritas na Figura 1. 5. Métodos de ensaio da pureza da amostra 5.1 Ensaio de proteína de célula hospedeira

[00122]A presente invenção também fornece métodos para a determinação dos níveis residuais de concentração de proteína de célula hospedeira (HCP) na composição de anticorpo isolado/purificado. Conforme descrito acima, as HCPs são desejavelmente excluídas do produto de substância alvo final, por exemplo, o anti- corpo anti-IL-13. As HCPs exemplificadoras incluem as proteínas que se originam a partir da fonte da produção de anticorpo. A falha na identificação e remoção suficien- te das HCPs a partir do anticorpo alvo pode conduzir à eficácia reduzida e/ou rea- ções particulares adversas.

[00123]Para uso na presente invenção, o termo "HCP ELISA" se refere a um ELISA onde o segundo anticorpo usado no ensaio é específico para as HCPs produ- zidas a partir de células, por exemplo, células CHO, usadas para gerar o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-IL-13). O segundo anticorpo pode ser produzido de acordo com os métodos convencionais conhecidos pelos elementos versados na técnica. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser produzido com o uso de HCPs obtidas por procedimentos de produção e purificação simulada, isto é, a mesma li- nha de célula usada para produzir o anticorpo de interesse é usada, mas a linha de célula não é transfectada com o DNA do anticorpo. Em uma modalidade exemplifi- cadora, o segundo anticorpo é produzido com o uso de HPCs similares àquelas ex- pressas no sistema de expressão celular de escolha, isto é, o sistema de expressão celular usado para produzir o anticorpo alvo.

[00124]Geralmente, o ELISA de HCP compreende colocar uma amostra lí- quida que compreende HCPs entre duas camadas de anticorpos, isto é, um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo. A amostra é incubada durante o tempo em que as HCPs na amostra são capturadas pelo primeiro anticorpo, por exemplo, mas não se limita a, anti-CHO de cabra, purificado por afinidade (Cygmis). Um segundo anti- corpo marcado, ou mistura de anticorpos, específico para as HCPs produzidas a partir das células usadas para gerar o anticorpo, por exemplo, HCP anti-CHO biotini- ladas, é adicionado e se liga às HCPs dentro da amostra. Em determinadas modali- dades, o primeiro e segundo anticorpos consistem em anticorpos policlonais. Em determinados aspectos, o primeiro e segundo anticorpos consistem em misturas de anticorpos policlonais criados contra HCPs, por exemplo, mas não se limita a, mistu- ra de anti-proteína de célula hospedeira de cabra biotinilada 599/626/748. A quanti- dade de HCP contida na amostra é determinada com o uso do teste adequado com base no rótulo do segundo anticorpo.

[00125]O ELISA de HCP pode ser usado para a determinação do nível de HCPs em uma composição de anticorpo, tal como um eluído ou fluxo contínuo obti- do com o uso do processo descrito acima. A presente invenção também fornece uma composição que compreende um anticorpo, em que a composição não tem ní- vel detectável de HCPs, conforme determinado por um ensaio imunoabsorvente li- gado à enzima de HCP ("ELISA"). 5.2 Ensaio de material cromatográfico de afinidade

[00126]Em determinadas modalidades, a presente invenção também fornece métodos para a determinação dos níveis residuais de material cromatográfico de afinidade na composição de anticorpo isolado/purificado. Em determinados contex- tos, tal material lixívia na composição de anticorpo durante o processo de purifica- ção. Em determinadas modalidades, um ensaio para a identificação da concentração de proteína A na composição de anticorpo isolado/purificado é empregado. Para uso na presente invenção, o termo "ELISA de proteína A" se refere a um ELISA onde o segundo anticorpo usado no ensaio é específico à proteína A empregada para purifi- car o anticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo anti-IL-13. O segundo anti- corpo pode ser produzido de acordo com os métodos convencionais conhecidos pe- los elementos versados na técnica. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser pro- duzido com o uso de proteína A recombinante ou de ocorrência natural, no contexto de métodos convencionais para a geração e produção de anticorpo.

[00127]Geralmente, o ELISA de proteína A compreende colocar uma amos- tra líquida que compreende a proteína A (ou que possivelmente contém proteína A) entre duas camadas de anticorpos anti-proteína A, isto é, um primeiro anticorpo anti- proteína A e um segundo anticorpo anti-proteína A. A amostra é exposta a uma pri- meira camada de anticorpo anti-proteína A, por exemplo, mas não se limita a, anti- corpos policlonais ou misturas de anticorpos policlonais, e incubada por um período suficiente para que a proteína A na amostra seja capturada pelo primeiro anticorpo. Um segundo anticorpo marcado, por exemplo, mas não se limita a, anticorpos poli- clonais ou misturas de anticorpos policlonais, específicos à proteína A é, então, adi- cionado e se liga à proteína A capturada dentro da amostra. Os exemplos não limi- tadores adicionais de anticorpos anti-proteína A úteis no contexto da presente inven- ção incluem anticorpos anti-proteína A de galinha e anti-proteína A biotinilada. A quantidade de proteína A contida na amostra é determinada com o uso do teste adequado com base no rótulo do segundo anticorpo. Ensaios similares podem ser empregados para identificar a concentração de materiais cromatográficos de afini- dade alternativos.

[00128]O ELISA de proteína A pode ser usados para a determinação do ní- vel de proteína A em uma composição de anticorpo, tal como um eluído ou fluxo contínuo obtido com o uso do processo descrito acima. A presente invenção também fornece uma composição que compreende um anticorpo, em que a composição não tem nível detectável de proteína A, conforme determinado por um ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima de proteína A ("ELISA"). 6. Modificações adicionais

[00129]Os anticorpos da presente invenção podem ser modificados. Em al- gumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mes- mos são quimicamente modificados para fornecer um efeito desejado. Por exemplo, a peguilação de anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção pode ser reali- zada por meio de qualquer uma das reações de peguilação conhecidas na técnica, conforme descrito, por exemplo, nas seguintes referências: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; e EP 0 401 384, cada uma das quais está aqui incor- porada a título de referência, em sua totalidade. Em um aspecto, a peguilação é rea- lizada através de uma reação de acrilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análo- go). Um polímero solúvel em água adequado para a peguilação dos anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção consiste no polietileno glicol (PEG). Para uso na presente invenção, o "polietileno glicol" se destina a incluir qualquer uma das formas de PEG que têm sido usadas para derivar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi- polietileno glicol.

[00130]Os métodos para a preparação de anticorpos e fragmentos de anti- corpo peguilados da invenção irá compreender, geralmente, as etapas de (a) reagir o anticorpo ou fragmento de anticorpo com polietileno glicol, tal como um derivado de aldeído ou éster reativo de PEG, sob condições adequadas, de modo que o anti- corpo ou fragmento de anticorpo fique fixado a um ou mais grupos PEG, e (b) obter os produtos de reação. Será evidente para um elemento versado na técnica selecio- nar as condições de reação ótimas ou as reações de acrilação com base nos parâ- metros conhecidos e no resultado desejado.

[00131]Os anticorpos e fragmentos de anticorpo peguilados específico para IL-13 podem ser geralmente usados para tratar distúrbios relacionados a IL-13 da invenção por meio da administração dos anticorpos anti-IL-13 e fragmentos de anti- corpo descritos no presente documento. Geralmente, os anticorpos e fragmentos de anticorpo peguilados têm meia-vida aumentada, conforme comparado com os anti- corpos e fragmentos de anticorpo não peguilados. Os anticorpos e fragmentos de anticorpo não peguilados podem ser empregados sozinhos, em conjunto ou em combinação com outras composições farmacêuticas.

[00132]Um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Con- sequentemente, os anticorpos e parte de anticorpos da invenção são destinados a incluir as formas derivadas e de outra forma modificadas dos anticorpos anti-hIL-13 humana descritos no presente documento, que incluem as moléculas de imunoade- são. Por exemplo, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser ligado de forma funcional (por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), uma agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou parte de anticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou uma etiqueta de polihistidina).

[00133]Um tipo de anticorpo derivado é produzido mediante a reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, que têm dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador adequado (por exemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de disuccinimidil). Tais ligantes estão disponíveis junto a Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

[00134]Os agentes detectáveis úteis com os quais um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser derivado incluem compostos fluorescentes. Os agentes detectáveis fluorescentes adequados incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonil, ficoeritrina e similares. Um anticorpo também pode ser derivado com enzimas detectáveis, tais como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, glicose oxidase e similares. Quando um anticorpo é derivado com uma enzima detectável, é detectado mediante a adição de reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase de rábano silvestre está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina con- duz a um produto de reação colorido, o qual é detectável. Um anticorpo também po- de ser derivados com biotina e detectados através da medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. 7. Composições farmacêuticas

[00135]Os anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem ser incorpo- rados em composições farmacêuticas adequadas para a administração a um indiví- duo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para uso na pre- sente invenção, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngi- cos, agentes de retardo de absorção e isotônicos, e similares, que são fisiologica- mente compatíveis. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais dentre água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, assim como combinações dos mesmos. Em muitos casos, é desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polial- coóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender, adicionalmente, pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsifi- cantes, conservantes ou tampões, os quais otimizam a vida útil ou efetividade do anticorpo ou parte de anticorpo.

[00136]Os anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem ser incorpo- rados em uma composição farmacêutica adequada para a administração parenteral. O anticorpo ou partes de anticorpo podem ser preparados como uma solução injetá- vel que contém, por exemplo, 0,1 a 250 mg/mL de anticorpo. A solução injetável po- de ser composta de uma forma de dosagem líquida ou liofilizada em um frasco de âmbar ou sílex, ampola ou seringa pré-preenchida. O tampão pode consistir em L- histidina aproximadamente 1 a 50 mM, (de forma ótima, 5 a 10 mM), em pH 5,0 a 7,0 (de forma ótima, pH 6,0). Outros tampões adequados incluem, mas não se limitam a, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. O clore- to de sódio pode ser usado para modificar a toxicidade da solução em uma concen- tração de 0 a 300 mM (de forma ótima, 150 mM para uma forma de dosagem líqui- da). Os crioprotetores podem ser incluídos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente, 0 a 10% de sucrose (de forma ótima, 0,5 a 1,0%). Outros crioproteto- res adequados incluem trealose e lactose. Os agentes avolumadores podem ser in- cluídos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente, 1 a 10% de manitol (de forma ótima, 24%). Os estabilizantes podem ser usados tanto na forma de dosa- gem liofilizada como líquida, principalmente, 1 a 50 mM de L-metionina (de forma ótima, 5 a 10 mM). Outros agentes avolumadores adequados incluem glicina, argini- na, podem ser incluídos como 0 a 0,05% de polisorbato-80 (de forma ótima, 0,005 a 0,01%). Os tensoativos adicionais incluem, mas não se limitam a, tensoativos de polisorbato 20 e BRIJ.

[00137]Em um aspecto, a composição farmacêutica inclui o anticorpo em uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg. Em outro aspecto, as dosagens do anticorpo incluem aproximadamente 1 mg/kg administradas em semanas alterna- das, ou aproximadamente 0,3 mg/kg administrados semanalmente. Um elemento versado na técnica pode avaliar a dosagem e regime adequado para a administra- ção a um indivíduo.

