BR112012008650B1 - N-((1r,2s,5r)-5-(terc-butilamino)-2-((s)-3-(7-terc-butilpir azolo[1,5-a] [1,3,5]triazin-4-ilamino)-2- oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, um modulador dual de atividade de receptor de quimiocina, forma cristalina n-1 e processo - Google Patents

Abstract

n-((1r,2s,5r)-5-(terc-butilamino)-2-((s)-3-(7-terc-butilpirazo-lo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sua composição farmacêutica, seus usos e seus processos de preparação. a presente invenção refere-se a um novo antagonista: n-((1r,2s,5r)-5-(terc-butilamino)-2-((s)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida: ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou profármaco, do mesmo, tendo atividade dual inesperada de receptor ccr-2 e ccr-5. são também descritos formas cristalinas, metabólitos, composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de uso das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares. a presente invenção também fornece processos para a preparação de compostos de fórmula (i) como fornecido aqui, incluindo n-((1r,2s,5r)-5-(terc-butilamino)-2-((s)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilano)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida. são também fornecidos compostos que são intermediários úteis do processo.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção fornece N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou profármaco, do mesmo, tendo atividade dual desejável inesperada. Formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de uso das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares é também um objetivo desta invenção. A presente invenção também fornece um processo para a preparação de compostos de fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin- 1-il)cicloexil)acetamida:

em que R1, R8, R9, R10, e são como descritos aqui. Compostos que são intermediários úteis do processo são também fornecidos aqui. Metabólitos de compostos ativos, composições farmacêuticas, e uso dos mesmos são também fornecidos aqui.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[0002] Quimiocinas são citocinas quimiotáticas, de peso molecular 6-15 kDa, que são liberadas por uma ampla variedade de células para atrair e ativar, entre outros tipos celulares, macrófagos, Linfócitos T e B, eosinófilos, basófilos e neutrófilos (revisado em: Charo e outro, New Eng. J. Med., 354:610-621 (2006); Luster, New Eng. J. Med., 338:436 445 (1998); e Rollins, Blood, 90:909-928 (1997)). Existem duas classes principais de quimiocinas, CXC e CC, dependendo de se as duas primeiras cisteínas na sequência de aminoácido são separadas por um único aminoácido (CXC) ou são adjacentes (CC). As quimiocinas CXC, tais como interleucina-8 (IL-8), proteína-2 ativadora de neutrófilo (NAP- 2) e proteína de atividade estimulatória do crescimento de melanoma (MGSA) são quimiotáticas primariamente para neutrófilos e linfócitos T, ao passo que as quimiocinas CC, tais como RANTES, MIP-1α, MIP-1β, as proteínas quimiotáticas de monócito (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP- 4, e MCP-5) e as eotaxinas (-1 e -2) são quimiotáticas para, entre outros tipos celulares, macrófagos, linfócitos T, eosinófilos, células dendríticas, e basófilos. Neste contexto também existem as quimiocinas linfotactina- 1, linfotactina-2 (ambas as quimiocinas C), e fractalcina (a CX3C quimiocina) que não se incluem em qualquer das principais subfamílias de quimiocina.

[0003] As quimiocinas ligam-se a receptores de superfície celular específicos que pertencem à família de sete proteínas de domínio de transmembrana acopladas à proteína G (revisado em: Horuk, Trends Pharm. Sci., 15:159-165 (1994)) que são denominadas "receptores de quimiocina." Na ligação de seus ligantes cognatos, receptores de quimiocina transduzem an intracellular signal embora proteínas G triméricas associadas, resultando em, entre outras respostas, um rápido aumento em concentração de cálcio intracellular, mudanças em forma celular, expressão aumentada de moléculas de adesão celular, desgranulação, e promoção de migração celular. Existem pelo menos dez receptores humanos de quimiocina que se ligam ou respondem às quimiocinas CC com os seguintes padrões característicos (revisado em Zlotnik e outro, Immunity, 12:121 (2000)): CCR-1 (ou "CKR-1" ou "CC- CKR-1") [MIP-1α, MCP-3, MCP-4, RANTES] (Ben-Barruch e outro, Cell, 72:415-425 (1993), e Luster, New Eng. J. Med., 338:436-445 (1998)); CCR-2A e CCR-2B (ou "CKR-2A"/"CKR-2B" ou "CC-CKR-2A"/"CC- CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756 (1994), e Luster, New Eng. J. Med., 338:436-445 (1998)); CCR-3 (ou "CKR-3" ou "CC-CKR-3") [eotaxina-1, eotaxina-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere e outro, J. Biol. Chem., 270:16491-16494 (1995), e Luster, New Eng. J. Med., 338:436-445 (1998)); CCR-4 (ou "CKR-4" ou "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power e outro, J. Biol. Chem., 270:19495-19500 (1995), e Luster, New Eng. J. Med., 338:436-445 (1998)); CCR-5 (ou "CKR-5" ou "CC-CKR-5") [MIP-1α, RANTES, MIP-1β] (Samson e outro, Biochemistry, 35:3362-3367 (1996)); CCR-6 (ou "CKR-6" ou "CC-CKR- 6") [LARC] (Baba e outro, J. Biol. Chem., 272:14893-14898 (1997)); CCR-7 (ou "CKR-7" ou "CC-CKR-7") [ELC] (Yoshie e outro, J. Leukoc. Biol., 62:634-644 (1997)); CCR-8 (ou "CKR-8" ou "CC-CKR-8") [I-309] (Napolitano e outro, J. Immunol., 157:2759-2763 (1996)); CCR-10 (ou "CKR-10" ou "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (Bonini e outro, DNA Cell Biol., 16:1249-1256 (1997)); e CCR-11 [MCP-1, MCP-2, e MCP-4] (Schweickart e outro, J. Biol. Chem., 275:9550 (2000)).

[0004] Além dos receptores mamíferos de quimiocina, citomegaloviroses mamíferas, herpesviroses e poxviroses mostraram expressar, em células infectadas, proteínas com as propriedades de ligação de receptores de quimiocina (revisado em: Wells e outro, Curr. Opin. Biotech., 8:741-748 (1997)). Quimiocinas humanas CC, tais como RANTES e MCP-3, podem causar rápida mobilização de cálcio por meio destes receptores viralmente codificados. A expressão do receptor pode ser permissiva de infecção provendo a subversão de vigilância do sistema imune normal e resposta à infecção. Adicionalmente, receptores de quimiocina humanos, tais como CXCR4, CCR-2, CCR-3, CCR-5 e CCR-8, podem agir como co-receptores para a infecção de células mamíferas por micróbios como com, por exemplo, as viroses de imunodeficiência humana (HIV).

[0005] As quimiocinas e seus receptores cognatos têm sido implicadas como sendo importantes mediadores de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas, e imunorregulatórios, incluindo asma e doenças alérgicas; bem como patologias autoimunes, tais como artrite reumatoide e esclerose múltipla; e doenças metabólicas, tais como aterosclerose e diabetes (revisado em: Charo e outro, New Eng. J. Med., 354:610-621 (2006); Gao, Z. e outro, Chem. Rev., 103:3733 (2003); Carter, P.H., Curr. Opin. Chem. Biol., 6:510 (2002); Trivedi e outro, Ann. Reports Med. Chem., 35:191 (2000); Saunders e outro, Drug Disc. Today, 4:80 (1999); Premack e outro, Nature Medicine, 2:1174 (1996)). por exemplo, o quimioatraente-1 de monócito de quimiocina (MCP-1) e seu receptor Receptor 2 de Quimiocina CC (CCR-2) desempenha um papel fundamental em atração de leucócitos para sítios de inflamação e em subsequente ativação destas células. Quando a quimiocina MCP-1 liga-se a CCR-2, ela induz um rápido aumento em concentração de cálcio intracelular, expressão aumentada de moléculas de adesão celular, e a promoção de migração de leucócito. Demonstração da importância da interação de MCP-1/CCR-2 foi fornecida por experimentos com camundongos geneticamente modificados. Camundongos MCP-1 -/- foram incapazes de recrutar monócitos nos sítios de inflamação após diversos diferentes tipos de desafio imune (Lu, B. e outro, J. Exp. Med., 187:601 (1998)). Igualmente, camundongos CCR-2 -/- foram incapazes de recrutar monócitos ou produzir interferon-Y quando desafiados com vários agentes exógenos; além disso, os leucócitos de camundongos nulos de CCR-2 não migraram em resposta a MCP-1 (Boring, L. e outro, J. Clin. Invest., 100:2552 (1997)), desse modo demonstrando a especificidade da interação de MCP-1/CCR-2. Dois outros grupos independentemente reportaram resultados equivalentes com diferentes cepas de camundongos CCR-2 -/- (Kuziel, W.A. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12053 (1997), e Kurihara, T. e outro, J. Exp. Med., 186:1757 (1997)). A viabilidade e geralmente saúde normal dos animais MCP-1 - /- e CCR-2 -/- é digna de nota, pelo fato de que o rompimento da interação de MCP-1/CCR-2 não induz crise fisiológica. Considerados juntos, estes dados levam à conclusão de que as moléculas que bloqueiam as ações de MCP-1/CCR-2 seriam úteis no tratamento de diversos distúrbios inflamatórios e autoimunes (revisado em: Feria, M. e outro, Exp. Opin. Ther. Patents, 16:49 (2006); e Dawson, J. e outro, Exp. Opin. Ther. Targets, 7:35 (2003)). Esta hipótese foi validada em diversos diferentes modelos de doença animal, como descrito abaixo.

[0006] Sabe-se que a MCP-1 é super-regulada em pacientes com artrite reumatoide (Koch, A. e outro, J. Clin. Invest., 90:772-779 (1992)). Além disso, diversos estudos preclínicos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de artrite reumatoide. Uma vacina de DNA MCP-1 foi mostrada recentemente melhorar artrite em ratos induzida por poliadjuvante crônica (Youssef, S. e outro, J. Clin. Invest., 106:361 (2000)). Igualmente, os sintomas da doença podem ser controlados por meio de administração direta de anticorpos para MCP-1 a ratos com artrite induzida por colágeno (Ogata, H. e outro, J. Pathol., 182:106 (1997)), ou artrite induzida por parede celular estreptocócica (Schimmer, R.C. e outro, J. Immunol., 160:1466 (1998)). Talvez mais significantemente, um antagonista de peptídeo de MCP-1, MCP-1 (9 76), foi mostrado tanto prevenir o início da doença, quanto reduzir os sintomas da doença (dependendo do tempo de administração) no modelo de artrite de camundongo MRL-lpr (Gong, J.-H. e outro, J. Exp. Med., 186:131 (1997)). Além disso, foi demonstrado que a administração de antagonistas de CCR-2 de molécula pequena reduziu o escore clínico em modelos de artrite de roedor (Brodmerkel, C.M. e outro, J. Immunol., 175:5370 (2005); e Xia, M. e outro, Publicação dos Estados Unidos No. 2006/0069123). A administração de um anticorpo anti-CCR-2 teve efeitos variáveis sobre CIA de murino, dependendo do tempo de administração (Bruhl, H. e outro, J. Immunol., 172:890 (2004)). Recentes estudos com camundongos CCR-2 -/- sugeriram que a deleção de CCR-2 pode exacerbar modelos de artrite de roedor em circunstâncias experimentais específicas (Quinones, M.P. e outro, J. Clin. Invest., 113:856 (2004); Quinones, M.P. e outro, J. Mol. Med., 84:503 (2006)).

[0007] Sabe-se que MCP-1 é super-regulada em lesões ateroscleróticas, e foi demonstrado que níveis circulantes de MCP-1 são reduzidos por meio de tratamento com agentes terapêuticos (Rezaie- Majd, A. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22:1194-1199 (2002)). Diversos estudos essenciais demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de aterosclerose. Por exemplo, quando camundongos MCP-1 -/- são cruzados com camundongos deficiente de receptor de LDL, uma redução de 83% em deposição de lipídeo aórtico foi observada (Gu, L. e outro, Mol. Cell, 2:275 (1998)). Similarmente, quando MCP-1 foi geneticamente removida de camundongos que já superexpressaram apolipoproteína B humana, os camundongos resultantes foram protegidos de formação de lesão aterosclerótica com relação aos camundongos de controle de MCP-1 +/+ apoB (Gosling, J. e outro, J. Clin. Invest., 103:773 (1999)). Igualmente, quando camundongos CCR- 2 -/- são cruzados com camundongos apolipoproteína E -/-, um decréscimo significante na incidência de lesões ateroscleróticas foi observado (Boring, L. e outro, Nature, 394:894 (1998); Dawson, T.C. e outro, Aterosclerose, 143:205 (1999)). Finalmente, quando a camundongos apolipoproteína E -/- é administrado um gene codificando um antagonista de peptídeo de CCR-2, então o tamanho da lesão é diminuída e a estabilidade da placa é aumentada (Ni, W. e outro, Circulation, 103:2096-2101 (2001)). Transplante de medula óssea de camundongos CCR-2 -/- para camundongos ApoE3-Leiden inibiu a aterogênese precoce (Guo, J. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 23:447 (2003)), porém teve efeitos mínimos em lesões avançadas (Guo, J. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 25:1014 (2005)).