[00138]As composições desta invenção podem ser em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e sóli- da, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dis- persões ou suspensões, tabletes, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma depende, por exemplo, do modo de administração pretendido e da aplicação tera- pêutica. As composições típicas são na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como as composições similares àquelas usadas para a imunização passiva de humanos com outros anticorpos. Um modo de administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Em um aspecto, o anticorpo é administrado por injeção ou infusão intravenosa. Em outro aspecto, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00139]As composições terapêuticas precisam ser tipicamente esteriles e es- táveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutu- ra ordenada adequada para a alta concentração de fármaco. As soluções injetáveis esteriles podem ser preparadas mediante a incorporação do composto ativo (isto é, anticorpo ou parte de anticorpo) na quantidade exigida em um solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguida pela esterilização de filtrado. Geralmente, as dispersões são preparadas mediante a incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos a partir daqueles enume- rados acima. No caso de pós liofilizados esteriles para a preparação de soluções injetáveis esteriles, os métodos de preparação consistem em secagem a vácuo e secagem por aspersão que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingredi- ente desejado adicional a partir de uma solução filtrada previamente estéril do mes- mo. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigi- do no caso da dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de com- posições injetáveis pode ser ocasionada mediante a inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00140]Os anticorpos e partes de anticorpo da presente invenção podem ser administrados por meio de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, uma via/modo de administração consiste na injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infusão. Conforme será observado pelo elemento versado na técnica, a via e/ou mo- do de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Em determi- nadas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra a rápida liberação, tal como uma formulação de libera- ção controlada, que inclui implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de libera- ção microencapsulados. Os polímeros biocompatíveis e biodegradáveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formula- ções são patenteados ou geralmente conhecidos pelos elementos versados na téc- nica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência.

[00141]Em determinados aspectos, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também podem ser incluídos em uma cápsula de gelatina de casca dura ou mole, comprimidos em tabletes, ou diretamente incorporados na dieta do indivíduo. Para a administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipien- tes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes orais, pastilhas, cápsulas, elixi- res, suspensões, xaropes, discos, e similares. Para administrar um composto da in- venção por meio de outra administração além da parenteral, pode ser necessário revestir o composto com ou coadministrar o composto com um material para evitar sua inativação.

[00142]Os compostos ativos suplementares também podem ser incorpora- dos nas composições. Em determinados aspectos, um anticorpo ou parte de anti- corpo da invenção é coformulado com e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que são úteis para o tratamento de distúrbios, nos quais a atividade de IL-13 é prejudicial. Por exemplo, um anticorpo anti-hIL- 13 ou parte de anticorpo da invenção pode ser co- formulado e/ou co-administrado com um ou mais anticorpos adicionais que ligam outros alvos (por exemplo, anticorpos que ligam ou- tras citocinas ou que ligam moléculas de superfície de célula). Adicionalmente, um ou mais anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos mencionados anteriormente. Tais terapias de combi- nação podem utilizar vantajosamente dosagens menores dos agentes terapêuticos administrados, evitando, assim, possíveis toxicidades ou complicações associadas às diversas monoterapias. O elemento versado na técnica irá observar que quando os anticorpos da invenção são usados como parte de uma terapia de combinação, uma dosagem menor do anticorpo pode ser desejável do que quando o anticorpo sozinho é administrado a um indivíduo (por exemplo, um efeito terapêutico sinérgico pode ser alcançado através do uso da terapia de combinação que, por sua vez, permite o uso de uma dose menor do anticorpo para se alcançar o efeito terapêutico desejado).

[00143]Deve-se compreender que os anticorpos da invenção ou parte de li- gação de antígeno dos mesmos podem ser usados sozinhos ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, sendo que o dito agente adicional é selecionado pelo elemento versado na técnica para seu propósito pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode consistir em um agente terapêuti- co reconhecido na técnica como sendo útil para tratar a doença ou condição que é tratada pelo anticorpo da presente invenção. O agente adicional também pode con- sistir em um agente que confere um atributo benéfico para a composição terapêuti- ca, por exemplo, um agente que afeta a viscosidade da composição.

[00144]Deve-se compreender, adicionalmente, que as combinações que de- vem ser incluídas nesta invenção são aquelas combinações úteis para seu propósito pretendido. Os agentes apresentados abaixo são ilustrativos e não se destinam ser limitadores. As combinações que são parte desta invenção podem consistir nos anti- corpos da presente invenção e ao menos um agente adicional selecionado a partir das listas abaixo. A combinação também pode incluir mais do que um agente adicio- nal, por exemplo, dois ou três agentes adicionais, se a combinação for de tal modo que a composição formada possa executar sua função pretendida.

[00145]Algumas combinações consistem em fármaco(s) anti-inflamatório(s) não-esteróide(s) também mencionados como NSAIDS, os quais incluem os fárma- cos como ibuprofeno. Outras combinações consistem em corticosteróides que inclu- em prednisolona; os efeitos colaterais bem conhecidos do uso de esteroide podem ser reduzidos ou até eliminados mediante a redução da dose de esteroide exigida quando se trata pacientes em combinação com os anticorpos desta invenção. Os exemplos não limitadores de agentes terapêuticos para artrite reumatoide com os quais um anticorpo, ou parte de anticorpo, da invenção pode ser combinado incluem os seguintes: fármaco(s) anti-inflamatórios supressores de citocina (CSAIDs); anti- corpos a ou antagonistas de outras citocinas humanas ou fatores de crescimento, por exemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM- CSF, FGF e PDGF. Os anticorpos da invenção, ou parte de ligação de antígenos dos mesmos, podem ser combinados com os anticorpos a moléculas de superfície de célula, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, ou seus ligantes, que incluem CD 154 (gp39 ou CD40L).

[00146]Algumas combinações de agentes terapêuticos podem interferir em diferentes pontos na cascata inflamatória subsequente e autoimune; os exemplos incluem antagonistas de TNF como anticorpos de TNF quimérico, humanizado ou humano, D2E7, (pedido U.S. no. serial 08/599.226, depositado em 9 de fevereiro de 1996, cuja instrução integral está aqui incorporada a título de referência), cA2 (Re- micade™), CDP 571, fragmentos de anticorpo anti-TNF (por exemplo, CDP870), e receptores de TNF p55 ou p75 solúveis, derivados dos mesmos, (P75TNFRIgG (En- brel™) ou p55TNFRl gG (Lenercept), receptor de IL-13 solúvel (sIL- 13), e também inibidores de enzima de conversão de TNFcc (TACE); semelhantemente, os inibido- res de IL-1 (por exemplo, inibidores de enzima de conversão de interleucina-1, tais como Vx740, ou IL-1RA, etc.) podem ser eficazes pela mesma razão. Outras combi- nações incluem interleucina 11, anti-P7s e ligante de glicoproteína p-selectina (PSGL). Mais outras combinações envolvem outros elementos essenciais da respos- ta autoimune que podem agir paralelos a, dependente de ou de acordo com a fun- ção de IL-13. Ainda outra combinação inclui os inibidores anti-CD4 de não-depleção. Mais outras combinações incluem antagonistas da via co-estimulante CD80 (B7.1) ou CD86 (B7.2) que incluem os anticorpos, receptores solúveis ou ligantes de anta- gonista.

[00147]Os anticorpos da invenção, ou parte de ligação de antígenos dos mesmos, também podem ser combinados com agentes, tais como metotrexato, 6- MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular e oral), azatioprina, colchicina, corticoste- róides (oral, inalado e injeção local), agonistas de adrenoreceptor β-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotifeno, ipratrópio e oxittrópio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mo- fetil, leflunomida, NSAIDs, por exemplo, ibuprofeno, corticosteroides, tais como prednisolona, inibidores de fosfodiesterase, agonistas de adensosina, agentes anti- trombóticos, inibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfe- rem com a sinalização por citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFα ou IL-1 (por exemplo, inibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP quinase), inibidores de enzima de conversão de IL-1β (por exemplo, Vx740), anti-P7s, ligante de glicoproteína p- selectina (PSGL), inibidores de enzima de conversão de TNFα (TACE), inibidores de sinalização de célula T, tais como inibidores de quinase, inibidores de metaloprotei- nase, sulfasalazina, azatioprina, 6- mercaptopurinas, inibidores de enzima de con- versão de angiotensina, receptores de citocina solúveis e derivados dos mesmos (por exemplo, receptores de p55 ou p75 TNF solúveis e os derivados p75TNFRIgG (Enbrel.TM.) e p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1 RI, sIL- 1RII, sIL-6R, receptor de IL- 13 solúvel (sIL-1 )) e citocina anti-inflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 e TGFβ). Algumas combinações incluem metotrexato ou leflunomida e em casos de artrite reumatóide severa ou moderada, ciclosporina.

[00148]As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por período de tempo ne- cessário, para se alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz do anticorpo ou parte de anticorpo pode variar de acordo com os fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a ca- pacidade do anticorpo ou parte de anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também consiste em uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou parte de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilatica- mente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quanti- dade terapeuticamente eficaz.

[00149]Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a res- posta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas no decorrer do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Em de- terminadas modalidades, é especialmente vantajoso formular composições parente- rais na forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e uniformi- dade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, para uso na presente invenção, se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade que compreende uma quanti- dade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico exigido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é estipulada por e diretamente de- pendente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na técnica da composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[00150]Uma faixa não limitadora e exemplificadora para uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou parte de anticorpo da in- venção é de 0,01 a 20 mg/kg, 1 a 10 mg/kg ou 0,3 a 1 mg/kg. Deve-se observar que os valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser ali- viada. Deve-se compreender adicionalmente que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados no decorrer do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional do indivíduo que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem apresentadas no presente documento são somente exemplificadoras e não se destinam a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. 8. Usos dos anticorpos da invenção 8.1 Usos do Anticorpo anti-IL-13 em geral

[00151]Dada sua capacidade de ligar-se a IL-13, os anticorpos anti-IL-13, ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, da invenção podem ser usados para detectar IL- 13, em um aspecto, a hIL-13 (por exemplo, em uma matriz de amostra, em um aspecto, uma amostra biológica, tal como soro ou plasma), com o uso de um imunoensaio convencional, tal como um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imunohistoquímica de tecido. A invenção fornece um método para a detecção de IL-13 em uma amostra biológica que com- preende colocar em contato uma amostra com um anticorpo, ou parte de anticorpo, da invenção e detectar o anticorpo ligado a IL-13 ou anticorpo não ligado, para de- tectar, assim, a IL-13 na amostra. O anticorpo é direta ou indiretamente marcado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem diversas enzimas, grupos protésicos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfa- tase alcalina, β- galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupo protésico adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e os exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. A detecção de IL-13 em uma amostra pode ser útil em um contexto de diagnóstico, por exemplo, na diagnose de uma condição associada com a IL-13 aumentada e/ou pode ser útil na identificação de um indivíduo que pode ser beneficiar do tratamento com um anti- corpo anti-IL-13.

[00152]Como uma alternativa para os ensaios de detecção que envolvem anticorpo anti-IL-13 marcado, a IL-13 pode ser detectada em uma amostra por um imunoensaio de competição que utiliza, por exemplo , padrões de rhIL-13 marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IL-13 não marcado, tal como um anticorpo anti-hIL-13. Neste ensaio, a amostra, os padrões de rhIL-13 marcados e o anticorpo anti-hIL-13 são combinados e a quantidade de padrão de rhIL-13 marcado ligado ao anticorpo não marcado é determinada. A quantidade de hIL- 13 na amostra é inversamente proporcional à quantidade de padrão de rhIL-13 marcado ligado ao anticorpo anti-hIL-13.