[0008] Pacientes com diabetes melito tipo 2 tipicamente exibiram resistência à insulina como um dos aspectos característicos da doença. Resistência à insulina está também associada com o grupo de anormalidades conhecidas como a "síndrome metabólica"ou "síndrome X," que inclui obesidade, aterosclerose, hipertensão, e dislipidemia (revisado em: Eckel e outro, Lancet, 365:1415 (2005)). É bem reconhecido que a inflamação desempenha um papel na exacerbação do processo da doença em diabetes tipo 2 e as patologias da "síndrome X" (revisado em: Chen, H., Pharmacological Research, 53:469 (2006); Neels e outro, J. Clin. Invest., 116:33 (2006); Danadona e outro, Am. J. Cardiol., 90:27G-33G (2002); Pickup e outro, Diabetologia, 41:1241 (1998)). MCP-1 é reconhecida como desempenhando um papel em resistência à insulina induzida por obesidade. Em cultura, preadipócitos humanos constitutivamente expressaram MCP-1 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology, 175:81 (2001)). CCR-2 é expresso em adipócitos; Adição de MCP-1 a adipócitos diferenciados in vitro diminui captação de glicose estimulada por insulina e a expressão de diversos genes adipogênicos (LpL, adipsina, GLU-4), aP2, receptor e3-adrenérgico, e PPARy) (Sartipy, P. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:6902 (1999)). Pacientes com diabetes tipo 2 tiveram níveis maiores de MCP-1 circulante do que controles não diabéticos (Nomura, S. e outro, Clin. Exp. Immunol., 121:437 (2000)), e a liberação de MCP-1 de tecido de adipose pôde ser reduzida por tratamento com terapias antidiabéticas, tais como metformina ou tiazolidinadionas (Bruun, J.M. e outro, J. Clin. Endocrinol. Metab., 90:2282 (2005)). Igualmente, MCP-1 foi também superexpressa em modelos de obesidade experimentais de murino, e foi primariamente produzida por tecido de adipose (Sartipy e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:7265 (2003)). Em camundongos obesos, a expressão de MCP-1 tanto precedeu quanto ocorreu concomitantemente com o início de resistência à insulina (Xu, H. e outro, J. Clin. Invest., 112:1821 (2003)). Outro estudo mostrou que a expressão de MCP-1 positivamente correlacionou-se com massa corporal no tecido de adipose perigonadal de camundongos (Weisberg e outro, J. Clin. Invest., 112:1796 (2003)). Consistente com estes dados, o desenvolvimento de resistência à insulina em camundongos db/db foi melhorado ou por meio de deleção genética de MCP-1 ou por expressão induzida por gene de um peptídeo negativo dominante (Kanda, H. e outro, J. Clin. Invest., 116:1494 (2006)). A conversa lógica pode também ser demonstrada: superexpressão de MCP-1 em tecido de adipose promoveu resistência à insulina (Kamei, N. e outro, J. Biol. Chem., 281:26602 (2006)). Também surgiu um resultado conflitante mostrando que a deleção genética de MCP-1 não exerce resistência à insulina no camundongo db/db (Chow, F.Y. e outro, Diabetologia, 50:471 (2007)). Consistente com os dados sobre MCP-1, estudos diretos com CCR-2 (o receptor de MCP-1) mostraram que ela desempenha um papel na formação de obesidade e resistência à insulina induzida por obesidade. A manutenção de uma dieta com alto teor de gordura aumentou os números de monócitos inflamatórios CCR-2+ circulantes em ambos, camundongos do tipo selvagem (Tsou, C.L. e outro, J. Clin. Invest., 117:902 (2007)) e camundongos ApoE -/- (Tacke, F. e outro, J. Clin. Invest., 117:185 (2007)). Deleção genética de CCR-2 reduziu os números de macrófagos ativados em tecido de adipose de murino (Lumeng, C.N. e outro, Diabetes, 56:16 (2007)), porém não afetou uma população de macrófagos de M2 adipose suposta manter o estado "magro" (Lumeng, C.N. e outro, J. Clin. Invest., 117:175 (2007)). Deleção genética de CCR-2 reduziu a obesidade induzida pela dieta e melhorou a sensibilidade à insulina em modelo de obesidade induzida por dieta (Weisberg, S.P. e outro, J. Clin. Invest., 116:115 (2006); Cornelius, P. e outro, Publicação PCT No. WO 2006/013427 A2), dependendo de condições experimentais (Chen, A. e outro, Obes. Res., 13:1311 (2005)). Administração de um antagonista de CCR-2 de molécula pequena também melhorou a sensibilidade à insulina neste modelo da mesma (Weisberg, S.P. e outro, J. Clin. Invest., 116:115 (2006)).

[0009] Dois estudos descreveram o importante papel de CCR-2 em inflamação vascular induzida por hipertensão, remodelagem, e hipertrofia (Bush, E. e outro, Hypertension, 36:360 (2000); Ishibashi, M. e outro, Circ. Res., 94:1203 (2004)).

[00010] Sabe-se que a MCP-1 é super-regulada em esclerose múltipla humana, e mostrou que terapia efetiva com interferon β-1b reduz a expressão de MCP-1 em células mononucleares de sangue periférico, sugerindo que a MCP-1 desempenha um papel em progressão da doença (Iarlori, C. e outro, J. Neuroimmunol., 123:170 179 (2002)). Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de esclerose múltipla; todos estes estudos foram demonstrados em encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo animal convencional para esclerose múltipla. Administração de anticorpos para MCP-1 para animals com EAE significantemente diminuiu a recaída da doença (Kennedy, K.J. e outro, J. Neuroimmunol., 92:98 (1998)). Além disso, dois relatos mostraram que camundongos CCR-2 -/- são resistentes a EAE (Fife, B.T. e outro, J. Exp. Med., 192:899 (2000); Izikson, L. e outro, J. Exp. Med., 192:1075 (2000)). Um subsequente relato estendeu estas observações iniciais examinando os efeitos de deleção de CCR-2 em camundongos de diferentes cepas (Gaupp, S. e outro, Am. J. Pathol., 162:139 (2003)). Notavelmente, a administração de um antagonista de CCR-2 de molécula pequena também mitigou a progressão da doença em camundongos C57BL/6 (Brodmerkel, C.M. e outro, J. Immunol., 175:5370 (2005)).

[00011] Sabe-se que a MCP-1 é super-regulada em pacientes que desenvolvem syndrome de bronquiolite obliterante após transplante de pulmão (Reynaud-Gaubert, M. e outro, J. Heart pulmão Transplant., 21:721-730 (2002); Belperio, J. e outro, J. Clin. Invest., 108:547-556 (2001)). Em um modelo de murino de síndrome de bronquite obliterante, administração de um anticorpo a MCP-1 levou à atenuação de obliteração das vias aéreas; igualmente, camundongos CCR-2 -/- foram resistentes à obliteração das vias aéreas neste mesmo modelo (Belperio, J. e outro, J. Clin. Invest., 108:547-556 (2001)). Estes dados sugerem que o antagonismo de MCP-1/CCR-2 pode ser benéfico no tratamento de rejeição de órgãos após o transplante. Além disso, estudos mostraram que o rompimento do eixo MCP-1/CCR-2 foi capaz de prolongar a sobrevivência de transplante de ilhota (Lee, I. e outro, J. Immunol., 171:6929 (2003); Abdi, R. e outro, J. Immunol., 172:767 (2004)). Em modelos de enxerto de rato, CCR-2 e MCP-1 foi mostrado ser super-regulado em enxergos que desenvolvem vasculopatia de enxerto (Horiguchi, K. e outro, J. Heart pulmão Transplant., 21:1090 (2002)). Em outro estudo, terapia de gene anti-MCP-1 atenuou a vasculopatia de enxerto (Saiura, A. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 24:1886 (2004)). Um estudo descreveu a inibição de formação de neoíntima de enxerto de veia experimental por bloqueio de MCP-1 (Tatewaki, H. e outro, J. Vasc. Surg., 45:1236 (2007)).

[00012] Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de asma. Sequestração de MCP-1 com um anticorpo neutralizante em camundongos desafiados com ovalbumina resultou em decréscimo acentuado em hipersensibilidade e inflamação bronquial (Gonzalo, J.-A. e outro, J. Exp. Med., 188:157 (1998)). Provou-se ser possível reduzir inflamação das vias aéreas alérgica em camundongos desafiados com ovos de Schistosoma mansoni por meio da administração de anticorpos para MCP-1 (Lukacs, N.W. e outro, J. Immunol., 158:4398 (1997)). Consistente com isto, camundongos MCP-1 -/- apresentaram uma resposta reduzida ao desafio com ovos de Schistosoma mansoni (Lu, B. e outro, J. Exp. Med., 187:601 (1998)).

[00013] Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de doença renal. Administração de anticorpos para MCP-1 em um modelo de nefrite glomerular de murino resultou em um decréscimo acentuado em formação crescente glomerular e deposição de colágeno tipo I (Lloyd, C.M. e outro, J. Exp. Med., 185:1371 (1997)). Além disso, camundongos MCP-1 -/- com nefrite de soro nefrotóxica induzida mostrou dano significantemente menos tubular do que seus contrapartes MCP-1 +/+ (Tesch, G.H. e outro, J. Clin. Invest., 103:73 (1999)).

[00014] Diversos estudos demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de lúpus eritematoso sistêmico. Camundongos CCR-2 -/- exibiram sobrevivência prolongada e doença renal reduzida com relação a seus contrapartes WT em um modelo murino de lúpus eritematoso sistêmico (Perez de Lema, G. e outro, J. Am. Soc. Neph., 16:3592 (2005)). Estes dados são consistentes com a atividade de modificação da doença encontrada em estudos recentes sobre a deleção genética de MCP-1 (Shimizu, S. e outro, Rheumatology (Oxford), 43:1121 (2004); Tesch, G.H. e outro, J. Exp. Med., 190:1813 (1999)) ou administração de um antagonista de peptídeo de CCR-2 (Hasegawa, H. e outro, Artrite Rheum., 48:2555 (2003)) em modelos de roedor de lúpus.

[00015] Um aumento de 30 vezes extraordinário em linfócitos da própria lâmina de CCR-2+ foi observado no intestino delgado de pacientes de Crohn com relação a íleo não doente (Connor, S.J. e outro, Gut, 53:1287 (2004)). Também de nota, houve uma expansão no subgrupo de monócitos CCR-2+/CD14+/CD56+ circulantes em pacientes com doença de Crohn ativa com relação aos controles. Diversos estudos de roedor demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de doença de Crohn/colite. Camundongos CCR-2 -/- foram protegidos dos efeitos de colite induzida por sulfato de sódio de dextrana (Andres, P.G. e outro, J. Immunol., 164:6303 (2000)). Administração de um antagonismo de molécula pequena de CCR-2, CCR-5, e CXCR3 (afinidades de ligação de murino = 24, 236, e 369 nM, respectivamente) também protegeu contra colite induzida por sulfato de sódio de dextrana (Tokuyama, H. e outro, Int. Immunol., 17:1023 (2005)). Finalmente, camundongos MCP- 1 -/- mostraram dano colônico substancialmente reduzido (tanto macroscópico quanto e histológico) em um modelo de colite induzido por hapteno (Khan, W.I. e outro, Am. J. Physiol. Gastrointest. fígado Physiol., 291:G803 (2006)).

[00016] Dois relatos descreveram a superexpresão de MCP-1 nas células epiteliais intestinais e mucosa do intestino de pacientes com doença do intestino inflamatória (Reinecker, H.C. e outro, Gastroenterology, 108:40 (1995), e Grimm, M.C. e outro, J. Leukoc. Biol., 59:804 (1996)).

[00017] Um estudo descreveu a associação de polimorfismo promotor no gene MCP-1 com escleroderma (esclerose sistêmica) (Karrer, S. e outro, J. Invest. Dermatol., 124:92 (2005)). Em modelos relatados de fibrose de tecido, inibição de eixo CCR-2/MCP-1 reduziu a fibrose em pele (Yamamoto, T. e outro, J. Invest. Dermatol., 121:510 (2003); Ferreira, A.M. e outro, J. Invest. Dermatol., 126:1900 (2006)), pulmão (Okuma, T. e outro, J. Pathol., 204:594 (2004); Gharaee- Kermani, M. e outro, Cytokine, 24:266 (2003)), rim (Kitagawa, K. e outro, Am. J. Pathol., 165:237 (2004); Wada, T. e outro, J. Am. Soc. Nephrol., 15:940 (2004)), coração (Hayashidani, S. e outro, Circulation, 108:2134 (2003)), e fígado (Tsuruta, S. e outro, Int. J. Mol. Med., 14:837 (2004)).

[00018] Um estudo demonstrou o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de alveolite. Quando ratos com dano de pulmão do complexo immune de IgA foram tratados intravenosamente com anticorpos criados em comparação com MCP-1 de rato (JE), os sintomas de alveolite foram parcialmente aliviados (Jones, M.L. e outro, J. Immunol., 149:2147 (1992)).

[00019] Diversos estudos mostraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de câncer (revisado em: Craig, M.J. e outro, câncer Metastasis Rev., 25:611 (2006); Conti, I. e outro, Seminars in câncer Biology, 14:149 (2004); Giles, R. e outro, Curr. Cancer Drug Targets, 6:659 (2006)). Quando camundongos imunodeficientes transportando células de carcinoma de mama humana foram tratados com um anticorpo anti-MCP-1, inibição de micrometástases de pulmão e aumentos em sobrevivência foram observados (Salcedo, R. e outro, Blood, 96:34-40 (2000)). Usando espécimens de tumor clínicas humanas, a expressão de CCR-2 foi associada com a progressão de câncer de próstata (Lu, Y. e outro, J. Cell. Biochem., 101:676 (2007)). In vitro, a expressão de MCP-1 mostrou mediar o crescimento e invasão de célula de cancer de próstata (Lu, Y. e outro, Próstata, 66:1311 (2006)); Além disso, MCP-1 expressa por células de câncer da próstata induziu progenitores de medula óssea humana para reabsorção óssea (Lu, Y. e outro, Cancer Res., 67:3646 (2007)).

[00020] Múltiplos estudos descreveram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de restenose. ESm humanos, níveis de MCP-1 correlacionam-se diretamente com risco para restenose (Cipollone, F. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 21:327 (2001)). Camundongos deficientes em CCR-2 ou em MCP-1 mostraram reduções na area íntima e na relação íntima/meio (com relação a filhotes do tipo selvagem) após lesão arterial (Roque, M. e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22:554 (2002); Schober, A. e outro, Circ. Res., 95:1125 (2004); Kim, W.J. e outro, Biochem. Biophys. Res. Commun., 310:936 (2003)). Em camundongos, transfecção de um inibidor negativo dominante de MCP-1 no músculo esqueletal (Egashira, K. e outro, Circ. Res., 90:1167 (2002)) também reduziu a hiperplasia íntima após lesão arterial. Bloqueio de CCR-2 usando um anticorpo neutralizante reduziu a hiperplasia neoíntima após colocação de stent em primatas (Horvath, C. e outro, Circ. Res., 90:488 (2002)).

[00021] Dois relatos descrevem a superexpressão de ratos MCP-1 com trauma cerebral induzido (King, J.S. e outro, J. Neuroimmunol., 56:127 (1994), e Berman, J.W. e outro, J. Immunol., 156:3017 (1996)). Além disso, estudos mostraram que ambos os camundongos CCR-2 -/- (Dimitrijevic, O.B. e outro, acidente vascular cerebral, 38:1345 (2007)) e MCP-1 -/- (Hughes, P.M. e outro, J. Cereb. Blood Flow Metab., 22:308 (2002)) são parcialmente protegidos de isquemia dano de reperfusão.

[00022] Sabe-se que monócitos/macrófagos desempenham um importante papel no desenvolvimento de dor neuropática (Liu, T. e outro, Pain, 86:25 (2000)). Consistente com esta noção, um papel potencial para CCR-2 no tratamento de dor tanto inflamatória quanto neuropática foi recentemente descrito. Camundongos CCR-2 -/- mostraram respostas alternadas à dor inflamatória com relação a seus contrapartes WT, incluindo comportamento de dor reduzida após injeção de formalina intraplantar e alodinia mecânica ligeiramente reduzida após injeção de CFA intraplantar (Abbadie, C. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:7947 (2003)). Além disso, camundongos CCR-2 -/- não mostraram significante alodinia mecânica após lesão de nervo ciático. Igualmente, um antagonista de CCR-2 de molécula pequena reduziu a alodinia mecânica para ~80% de níveis pré-lesão após administração oral (Abbadie, C. e outro, PCT Publication No. WO 2004/110376).

[00023] Um estudo descreveu o papel crítico de MCP-1 em cardiomiopatia isquêmica (Frangogiannis, N.G. e outro, Circulation, 115:584 (2007)). Outro estudo descreveu a atenuação de insuficiência cardíaca experimental após a inibição de MCP-1 (Hayashidani, S. e outro, Circulation, 108:2134 (2003)).

[00024] Outros estudos forneceram evidência de que a MCP-1 é superexpressa em vários estados de doença não mencionados acima. Estes relatos fornecem evidência correlative de que antagonistas de MCP-1 podem ser terapêuticos úteis para tais doenças. Outro estudo demonstrou a superexpressão de MCP-1 em aloenxertos cardíacos de roedor, sugerindo um papel para MCP-1 na patogênese de arteriosclerose por transplante (Russell, M.E. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6086 (1993)). A superexpressão de MCP-1 observada nas células endoteliais de pulmão de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (Antoniades, H.N. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5371 (1992)). Similarmente, a superexpressão de MCP-1 foi observada na pele de pacientes com psoríase (Deleuran, M. e outro, J. Dermatol. Sci., 13:228 (1996), e Gillitzer, R. e outro, J. Invest. Dermatol., 101:127 (1993)); descobertas correlativas com predominância de células CCR- 2+ foram também reportadas (Vestergaard, C. e outro, Acta Derm. Venerol., 84:353 (2004)). Finalmente, um recente relato mostrou que a MCP-1 é superexpressa no cérebro e fluido cerebroespinhal de pacientes com demência associada com HIV-1 (Garzino-Demo, A., Publicação PCT No. WO 99/46991).

[00025] Além disso, polimorfismo foi mostrado estar associado com sarcoidose pelo menos em um subgrupo de pacientes (Spagnolo, P. e outro, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 168:1162 (2003)).

[00026] Deve também ser observado que CCR-2 foi implicado como um co-receptor para algumas cepas de HIV (Doranz, B.J. e outro, Cell, 85:1149 (1996)). Foi também determinado que o uso de CCR-2 como um co-receptor de HIV pode estar correlacionado com a progressão da doença (Connor, R.I. e outro, J. Exp. Med., 185:621 (1997)). Esta descoberta é consistente com a recente descoberta de que a presença de um mutante de CCR-2, CCR-2-64I, está positivamente correlacionada com o início retardado de HIV na população humana (Smith, M.W. e outro, Science, 277:959 (1997)). Embora MCP-1 não tenha sido implicada com estes processos, pode ser que antagonistas de MCP-1 que agem por meio da ligação a CCR-2 possam tser efeitos terapêuticos benéficos no retardo da progressão da doença para AIDS em pacientes infectados com HIV.

[00027] Deve ser observado que a CCR-2 é também o receptor para as quimiocinas humanas MCP-2, MCP-3, e MCP-4 (Luster, New Eng. J. Med., 338:436-445 (1998)). Visto que os novos compostos de fórmula (I) descritos aqui antagonize MCP-1 por ligação ao receptor CCR-2, pode ser que estes compostos de fórmula (I) são também antagonistas efetivos das ações de MCP-2, MCP-3, e MCP-4 que são mediadas por CCR-2. Consequentemente, quando Referência é feita aqsui a "antagonismo de MCP-1," deve ser assumido qsue isto é equivalente a "antagonismo de estimulação de quimiocina de CCR-2."

[00028] Consequentemente, compostos que modulam a atividade de quimiocina podem demonstrar uma ampla faixa de utilidades no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares. Publicação PCT Nos. WO 2005/021500 A1 (incorporada aqui por Referência e designada para o presente requerente), WO 2008/014381 A1, WO 2008/014360 A1 e WO 2008/014361 A1, descrevem compostos que modulam a atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4 por meio de CCR-2. As referências também descrevem vários processos para preparer estes compostos incluindo síntese de múltiplas etapas que incluem a introdução e subsequente remoção de grupos de proteção.

[00029] É desejável encontrar novos compostos com caracaterísticas farmacológicas melhoradas em comparação com moduladores conhecidos de quimiocina. Por exemplo, é desejável encontrar novos compostos com atividade inibitória de CCR-2/5 dual equipotente em comparação à seletividade para CCR-2 sozinho, predominantemente CCR-2 versus CCR-5, predominantemente CCR-5 versus CCR-2, ou outros receptores acoplados à proteína G (isto é, receptor de 5HT2A). É também desejável encontrar compostos com atividade inibitória de CCR-2/5 dual equipotente e vantajosas características em uma ou mais das seguintes categorias: (a) propriedades farmacêuticas (isto é, solubilidade, permeabilidade, receptividade para formulações de liberação sustentada); (b) requisitos de dosagem (por exemplo, dosagens inferiores e/ou dosagem de uma vez ao dia); (c) fatores que diminuem as características de pico-a-rasa da concentração sanguínea (isto é, clearance e/ou volume de distribuição); (d) fatores que aumentam a concentração de fármaco ativo no receptor (isto é, ligação de proteína, volume de distribuição); (e) fatores que diminuem o risco de interações fármaco- fármaco clínicas (inibição ou indução de enzima citocromo P450, tal como inibição de CYP 2D6, veja Dresser, G.K. e outro, Clin. Pharmacokinet., 38:41-57 (2000), que é pelo presente incorporado por referência); e (f) fatores que diminuem o potencial de efeitos colaterais adversos (por exemplo, seletividade farmacológica além de receptores acoplados à proteína G, química potencial ou reatividade metabólica, penetração do CNS limitada, seletividade de canal de íon). É especialmente desejável encontrar compostos tendo uma combinação desejável das características farmacológicas anteriormente mencionadas.

[00030] É também desejável na técnica fornecer novos e/ou melhorados processos para preparar tais compostos. Estes processos podem ser caracterizados, sem limitação, por a) fácil adaptação a produção de maior escala, tais como usinas piloto ou escalas de fabricação; b) etapas de processo e/ou técnicas que possibilitam melhoras na pureza (incluindo pureza quiral), estabilidade e/ou facilidade de manipulação de intermediários e/ou compostos finais; e/ou c) menos etapas de processo.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00031] A presente invenção fornece um novo antagonista: N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou profármaco, do mesmo, tendo inesperada atividade inibitória dos receptores CCR-2 e CCR-5 dual equipotente. Além disso, a presente invenção apresenta uma nova e inesperada combinação de atividade de CCR-2/5 equipotent dual e desejáveis características farmacológicas. Formas cristalina e metabólita da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de uso das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares é também um objetivo desta invenção. A presente invenção também fornece um processo para a preparação de compostos de fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida:

[00032] em que R1, R8, R9, R10, e HET são como descritos aqui.Compostos que são intermediários úteis do processo são também fornecidos aqui.

[00033] A presente invenção também fornece o uso de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-(2-hidróxi-1,1-dimetil- etil)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou profármaco, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares.

[00034] A presente invenção também fornece metabólitos de compostos ativos, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou profármacos do mesmo, composições farmacêuticas do mesmo e métodos de uso dos metabólitos no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares, particularly diabetes, esclerose múltipla, doença de Crohn e/ou aterosclerose.

[00035] Consequentemente, são descritos aqui novos moduladores de atividade de quimiocina, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou profármacos do mesmo, tendo uma combinação inesperada de características farmacológicas desejáveis.

[00036] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou forma de profármaco do mesmo.

[00037] A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares, particularmente diabetes, esclerose múltipla, doença de Crohn e/ou aterosclerose, compreendendo administrar a um hospedeiro em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou forma de profármaco do mesmo.

[00038] A presente invenção fornece um processo para a preparação de compostos descritos aqui e intermediários úteis portanto.

[00039] A presente invenção provê o uso dos compostos da presente invenção em terapia.

[00040] A presente invenção provê o uso de compostos da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00041] A FigurA 1 descreve os padrões de pó experimentais e simulados do N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida.

[00042] A Figura 2 descreve a Análise de Calorimetria de Varredura Diferencial de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, Forma de Base Livre N-1.

[00043] A Figura 3 descreve a análise termogtavimétrica de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, Forma de Base Livre N-1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00044] A presente invenção fornece um novo antagonista: N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou profármaco, do mesmo, tendo inesperada atividade de receptor CCR-2 e CCR-5 dual equipotente. Adicionalmente, a presente invenção fornece uma nova combinação de desejáveis características farmacológicas. Formas cristalinas e metabólitos da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de uso das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares é também um objetivo desta invenção. A presente invenção também fornece um processo para a preparação de compostos de fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin- 1-il)cicloexil)acetamida:

[00045] em que R1, R8, R9, R10, e HET são como descritos aqui.Compostos que são intermediários úteis do processo são também fornecidos aqui.

[00046] N-((1R,2S,5R)-5-(terc-Butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, inesperadamente demonstra atividade inibitória do receptor CCR-2/5 dual equipotente.

[00047] Adicionalmente, N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3- (7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida demonstra uma desejável combinação de atividade inibitória de receptor CCR-2/5 dual equipotente e características farmacológicas incluindo um grau surpreendentemente elevado de biodisponibilidade oral em combinação com indicações, que é altamente eficaz e tem excelentes critérios de segurança.

[00048] Moduladores conhecidos de receptores de quimiocina, tais como aqueles descritos nas Publicações PCT Nos. WO 2004/071460 A1 e WO 2005/021500 A1 (Patente dos Estados Unidos No. 7.163.937, emitidas em 16 de janeiro de 2007, designado para o presente Requerente) não são suficientemente eficazes, como medido por sua capacidade de ligação a CCR-2 ou CCR-5 (uma medida de eficácia), e/ou eles não possuem critérios apropriados para segurança como indicado por seletividade de canal de íon como medido por estudos de canal de íon de hERG e Na+.

[00049] Outros moduladores conhecidos de receptores de quimiocina, tais como aqueles descritos nas Publicações PCT Nos. WO 2008/014381 A1, WO 2008/014360 A1 e WO 2008/014361 A1, são seletivos como antagonista ou parcial agonista/antagonista de atividade de receptor de CCR-2. Entretanto, estes moduladores conhecidos demonstram predominantemente atividade de CCR-2 e não são antagonistas duais equipotentes, como medido por sua capacidade de ligação a CCR-2 e CCR-5.

[00050] Outros conhecidos moduladores de receptores de quimiocina, tais como aqueles descritos por Carter e outro (American Chemical Society, August 17, 2008) são moduladores duais CCR-2/5, porém não possuem critérios apropriados para segurança como indicado por seletividade de canal de íon como medido por estudos de canal de íon de hERG e Na+.

[00051] Ao contrário, como ilustrado pelos dados apresentados aqui na seção intitulada "Características Farmacológicas Comparativas", infra, N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida surpreendentemente exibe capacidade de ligação a CCR-5 e CCR-2 equipotente. Além disso, N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida demonstra um grau surpreendentemente elevado de permeabilidade de membrana, e ainda mantém capacidade de ligação dual a CCR-2/5 juntamente com excelente seletividade de canal de íon.