[00153]Os anticorpos e parte de anticorpos da invenção são capazes de neutralizar a atividade de IL-13 in vitro e in vivo, em um aspecto, uma atividade de hIL-13. Consequentemente, os anticorpos e parte de anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a atividade de IL-13, por exemplo, em uma cultura de célula que contém IL-13, em indivíduos humanos ou em outras espécies mamíferas que têm IL-13 com a qual um anticorpo da invenção tem reação cruzada (por exemplo, primatas, tais como babuíno, macaco-caranguejeiro e reso). Em um aspecto, a in- venção fornece um anticorpo humano isolado, ou parte de ligação de antígeno do mesmo, que neutraliza a atividade de IL-13 humana, e ao menos uma IL-13 primata adicional selecionada a partir do grupo que consiste em IL-13 de babuíno, IL-13 de sagui, IL- 13 de chimpanzé, IL-13 de macaco-caranguejeiro e IL-13 de reso, mas não neutraliza a atividade da IL-13 de camundongo. Em um aspecto, a IL-13 é IL-13 humana. Por exemplo, em uma cultura de célula que contém, ou é suspeita de con- ter hIL-13, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser adicionado ao meio de cultura para inibir a atividade de hIL-13 na cultura.

[00154]Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a inibição da atividade de IL-13 em um indivíduo que sofre de um distúrbio em que a atividade de IL-13 é prejudicial. Para uso na presente invenção, a frase "um distúrbio em que a atividade de IL-13 é prejudicial" se destina a incluir doenças e outros distúrbios em que a presença de IL-13 em um indivíduo que sofre do distúrbio tem se mostrado ser ou é suspeita de ser responsável pela patofisiologia do distúrbio ou um fator que contribui para a piora do distúrbio. Consequentemente, um distúrbio em que a ativi- dade de IL-13 é prejudicial consiste em um distúrbio em que a inibição da atividade de IL-13 é esperada para aliviar os sintomas e/ou progresso do distúrbio. Tais dis- túrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração de IL-13 em um fluido biológico de um indivíduo que sofre do distúrbio (por exemplo, um aumento na concentração de IL-13 em soro, plasma, fluido sinovial, etc. do indi- víduo), a qual pode ser detectada, por exemplo, com o uso de um anticorpo anti- IL- 13, conforme descrito acima. Em um aspecto, os anticorpos ou parte de ligação de antígenos dos mesmos, podem ser usados na terapia para tratar as doenças ou dis- túrbios descritos no presente documento. Em outro aspecto, os anticorpos ou parte de ligação de antígenos dos mesmos, podem ser usados para a fabricação de um remédio para o tratamento das doenças ou distúrbios descritos no presente docu- mento. Existem inúmeros exemplos de distúrbios em que a atividade de IL-13 é pre- judicial. Por exemplo, a IL-13 desempenha um papel crítico na patologia associada com uma variedade de doenças que envolvem elementos imunes e inflamatórios, que incluem, mas não se limitam a, distúrbios respiratórios, tais como asma e doen- ça pulmonar obstrutiva crônica. Os distúrbios adicionais relacionados a IL-13 inclu- em, mas não se limitam a: distúrbios atópicos (por exemplo, dermatite atópica e rini- te alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes da pele, órgãos gastrointesti- nais (por exemplo, doenças inflamatórias intestinais (IBD), tais como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), e fígado (por exemplo, cirrose, fibrose); escleroderma; tumo- res ou cânceres, por exemplo, linfoma de Hodgkin.

[00155]Consequentemente, os anticorpos anti-IL-13, partes de ligação de antígeno dos mesmos ou vetores que expressam os mesmos in vivo são indicados para o tratamento de doenças, tais como asma ou outras condições inflamatórias e/ou autoimunes em que há uma expressão anormal de IL-13, conduzindo a um ex- cesso de IL-13 ou em casos de complicações devido à IL-13 administrada de forma exógena. 8.2 Uso de anticorpo anti-IL-13 em distúrbios respiratórios

[00156]Em determinadas modalidades da presente invenção, um anticorpo anti-IL-13, ou parte de ligação de antígeno do mesmo, é empregado no tratamento de um ou mais distúrbios associados a IL- 13, que incluem, mas não se limita a, dis- túrbios respiratórios (por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica ou não alérgi- ca (por exemplo, asma devido à infecção com, por exemplo, vírus sincicial respirató- rio (RSV), por exemplo, em crianças mais jovens)), doença pulmonar obstrutiva crô- nica (COPD) e outras condições que envolvem inflamação das vias aéreas, eosinofi- lia, fibrose e produção de muco em excesso, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar.

[00157]Em determinadas modalidades, este pedido fornece métodos de tra- tamento (por exemplo, redução, melhora) ou prevenção de um ou mais sintomas associados com um distúrbio respiratório, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica ou não alérgica); alergias; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); uma condição que envolve inflamação das vias aéreas, eosinofilia, fibrose e produção de muco em excesso, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar. Por exemplo, os sintomas de asma incluem, mas não se limitam a, sibilação, falta de ar, broncocons- trição, hiperreatividade das vias aéreas, capacidade reduzida do pulmão, fibrose, inflamação das vias aéreas e produção de muco. O método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo de IL-13, ou um fragmento do mesmo, em uma quantida- de suficiente para tratar (por exemplo, reduzir, melhorar) ou prevenir um ou mais sintomas. O anticorpo de IL-13 pode ser administrado de forma terapêutica ou profi- lática, ou ambas. O antagonista IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13, ou frag- mento do mesmo, pode ser administrado ao indivíduo, sozinho ou em combinação com outras modalidades terapêuticas, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um huma- no que sofre de um distúrbio associado a IL-13, conforme descrito no presente do- cumento.

[00158]Conforme observado acima, a IL-13 tem sido envolvida em um papel essencial na causa de respostas patológicas associadas à asma. No entanto, outros mediadores de vias imunológicas diferentes também estão envolvidos na patogêne- se da asma, e o bloqueio destes mediadores, em adição a IL-13, pode oferecer be- nefício terapêutico adicional. Deste modo, as proteínas de ligação da invenção po- dem ser incorporadas em um anticorpo biespecífico, em que no anticorpo biespecífi- cos é capaz de ligar pares alvo que incluem, mas não se limitam a, IL-13 e uma cito- cina pró-inflamatória, tal como fator de necrose de tumor α (TNF-α). O TNF-α pode amplificar a resposta inflamatória em asma e pode ser ligado à severidade da doen- ça (McDonnell et al, Progress in Respiratory Research (2001), 31 (New Drags for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Isto sugere que o bloqueio tanto de IL-13 como TNF-α pode ter efeitos benéficos, particularmente, em doença das vias aéreas severas. Em uma modalidade não limitadora, o anticorpo biespecífico da invenção liga os alvos IL-13 e TNF-α e é usado para o tratamento de asma.

[00159]Em outra modalidade, as proteínas de ligação da invenção podem ser usadas para gerar moléculas de anticorpo biespecífico que ligam IL-13 e IL- 1beta, IL-13 e IL- 9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e DL-25; IL-13 e TARC; EL-13 e MDC; IL-13 e M1F; IL-13 e TGF-β; EL-13 e agonista LHR; DL-13 e CL25; IL- 13 e SPRR2a; EL-13 e SPRR2b; e DL- 13 e ADAM8. A presente invenção também forne- ce anticorpos biespecíficos capazes de ligar IL-13 e um ou mais alvos envolvidos na asma selecionados a partir do grupo que consiste em CSF1 (MCSF), CSF2 (GM- CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1; IFNG, histamina e receptores de hista- mina, EL1A, DL1B, BL2, IL3, EL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ELI 1, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, EL19, IL- 20, IL-21, IL-22, EL-23, EL-24, EL-25, IL-26, IL-27, EL-28, IL-30, EL-31, EL-32, IL-33, tTLG, PDGFB, IL2RA, EL4R, IL5RA, IL8RA, DL8RB, IL12RB1, IL12RB2, EL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24.CX3CL1, CXCLl, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR e quitinase. EXEMPLOS 1. A produção de anticorpo anti-IL-13

[00160]Um lote de produção da substância do fármaco consiste em uma so- lução de anticorpo monoclonal ABT-308 obtida a partir da série germinal, produção, recuperação primária e captura, e purificação fina da substância do fármaco deriva- da a partir de um único ciclo do reator de produção. 1.1 Preparação de meio

[00161]As soluções são preparadas de acordo com GMP Solution Records com água purificada que atende os padrões USP/EP/JP. A solução do meio formu- lada consiste em 0,1 μm filtrado na bolsa, biorreator ou recipiente pré-esterilizado de tamanho adequado. O filtro de 0,1 μm é testado acerca da integridade após o uso. As composições do meio de produção e crescimento são dadas na Tabela 2. Tabela 2. Composição do meio de cul tura de célula

1.2 Expansão de inóculo

[00162]As operações de frasco centrifugador e bolsa Biowave servem para expandir as células CHO a partir de um único frasco congelado de MCB à biomassa desejada para a inoculação de um biorreator de semente de 110 L. Um frasco con- gelado do banco de células primário é degelado e colocado no meio de crescimento (SR-512) e centrifugado. As células são novamente suspensas no meio de cresci- mento e expandidas a 37°C e CO2 a 5% em frascos centrifugadores descartáveis ou bolsas Biowave de volume crescente. As bolsas Biowave de 20 L duplicadas são usadas para maximizar a expansão de massa de célula final antes da inoculação no biorreator de sementes. Quando a densidade celular atinge > 2,0 x 106 células viá- veis/mL a partir de ambas as bolsas Biowave de 20 L em aproximadamente 15 a 17 dias, a cultura é transferida para um biorreator de sementes de 110 L carregado com o meio de crescimento SR-520 para expansão adicional. Após a inoculação, a tem- peratura alvo é de 37°C e o pH é ajustado em um alvo de 7,1 e controlado mediante a adição de NaOH e aspersão de CO2. O oxigênio dissolvido (DO) no biorreator é controlado em valor alvo de 40% mediante a aspersão com ar e oxigênio. Uma vez que a densidade celular alcança > 2,6 x 106 células viáveis/mL após aproximada- mente 2 a 4 dias, a cultura é transferida para um biorreator de produção de 3000 L. 1.3 Biorreator de preenchimento curto

[00163]Um preenchimento parcial do biorreator de produção de 3000 L é usado para expandir adicionalmente a cultura de célula. Inicialmente, o reator é car- regado com o meio de crescimento (SR- 520) e inoculado com o lote a partir do bior- reator de semente de 110 L.