[00052] Consequentemente, a presente invenção fornece novos moduladores de quimiocina tendo capacidade de ligação a CCR-2 e CCR-5 equipotente e melhora as características farmacológicas que são supostas serem úteis no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares.

MODALIDADES

[00053] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida:

N O e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00054] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida.

[00055] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, em que a forma cristalina compreende a Forma N-1 e/ou P-1.

[00056] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, em que a forma cristalina compreende a Forma N-1.

[00057] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, em que a forma cristalina compreende a Forma N-1 ou P-1 em forma substancialmente pura.

[00058] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, em que a forma cristalina compreende a Forma N-1 em forma substancialmente pura.

[00059] Outra modalidade é a Forma N-1 caracterizada por parâmetros celulares unitários substancialmente iguais aos seguintes:

[00060] Dimensões celulares: a = 7,3085(6) b= 16,257(1) c = 22.688(2) α° = 90 β° = 90 Y° = 90 Grupo de espaço P212121 Moléculas/célula unitária (Z): 1 Densidade, calc. g-cm-3: 1.194 em que o referido cristal está em uma temperatura de cerca de -70 °C.

[00061] Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de raio-x de pó substancialmente de acordo com a figura 1.

[00062] Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um termograma de calorimetria de varredura diferencial substancialmente de acordo com aquilo mostrado na figura 2, tendo uma transição endotérmica acima de aproximadamente 205 °C.

[00063] Outra modalidade é caracterizada por (ou tendo) uma curva de análise gravimétrica térmica de acordo com aquilo mostrado na figura 3.

[00064] Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, compreendendo a Forma N-1, caracterizada pelos parâmetros de célula unitária encontrados na tabela 1; e/ou um padrão de difração de raio-x de pó substancialmente de acordo com a figura 1.

[00065] Outra modalidade é uma composição farmacêutica compreendida de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00066] Outra modalidade é uma composição farmacêutica compreendida de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00067] Outra modalidade é uma composição farmacêutica compreendida de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00068] Outra modalidade é um método para modular quimiocina ou atividade de receptor de quimiocina compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00069] Outra modalidade é um método de modular atividade de receptor CCR-2 e CCR-5 compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00070] Outra modalidade é um método de modulação da atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1a, MIP-1b e RANTES que é mediada pelo receptor CCR-2 e CCR-5 compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3- (7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00071] Outra modalidade é um método de modular a atividade de MCP-1 compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00072] Outra modalidade é um método de tratar um distúrbio, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, o referido distúrbio é selecionado de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose por transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite de soro nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatoide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, e câncer.

[00073] Outra modalidade é um método de tratar um distúrbio, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, em que o referido distúrbio é selecionado de diabetes, obesidade, doença de Crohn, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose por transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite de soro nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, e artrite reumatoide, restenose, transplante de órgão, câncer, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

[00074] Outra modalidade é um método de tratar um distúrbio, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, em que o referido distúrbio é selecionado de diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose, transplante de órgão, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

[00075] Outra modalidade é um método de tratar um distúrbio, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, em que o referido distúrbio é selecionado de esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn, diabetes, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

[00076] Outra modalidade é um método de tratar um distúrbio, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, em que o referido distúrbio está sendo selecionado de restenose, transplante de órgão, câncer, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

[00077] Outra modalidade é um método de tratamento de diabetes, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00078] Outra modalidade é um método de tratamento de doença de Crohn, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de t N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00079] Outra modalidade é um método de tratamento de esclerose múltipla, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00080] Outra modalidade é um método de tratamento de aterosclerose, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00081] Outra modalidade é um método de tratamento de restenose, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00082] Outra modalidade é um método de tratamento de transplante de órgão, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00083] Outra modalidade é um método de tratamento de câncer, por exemplo, câncer de mama, câncer de fígado, câncer da próstata e melanoma, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00084] Outra modalidade é um método de tratamento de hiperplasia neoíntima venosa, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00085] Outra modalidade é um método de tratamento de hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00086] Outra modalidade é um método de tratamento de hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00087] Outra modalidade é um método de tratamento de uma doença inflamatória, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, e/ou cardiovasculares compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00088] Outra modalidade é um método de tratamento de uma doença que é pelo menos parcialmente mediada por CCR-2 e CCR-5, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo.

[00089] Outra modalidade é um método de uso de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose por transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite de soro nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatoide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, câncer, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

[00090] Em ainda outra modalidade, a invenção é direcionada a N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-(2-hidróxi-1,1-dimetil- etil)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida:

[00091] e sais farmaceuticamente aceitáveis, do mesmo. Composições farmacêuticas contendo os mesmos e métodos de uso dos mesmos como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares são também uma modalidade desta invenção.

MODALIDADES DO PROCESSO

[00092] Em uma primeira modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I, ou uma forma de sal do mesmo: compreendendo:

1) converter um composto de hidrazona de fórmula I-cc em um composto de fórmula I-bb; e 2) acoplar o composto de fórmula I-bb com um composto de fórmula I-aa; em que: R1 é independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina selecionado de um grupo carbobenzilóxi, um terc- butiloxicarbonila, um grupo fluorenilmetiloxicarbonila, um grupo benzila, e um grupo p-metoxibenzila; R8 e R9 são independentemente hidrogênio ou C1-6alquila; R21 é =O; HET é um anel bicíclico heteroarila ou heterociclo de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo pelo menos um heteroátomo de nitrogênio; e LG é -OR16, em que R16 é C1-6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos com 1 a 3 grupos selecionados de halogênio, CF3 ou C1-6alquila.

[00093] Em uma segunda modalidade, a invenção fornece um processo em que o composto de fórmula I é N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida.

[00094] Em uma terceira modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I em que o composto de fórmula I-bb é um composto da fórmula:

[00095] Em uma quarta modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I em que o acoplamento ocorre por meio de uma preparação acídica seguida pela adição de uma base.

[00096] Em uma quinta modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I em que o ácido em preparação acídica é selecionado de ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glicólico, e ácido hidroclórico.

[00097] Em uma sexta modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I em que a base é selecionada de K2HPO4, Na2HPO4, NaHCO3 e KHCO3.

[00098] Em uma sétima modalidade, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula I em que a conversão do composto de hidrazona de fórmula I-cc no composto de fórmula I-bb compreende reagir o composto de hidrazona de fórmula I- cc com um agente de acilação, um nucleófilo, e/ou uma base de amina terciária em um solvente seguido por interceptação com ou (i) um álcool na presença de uma segunda base de amina terciária ou (ii) um alcóxido para formar o composto de fórmula I-bb.

[00099] Em uma oitava modalidade, a invenção fornece um processo em que o agente de acilação é selecionado de oxicloreto de fósforo, cloreto de oxalila, cloreto de tionila e fosgênio, preferivelmente oxicloreto de fósforo.

[000100] Em uma nona modalidade, a invenção fornece um processo em que a base de amina terciária é selecionada de trietilamina, N-N- diisopropil-N-etil amina, tri-n-propilamina, N-metil morfolina e 1,4- diazabiciclo[2.2.2]octano, preferivelmente N-N-diisopropil-N-etil amina.

[000101] Em uma décima modalidade, a invenção fornece um processo em que o nucleófilo é selecionado de dimetil 4-aminopiridina, dimetilanilina, piridina e lutidina, preferivelmente dimetil 4-aminopiridina.

[000102] Em uma decimal primeira modalidade, a invenção fornece um processo em que a quantidade de nucleófilo usada na reação é 2,0 a 4,0 equivalentes, preferivelmente, 3,0 equivalentes.

[000103] Em uma décima segunda modalidade, a invenção fornece um processo em que o álcool ou alcóxido é selecionado de fenol, pentafluorofenol, metanol, etanol, metóxido de sódio e fenolato de sódio, preferivelmente, fenol.

[000104] Em uma décima terceira modalidade, a presente invenção fornece um processo em que a segunda base de amina terciária é selecionada de trietilamina, N-N-diisopropil-N-etil amina, tri-n- propilamina, N-metil morfolina, e 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, preferivelmente, N-N-diisopropil-N-etil amina.

[000105] Em uma décima quarta modalidade, a invenção fornece um processo em que o solvente é selecionado de acetonitrila, diclorometano e oxicloreto de fósforo puro.

[000106] Em uma decimal quinta modalidade, a invenção fornece um processo em que a reação e interceptação são realizadas em uma temperatura na faixa de temperatura ambiente a 70 °C.

[000107] Em uma décima sexta modalidade, a invenção fornece um processo em que o composto de fórmula I-cc é um composto da fórmula:

[000108] Em uma décima sétima modalidade, a presente invenção fornece um processo em que o composto de hidrazona de fórmula I-cc é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de hidrazona de fórmula I-dd

[000109] com ortoformiato na presença de um ácido em temperatura elevada para produzir o composto de hidrazona de fórmula I-cc; em que R21 é =O; R22 é -NH-NH2; e R23 é cianoalquila; ou R22 e R23 podem ser empregados juntos um anel de 5 a 8 membros, em que o anel pode ser opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados de amino, alquila, arila, ou heteroarila e pode opcionalmente conter 1, 2, 3, ou 4 heteroátomos independentemente selecionados do grupo consistindo em N, S, ou O.

[000110] Em uma décima oitava modalidade, a invenção fornece um processo em que o ortoformiato é selecionado de trimetilortoformiato, trietilortoformiato, e tripropilortoformiato, preferivelmente, trimetilortoformiato.

[000111] Em uma décima nona modalidade, a invenção fornece um processo em que o ácido é selecionado de ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido hidroclórico e ácido metanossulfônico, preferivelmente, ácido acético.

[000112] Em uma vigésima modalidade, a invenção fornece um processo em que a reação são realizadas em uma temperatura na faixa de 40-90 °C, preferivelmente, 40-75 °C.

[000113] Em uma vigésima primeira modalidade, a invenção fornece um processo em que o composto de fórmula I-dd é selecionado de um composto da fórmula:

[000114] Em uma vigésima segunda modalidade, a invenção fornece um processo em que o composto de hidrazona de fórmula I-dd é preparado por um processo compreendendo condensar um composto de fórmula I-ee, R23=O, com um composto de carbazida de fórmula I-ff:

[000115] em um solvente na presença de uma base para produzir o composto de hidrazona de fórmula I-dd; em que R21 é =O e R22 e R23 são como mencionado acima.

[000116] Em uma vigésima terceira modalidade, a invenção fornece um processo em que o solvente é selecionado de etanol, 2-propanol, 1- propanol e metanol, preferivelmente, etanol.

[000117] Em uma vigésima quarta modalidade, a invenção fornece um processo em que a base é selecionada de acetato de sódio, acetato de potássio, trietilamina e N-N-diisopropil-N-etil amina, preferivelmente, acetato de sódio.

[000118] Em uma vigésima quinta modalidade, a invenção fornece um processo em que a condensação ocorre em uma temperatura na faixa de 20-60 °C, preferivelmente, 25-55 °C.

[000119] Em uma vigésima sexta modalidade, a presente invenção fornece um processo em que o composto de carbazida de fórmula I-ff é cloridrato de semicarbazida.

[000120] Em uma vigésima sétima modalidade, a presente invenção fornece um processo em que o composto de fórmula I-ee é acetonitrila de pivaloíla.

[000121] Em uma vigésima oitava modalidade, a presente invenção fornece um processo para a preparação de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida compreendendo o processo mencionado no seguinte esquema:

[000122] A presente invenção pode ser representada em outras formas específicas sem afastar-se do espírito ou atributos essenciais da mesma. Desse modo, as modalidades acima não devem ser consideradas limitantes. Qualquer e todas as modalidades da presente invenção pode ser consideradas em conjunto com outra modalidade ou modalidades para descrever modalidades adicionais. Cada elemento individual (por exemplo, aspectos preferíveis ou especiais) das modalidades é sua própria modalidade independente. Além disso, qualquer elemento de uma modalidade é entendido estar combinado com qsualquer e todos os outros elementos de qualquer modalidade para descrever uma modalidade adicional. Além disso, a presente invenção abrange combinações de modalidade diferente, partes de modalidades, definições, descrições, e exemplos da invenção mencionados aqui.

DEFINIÇÕES

[000123] Os seguintes são definições de termos usados nesta especificação e reivindicações anexas. A definição inicial fornecida para um grupo ou termo aqui aplica-se àquele grupo ou termo em toda a especificação e reivindicações, individualmente ou como parte de outro grupo, a menos que de outro modo indicado.

[000124] O termo "alquila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 1 a 12 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono. Quando números aparecem em um subscrito após o símbolo "C", o subscrito define com mais especificidade o número de átomos de carbono que um grupo particular pode conter. Por exemplo, "C1-6 alquila" refere-se a grupos alquila de cadeia linear e ramificada com 1 a 6 átomos de carbono, tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, n-pentila, e assim em diante. O subscrito "0" refere-se a uma ligação. Desse modo, o termo hidróxi(C0-2)alquila ou (C0-2)hidroxialquila inclui hidróxi, hidroximetila e hidroxietila. Grupos alquila podem ser substituídos com 1 a 3 grupos selecionados de (C1-6) alquila, (C2-6)alquenila, hidróxi, halogênio, ciano, nitro, CF3, O(C1-6 alquila), OCF3, C(=O)H, C(=O)(C1-6 alquila), CO2H, CO2(C1-6alquila), NHCO2(C1-6alquila), -S(C1-6alquila), NH2, NH(C1-6 alquila), N(C1-6 alquil)2, N(CH3)3+, SO2(C1-6 alquila), C(=O)(C1- 4alquileno)NH2, C(=O)(C1-4 alquileno)NH(alquila), C(=O)(C1-4 alquileno)N(C1-4 alquila)2, C3-7 cicloalquila, fenila, benzila, feniletila, fenilóxi, benzilóxi, naftila, um heterociclo de 4 a 7 membros, e/ou uma heteroarila de 5 a 6 membros. Quando uma alquila substituída é substituída com um grupo arila, heterociclo, cicloalquila, ou heteroarila, referidos sistemas de anel são como definidos abaixo e desse modo podem ter 0, 1, 2, ou 3 substituintes, também como definidos abaixo.

[000125] Quando o termo "alquila" é usado junto com outro grupo, tal como em "arilalquila", esta conjunção define com mais especificidade pelo menos um dos substituintes que a alquila substituída conterá. Por exemplo, "arilalquila" refere-se a um grupo alquila substituído como definido acima onde pelo menos um dos substituintes é uma arila, tal como benzila. Desse modo, o termo aril(C0-4)alquila inclui uma alquila inferior substituída tendo pelo menos um substituinte arila e também inclui uma arila diretamente ligada ao outro grupo, isto é, aril(C0)alquila.

[000126] O termo "alquenila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla. Grupos alquenila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma ligação dupla são mais preferidos. Grupos alquenila podem ser substituídos como descrito acima para grupos alquila.

[000127] O termo "alquinila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla. Grupos alquinila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma ligação tripla são mais preferidos. Grupos alquinila podem ser substituídos como descrito acima para grupos alquila.

[000128] O termo "alquileno" refere-se um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada bivalente tendo 1 a 12 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, {-CH2-}n, em que né 1 a 12, preferivelmente 1 a 8. Grupos alquilenos inferiores, isto é, grupos alquilenos de 1 a 2 átomos de carbono, são mais preferidos. Os termos "alquenileno" e "alquinileno" referem-se a radicais bivalentes de grupos alquenila e alquinila, respectivamente, como definido acima. Grupos alquenileno podem ser substituídos como descrito acima por grupos alquila.

[000129] O termo "alcóxi"refere-se a um átomo de oxigênio substituído por alquila, como definido aqui. Por exemplo, o termo "alcóxi"inclui o grupo -O-C1-6 alquila.

[000130] Quando um subscrito é usado com referência a um alcóxi, tioalquila ou aminoalquila, o subscrito refere-se ao número de átomos de carbono que o grupo pode conter além dos heteroátomos.

[000131] Deve ser entendido que as seleções para todos os grupos, incluindo por exemplos, alcóxi, tioalquila, e aminoalquila, serão feitas por alguém versado no campo para fornecer compostos estáveis.

[000132] O termo "carbonila" refere-se a um grupo carbonila bivalente -C(=O)-.

[000133] O termo "acila" refere-se a um grupo carbonila ligado a um radical orgânico, mais particularmente, o grupo C(=O)Re, bem como o grupo bivalente -C(=O)Re-, que são ligados a radicais orgânicos. O grupo Re pode ser selecionado de alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclo, arila, ou heteroarila como definido aqui, ou quando apropriado, o grupo bivalente correspondente, por exemplo, alquileno.

[000134] O termo "cicloalquila" refere-se a aneis hidrocarboneto totalmente saturados ou parcialmente insaturados (e portanto inclui "aneis cicloalquenila") de 3 a 9, preferivelmente 3 a 7 átomos de carbono. O termo "cicloalquila" inclui tais aneis tendo 0, 1, 2, ou 3 substituintes selecionados de (C1-4)alquila, (C2-4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, O(C1-4alquila), OCF3, C(=O)H, C(=O)(C1- 4alquila), CO2H, CO2(C1-4alquila), NHCO2(C1-4alquila), S(C1-4alquila), NH2, NH(C1-4alquila), N(C1-4alquila)2, N(C1-4alquila)3+, SO2(C1-4alquila), C(=O)(C1-4alquileno)NH2, C(=O)(C1-4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=O)(C1-4alquileno)N(C1-4alquila)2. O termo "cicloalquila"também inclui tais aneis tendo um segundo anel fundido a eles (por exemplo, incluindo aneis benzo, heterociclo, ou heteroarila) ou tendo uma ponte carbono- carbono de 3 a 4 átomos de carbono.

[000135] O termo "halo" ou "halogênio"refere-se a cloro, bromo, flúor e iodo.

[000136] O termo "haloalquila" significa uma alquila substituída tendo um ou mais substituintes halo. Por exemplo, "haloalquila" inclui mono, bi, e trifluorometila.

[000137] O termo "haloalcóxi"significa um grupo alcóxi tendo um ou mais substituintes halo. Por exemplo, "haloalcóxi"inclui OCF3.

[000138] O termo "heteroátomos"deve incluir oxigênio, enxofre e nitrogênio.

[000139] O termo "arila" refere-se a fenila, bifenila, fluorenila, 1-naftila e 2-naftila. O termo "arila" inclui tais aneis tendo 0, 1, 2 ou 3 substituintes selecionados de (C1-4)alquila, (C2-4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, O(C1-4alquila), OCF3, C(=O)H, C(=O)(C1-4alquila), CO2H, CO2(C1-4alquila), NHCO2(C1-4alquila), S(C1-4alquila), NH2, NH(C1- 4alquila), N(C1-4alquila)2, N(C1-4alquila)3+, SO2(C1-4alquila), C(=O)(C1- 4alquileno)NH2, C(=O)(C1-4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=O)(C1- 4alquileno)N(C1-4alquila)2.

[000140] Os termos "heterociclo" ou "heterocíclico"refere-se a anéis de 3 a 15 membros não aromáticos substituídos e não substituídos (que podem ser parcialmente ou totalmente saturados) tendo 1 a 4 heteroátomos. Tais aneis podem ser grupos monocíclicos de 3 a 7 membros, grupos bicíclicos de 7 a 11 membros, e grupos tricíclicos de 10 a 15 membros. Cada anel do grupo heterociclo contendo um heteroátomo pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de 1 a 4 átomos de nitrogênio desde que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos, e também desde que o anel contenha pelo menos um átomo de carbono. Os aneis fundidos completando grupos bicíclicos e tricíclicos podem conter somente átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou não saturados. Os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcionalmente ser quaternizados. O grupo heterociclo pode ser ligado a qualquer átomo de carbono ou nitrogênio disponível. O anel heterociclo pode conter 0, 1, 2 ou 3 substituintes selecionados de (C1- 4)alquila, (C2-4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, O(C1- 4alquila), OCF3, C(=O)H, C(=O)(C1-4alquila), CO2H, CO2(C1-4alquila), NHCO2(C1-4alquila), S(C1-4alquila), NH2, NH(C1-4alquila), N(C1-4alquila)2, N(C1-4alquila)3+, SO2(C1-4alquila), C(=O)(C1-4alquileno)NH2, C(=O)(C1- 4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=O)(C1-4alquileno)N(C1-4alquila)2. Grupos heterocíclicos exemplares incluem azetidinila, pirrolidinila, oxetanila, imidazolinila, oxazolidinila, isoxazolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, tetraidrofuranila, piperidila, piperazinila, 2-oxopiperazinila, 2- oxopiperidila, 2-oxopirrolodinila, 2-oxoazepinila, azepinila, 4- piperidonila, tetraidropiranila, morfolinila, tiamorfolinila, sulfóxido de tiamorfolinila, tiamorfolinil sulfona, 1,3-dioxolano, quinuclidinila, tetraidro-1,1-dioxotienila e similares.

[000141] O termo "heteroarila" refere-se a aneis de 3 a 14 membros aromáticos substituídos e não substituídos tendo 1 a 4 heteroátomos selecionados de O, S, ou N em pelo menos um dos aneis. Referidos aneis podem ser grupos monocíclicos de 5 ou 6 membros, grupos bicíclicos de 9 ou 10 membros, e grupos tricíclicos de 11 a 14 membros. Cada anel do grupo heteroarila contendo um heteroátomo pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de 1 a 4 átomos de nitrogênio desde que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos e cada anel tenha pelo menos um átomo de carbono. Os aneis fundidos completando os grupos bicíclicos e tricíclicos podem conter somente átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou não saturados. Os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcionalmente ser quaternizados. Grupos heteroarila que são bicíclicos ou tricíclicos devem incluir pelo menos um anel totalmente aromático porém o outro anel ou aneis fundidos podem ser aromáticos ou não aromáticos. O grupo heteroarila pode ser ligado a qualquer átomo de carbono ou nitrogênio disponível em qualquer anel. O sistema de anel heteroarila pode conter 0, 1, 2 ou 3 substituintes selecionados de (C1-4)alquila, (C2-4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, O(C1-4alquila), OCF3, C(=O)H, C(=O)(C1-4alquila), CO2H, CO2(C1- 4alquila), NHCO2(C1-4alquila), S(C1-4alquila), NH2, NH(C1-4alquila), N(C1- 4alquila)2, N(C1-4alquila)3+, SO2(C1-4alquila), C(=O)(C1-4alquileno)NH2, C(=O)(C1-4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=O)(C1-4alquileno)N(C1- 4alquila)2.

[000142] Grupos heteroarila exemplares incluem pirrolila, pirazolila, pirazolinila, imidazolila, oxazolila, isoxazolila, tiazolila, tiadiazolila, isotiazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, piridila, pirazinila, pirimidinila, piridazinila, triazinila, indolila, benzotiazolila, benzodioxolila, benzoxazolila, benzotienila, quinolinila, tetraidroisoquinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzopiranila, indolizinila, benzofuranila, cromonila, coumarinila, benzopiranila, cinolinila, quinoxalinila, indazolila, pirrolopiridila, furopiridila, diidroisoindolila, tetraidroquinolinila e similares. Grupos heteroarila particulares incluem, por exemplo, 6- trifluorometil-quinazolin-4-ila e quinazolin-4-ila substituída por 6.

[000143] Onde um grupo é opcionalmente substituído, deve-se incluir grupos substituídos e não substituídos.

[000144] Os compostos aqui descritos podem ter centros assimétricos. Compostos da presente invenção contendo um átomo assimetricamente substituído podem ser isolados em formas racêmicas ou oticamente ativas. É bem conhecido na técnica como preparar formas oticamente ativas, tal como por resolução de formas racêmicas ou por síntese de materiais de partida oticamente ativos. Muitos isômeros geométricos de olefinas, ligações duplas C=N, e similares podem também estar presentes nos compostos descritos aqui, e todos tais isômeros estáveis são contemplados na presente invenção. Isômeros geométricos cis e trans dos compostos da presente invenção são descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isoméricas separadas. Todas as formas racêmicas diastereoméricas quirais e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a menos que a forma isomérica ou estereoquímica específica seja especificamente indicada.

[000145] Um enantiômero de compostos descritos aqui pode exibir atividade superior comparado com o outro. Desse modo, todas as estereoquímicas são consideradas ser uma parte da presente invenção. Quando requerido, separação do material racêmico pode ser ativada por HPLC usando uma coluna quiral ou por uma resolução usando um agente de resolução tal como cloreto canfórico como em Young, S.D. e outro, Antimicrobial Agents and Chemotherapi, 2602-2605 (1995).

[000146] A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para referir-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humano e animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurado com uma relação de risco/benefício razoável.

[000147] Como usado aqui, "sais farmaceuticamente aceitáveis"referem-se a derivados dos compostos descritos em que o composto origem é modificado por preparação de sais de ácido ou de base do mesmo. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a, sais de ácido orgânico ou mineral de resíduos básicos tais como aminas; sais orgânicos ou de álcali de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos; e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternários do composto origem formado, por exemplo, de ácidos orgânicos ou inorgânios não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como hidroclórico, benzeno sulfônico, hidrobrômico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e similares; e os sais preparados de ácidos orgânicos tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetiônico, e similares.

[000148] Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados do composto origem que contem uma porção básica ou acídica por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados por reagir as formas de base ou ácido livre destes compostos com uma quantidade estoiquiométrica do ácido ou base apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois; geralmente, meio não aquoso tipo éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985), a invenção de, que é por este meio incorporada por referência.

[000149] Visto que profármacos são conhecidos para realçar qualidades desejáveis numerosas de produtos farmacêuticos (por exemplo, solubilidade, biodisponibilidade, fabricação, etc.), os compostos da presente invenção podem ser liberados em forma de profármaco. Desse modo, a presente invenção destina-se a abranger profármacos dos compostos atualmente reivindicados, métodos de liberar os mesmos e composições contendo os mesmos. "Profármacos" são destinados a incluir quaisquer veículos covalentemente ligados que liberam um fármaco origem ativo da presente invenção in vivo quando tal profármaco é administrado a um indivíduo mamífero. Profármacos na presente invenção são preparados modificando grupos funcionais presentes no composto de uma TAM maneira que as modificações são clivadas, em manipulação de rotina ou in vivo, ao composto origem. Profármacos incluem compostos da presente invenção em que um grupo hidróxi, amino, ou sulfidrila é ligado ao grupo qualquer que, quando o profármaco da presente invenção é administrado a um indivíduo mamífero, ele cliva para formar um grupo hidroxila livre, amino livre, ou sulfidrila livre, respectivamente. Exemplos de profármacos incluem, porém não são limitados a, acetato, formiato e benzoato derivados de álcool e grupos funcionais amina nos compostos da presente invenção.