[00164]Durante este estágio de curto preenchimento, a temperatura, oxigê- nio dissolvido e pH são controlados em 37°C, 40% e 7,1, respectivamente. O pH da cultura é controlados com aspersão de CO2 e adição de NaOH. Tipicamente, as cé- lulas crescem por 2 a 4 dias antes de alcançar a densidade exigida de > 1,6 x 106 células viáveis/mL. 1.4 Biorreator de produção

[00165]O meio de produção SR-521 (1950 L) é adicionado à cultura de célu- la no biorreator de 3000 L para iniciar o estágio de produção. O anti-espumante C é adicionado para diminuir a formação de espuma. O pH da cultura é controlado em um valor alvo de 6,9 com aspersão de CO2 e adição de NaOH intermitentes. A tem- peratura e o oxigênio dissolvido são controlados em valores alvo de 35°C e 40%, respectivamente. O DO no biorreator é inicialmente controlado no valor desejado mediante a aspersão de ar e suplementado com oxigênio puro se necessário. Em determinadas modalidades, a temperatura é reduzida a um valor alvo de 33°C, quando a densidade de célula viável alcança > 3,0 x 106 células/mL, e o pH e o DO são mantidos em valores alvo de 6,9 e 40%, respectivamente. A glicose (SR-334) é adicionada conforme necessário. As culturas são coletadas e purificadas conforme descrito abaixo, quando a viabilidade de célula cai para < 50%. 1.5 Desempenho do processo

[00166]O desempenho do processo e resultados de teste durante o proces- so são dados na Tabela 3 e Tabela 4, respectivamente. Tabela 3. Desempenho do processo de cultura de célula para fabricação de ABT-308

Tabela 4. Resultados de teste durante o processo do processo de cultura de célula

a. Especificação 2. O isolamento e purificação do anticorpo anti-IL-13

[00167]As operações de recuperação primária e captura incluem a clarifica- ção da coleta por meio de filtração, captura do anticorpo por cromatografia de afini- dade de proteína A e inativação viral de baixo pH seguida pela filtração de profundi- dade. As operações de purificação fina incluem a cromatografia de troca aniônica, cromatografia de interação hidrofóbica, filtração viral, ultrafiltração/diafiltração e fil- tração final, engarrafamento e congelamento. 2.1 Preparação de soluções

[00168]As soluções são preparadas de acordo com GMP Solution Records com água purificada USP (USP-PW) ou água para injeção (WFI). As soluções prin- cipais consistem 0,2 μm filtradas em bolsas irradiadas, recipientes vaporizados no lugar ou submetidos a autoclave. 2.2 Recuperação primária e Clarificação

[00169]O propósito da recuperação primária por filtração consiste em remo- ver as células e fragmentos celulares a partir da coleta do biorreator de produção. A coleta não processada é passada através de um conjunto de filtro que consiste em filtros de profundidade, filtros de profundidade delipid e filtros de membrana. O so- brenadante clarificado é coletado no tanque de coleta e mantido em 2 a 8°C. Os controles durante o processo para a coleta clarificada incluem a concentração de ABT-308 por cromatografia Poros A, biocarga e teste de endotoxina. 2.3 Cromatografia de afinidade de proteína A

[00170]O objetivo da cromatografia de afinidade de proteína A consiste em capturar ABT- 308 a partir da coleta clarificada e reduzir as impurezas relacionadas ao processo. Três ciclos de cromatografia são tipicamente executados para proces- sar toda a coleta. As concentrações de produto a partir dos três ciclos são combina- das para o processamento adicional.

[00171]Uma coluna de 45 cm de diâmetro x 22 cm de comprimento (35 L) é embalada com resina de proteína A MabSelect® (GE Healthcare) ou ProSep Ultra Plus™ (Millipore) e qualificada para o uso. O tampão de armazenamento é removido a partir da coluna por água purificada USP (USP-PW) seguido por 0,2 M de ácido acético e finalmente mediante o enxague com USP PW. A coluna é equilibrada com 25 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,2, então, carregada com a coleta clarificada a um máximo de 32 g de proteína/L de resina para a resina de proteína A MabSelect® (GE Healthcare) ou 45 g de proteína/L de resina para a reina ProSep Ultra Plus™ (Millipore). A coluna é lavada com 25 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,2, então, com 20 mM de citrato de sódio, 0,5 M de NaCl, pH 6,0 e, finalmente, lavada nova- mente com 25 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,2. O anticorpo é eluído a partir da coluna com 0,1 M de ácido acético, pH 3,5. Após cada ciclo, o pH da concentração de eluído é ajustado para um alvo de 4,1, se exigido. Os controles durante o proces- so incluem a determinação da concentração de proteína por A280, SE-HPLC, biocar- ga e teste de endotoxina.

[00172]Após o primeiro ciclo, a coluna é regenerada com 0,2 M de ácido acético e enxaguada com USP-PW. Após o segundo ciclo, a coluna é regenerada com 0,2 M de ácido acético, enxaguada com USP-PW, então, desinfetada com 0,1 M de ácido acético, etanol a 20% seguido pela lavagem e armazenamento de curto prazo em 50 mM de acetato de sódio, etanol a 20%, pH 5. Após o terceiro ciclo, a coluna é regenerada com 0,2 M de ácido acético e enxaguada com USP-PW. É, en- tão, limpa com 0,4 M de ácido acético, 0,5 M de NaCl, Tween 80 a 0,1%, seguido por USP-PW, seguido por 50 mM de NaOH, 1,0 M de NaCl, então, USP-PW. Final- mente, é desinfetada com 0,1 M de ácido acético, etanol a 20%, seguido pela lava- gem e armazenamento em 50 mM de ácido acético, etanol a 20%, pH 5,0. 2.4 Incubação de pH baixo e Filtração

[00173]A incubação de pH baixo é uma etapa de redução viral dedicada que fornece garantia adicional de segurança viral pela inativação de vírus inesperados envelopados que poderiam estar presentes no eluído de proteína A. O propósito da filtração após a incubação de pH baixo consiste em remover quaisquer precipitados que podem se formar durante o tratamento de pH baixo.

[00174]O pH dos eluídos de cromatografia de proteína A combinados é ajus- tado para um valor alvo de 3,5 com 0,5 M de ácido fosfórico e mantido em 18 a 25°C por 60 a 70 minutos. A mistura é, então, ajustada para pH 5 com 1 M de Tris, pH 10, clarificada por uma combinação de filtros de profundidade e filtros de membrana, então, resfriada a 10 a 14°C. Os controles durante o processo para o tratamento de pH baixo e etapa de filtração incluem a determinação da concentração de proteína por A280, SE-HPLC, biocarga e teste de endotoxina. 2.5 Desempenho do processo de recuperação primária e captura

[00175]O desempenho do processo para as operações de recuperação pri- mária e captura é dado na Tabela 5 e os resultados dos controles durante o proces- so são dados na Tabela 6. Tabela 5. Desempenho do processo de recuperação primária e captura

a Rendimento combinado devido ao erro de amostragem após inativação de pH baixo.

[00176]B A área do filtro de profundidade era três vezes maior no lote 56136BI do que nos lotes 57058BI e 58207BI. A área de filtro maior no lote 56136BI resultou no rendimento diminuído. Tabela 6. Resultados do teste durante o processo do processo de recupera- ção primária e captura

a Amostras de biocarga e endotoxina tomadas no início da operação de uni- dade seguinte. b Amostra não tomada. 2.6 Cromatografia de troca aniônica forte

[00177]O propósito da etapa de cromatografia de troca aniônica forte consis- te em reduzir as impurezas relacionadas ao processo, tais como proteínas de célula hospedeira, DNA e endotoxinas. Também pode servir como uma etapa de elimina- ção viral. Em determinadas modalidades, uma coluna de resina Q Sepharose™ FF é operada no modo de fluxo contínuo em que o anticorpo flui através da coluna e as impurezas permanecem ligadas à resina, em modalidades alternativas, uma mem- brana Mustang Q™ (Pall Corp.) é empregada no lugar da coluna de resina Q Sepha- rose FF. As operações são executadas em 10 a 14°C.

[00178]Uma coluna de 45 cm de diâmetro x 22 cm de comprimento (35 L) é embalada com resina Q Sepharose™ FF (GE Healthcare) e qualificada para o uso. A coluna é equilibrada com 25 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 8,0. O pH da solução de inativação filtrada e neutralizada é ajustado para 8,0 com 1 M de Tris, pH 10, a condutividade é ajustada para 5,0 a 6,5, e a solução é filtrada através de filtros de membrana e delipid. A carga de Q Sefarose é bombeada através da coluna em uma carga máxima de 80 g de proteína/L de resina. Após o carregamento, a coluna é la- vada com 25 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 8,0 e o fluxo contínuo e a lavagem são combinados. Isto consiste na concentração de fluxo contínuo de Q Sepharose™ e lavagem (QFTW). Os controles durante o processo para a etapa de Q Sepharo- se™ incluem a concentração por A280, SE-HPLC, biocarga e teste de endotoxina.

[00179]A coluna é regenerada com 25 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 7,0, seguido por um enxague com WFI, e desinfetada com 1,0 M de NaOH seguido por um enxague com WFI. A coluna é, então, neutralizada com 25 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 7,0 e armazenada em 25 mM de fosfato de só- dio, isopropanol a 20%, pH 7,0. 2.7 Cromatografia de interação hidrofóbica

[00180]O propósito da etapa de Fenil Sepharose™ consiste na remoção de agregados, fragmentos de ABT- 308 e impurezas relacionadas ao processo. As ope- rações são executadas em 10 a 14°C.

[00181]Uma coluna de 60 cm de diâmetro x 15 cm de comprimento (42 L) é embalada com resina de Fenil Sepharose™ HP (GE Healthcare) e qualificada para o uso. A coluna é equilibrada com WFI, então, 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M de sulfato de amônio, pH 7,0.

[00182]O fluxo contínuo de Q Sepharose™ e a lavagem é diluída 1:1 (por volume) com 40 mM de fosfato de sódio, 2,2 M de sulfato de amônio, pH 7,0. Esta solução, a carga de Fenil Sepharose™, é filtrada através de um filtro de 0,2 μm e carregada na coluna em uma carga máxima de 64 g de proteína/L de resina. A colu- na é lavada com 25 mM de fosfato de sódio, 1,4 M de sulfato de amônio, pH 7,0 e o ABT-308 é eluído a partir da coluna com 11 mM de fosfato de sódio, 0,625 M de sul- fato de amônio, pH 7,0. Os controles durante o processo para a etapa de Fenil Sepharose™ incluem a concentração por A280, SE-HPLC, biocarga e teste de en- dotoxina.

[00183]A coluna é regenerada com WFI, então, desinfetada com 1 M de NaOH, enxaguada com WFI e armazenada em 25 mM de fosfato de sódio, isopro- panol a 20%, pH 7. 2.8 Nanofiltração

[00184]A nanofiltração consiste em uma etapa de eliminação viral dedicada que fornece garantia adicional de segurança viral mediante a remoção física de vírus inesperados > 20 nm de diâmetro que poderiam estar presentes no eluído da coluna de Fenil Sepharose HP. As operações são executadas em 10 a 14°C.

[00185]O eluído da coluna de Fenil Sepharose™ HP é passado através de um filtro de 0,1 μm e um conjunto de filtro Ultipor DV20 pré-umedecido com 15 mM de histidina, pH 5,6. Após a filtração, o conjunto de filtro é lavado com 15 mM de his- tidina, pH 5,6, para recuperar qualquer ABT-308 retido. Após o uso, um teste de in- tegridade é executado sobre o filtro DV20 e o filtro é descartado. Se o filtro não pas- sar no teste de integridade, a solução pode ser refiltrada conforme descrito acima. Os controles durante o processo para a etapa de nanofiltração incluem concentração de proteína por A280, SE-HPLC, biocarga e teste de endotoxina. 2.9 Formulação de substância de fármaco de ABT-308 por Ultrafiltra- ção/Diafiltração

[00186]O propósito da etapa de UF/DF consiste na diafiltração da substância de fármaco no tampão de formulação final, 15 mM de histidina, pH 5,6 e concentra- ção de ABT- 308. Estas operações são executadas em 10 a 14°C.

[00187]O nanofiltrado é concentrado a aproximadamente 50 g/L com o uso de membranas de poliéter sulfona de MWCO 30 kDa, diafiltrado com o tampão de formulação, então, concentrado a aproximadamente 180 g/L. O sistema de UF é drenado do produto e enxaguado com o tampão de diafiltração para recuperar qual- quer produto remanescente no sistema. O concentrado e a lavagem são combina- dos para produzir o ABT-308 diafiltrado em uma concentração de aproximadamente 120 a 160 g/L. O ABT-308 concentrado é filtrado através de filtros de membrana. Os controles durante o processo para a etapa de ultratfiltração/diafiltração incluem con- centração por A280, SE-HPLC, biocarga e teste de endotoxina.

[00188]Após cada procedimento, o sistema de ultrafiltração é lavado com WFI e limpo com uma solução de hipoclorito de sódio de 250 ppm, então, desinfeta- do e armazenado em 0,1 M de hidróxido de sódio. 2.10 Filtração final, Engarrafamento e Congelamento

[00189]As operações de filtração e engarrafamento são executadas em uma área Class 100 a 2 a 8°C em uma capela de fluxo laminar Class 100. O ABT-308 formulado é filtrado através de um filtro de 0,2 μm em garrafas de PETG livres de pirogênio e pré-esterilizadas. As garrafas rotuladas são colocadas em uma unidade de congelamento vazia a - 80°C (nominal) até congelar e, então, transferidas para congeladores de armazenamento mantidos a -80°C (nominal). Os controles durante o processo para a etapa de filtração final e engarrafamento incluem A280, biocarga e teste de endotoxina (resultados do teste de substância de fármaco). 2.11 Desempenho do processo de purificação fina

[00190]O desempenho do processo para as operações de recuperação pri- mária e captura é dado na Tabela 7 e os resultados dos controles durante o proces- so são dados na Tabela 8. Tabela 7. Desempenho do processo, de purificação fina

Tabela 8. Resultados do teste durante o processo de purificação fina

[00191]a. Amostras de biocarga e endotoxina tomadas no início da operação de unidade seguinte.

[00192]b. O resultado de endotoxina de 6 EU/mL não é considerado signifi- cante devido ao fato de que a substância do fármaco subsequente atende a especi- ficação de < 0,2 EU/mg. Além disso, o lote 56003BF consistiu em um processo de engenharia e não liberado para o uso humano.

[00193]c. Especificação de liberação de substância de fármaco.

[00194]d. Resultado da liberação de substância de fármaco. 3. Determinação da concentração de proteína de célula hospedeira em com- posições de anticorpo

[00195]Este procedimento descreve a metodologia de teste para a determi- nação de concentração de proteína de célula hospedeira residual em amostras de anticorpo. O ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) é usado para colocar a proteína de célula hospedeira (Antígenos) entre duas camadas de anticorpos es- pecíficos. Isto é seguido pelo bloqueio de locais não-específicos com caseína. As proteínas de célula hospedeira são, então, incubadas durante o tempo em que as moléculas do antígeno são capturadas pelo primeiro anticorpo (Anticorpo de reves- timento). Um segundo anticorpo (anti- proteína de célula hospedeira biotinilada) é, então, adicionado, o qual se fixa ao antígeno (Proteínas de célula hospedeira). A neutravidina conjugada a HRP é adicionada, a qual se liga à anti-proteína de célula hospedeira biotinilada. Isto é seguido pela adição de substrato azul. O substrato cromogênico é hidrolisado pelo anticorpo conjugado à enzima ligado, produzindo uma cor azul. A reação é parada com 2M de H3PO4, modificando a cor para amare- la. A intensidade da cor é diretamente proporcional à quantidade de antígeno ligado no poço.

[00196]Preparação de 50 mM de Bicarbonato de sódio (Tampão de revesti- mento), pH 9,4. A um béquer de 1 L adicionar: 900 mL de água Milli-Q; 4,20 g ± 0,01 g de bicarbonato de sódio. Agitar até dissolver completamente. Ajustar pH para 9,4 com 1 N de NaOH. Transferir para um frasco volumétrico de 1 L e adicionar água Milli-Q até que o volume do frasco seja atingido. Misturar por inversão até ficar ho- mogêneo. Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,22 μm. Armazenar a 4°C nominais por até 7 dias a partir da data de preparação.

[00197]Preparação de 0,104 M de Na2HPO4 * 7H2O, 1,37 M de NaCl, 0,027 M de KCl, 0,0176 M de KH2PO4, pH = 6,8 a 6,9 (10X PBS). Adicionar aproximada- mente 400 mL de água Milli-Q a um béquer de vidro. Adicionar 13,94 g ± 0,01 g de Na2HPO4 x 7H2O. Adicionar 40,0 g ± 0,1 g de NaCl. Adicionar 1,00 g ± 0,01 g de KCl. Adicionar 1,20 g ± 0,01 g de KH2PO4. Agitar até ficar homogêneo. Transferir para um frasco volumétrico de 500 mL. QS ao volume de 500 mL com água Milli-Q. Misturar por inversão. Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,2 μm. Ar- mazenar em temperatura ambiente por até 7 dias.

[00198]Preparação de 1X PBS + 0,1% de Triton X-100, pH 7,40: (Tampão de lavagem de placa). Em um cilindro graduado de 4 L, misturar 400 mL de 10 X PBS (etapa 5.2) com 3500 mL de água Milli-Q. Verificar o pH e ajustar se necessário para 7,40 ± 0,05 com 1 N de HCl ou 1 N de NaOH. Adicionar água Milli-Q até que o volume do frasco seja atingido. Cobrir firmemente com parafilme o cilindro e misturar por inversão até ficar homogêneo. Transferir para uma garrafa de 4 L. Remover 4 mL do 1 X PBS e descartar. Adicionar 4 mL de triton X-100 aos 3996 mL de 1 X PBS. Colocar sobre a placa de agitação e agitar até dissolver completamente. Filtrar a quantidade de tampão de lavagem de placa necessária para a preparação de tam- pão de diluição através de uma unidade de filtro estéril de 0,22 μm. Armazenar em temperatura ambiente por até 7 dias.

[00199]Preparação de Mistura de anticorpo de revestimento: anti CHO 599/626/748 de cabra (lote no. G11201 @ 1,534 mg/mL), purificado por afinidade: NOTA: Estoques armazenados a - 80°C nominais em frascos. Preparar alíquotas. Pegar uma alíquota por placa no momento do uso.

[00200]Imediatamente antes do uso: Diluir a mistura de anticorpo para ter uma concentração final de 4 μg/mL em 50 mM de bicarbonato de sódio frio, confor- me exposto a seguir. Por exemplo: adicionar 31 μLs de mistura de anticorpo de re- vestimento a 11969 μLs de tampão de revestimento frio. Misturar por inversão deli- cadamente.

[00201]Preparação de mistura de anti proteína de célula hospedeira de ca- bra biotinilada, 599/626/748 (lote no. G11202 @ 0,822 mg/mL): NOTA: Estoques ar- mazenados a -80°C nominais em frascos. Preparar alíquotas. Pegar uma alíquota por placa no momento do uso. Imediatamente antes do uso: diluir a mistura de anti- corpo biotinilada para ter uma concentração final de 1 μg/mL em caseína a 37°C ± 2°C, conforme exposto a seguir. Por exemplo: adicionar 14,6 μLs de mistura de anti- corpo biotinilada a 11985 μLs de caseína a 37°C ± 2°C. Misturar por inversão delica- damente.

[00202]Preparação de Neutravidina-HRP. Reconstituir novos lotes (frasco de 2 mg) para 1 mg/mL, conforme exposto a seguir: Adicionar 400 μL de água Milli-Q ao frasco, então, adicionar 1600 μL de 1X PBS, para um total de 2 mL. Misturar por vórtice delicadamente. Armazenar a - 20°C nominal. Preparar alíquotas com volume desejado de modo que 1 alíquota por placa seja usada. Preparar em tubo de poli- propileno. Qualificar novos lotes para determinar a concentração de trabalho. Desig- nar expiração de 6 meses a partir da data de preparação. Por exemplo, se a concen- tração de trabalho foi determinada como 0,2 μg/mL, então, preparar conforme ex- posto a seguir. Imediatamente antes do uso: degelar uma alíquota de Neutravidina- HRP em temperatura ambiente. Diluir a solução de Neutravidina de 1 mg/mL a 0,1 mg/mL (100 μg/mL) com Caseína a 37°C ± 2°C. Por exemplo: Diluir X10, adicionar 50 μL de neutravidina a 450 μL de Caseína. Misturar por vórtice delicadamente. Dilu- ir adicionalmente a solução de 100 μg/mL a 0,2 μg/mL com Caseína a 37°C ± 2°C. Por exemplo: Diluir X500, adicionar 24 μL de neutravidina (100 μg/mL) a 11976 μL de Caseína. Misturar por vórtice delicadamente.

[00203]Preparação de 5,7 2M de ácido fosfórico (Solução de parada). Prepa- rar uma solução de 2 M de ácido fosfórico a partir de ácido fosfórico concentrado conforme exposto a seguir. A partir da % de ácido fosfórico indicada no rótulo, a densidade (1,685g/mL) e o peso da fórmula (98 g/mol), calcular o volume de ácido fosfórico concentrado necessário para preparar 500 mL de 2M de ácido fosfórico. Adicionar o volume de ácido fosfórico concentrado calculado acima ao frasco. Adici- onar água Milli-Q até que o volume do frasco seja atingido e misturar por inversão até ficar homogêneo. Armazenar em temperatura ambiente por até 6 meses a partir da data de preparação.

[00204]Preparação de Tampão de diluição (X100 diluído em caseína em 1X PBS + 0,1 % de Triton X100, pH 7,4). Diluir Caseína X100 a 37°C ± 2 °C em 1X PBS + 0,1 % de Triton X100 esterilizado por filtração de 0,22 μm, pH 7,4 (a partir de aci- ma). Por exemplo: Adicionar 1 mL de Caseína a 37°C ± 2 °C a 99 mL de 1X PBS + 0,1 de % Triton X100 esterilizado por filtração de 0,22 μm, pH 7,4. Misturar bem. Preparar novo para cada uso.

[00205]Preparação de Padrões. Padrões de proteína de célula hospedeira (Padrões de antígeno) (lote no. G11203 @ 1,218 mg/mL): NOTA: Estoques armaze- nados a -80°C nominais em 70 alíquotas. Degelar uma alíquota em temperatura am- biente. Executar diluições em série em tubos de polipropileno com o uso do tampão de diluição.

[00206]Preparação de Amostras. Em tubos de polipropileno, diluir amostras em massa finais a 24 mg/mL em tampão de diluição. Registrar a concentração. NOTA: utilizar as soluções abaixo para preparar amostras reforçadas e para prepa- rar as soluções de 12 mg/mL mencionadas abaixo. Em microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente as soluções de 24 mg/mL a 12 mg/mL em tampão de diluição. Carregar poços triplicados para cada uma das soluções de 12 mg/mL sobre a placa por um total de 6 poços.

[00207]Preparação de Reforço. Em um microtubo de polipropileno, preparar um reforço de proteína de célula hospedeira de 10 ng/mL a partir do padrão de 20 ng/mL preparado acima, por meio da diluição 2 X com tampão de diluição. Carregar três poços para a solução de reforço de 10 ng/mL sobre a placa. Utilizar a solução padrão de 20 ng/mL a partir da etapa 6.1 para reforçar as amostras.

[00208]Preparação de Amostras reforçadas. Em microtubos de polipropileno, reforçar 300 μL de cada solução em massa final de 24 mg/mL com 300 μL da 20 ng/mL solução de reforço (6.1). Carregar poços triplicados para cada solução de amostra reforçada por um total de 6 poços.

[00209]Preparação de Controle. Uma faixa de controle precisa ser ajustada para cada nova solução de estoque de controle, antes do uso no teste de rotina. Es- toque de controle: Preparar alíquotas de 150 μL de um lote de concentrado de subs- tância de fármaco de ABT-308 e armazenar congelado a -80°C nominal por até três anos.