[000150] "Composto estável"e "estrutura estável" são destinados a indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver à isolação em um grau útil de pureza de uma mistura reacional, e formulação em um agente terapêutico eficaz. A presente invenção destina-se a incorporar compostos estáveis.

[000151] "Quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se a incluir uma quantidade de um composto da presente invenção sozinho ou uma quantidade da combinação de compostos reivindicados ou uma quantidade de um composto da presente invenção em combinação com outros ingredientes ativos eficazes para inibir ambos CCR-2 e CCR-5 ou eficazes para tratar ou prevenir distúrbios como discutido aqui.

[000152] Como usado aqui, "tratando" ou "tratamento" abrange o tratamento de um estado de doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir o estado de doença de ocorrer em um mamífero, em particular, quando tal mamífero é predisposto ao estado de doença porém não foi ainda diagnosticado como tendo-a; (b) inibir o estado de doença, isto é, interrompendo seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado de doença, isto é, causar regressão do estado de doença.

[000153] Os nomes usados aqui para designar uma forma específica, por exemplo, "N-1" ou "P-1", não devem ser considerados limitando com respeito a qualquer outra substância possuindo características químicas e físicas idênticas ou similares, mas sim deve ser entendido que estas designações são meros identificadores que devem ser interpretados de acordo com a informação de caracterização também apresentada aqui.

[000154] A presente invenção fornece formas cristalinas da base livre de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida como um novo material, em particular, em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades preferidas, formas cristalinas da base livre são em forma substancialmente pura. Modalidades preferidas da base livre são descritas nos exemplos como uma forma N-1. Adicionalmente, acredita-se que a base livre pode existir como a forma P-1 e/ou uma combinação das formas N-1 e P-1.

[000155] Como usado aqui "polimorfo" refere-se às formas cristalinas tendo a mesma composição química porém diferentes disposições espaciais das moléculas, átomos, e/ou íons que formam o cristal.

[000156] Como usado aqui "solvato" refere-se a uma forma cristalina de uma molécula, átomo, e/ou íons que também contêm moléculas de um solvente ou solventes incorporados na estrutura cristalina. As moléculas de solvente no solvato podem ser apresentadas em uma disposição regular e/ou uma disposição desordenada. O solvato pode compreender uma quantidade estoiquiométrica ou não estoiquiométrica das moléculas de solvente. Por exemplo, um solvato com uma quantidade não estoiquiométrica de moléculas de solvente pode resultar em perda parcial de solvente do solvato.

[000157] A presente invenção é destinada a incluir todos os isótopos de átomos que ocorrem nos presentes compostos. Isótopos incluem aqueles átomos tendo o mesmo número atômico porém diferentes números de massa. A título de exemplo geral e sem limitação, isótopos de hidrogênio incluem deutério e trítio. Isótopos de carbono incluem 13C e 14C. Compostos isotopicamente rotulados da invenção podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica ou por processos análogos àqueles descritos aqui, usando um reagente isotopicamente rotulado apropriado em lugar do reagente não rotulado de outro modo empregado.

[000158] Como usado aqui "amorfo" refere-se a uma forma sólida de uma molécula, átomo, e/ou íons que não é cristalina. Um sólido amorfo não exibe um padrão de difração de raio X definitivo.

[000159] Como usado aqui, "substancialmente puro," quando usado em referência a uma forma cristalina, significa um composto tendo uma pureza maior do que 90 peso %, incluindo maior do que 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 peso %, e também incluindo igual a cerca de 100 peso % de composto I, com base no peso do composto. O material restante compreende outra(s) forma(s) do composto, e/ou impurezas reacionais e/ou impurezas de processo decorrentes de sua preparação. Por exemplo, uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)- 2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2- oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre, pode ser considerada substancialmente pura em que ela tem uma pureza maior do que 90 peso %, como medido por meios que são neste momento conhecidos e geralmente aceitos na técnica, onde o restante menos do que 10 peso % de material compreende outra(s) forma(s) de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre, e/ou impurezas reacionais e/ou impurezas de processo.

[000160] Amostras das formas cristalinas podem ser fornecidas com homogeneidade de fase substancialmente pura, indicando a presença de uma quantidade dominante de uma forma cristalina simples e opcionalmente quantidades menores de uma ou mais outras formas cristalinas. A presença de mais do que uma forma cristalina em uma amostra pode ser determinada por técnicas tais como difração de raio X de pó (PXRD) ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR). Por exemplo, a presença de picos extras na comparação de um experimentalmente medido padrão de PXRD com um simulado padrão de PXRD pode indicar mais do que uma forma cristalina na amostra. O PXRD simulado pode ser calculado de dados de raio X cristais simples. Veja Smith, D.K., "A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns," Lawrence Radiation Laboratory, Livermore, California, UCRL-7196 (Abril 1963).

[000161] Preferivelmente, a forma cristalina tem homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos do que 10%, preferivelmente menos do que 5%, e mais preferivelmente menos do que 2% da área de pico total no experimentalmente medido padrão de PXRD decorrente dos picos extras que estão ausentes do padrão PXRD simulado. Mais preferida é uma forma cristalina tendo homogeneidade de fase substancialmente pura com menos do que 1% da área de pico total no experimentalmente medido padrão de PXRD decorrente dos picos extras que estão ausentes do padrão PXRD simulado.

[000162] Procedimentos para preparação de formas cristalinas são conhecidos na técnica. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização de um solvente adequado, sublimação, desenvolvimento de uma transformação de estado sólido, fundido de outra fase, cristalização de um fluído supercrítico, e vaporização a jato. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura de solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solvente, cristal semeando uma mistura de solvente supersaturada da molécula e/ou sal, secagem por congelamento da mistura de solvente, e adição de antissolventes (contrasolventes) à mistura de solvente.

[000163] As formas podem ser caracterizadas e distinguidas usando difração de raio X de cristal simples, que é baseada nas medições de célula unitária de um cristal simples de uma forma em uma temperatura analítica fixa. Uma descrição detalhada de células unitárias é fornecida em Stout e outro, Chapter 3, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co., New York (1968). Alternativamente, a disposição única de átomos em relação espacial na treliça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coordenadas atômicas fracionais observadas. Outro meio de caracterizar a estrutura cristalina é por análise de difração de raio X de pó em que o perfil de difração observado ou experimental é comparado a um perfil simulado representando material em pó puro, ambos funcionando na mesma temperatura analítica, e medições para a forma objeto caracterizadas como uma série de valores 2θ.

[000164] Outros meios de caracterizar a forma podem ser usados, tais como ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR), calorimetria de varredura diferencial e análise termogravimétrica. Estes parâmetros podem também ser usados em combinação para caracterizar a forma objeto.

[000165] O termo "perda de peso insignificante," como empregado aqui, como caracterizado por TGA indica a presença de uma forma cristal (não solvatada) pura.

[000166] Em uma modalidade da invenção, uma forma cristalina de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre, é fornecida em forma substancialmente pura. Esta forma cristalina pode ser empregada em composições farmacêuticas que podem opcionalmente incluir um ou mais outros componentes selecionados, por exemplo, do grupo consistindo em excipientes, veículos, e um de outros ingredientes farmacêuticos ativos ou entidades químicas ativasde estruturas moleculares diferentes.

[000167] Preferivelmente, a forma cristalina tem homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos do que 10%, preferivelmente menos do que 5%, e mais preferivelmente menos do que 2% da área de pico total no experimentalmente medido padrão de PXRD decorrendo dos picos extras que estão ausentes do padrão PXRD simulado. Mais preferida é uma forma cristalina tendo homogeneidade de fase substancialmente pura com menos do que 1% da área de pico total no experimentalmente medido padrão de PXRD decorrendo dos picos extras que estão ausentes do padrão PXRD simulado.

[000168] Em outra modalidade, uma composição é fornecida consistindo essencialmente das formas cristalinas de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre. A composição desta modalidade pode compreender pelo menos 90 peso % da forma, com base no seu peso em uma composição.

[000169] A presença de impurezas reacionais e/ou impurezas de processo pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas na arte, tais como, por exemplo, cromatografia, espectroscopia de resonância magnética nuclear, espectrometria de massa ou espectroscopia infravermelha.

[000170] Formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização de um solvente adequado, sublimação, desenvolvimento de uma transformação de estado sólido, fundido de outra fase, cristalização de um fluído supercrítico, e vaporização a jato. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura de solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solvente, cristal semeando uma mistura de solvente supersaturada da molécula e/ou sal, secagem por congelamento da mistura de solvente, e adição de antissolventes (contrasolventes) à mistura de solvente. Técnicas de cristalização de alta produtividade podem ser empregadas para preparar formas cristalinas incluindo polimorfos.

[000171] Cristais de fármacos, incluindo polimorfos, métodos de preparação, e caracterização de cristais de fármaco são discutidos em Byrn, S.R. e outro, Solid-State Chemistry of Drugs, 2a Ed, SSCI, West Lafayette, Indiana (1999).

[000172] Para técnicas de cristalização que empregam solvente, a escolha de solvente ou solventes é tipicamente dependente de um ou mais fatores, tais como solubilidade do composto, técnica de cristalização, e pressão de vapor do solvente. Combinações de solventes podem ser empregadas; por exemplo, o composto pode ser solubilizado em um primeiro solvente para fornecer uma solução, seguida pela adição de um antissolvente para diminuir a solubilidade do composto na solução e para fornecer a formação de cristais. Um "antissolvente"é um solvente em que o composto tem baixa solubilidade. Solventes adequados para preparar cristais incluem solventes polares e não polares.

[000173] Em um método para preparar cristais, N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre, é suspenso e/ou agitado em um solvente adequado para fornecer uma suspensão, que pode ser aquecida para promover a dissolução. O termo "suspensão,"como usado aqui, significa uma solução saturada, que pode também conter mais quantidade do sólido para fornecer uma mistura heterogênea em uma dada temperatura. Solventes adequados quanto a isto incluem, por exemplo, solventes apróticos polares e solventes próticos polares, e misturas de dois ou mais destes, como descrito aqui.

[000174] Cristais semeados podem ser adicionados a qualquer mistura de cristalização para promover a cristalização. Como será claro para o técnico versado, semeadura é usada como um meio de controlar desenvolvimento de uma forma cristalina particular ou como um meio de controlar a distribuição de tamanho de partícula do produto cristalino. Consequentemente, cálculo de uma quantidade de sementes necessária depende do tamanho da semente disponível e o tamanho desejado de uma partícula de produto média como descrito, por exemplo, em Mullin, J.W. e outro, "Programmed cooling of batch crystallizers,"Chemical Engineering Science, 26:369-377 (1971). Em geral, sementes de tamanho pequeno são necessárias para efetivamente controlar o desenvolvimento de cristais na batelada. Sementes de tamanho pequeno podem ser geradas por peneiramento, moagem, ou micronização de cristais maiores, ou por microcristalização de soluções. Cuidado deve ser tomado para que moagem ou micronização de cristais não resultem em qualquer mudança em cristalinidade da forma de cristal desejada (isto é, mudar de amorfo ou de outro polimorfo).

[000175] Uma mistura resfriada pode ser filtrada sob vácuo, e os sólidos isolados podem ser lavados com um solvente adequado, tal como solvente de recristalização frio, e secados sobre uma purga de nitrogênio para fornecer a desejada forma cristalina. Os sólidos isolados podem ser analisados por uma técnica analítica ou espectroscópica adequada, tais como SSNMR, DSC, PXRD, ou similares, para assegurar formação da forma cristalina preferida do produto. A forma cristalina resultante é tipicamente produzida em uma quantidade maior do que cerca de 70 peso % de produção isolada, porém preferivelmente maior do que 90 peso % com base no peso de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre, originalmente empregado no procedimento de cristalização. O produto pode ser co- moído ou passado através de uma peneira de malha para desaglomerar o produto, se necessário.

[000176] Formas cristalinas podem ser preparadas diretamente do meio reacional da etapa de processo final para preparar N-((1R,2S,5R)- 5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal ou base livre. Isto pode ser ativado, por exemplo, empregando na etapa de processo final um solvente ou mistura de solventes do qual o composto pode ser cristalizado. Alternativamente, formas cristalinas podem ser obtidas por técnicas de adição de solvente ou destilação. Solventes adequados para este propósito incluem quaisquer daqueles solventes descritos aqui, incluindo solventes polares próticos, tais como álcoois, e solventes polares apróticos, tais como cetonas.

[000177] A título de orientação geral, a mistura reacional pode ser filtrada para remover quaisquer impurezas não desejadas, sais inorgânicos, e similares, seguidos por lavagem com solvente de cristalização ou reacional. A solução resultante pode ser concentrada para remover excesso de solvente ou constituintes gasosos. Se a destilação for empregada, a quantidade final de destilado coletada pode variar, dependendo de fatores de processo incluindo, por exemplo, tamanho do vaso, capacidade de agitação, e similares. A título de orientação geral, a solução reacional pode ser destilada em cerca de 1/10 do volume original antes da substituição de solvente ser realizada. A reação pode ser amostrada e ensaiada para determinar a extensão da reação e o peso % de produto de acordo com técnicas de processo padrão. Se desejado, mais solvente reacional pode ser adicionado ou removido para otimizar concentração reacional. Preferivelmente, a concentração final é ajustada para cerca de 50 peso % produto no qual uma suspensão tipicamente resulta.