[00210]Preparação de Controle de trabalho. Degelar uma alíquota de contro- le em temperatura ambiente. Em tubos de polipropileno, diluir o controle a 24 mg/mL com tampão de diluição. Em microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente a so- lução de controle de 24 mg/mL com tampão de diluição a 12 mg/mL. Preparar um único controle de carga e diluição em 3 poços da placa.

[00211]Procedimentos de ELISA. Preencher a garrafa de lavagem de placa com tampão de lavagem de placa (com referência à etapa 5.3, 1X PBS + 0,1% de Triton X-100). Iniciar o lavador de placa. Verificar os seguintes parâmetros: Parâme- tros deveriam ser ajustados para: Tipo de placa: 1 Para cada Ciclo (um total de 5 ciclos): Volume: 400 μLs; Tempo de enxague: 10 segundos; Tempo Asp.: 4 segun- dos.

[00212]Procedimento de ensaio. Revestir as placas com 100 μL/poço de 4 μg/mL de mistura de anticorpo de revestimento de cabra em 50 mM de bicarbonato de sódio frio. Bater no lado da placa até que a solução de revestimento cubra o fun- do dos poços uniformemente, cobrir com fita isolante e incubar a 4 °C nominal, en- quanto que agita em agitador de placa (ou equivalente) na velocidade 3 por 18 horas ± 1 hora. Após a incubação de um dia para o outro, remover a placa a partir do refri- gerador e deixar equilibrar a temperatura ambiente. Agitar o revestimento. Secar a placa com papel-toalha. Bloquear com 300 μL/po^o de Caseína a 37°C ± 2°C, cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de placa Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora. Preparar padrão, amostra, controle, reforço e amostras reforçadas durante a incubação de bloqueio. Lavar a placa 5 vezes com Tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Com o uso de uma pipeta de 8 canais, pipetar 100 μL/po^o de padrões, amostras, reforços, amostras reforçadas e controle em poços triplicados da placa. Pipetar 100 μL/po^o de tampão de diluição em todos os poços vazios da placa para servir como soluções em branco. Cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2 °C, enquanto que agita em agitador de placa Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora. Preencher um modelo para utilizar como guia ao carregar a placa.

[00213]Configuração de leitor de placa. Configurar modelo, inserir concen- trações para padrões. Não inserir fatores de diluição para amostras, controle, reforço ou amostras reforçadas. Designar os poços que contêm diluentes como soluções em branco a serem subtraídos do total de poços. Lavar a placa 5 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo de cabra biotinilado. Cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de placa Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora. Lavar a placa 5 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/poço de solução de conjugado de Neutravidina-HRP. Cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de placa Lab- line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora. Lavar a placa 5 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/po^o de Substrato azul K frio, cobrir com fita isolante e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos (iniciar o cronômetro assim que o substrato é adicionado à primeira fila), enquanto que agita na velocidade 3 sobre o agitador de placa de titulação Lab-line (ou equivalente). Parar a reação mediante a adição de 100 μL/po^o de 2M de ácido fosfórico (Etapa 5.7). Colocar a placa em um agitador de placa na velocidade 3 por 3 a 5 minutos. Ler a placa em 450 nm.

[00214]Análise de dados e cálculos. NOTA: somente as amostras, reforços, amostras reforçadas e controle, com densidades ótimas que se incluem no limite de quantificação prática (2,5 ng/mL de padrão) da curva padrão e que atende a % de CV ou % de critérios de diferença indicados abaixo, são aceitos. Se as OD's da amostra caírem abaixo do padrão de 2,5 ng/mL, o resultado deveria ser relatado como menor do que 2,5 ng/mL. Este valor deveria ser, então, dividido pela concen- tração de amostra diluída (12 mg/mL) para relatar o valor em ng/mg. Se a amostra for alta em concentração de célula hospedeira fazendo com que a amostra não re- forçada e/ou reforçada fique acima da curva padrão, relatar o valor como > 100 ng/mL. Este valor deveria ser, então, dividido pela concentração de amostra diluída (12 mg/mL) para relatar o valor em ng/mg. Considerar o valor zero da amostra para cálculos de recuperação de reforço quando a amostra esta abaixo do padrão de 2,5 ng/mL.

[00215]Curva padrão. As concentrações padrão deveriam ser inseridas no modelo de protocolo. Um ajuste de curva quadrática é usado. O coeficiente de de- terminação precisa ser = 0,99 e a % de CV entre poços triplicados precisa ser = 20%. Se estes critérios não foram atendidos: Um padrão (1 nível, 3 poços) pode ser baixado. Se o 1,25 ng/mL for baixado, somente as amostras e amostras reforçadas com densidades ótimas que se incluem nas densidades ótimas de 2,5 ng/mL e 100 ng/mL (os pontos de curva padrão restantes) são aceitáveis. Adicionalmente, para as triplicatas de cada nível de padrão, se um único poço for claramente contaminado ou mostrar baixa ligação, o mesmo pode ser baixado. Se um poço for baixado a par- tir de um nível de padrão, as cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. A % de CV para o menor padrão, o qual mostra valores de OD próximos ao fundo (soluções em branco) da placa, deveria ser = 30%. Se um poço for baixado, a % de diferença para as cópias restantes precisa ser = 35%. Se o menor padrão for baixado, somente as amostras e amostras reforçadas com densidades ótimas que se incluem nas densidades ótimas de nível de curva padrão restante são aceitáveis.

[00216]Amostras. % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Re- latar % de CV entre os poços triplicados. Um poço a partir de cada diluição de amos- tra pode ser baixado. As cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Nota: se a OD da amostra não reforçada estiver abaixo da OD padrão de 2,5 ng/mL, a % de critérios de diferença não se aplica aos resultados da não reforçada. Fazer referência ao cálculo acima.

[00217]Calcular concentração de célula hospedeira real em ng/mg a partir do valor médio (ng/mL), conforme exposto a seguir: Proteína de célula hospedeira CHO (ng/mg) = "Resultado de amostra não reforçada (ng/mL)" média _ concentração de amostra diluída (12 mg/mL).

[00218]Reforços. % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Re- gistrar % de CV. Um poço a partir do reforço podem ser baixado. Os pontos restan- tes precisam ter uma % de diferença = 20%. Fazer referência ao cálculo acima. Re- latar a concentração de célula hospedeira em ng/mL. Este resultado será usado em cálculos de recuperação de reforço. A concentração resultante para o reforço (ng/mL) precisa ser de ± 20% da concentração de reforço teórica. Registrar o resul- tado e indicar aprovado ou reprovado. Se o resultado do reforço não estiver dentro de 20% do teórico, o ensaio preciso ser repetido. A concentração de reforço média (ng/mL) x 100 = precisa ser 100% ± 20% 10 ng/mL.

[00219]Amostras reforçadas. % de CV deveria ser = 20%" entre os poços triplicados. Registrar a % de CV entre os poços triplicados. Um poço a partir de cada diluição de amostra reforçada pode ser baixado. As cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Fazer referência ao cálculo acima. Relatar "Resultado de amostra reforçada" para cada diluição em ng/mL. Registrar a % de diferença en- tre as diluições duplicadas. A % de diferença entre as diluições deveria ser = 25%. Estes resultados serão usados nos cálculos de recuperação de reforço.

[00220]Calcular % de recuperação de reforço para cada conjunto de diluição com o uso da fórmula abaixo: % de recuperação de reforço = valor de amostra refor- çada - valor de amostra não reforçada X 100 valor de reforço. NOTA: (1) Se o valor das OD's de amostra não reforçada caírem abaixo do padrão de 2,5 ng/mL, conside- rar o valor como zero no cálculo de % de recuperação de reforço. A % de recupera- ção de reforço precisa ser 100% ± 50% (50% a 150%) para cada diluição, para cada amostra. Registrar os resultados e aprovar/reprovar.

[00221]Controle. % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Re- gistrar % de CV result. Um poço a partir do controle pode ser baixado. As cópias res- tantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Fazer referência ao cálculo acima. Relatar a concentração de célula hospedeira no controle em ng/mL. Calcular a con- centração de célula hospedeira em ng/mg conforme exposto a seguir: Proteína de célula hospedeira (ng/mg) = resultados de proteína de célula hospedeira de controle em ng/mL. 4. Determinação da concentração de proteína A em composições de anti- corpo

[00222]Neste ELISA, as placas são revestidas com Anti-proteína A de gali- nha e incubadas. Os locais não específicos são bloqueados com caseína em PBS. As placas são lavadas em 1X PBS + 0,1 % de Triton X-100 para remover o material não ligado. Os padrões de amostras e Cys-rproteína A são diluídos em 1X PBS + 4,1% de Triton X + 10% de Caseína. As soluções são denaturadas mediante o aquecimento a 95° C ± 2° C, separando a proteína A do anticorpo. Em determinadas modalidades, por exemplo, se (GE Healthcare), as soluções são, então, adicionadas à placa e incubadas. Em modalidades alternativas, por exemplo, se a etapa de afini- dade de proteína A inclui o uso de ProSep Ultra Plus™ (Milipore), as soluções são resfriadas e 0,85 % de NaCl + 12,5 % de 1 N de ácido acético + 0,1 % de Tween 20, são adicionados a cada tubo (1:1) para ajudar, adicionalmente, na separação da pro- teína A a partir da proteína de amostra. Os tubos são vigorosamente submetidos ao vórtice, incubados e centrifugados. Os sobrenadantes são removidos e adicional- mente processados. O material não ligado é lavado com 1X PBS + 0,1% de Triton X- 100. A anti-proteína A de galinha biotinilada é adicionada à placa de microtitulação e incubada. A placa é lavada para remover o material não ligado e o conjugado de Neutravidina - Peroxidase é adicionado.

[00223]A Neutravidina irá se ligar à Anti-proteína A de galinha biotinilada que tem se ligado aos poços. A placa é novamente lavada para remover a Neutravidina não ligada e substrato de azul K (tetrametilbenzidina (TMB)) é adicionado à placa. O substrato é hidrolisado pela Neutravidina ligada produzindo uma cor azul. A reação é parada com ácido fosfórico, modificando a cor para amarela. A intensidade da cor amarela nos poços é diretamente proporcional à concentração de proteína A presen- te nos poços.

[00224]Preparação de Reagentes e Soluções. As garrafas de caseína preci- sam ser aquecidas a 37°C ± 2°C; sonicado por 2 minutos e separado em alíquotas. As alíquotas devem ser armazenadas em 4°C nominal. Quando o ensaio deve ser executado, o número de alíquotas de caseína necessário deveria ser colocado a 37°C ± 2°C. O tampão de revestimento e substrato são usados frios (tomados a par- tir de 4°C nominal pouco antes do uso).

[00225]50 mM de bicarbonato de sódio (Tampão de revestimento), pH 9,4. A um béquer de 1 L adiciona-se: 900 mL de água Milli-Q, 4,20 g ± 0,01 g de bicarbona- to de sódio. Agita-se até dissolver completamente. Ajustar pH para 9,4 com 1 N de NaOH. Transferir para um frasco volumétrico de 1 L e colocar água Milli-Q até com- pletar o volume. Misturar por inversão até ficar homogêneo. Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,22 CA μm. Armazenar a 4°C nominais por até 7 dias a partir da data de preparação.

[00226]104 M de Na2HPO4 * 7H20, 1,37 M de NaCl, 0,027 M de KCl, 0,0176 M de KH2PO4, pH = 6,8 a 6,9. (10 X PBS): Adicionar aproximadamente 400 mL de água Milli-Q a um béquer de vidro. Adicionar 13,94 g ± 0,01 g de Na2HPO4 x 7H20. Adicionar 40,0 g ± 0,1 g de NaCl. Adicionar 1,00 g ± 0,01 g de KCl. Adicionar 1,20 g ± 0,01 g de KH2PO4. Agitar até ficar homogêneo. Transferir para um frasco volumé- trico de 500 mL. QS a 500 mL de volume com água Milli-Q. Misturar por inversão. Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,2 CA μm. Armazenar em tempe- ratura ambiente por até 7 dias.

[00227]1X PBS + 0,1% de Triton X-100, pH 7,40: (Tampão de lavagem de placa). Em um cilindro graduado de 4 L, misturar 400 mL de 10 X PBS (vide acima) com 3500 mL de água Milli-Q. Verificar o pH e ajustar se necessário para 7,40 ± 0,05 com 1 N de HCl ou 1 N de NaOH. Adicionar água Milli-Q até que o volume do frasco seja atingido. Cobrir firmemente com parafilme o cilindro e misturar por inversão até ficar homogêneo. Transferir para uma garrafa de 4 L. Remover 4 mL do 1 X PBS e descartar. Adicionar 4 mL de triton X-100 aos 3996 mL de 1 X PBS. Colocar sobre a placa de agitação e agitar até dissolver completamente. Armazenar em temperatura ambiente por até 7 dias.

[00228]Anticorpo de Revestimento Anti-proteína A de galinha. Obter uma alíquota de anticorpo por placa no momento do uso. Para qualificar novos lotes de Anti-proteína A de galinha, pode ser necessário utilizar e qualificar Anti-proteína A- Biotina de galinha conjugada (preparada a partir do mesmo lote de revestimento) em conjunto. Imediatamente antes do uso: Diluir a mistura de anticorpo em 50 mM de bicarbonato de sódio frio à concentração determinada durante a qualificação de re- vestimento. Por exemplo: se durante a qualificação a concentração de revestimento a carregar sobre a foi determinada como 6 μg/mL e se a concentração de estoque for de 3000 g/mL, então, adicionar 24 μLs de anticorpo de revestimento a 11976 μLs de tampão de revestimento frio. Misturar por inversão delicadamente.

[00229]Anti proteína A de galinha biotinilada. Obter uma alíquota de anticor- po por placa no momento do uso. Para qualificar novos lotes de Anti-proteína A- Biotina de galinha conjugada, pode ser necessário utilizar e qualificar com o mesmo lote de Anti-proteína A de galinha que foi preparada. Imediatamente antes do uso: Diluir o anticorpo biotinilado em Caseína a 37°C ± 2°C à concentração determinada durante a qualificação de anticorpo biotinilado. Por exemplo: se durante a qualifica- ção a concentração de anticorpo biotinilado a carregar sobre a placa foi determinada como 4 μg/mL e a concentração de estoque for de 1000 μg/mL, então, adicionar 48 μLs de anticorpo biotinilado a 11952 μLs de Caseína a 37°C ± 2°C. Misturar por in- versão delicadamente. Neutravidina-HRP. Reconstituir novos lotes (2 mg/frasco) a 1 mg/mL con- forme exposto a seguir: Adicionar 400 μL de água Milli-Q ao frasco, então, adicionar 1600 μL de 1 X PBS, para um total de 2 mL. Misturar por vórtice delicadamente. Ar- mazenar a -80°C nominal. Preparar as alíquotas com volume desejado de modo que 1 alíquota por placa seja usada. Preparar em tubo de polipropileno. Designar a data de expiração de 6 meses a partir da data de preparação. Por exemplo, se a concen- tração de trabalho foi determinada como 0,1 μg/mL, então, preparar conforme ex- posto a seguir. Imediatamente antes do uso, degelar uma alíquota de Neutravidina- HRP em temperatura ambiente. Diluir a solução de Neutravidina de 1 mg/mL a 0,01 mg/mL (10 μg/mL) com Caseína a 37°C ± 2°C. Por exemplo: Diluir X10, adicionar 50 μL de neutravidina a 450 μL de Caseína. Misturar por vórtice delicadamente, X10 novamente, adicionar 100 μL de X10 neutravidina a 900 μL de Caseína. Misturar por vórtice delicadamente. Diluir adicionalmente a solução de 10 μg/mL a 0,1 μg/mL, com Caseína a 37°C ± 2°C. Por exemplo: Diluir X100, adicionar 120 μL de neutravi- dina (10 μg/mL) a 11880 μL de Caseína. Inverter várias vezes delicadamente para misturar. Solução de parada (1 N de ácido fosfórico adquirido é usado). Armazenar em temperatura ambiente por até 1 ano a partir da data de recebimento. Tampão de diluição (1X PBS + 4,1% de Triton X100 + 10% de Caseína, pH 7.4). Adicionar 86 mL de 1X PBS + 0,1% de Triton X100, pH 7,4 (da Etapa 5.3) a um béquer ou frasco, adicionar 4 mL de Triton X-100 e 10 mL de Caseína bloqueadora em PBS, e agitar para misturar/dissolver. Pode levar de 20 a 30 minutos para dissolver o triton. Isto se igual a uma solução de 1X PBS + 4,1 % de Triton X100 + 10% de Caseína, pH 7,4. Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,22 CA μm. Preparar novo para cada uso. Isto é suficiente para 1 placa. Padrões de proteína A (Padrões de antígeno). NOTA: Estoques armazena- dos a -20° C nominal em alíquotas de 70 μL. Degelar uma alíquota em gelo. Execu- tar diluições em série de acordo com os exemplos nos tubos de polipropileno da ta- bela abaixo com o uso de tampão de diluição (vide acima) com o uso da concentra- ção indicada no COA dos fabricantes: Por exemplo, se o COA indica que a concen- tração de estoque é de 2,1 mg/mL (2100000 ng/mL), então: Degelar a amostras em gelo. Em tubos de microcentrífuga de polipropileno, diluir as amostras em massa finais a 20 mg/mL em tampão de diluição (acima). Executar 2 diluições separadas. Registrar a concentração. Utilizar as soluções abaixo para preparar as amostras re- forçadas e para preparar as soluções de 10 mg/mL. Em tubos de microcentrífuga de polipropileno, diluir adicionalmente as soluções de 20 mg/mL a 10 mg/mL em tam- pão de diluição. Preparação de Reforço. Em um tubo de microcentrífuga de polipropileno, preparar um reforço de proteína A de 0,296 ng/mL a partir do padrão de 0,593 ng/mL preparado acima na Etapa 6.1, mediante a diluição do mesmo 2 X com tampão de diluição. Executar uma única diluição. Os poços triplicados para a solução de reforço de 0,296 ng/mL serão carregados sobre a placa. Usar a solução padrão de 0,593 ng/mL a partir da Etapa 6.1 para reforçar as amostras.

[00230]Preparação de Amostras reforçadas. Em tubos de microcentrífuga de polipropileno, reforçar 500 μL de cada solução em massa final de 20 mg/mL com 500 μL da solução de reforço de 0,593 ng/mL. Guardar para desnaturação. Os po- ços triplicados para cada solução de amostra reforçada serão carregados sobre a placa para um total de 6 poços.

[00231]Preparação de Controle. Obter um lote de substância de fármaco de ABT-308. Preparar alíquotas de 150 μL e armazenar congeladas a - 80 °C nominal por três anos a partir da data de separação em alíquotas.

[00232]Controle de trabalho: Degelar uma alíquota de controle em gelo. Em um tubo de microcentrífuga de polipropileno, diluir o controle a 10 mg/mL com tam- pão de diluição para ter um volume final de 1000 μLs. Preparar uma única diluição. Guardar para desnaturação. Os poços triplicados de controle serão carregados so- bre a placa.

[00233]Desnaturação. Para soluções em branco de placa, adicionar 1000 μLs de tampão de diluição aos tubos de microcentrifuga igual ao número de solu- ções em branco que serão executadas sobre a placa. As tampas dos tubos podem ser cobertas com parafilme para evitar que estourem durante o aquecimento ou uma segunda prateleira pode ser colocada sobre o topo dos mesmos para manter as tampas fechadas. Aquecer os padrões, amostras não-reforçadas, amostras reforça- das, reforço, soluções em branco e controle a 95°C ± 2° C por 15 minutos. Remover o parafilme a partir dos tubos durante o resfriamento, se usado. Deixar resfriar por 15 minutos e centrifugar por 5 minutos a aproximadamente 10000 rpm. Transferir 700 μLs do sobrenadante no microtubos para carregar sobre a placa. Ter cuidado para não afetar o pélete de triton/proteína.

[00234]Instruções de lavador de placa e configuração de banho. Preencher uma garrafa de lavagem de placa com tampão de lavagem de placa (com referência à Etapa 5.3, 1X PBS + 0,1% de Triton X-100). Iniciar o lavador de placa. Verificar os seguintes parâmetros: Parâmetros deveriam ser ajustados para: Tipo de placa: 1 Para cada Ciclo (um total de 4 ciclos): Velocidade de Asp: 10 mm/s; Volume: 400 μLs; Tempo de enxague: 5 segundos; tempo de Asp.: 6 segundos. Ativar o banho de água e ajustar para 95° C. Deixar a temperatura do banho de água equilibrar para 95° C ± 2° C por ao menos 30 minutos.

[00235]Procedimento de ensaio: Uma lista de verificação pode ser usada como um guia mediante a verificação das etapas na medida em que são completa- das. Adicionalmente, registrar todos os equipamentos usados durante o ensaio. A quantidade de alíquotas de Caseína a serem usadas para cada dia que o ensaio será executado precisa ser colocada a 37°C ± 2°C. O tampão de revestimento e substrato são usados frios. Preparar o padrão, amostra, controle, reforço e amostras reforçadas antes e durante a incubação de bloqueio. Pode levar mais tempo do que a incubação de bloqueio de 1 hora preparar as diluições, transferir para tubos ep- pendorf, desnaturar por 15 minutos, resfriar por 15 minutos, centrifugar por 5 minu- tos e transferir para os microtubos. Deixar ao menos 40 minutos antes de bloquear as placas. As amostras, Amostras reforçadas, Padrões, Controle, Reforço de ensaio e soluções em branco são carregadas sobre a placa horizontalmente a partir das filas B a G com o uso de uma pipeta de 12 canais. Os padrões são carregados a partir de alta a baixa concentração. O revestimento de placa, adição de biotina, adi- ção de neutravidina, adição de substrato e adição de solução de parada são feitos verticalmente a partir das colunas 2 a 11.

[00236]Revestir as placas com 100 μL/po^o de anticorpo de revestimento em 50 mM de bicarbonato de sódio frio. Bater no lado da placa até que uma solução de revestimento cubra o fundo dos poços uniformemente, cobrir com fita isolante e incubar a 4° C nominal, enquanto que agita em agitador de placa (ou equivalente) na velocidade 3.

[00237]Após a incubação de um dia para o outro, remover a placa a partir de refrigerador e deixar equilibrar a temperatura ambiente. Agitar o revestimento. Secar a placa com papel-toalha. Bloquear com 300 μL/po^o de Caseína a 37°C ± 2°C, co- brir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de pla- ca Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora ± 10 minutos.

[00238]Preparar o padrão, amostra, controle, reforço e amostras reforçadas antes e durante a incubação de bloqueio. Lavar a placa 4 vezes com tampão de la- vagem. Secar a placa com papel-toalha. Com o uso de uma pipeta de 8 canais, pi- petar 100 μL/po^o de padrões, amostras, reforços, amostras reforçadas, soluções em branco e controle desnaturados em poços triplicados da placa. Os poços fora da placa não são usados, adicionar tampão de diluição não tratado a estes poços. Co- brir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2 C, enquanto que agita em agitador de pla- ca Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 2 horas. Preencher um modelo para utilizar como guia ao carregar a placa.