[000178] Pode ser preferível adicionar solventes diretamente ao vaso reacional sem destilar a mistura reacional. Solventes preferidos para este propósito são aqueles que podem finalmente participar na treliça cristalina, como discutido acima em conexão com permuta de solvente. Apesar da concentração final poder variar dependendo da pureza desejada, recuperação e similares, a concentração final da base livre em solução é preferivelmente cerca de 4 % a cerca de 7 %. A mistura reacional pode ser agitada seguindo adição de solvente e simultaneamente aquecida. A título de ilustração, a mistura reacional pode ser agitada durante cerca de 1 hora ao mesmo tempo que aquecendo para cerca de 70 °C. A reação é preferivelmente filtrada quente e lavada com um solvente reacional, o solvente adicionado ou uma combinação do mesmo. Cristais de semente podem ser adicionados a qualquer solução de cristalização para iniciar a cristalização.

[000179] As várias formas descritas aqui podem ser distinguíveis de uma outra através do uso de várias técnicas analíticas conhecidas por alguém versado na técnica. Tais técnicas incluem, porém não são limitadas a, difração de raio X de pó (PXRD), Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) e/ou análise termogravimétrica (TGA). Alternativamente, as formas podem ser caracterizadas e distinguidas usando difração de raio X de cristal simples, que é baseada nas medições de célula unitária de um cristal simples de uma dada forma em uma temperatura analítica fixa. Uma descrição detalhada de células unitárias é fornecida em Stout e outro, capítulo 3, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co., New York (1968). Especificamente, a disposição única de átomos em relação espacial na treliça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coordenadas atômicas fracionais observadas. Outro meio de caracterizar a estrutura cristalina é por análise de difração de raio X de pó em que o perfil de difração observado é comparado ao um perfil simulado gerado de dados de estrutura de cristal simples. Medições de difração de raio X de pó para a forma objeto são caracterizadas como uma série de valores 2 θ (geralmente quatro ou mais).

[000180] Outros meios de caracterizar a forma podem ser usados, tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR), Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC), termografia e examinação bruta da morfologia amorfa ou cristalina. Estes parâmetros podem também ser usados em combinação para caracterizar a forma objeto.

[000181] Alguém versado na técnica apreciará que um padrão de difração de raio X pode ser obtido com um erro de medição que é dependente das condições de medição empregadas. Em particular, é geralmente conhecido que intensidades em um padrão de difração de raio X podem flutuar dependendo das condições de medição empregadas e a forma ou morfologia do cristal. Deve ser também entendido que intensidades relativas podem também variar dependendo das condições experimentais e, consequentemente, a exata ordem de intensidade não deve ser levada em conta. Adicionalmente, um erro de medição de ângulo de difração para um padrão de difração de raio X convencional é tipicamente cerca de 0,2° 2θ valores ou menos, preferivelmente cerca de 0,1° 2θ valores (como discutido a seguir), e tal grau de erro de medição deve ser levado em conta como pertencente aos ângulos de difração supracitados. Consequentemente, é para ser entendido que as formas de cristal da presente invenção não são limitadas às formas de cristal que fornecem padrões de difração de raio X completamente idênticos aos padrões de difração de raio X representados nas figuras acompanhantes descritas aqui. Quaisquer formas de cristal que fornecem padrões de difração de raio X substancialmente idênticos àqueles descritos nas figuras acompanhantes que se incluem no escopo da presente invenção. A habilidade para verificar identidades substanciais de padrões de difração de raio X inclui-se na competência de alguém versado na técnica.

SÍNTESE

[000182] Esquema 1: Preparação de hidrazona I-dd

[000183] Uma carbazida de fórmula I-ff, tal como cloridrato de semicarbazida, foi condensada com um composto de fórmula I-ee, tal como acetonitrila de pivaloíla, em um solvente, por exemplo, etanol, 2- propanol, 1-propanol e metanol, preferivelmente etanol, na presença de uma base, por exemplo, acetato de sódio, acetato de potássio, trietilamina e N-N-diisopropil-N-etil amina, preferivelmente acetato de sódio, em uma temperatura na faixa de 20-60 °C, preferivelmente, na faixa de 25-55 °C, para fornecer o composto de hidrazona de fórmula I- dd, em que R21 é =O; R22 é -NH-NH2; e R23 é cianoalquila; ou R22 e R23 podem ser empregados juntos com um anel de 5 a 8 membros, em que o anel pode ser opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados de amino, alquila, arila, ou heteroarila e pode opcionalmente conter 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos independentemente selecionados do grupo consistindo em N, S, ou O.

[000184] Esquema 2: Preparação de hidrazona de fórmula I-cc

[000185] Um composto de hidrazona de fórmula I-dd, tais como

[000186] foi reagido com um ortoformiato, por exemplo, trimetilortoformiato, trietilortoformiato, e tripropilortoformiato, preferivelmente, trimetilortoformiato, ortoformiato na presença de um ácido, por exemplo, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido hidroclórico e ácido metanossulfônico, preferivelmente ácido acético, em temperatura elevada, tais como 40-90 °C, preferivelmente, 40-75 °C, para produzir o composto de hidrazona de fórmula I-cc, em que R21 = O e R22 e R23 são como mencionado acima.

[000187] Esquema 3: Conversão de composto I-cc

[000188] Um composto de hidrazona de fórmula I-cc é convertido em um composto de fórmula I-bb, em que LG é -OR16, em que R16 é C1- 6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos com 1 a 3 grupos selecionados de halogênio, CF3 ou C1-6alquila, reagindo o composto de hidrazona de fórmula I-cc, por exemplo, 7-terc-butil-3H- pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ona, com um agente de acilação, um nucleófilo, tal como dimetil 4-aminopiridina (DMAP), e/ou uma base de amina terciária, em um solvente, por exemplo, acetonitrila, diclorometano e oxicloreto de fósforo puro, seguidos por interceptação com ou (i) um álcool na presença de uma segunda base de amina terciária ou (ii) um alcóxido para formar o composto de fórmula I-bb. Exemplos de agentes de acilação que podem ser usados são oxicloreto de fósforo (POCl3), cloreto de oxalila, cloreto de tionila e fosgênio. Um agente de acilação preferido é POCl3. Trietilamina, N-N-diisopropil-N- etil amina (DIEA), tri-n-propilamina, N-metil morfolina e 1,4- diazabiciclo[2,2,2]octano (DABCO) são exemplos de bases de amina terciárias que podem ser usados na conversão. Uma base de amina terciária preferida é DIEA. Geralmente, a quantidade de nucleófilo usada na reação é 2,0 a 4,0, preferivelmente, 3,0, equivalentes. Exemplos de álcoois ou alcóxidos que podem ser usados na conversão são fenol, pentafluorofenol, metanol, etanol, metóxido de sódio e fenolato de sódio com fenol sendo o álcool preferido. Geralmente, a reação e interceptação podem ser realizadas em uma temperatura na faixa de temperatura ambiente a 70 °C.

[000189] Esquema 4: Preparação de um composto de fórmula I, ou um sal do mesmo

Um composto de fórmula I-bb, por exemplo,

é acoplado com um composto de fórmula I-aa, preparado de uma maneira similar como descrito em WO 2008/014381 A1, em que: R1 é independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina selecionado de um grupo carbobenzilóxi (Cbz), um terc-butiloxicarbonila (BOC), um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn), e um grupo p-metoxibenzila (PMB), preferivelmente hidrogênio; R8 e R9 são independentemente hidrogênio ou C1-6alquila; R21 é =O; HET é um anel bicíclico heteroarila ou heterociclo de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo pelo menos um heteroátomo de nitrogênio, preferivelmente dois a quatro heteroátomos totais, especialmente quatro átomos de nitrogênio; e LG é -OR16, em que R16 é C1-6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos com 1 a 3 grupos selecionados de halogênio, CF3 ou C1-6alquila, para obter o correspondente composto de fórmula I, por exemplo, N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4- ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal do mesmo. Acoplamento pode ser realizado por métodos de acoplamento comumente conhecidos na técnica, ou, alternativamente, por meio de uma preparação acídica seguida pela adição de uma base. Exemplos de ácidos que podem ser usados na preparação acídica são ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glicólico, e ácido hidroclórico. Exemplos de bases que podem ser adicionadas são K2HPO4, Na2HPO4, NaHCO3 e KHCO3.

[000190] Especificamente, N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)- 3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida pode ser preparado de acordo com o seguinte esquema:

[000191] Para o processo desta invenção, materiais de partida são comercialmente disponíveis ou podem ser prontamente preparados por alguém versado na técnica. Solventes, temperaturas, pressões, materiais de partida tendo os desejados grupos, e outras condições reacionais, podem ser prontamente selecionados como apropriado por alguém versado na técnica. O processo pode ser ampliado a fim de preparar maiores quantidades do composto de fórmula I, tal como em uma facilidade de produção comercial.

EXEMPLOS

[000192] Os seguintes exemplos ilustram modalidades dos compostos inventivos e materiais de partida, e não são destinados a limitar o escopo das reivindicações.

[000193] Como apropriado, as reações foram conduzidas sob uma atmosfera de nitrogênio seco (ou argônio). Para reações anidrosas, solventes DRISOLV® de EM foram empregados. Para outras reações, solventes de grau reagente ou grau HPLC foram utilizados. A menos que de outro modo estabelecido, todos os reagentes comercialmente obtidos foram usados como recebidos.

[000194] Medições de LC/MS foram obtidas usando um sistema híbrido de espectrômetro de massa quadrupolo simples Waters ZQ/HPLC Shimadzu. Dados para o pico de interesse são reportados de ionização por eletrovaporização de modo positivo. Espectros de NMR (ressonância magnética nuclear) foram tipicamente obtidos em instrumentos Bruker ou JEOL 400 MHz e 600 MHz nos solventes indicados. Todos os deslocamentos químicos são reportados em ppm de tetrametilsilano com a ressonância de solvente como o padrão interno. Dados espectrais de 1H NMR são tipicamente reportados como segue: deslocamento químico, multiplicidade (s = singleto, br s = singleto amplo, d = dubleto, dd = dubleto de dubletos, t = tripleto, q = quarteto, sep = septeto, m = multipleto, app = aparente), constantes de acoplamento (Hz), e integração.

[000195] Alguém versado na técnica reconhecerá as abreviações padrões utilizadas aqui. Para facilidade de referência, as abreviações incluem, porém não são necessariamente limitadas a: Hg = mercúrio; sat. = saturado, HPLC = cromatografia líquida de alta performance, AP = percentual de área, KF = Karl-Fischer, RT = temperatura ambiente (a menos que especificado de outro modo RT é uma temperatura de cerca de 22 °C), mmol = milimoles, HRMS = espectroscopia de massa de alta resolução, °C = graus Celsius, kg - quilograma ou quilogramas, g = grama ou gramas, mg = miligrama ou miligramas, L = litro ou litros, mL (ou ml) = mililitro ou mililitros, h ou hr = hora ou horas, M = molar, N = normal, min = minuto ou minutos, MHz = megahertz, v/v = volume em relação de volume, %w/w = percentual de peso/peso, wt% = percentual de peso, nm = nanometro ou nanometros, LOD = perda de secagem.

[000196] "α", "β", "R" e "S"são designações estereoquímicas familiares àqueles versados na técnica.

[000197] ExemploJ. N-((1R,2S,5R)-5-( terc- Butilamino)-2-((S)-3-(7- terc- butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida

[000198] Exemplo 1, Etapa 1: A um frasco de base redonda de 3 L foram adicionados cloridrato de semicarbazida (100,0 g, 0,89 moles), acetonitrila de pivaloíla (112,2 g, 0,89 moles) e etanol (1 L) a 22-25 °C. Na conclusão da adição, a mistura reacional foi resfriada para 12-15 °C e acetato de sódio anidroso (73,5 g, 0,89 moles) foi adicionado. A adição do acetato de sódio anidroso foi endotérmica desse modo elevando a temperatura para 22-25 °C. A mistura reacional foi mantida a 22-25 °C e agitada durante 60-90 minutos. Após este tempo, a mistura reacional foi analisada por HPLC, que indicava que a formação do intermediário de hidrazona foi concluída.

[000199] Exemplo 1, Etapa 2: A mistura reacional foi em seguida aquecida para 68-72 °C e trimetilortoformiato (475,7 g, 4,48 moles) foi adicionado durante um período de 5-10 minutos. A mistura reacional foi deixada resfriar para 40-45 °C e em seguida ácido acético (53,8 g, 0,89 moles) foi adicionado durante um período de 15-20 minutos. Na conclusão da adição, a temperatura foi elevada para 70±2 °C durante um período de 20-25 min. Uma vez na temperatura prescrita, a mistura reacional foi agitada durante 18-20 hr. Na conclusão deste período, a mistura reacional foi analisada por HPLC, que indicava que a formação da pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazina foi concluída.

[000200] Exemplo 1, Etapa 3: A pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazina de exemplo 1, Etapa 2, foi concentrada a 50-55 °C sob pressão reduzida (~ 5-10 mm Hg) para produzir um resíduo. Tetraidrofurano (THF, 2 L) e acetona (2 L) foram adicionados ao resíduo, e a mistura resultante foi agitada a 50-55 °C durante 90 minutos. Após este tempo, a mistura reacional foi filtrada através de funil Buckner para remover os precipitados de cloreto de sódio resultante (NaCl) e acetato de sódio (NaOAc). O filtrado resultante foi concentrado até a secura a 50-55 °C sob pressão reduzida (~ 400-450 mm Hg) para produzir um resíduo. O resíduo foi apreendido em 2-metilortoformiato (THF de 2-metila, 450 mL) e a mistura resultante foi agitada a 22-25 °C durante duas (2) horas. Na conclusão deste período, a mistura reacional foi filtrada e em seguida lavada por vaporização com THF de 2-metila (100 mL), seguido por terc- butil metil éter (MTBE, 200 mL). O produto resultante foi secado a 45 50 °C de pressão reduzida (~ 400-450 mm Hg) para fornecer 7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4(3H)-ona (107,0 g, 62,1% peso/peso, pureza de HPLC: 99,2 AP a 220 nm). Etapas 1 a 3 foram repetidas em uma larga escala para produzir quantidades de quilograma de 7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4(3H)-ona.