[00239]Configuração de leitor de placa. Lavar a placa 4 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo biotinilado. Cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de placa Lab-line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 1 hora.

[00240]Lavar a placa 4 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/poço de solução de conjugado de Neutravidina-HRP. Iniciar o cronômetro assim que a neutravidina é adicionada à última fila. Cobrir com fita isolante e incubar a 37°C ± 2°C, enquanto que agita em agitador de placa Lab- line Environ (ou equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm por 30 minutos. Lavar a placa 4 vezes com tampão de lavagem. Secar a placa com papel-toalha. Adicionar 100 μL/poço de substrato azul K, cobrir com fita isolante e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos (iniciar o cronômetro assim que o substrato é adicionado à primeira fila), enquanto que agita na velocidade 3 no agitador de placa de titulação Lab-line (ou equivalente). Parar a reação mediante a adição de 100 μL/po^o de 1 N de ácido fos- fórico. Colocar a placa em um agitador de placa na velocidade 3 por 3 minutos. Ler a placa em 450 nm.

[00241]Análise de dados e cálculos. NOTA: Somente as amostras, reforços, amostras reforçadas e controle com densidades ótimas que se incluem no limite de quantificação prática da curva padrão e que atendem a % de CV ou % de critérios de diferença indicados abaixo, são aceitos. Se as OD's da amostra descer abaixo da curva padrão, o resultado deveria ser relatado como menor do que 0,18 ng/mL (en- saio LOQ). Este valor deveria ser, então, dividido pela concentração de amostra dilu- ída (10 mg/mL) para relatar o valor em ng/mg. Se a amostra for alta em concentra- ção de proteína A fazendo com que a amostra não reforçada e/ou reforçada fique acima da curva padrão (2 ng/mL), então, diluir adicionalmente para que fique dentro da curva padrão. Este valor deveria ser, então, dividido pela concentração de amos- tra diluída para relatar o valor em ng/mg. Para os cálculos de recuperação de refor- ço, subtrair o valor de amostra não reforçada (ng/mL) a partir do valor de amostra reforçada (ng/mL), até quando o valor de amostra não reforçada (ng/mL) está abaixo da curva. Se o valor for negativo ou a 'faixa’ é obtida, então, considerar a amostra não reforçada como zero para os cálculos de recuperação de reforço.

[00242]Curva padrão. Concentrações de padrão deveriam ser inseridas no modelo de protocolo. Um ajuste de curva quadrática é usado. O coeficiente de de- terminação precisa ser = 0,99 e a % de CV entre os poços triplicados precisa ser = 20%. Se estes critérios não foram atendidos: Um padrão (1 nível, 3 poços) pode ser baixado. Se o 0,18 ng/mL for baixado, somente as amostras e amostras reforçadas com densidades ótimas que se incluem nas densidades ótimas de 0,26 ng/mL e 2 ng/mL (os pontos de curva padrão restantes) são aceitáveis. Adicionalmente, para as triplicatas de cada nível de padrão, se um único poço for claramente contaminado ou mostrar baixa ligação, o mesmo pode ser baixado. Se um poço for baixado a par- tir de um nível de padrão, as cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. A % de CV para o menor padrão, o qual mostra valores de OD próximos ao fundo (solução em branco) da placa, deveria ser = 30%. Se um poço for baixado, a % de diferença para as cópias restantes precisa ser = 35%. Se o menor padrão for baixado, somente as amostras e amostras reforçadas com densidades ótimas que se incluem nas densidades ótimas de nível de curva padrão restante são aceitáveis.

[00243]Calcular a % de diferença conforme exposto a seguir: % de diferença = (Abs. (diluição de resultado 1 - diluição de resultado 2)/valor médio) X 100%. O ensaio precisa ser repetido se os padrões não atendem os critérios acima. Relatar valores de % de CV e/ou % de diferença e resultados de coeficiente de determina- ção de curva padrão.

[00244]Amostras. % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Re- latar % de CV entre os poços triplicados. Um poço a partir de cada diluição de amos- tra pode ser baixado. As cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Nota: Se a OD da amostra não reforçada estiver abaixo da menor OD padrão, a % de critérios de diferença não se aplica aos resultados da não reforçada: Fazer refe- rência ao cálculo acima.

[00245]Relatar "Resultado de amostra não reforçada" para cada diluição em ng/mL. Estes valores serão usados em cálculos de recuperação de reforço. Calcular o "Resultado de amostra não reforçada (ng/mL)" médio e a % de diferença entre as diluições. Relatar os resultados. A % de diferença entre as diluições precisa ser = 25%. Calcular a concentração de proteína A real em ng/mg a partir do valor médio (ng/mL), conforme exposto a seguir: proteína A (ng/mg) = "Resultado de amostra não reforçada (ng/mL) médio" Concentração de amostra diluída (10 mg/mL). Regis- trar o resultado.

[00246]Reforços. A % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Registrar a % de CV. Um poço a partir do reforço pode ser baixado. Os pontos res- tantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Fazer referência ao cálculo acima. Relatar a concentração de proteína A em ng/mL. Este resultado será usado em cál- culos de recuperação de reforço. A concentração resultante para o reforço (ng/mL) precisa ser ± 20% da concentração de reforço teórica. Registrar o resultado e indicar aprovado ou reprovado. Se o resultado de reforço não estiver dentro de 20% do teó- rico, o ensaio precisa ser repetido. A concentração de reforço média (ng/mL) x 100 = precisa ser 100% ± 20% 0,296 ng/mL

[00247]Amostras reforçadas. A % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Registrar a % de CV entre os poços triplicados. Um poço a partir de cada diluição de amostra reforçada pode ser baixado. As cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%, Fazer referência ao cálculo acima. Relatar "resultado de amostra reforçada" para cada diluição em ng/mL. Registrar a % de diferença entre as diluições duplicadas. A % de diferença entre as diluições deveria ser = 25%. Es- tes resultados serão usados nos cálculos de recuperação de reforço. Calcular a % de recuperação de reforço para cada conjunto de diluição com o uso da fórmula abaixo: % de recuperação de reforço = valor de amostra reforçada - valor de amos- tra não reforçada X 100. Valor de reforço. NOTA: Para os cálculos de recuperação de reforço, subtrair o valor de amostra não reforçada (ng/mL) a partir do valor de amostra reforçada (ng/mL), mesmo quando o valor de amostra não reforçada (ng/mL) está abaixo da curva. Se o valor for negativo ou a 'faixa' é obtida, então, considerar a amostra não reforçada como zero para os cálculos de recuperação de reforço. % de recuperação de reforço precisa ser 100% ± 50% (50% a 150%o) para cada diluição para cada amostra. Registrar os resultados e aprovar/reprovar.

[00248]Controle. A % de CV deveria ser = 20% entre os poços triplicados. Registrar o resultado de % de CV. Um poço a partir do controle pode ser baixado. As cópias restantes precisam ter uma % de diferença = 20%. Tabela 9. Resultados do ensaio de proteína A e proteína de célula hospedei- ra residual

Tabela 10. Resultados do ensaio de proteína A e proteína de célula hospe- deira residual: Em amostras do processo

[00249]Diversas publicações são mencionadas no presente documento, os conteúdos das quais estão aqui incorporados a título de referência, em suas totali- dades.

Claims (8)

1. Método para purificar um anticorpo anti-IL-13 a partir de uma mistura de amostra que compreende um anticorpo anti-IL-13 e pelo menos uma proteína de célula hospedeira (HCP), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que com- preende: (a) filtração de profundidade da dita primeira amostra de pH ajustado e cole- ta de uma amostra filtrada em profundidade; (b) colocar em contato a dita amostra filtrada em profundidade com uma re- sina de cromatografia de afinidade de Proteína A, lavar a dita resina de cromatogra- fia de afinidade com um tampão que compreende T ris 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2, seguido por uma lavagem com um tampão que compreende citrato de sódio/ácido cítrico 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 6, e depois com um tampão que compreende Tris 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2, e coletar uma amostra de cromatografia de afinidade; (c) submeter a dita amostra de cromatografia de afinidade a uma redução no pH formando, assim, uma amostra de pH reduzido, em que a dita redução no pH é para um pH de cerca de 3 a cerca de 4; (d) ajustar a dita amostra de pH reduzido para um pH de cerca de 4,5 a cer- ca de 8,5 e colocar em contato a dita amostra de pH ajustado com um material de troca aniônica e coletar uma amostra de troca aniônica; (e) colocar em contato a dita amostra de troca aniônica com um material de cromatografia interativa hidrofóbica (HIC) e coletar uma amostra de HIC, em que o dito anticorpo anti-IL-13 compreende seis regiões determinantes de complementaridade (CRDs): CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, em que: CDR-H1 compreende os aminoácidos 33 a 38 da SEQ ID NO:1, CDR-H2 compreende os aminoácidos 52 a 67 da SEQ ID NO:1, CDR-H3 compreende os aminoácidos 100 a 112 da SEQ ID NO:1, CDR-L1 compreende os aminoácidos 24 a 34 da SEQ ID NO:2, CDR-L2 compreende os aminoácidos 50 a 55 da SEQ ID NO:2, e CDR-L3 compreende os aminoácidos 89 a 97 da SEQ ID NO:2.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita redução no pH é realizada pela mistura de um ácido adequado com a dita mistura de amostra, e em que o dito ácido adequado é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido cítrico, ácido acético e ácido caprílico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita resina de Proteína A é resina MabSelect™.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material de troca aniônica é: (i) uma resina de troca aniônica; ou (ii) um material de troca aniônica que é uma resina de troca aniônica que compreende um substituinte aniônico; ou (iii) um material de troca aniônica que é uma resina de troca aniônica que compreende um substituinte aniônico de dietilaminoetil (DEAE); ou (iv) um material de troca aniônica que é uma resina de troca aniônica que compreende um substituinte aniônico de aminoetil quaternário (QAE); ou (v) um material de troca aniônica que é uma resina de troca aniônica que compreende um substituinte aniônico de amina quaternária (Q); ou (vi) um material de troca aniônica que é uma resina de troca aniônica Q- sefarose; ou (vii) um material de troca aniônica que é uma membrana Mustang® Q.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita etapa de troca aniônica compreende uma primeira etapa de troca aniônica e uma segunda etapa de troca aniônica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material de HIC é: (i) uma coluna de HIC cuja fase estacionária compreende grupos hidrofóbi- cos, ou (ii) uma coluna de HIC cuja fase estacionária compreende grupos hidrofóbi- cos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos alquila, grupos arila e uma combinação dos mesmos; ou (iii) uma coluna de HIC selecionada a partir do grupo que consiste em fenil sefarose (tal como, coluna de Fluxo Rápido de Fenil Sefarose™ 6, coluna de Alto Desempenho de Fenil Sefarose™), coluna de Alto Desempenho de Octil Sefarose™, Fractogel™ EMD Propil, colunas de Fractogel™ EMD Fenil, Macro-Prep™ Metil, su- portes de Macro-Prep™ t-Butil, coluna WP HI-Propil (C3)™ e colunas de Toyopearl™ éter, fenil ou butil; ou (iv) uma resina de agarose substituída com grupos fenila.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de filtração, em que a dita amostra de HIC é submetida a filtração para remover partículas virais e para facilitar a troca de tam- pão.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo anti-IL-13 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado.

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