[000201] Exemplo 1, Etapa 4: A um reator revestido de vidro foram adicionados 7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4(3H)-ona (1,0 kg, 5,2 moles), dimetil 4-aminopiridina (1,27 kg, 10,4 moles), acetonitrila (10 L), e diisopropiletilamina (0,672 kg, 5,2 mole). A suspensão resultante foi agitada em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio durante um período de não menos do que 15 minutos até uma solução clara ser formada. A solução clara foi lentamente adicionada a um segundo reator revestido de vidro contendo acetonitrila (6,0 L) e oxicloreto de fósforo (POCl3, 0,822 kg, 5,3 moles). Na conclusão da adição, a mistura resultante foi agitada a menos de 35 °C durante 2 horas. Na conclusão deste período, a reação foi analisada por HPLC, que indicava que a reação foi concluída. Fenol (0,64 kg, 6,8 mole) e diispropiletilamina (0,87 kg) foram adicionados e a mistura reacional resultante foi agitada em temperatura ambiente durante não menos do que 1 hr. Após este tempo, a mistura reacional foi analisada por HPLC, que indicava que a reação foi concluída. 2-Metil-THF (20 L), seguido por água (10 L) foram adicionados à mistura reacional. As fases aquosas e orgânicas foram separadas e a fase aquosa foi descartada. A fase orgânica foi lavada com uma solução de salmoura-ácido cítrico (5 peso%, 10 L), e as fases aquosas e orgânicas resultantes foram separadas e a fase aquosa foi descartada novamente. A lavagem de solução de salmoura-ácido cítrico acima foi repetida mais duas vezes. Na conclusão das lavagens de solução de salmoura-ácido cítrico, uma solução de base fosfórica de potássio (K2HPO4, 7,5 peso%, 10 L) foi adicionada. As fases aquosas e orgânicas foram separadas e a fase aquosa foi descartada. A lavagem de solução de K2HPO4 acima foi repetida mais uma vez até pH ~8.

[000202] Exemplo 1, Etapa 5: N-[2-(3-Amino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5- terc-butilamino-cicloexil]-acetamida (preparado de uma maneira similar como descrito em Publicação dos Estados Unidos No. 2008/0027083 A1, 1,05 kg) foi adicionado à fase orgânica básica de exemplo 1, Etapa 4. Na conclusão da adição, a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 16 hr. Na conclusão deste período, a mistura reacional foi analisada por HPLC, que indicava que a reação foi concluída. Água (20 L) seguida por ácido acético (HOAc, 0,406 kg) foram adicionados à mistura reacional, e as camadas aquosas e orgânicas resultantes foram separadas. A camada aquosa foi extraída com THF de 2-metila (10 L). As camadas orgânicas foram combinadas e HOAc (0,406 kg) foi adicionado. A mistura resultante foi lavada com água (10L) e as camadas aquosas e orgânicas resultantes foram separadas. Esta camada aquosa foi extraída novamenten com 2-metil- THF (10 L). As camadas aquosas foram combinadas novamente e diclorometano (DCM, 15 L) foi adicionado. Hidróxido de sódio (NaOH, 10 N, 1,04 L) foi adicionado para ajustar o pH para ~ 13,0. Na conclusão da adição, as camadas aquosas e orgânicas foram separadas novamente e a camada de DCM rica em produto foi posta de lado. A camada aquosa foi extraída com mais diclorometano (10L). As camadas orgânicas ricas em DCM foram combinadas e lavadas com água (10 L). A solução de DCM rica em produto resultante foi concentrada em vácuo em um volume mínimo. Acetato de etila (EtOAc) foi adicionado e o DCM residual e água foram continuamente destilados para produzir uma suspensão (volume final ~ 5 L). MTBE (15 L) foi adicionado e a suspensão resultante foi agitada durante não menos do que 1 hr. Após este tempo, a suspensão foi filtrada e a massa filtrante úmida foi lavada com mais MTBE (5 L). A massa úmida foi secada a 55 °C em vácuo até LOD <0,5 peso% para fornecer a base livre amorfa de Exemplo 1 (0,9 kg, 55 M% de produção, pureza de HPLC: 99,5 AP). 1H NMR (600,13 MHz, DMSO-d6) δ 1,04 (s, 9H), 1,34 (s, 9H), 1,58 (m, 3H), 1,64 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 2,05 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 2,36 (m, 1H), 2,93 (br s, 1H), 3,48 (m, 2H), 3,84 (m, 1H), 4,26 (br s, 1H), 4,86 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 6,39 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,94 (br s, 1H); 13C NMR (125,8 MHz, DMSO-d6) δ 21,3, 23,3, 25,9, 29,3, 30,0, 32,2, 32,6, 35,5, 43,1, 46,5, 47,7, 50,7, 51,7, 52,5, 92,3, 148,7, 148,8, 152,9, 167,3, 168,5, 171,2; HRMS calculada para C25H40N8O2 (M+1) 485,3274, encontrada 485,3343.

[000203] Exemplo_2 N-((1R,2S,5R)-5-( terc- butilamino)-2-((S)-3-(7- terc- butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida rotulado por trítio

[000204] Exemplo_3 N-((1R,2S,5R)-5-( terc- butilamino)-2-((S)-3-(7- terc- butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida rotulado por deutério

[000205] Exemplo_4 N-((1R,2S,5R)-5-( terc- butilamino)-2-((S)-3-(7- terc- butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida rotulado por carbono-14

[000206] Exemplo_5 Forma de cristal N-1 de N-((1R,2S,5R)-5-( terc- butilamino)-2-((S)-3-(7- terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida

[000207] A forma de cristal de base livre de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, incluindo formas de sal, e solvatos do mesmo, foi preparada e caracterizada como descrito abaixo. Procedimentos para caracterizar as formas Dados de Cristal Simples

[000208] Dados foram coletados em um difractômetro serial CAD4 Bruker-Nonius (Bruker AXS, Inc., 5465 East Cheril Parkway Madison, WI 53711 USA). Parâmetros celulares unitários foram obtidos através de análise de quadrados mínimos da fixações de difractômetro experimentais de 25 reflexões de ângulo elevado. Intensidades foram medidas usando radiação de Cu Kα (À = 1,5418 Â) em uma temperatura constante com a técnica de varredura de variável θ-2θ e foram corrigidas somente para fatores de polarização Lorentz. Contagens de base foram coletadas nos extremos da varredura durante metade do tempo da varredura. Alternadamente, dados de cristal simples foram coletados em um sistema Bruker-Nonius Kappa CCD 2000 usando radiação de Cu Kα (À = 1,5418 A). Indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram realizados com o pacote de software HKL2000 (Otwinowski, Z. e outro em Macromolecular Crystallography, Carter, W.C., Jr. e outro, eds., academic, NY, publ., Vol. 276, pp. 307-326 (1997)) no conjunto de programa Collect. (Collect Data collection and processing user interface: Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B.V., 1998.). Alternadamente, dados de cristal simples foram coletados em um sistema Bruker-AXS APEX2 CCD usando radiação de Cu Kα (À = 1,5418 A). Indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram realizados com o conjunto de programa/pacote de software APEX2 (APEX2 Data collection and processing user interface: APEX2 User Manual, v1,27; Bruker AXS, Inc., 5465 East Cheril Parkway Madison, WI 53711 USA).

[000209] Quando indicado, cristais foram resfriados na corrente fria de um sistema Oxford cryo (Oxford Cryosystems Cryostream cooler: Cosier, J. e outro, J. Appl. Cryst., 19:105 (1986)) para coleção de dados.

[000210] As estruturas foram resolvidas por métodos diretos e refinadas na base de reflexões observadas usando o pacote de software SDP (SDP, Structure Determination Package, Enraf-Nonius, Bohemia NY 11716. Scattering factors, incluindo f e f", no software SDP foram tomados do International Tables for Crystallography, Kynoch Press, Birmingham, England, Vol. IV, Tabelas 2,2A e 2,3,1 (1974)) com modificações locais menores ou os pacotes cristalográficos MAXUS (maXus solution and refinement software suite: Mackay, S. e outro, maXus: um programa de computador para a solução e refinamento de estruturas de cristal de dados de difração ou SHELXTL4. Os parâmetros atômicos derivados (fatores de temperatura e coordenadas) foram refinados através de quadrados mínimos de matriz completa. A função minimizada nos refinamentos foi ∑w(|Fo| - |Fc|)2.. R é definido como ∑ ||Fo| - |Fc||/∑ |Fo| ao mesmo tempo que Rw = [∑w(|Fo| - |Fc|)2/∑w |Fo|2]1/2 onde w é uma função de carga apropriada com base nos erros nas intensidades observadas. Mapas de diferença foram examinados em todos os estágios de refinamento. Hidrogênios foram introduzidos em posições idealizadas com fatores de temperatura isotrópicos, porém nenhum parâmetro de hidrogênio foi variado.

Dados de Difração de raio X de pó (PXRD)

[000211] Dados de PXRD foram obtidos usando um Bruker C2 GADDS . A radiação foi Cu Kα (40 KV, 50mA). A distância de detector de amostra foi de 15 cm. Amostras de pó foram colocadas em capilares de vidro selados de 1 mm ou menos em diâmetro; o capilar foi girado para coleção de dados. Os dados foram coletados por 3 <2θ < 35° com o tempo de exposição de amostra de pelo menos 2000 segundos. Os arcos de difração bi-dimensionais resultantes foram integrados para criar um padrão unidimensional tradicional de PXRD com um tamanho de etapa de 0,02 graus 2θ Dna faixa de 3 a 35 graus 2θ. Cerca de 200 mg foram empacotados em um portador de amostra de difração de raio X de pó (PXRD) Philips. A amostra foi transferida para uma unidade MPD Philips (45 KV, 40 mA, Cu Kα). Os dados foram coletados em temperatura ambiente na faixa de 2-teta 2 a 32 (modo de varredura contínuo, taxa de varredura 0,03 graus/seg., incisões de auto divergência e anti-dispersão, incisão de recepção: 0,2 mm, fiandeiro de amostra : ON)

Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)

[000212] Experimentos de DSC foram realizados em um TA INSTRUMENTS® modelo Q1000 ou 2920. A amostra (cerca de 2-6 mg) foi pesada em uma panela de alumínio e precisamente registrada para um centésimo de um miligrama, e transferida para o DSC. O instrumento foi purgado com gás de nitrogênio em 50 mL/min. Os dados foram coletados entre temperatura ambiente e 300 °C a 10 °C/min de taxa de aquecimento. O plote foi feito com os picos endotérmicos apontando para baixo.

Análise Gravimétrica Térmica (TGA)

[000213] Experimentos de TGA foram realizados em um TA INSTRUMENTS® modelo Q500 ou 2950. A amostra (cerca de 10-30 mg) foi colocada em uma panela de platina previamente tarada. O peso da amostra foi medido precisamente e registrado para um milésimo de um miligrama pelo instrumento. O forno foi purgado com gás de nitrogênio a 100 mL/min. Os dados foram coletados entre temperatura ambiente e 300 °C a 10 °C/min de taxa de aquecimento.

Preparação e Análise das formas

[000214] Os dados de célula unitária e outras propriedades para o exemplo são apresentados na tabela 1. Os parâmetros celulares unitários foram obtidos de análise cristalográfica de raio X de cristal simples. Uma narrativa detalhada de células unitárias pode ser encontrada no capítulo 3 de Stout e outro, X-Ray Structure Determination: a Practical Guide, Macmillan (1968).

[000215] Finalmente, figura 1 apresenta o padrão de XRPD no exemplo 5. Figuras 2 e 3 descrevem a análise de DSC e TGA, respectivamente, no Exemplo 5. Forma de preparação, caracterização de XRD, DSC e TGA.

[000216] Exemplo 5. Forma N-1, Base livre

[000217] N-((1R,2S,5R)-5-(terc-Butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, forma N-1, foi cristalizado de acetato de etila e MTBE. Forma N-1, é uma forma pura (nenhuma molécula de água ou solvente) de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida. Forma N-1 foi caracterizada por um padrão XRD que iguala-se ao padrão simulado gerado dos dados de estrutura de cristal simples. Forma N-1 foi caracterizada por um termograma DSC tendo uma endoterma de fusão/decomposição com um início tipicamente em aproximadamente 205 °C. Forma N-1 foi caracterizada por uma curva térmica TGA tendo uma perda de peso em até aproximadamente 210 °C. TABELA 1 Parâmetros de célula unitária

[000218] As variáveis usadas na Tabela 1 são definidas abaixo:

[000219] T = temperatura em Centígrados para os dados cristalográficos (RT é temperatura ambiente, que é de cerca de +22 °C)

[000220] V = volume de célula unitária

[000221] Z‘ = número de moléculas de fármaco por unidade assimétrica

[000222] Vm = V(célula unitária) / (Z moléculas de fármaco por célula)

[000223] sg = grupo de espaço

[000224] dcalc = densidade de cristal calculada

CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS COMPARATIVAS

[000225] Ensaios e dados comparando as características farmacológicas de exemplo 1 e compostos encontrados em WO 2005/021500 A1, WO 2008/014381 A1 e WO 2008/014360 A1 são apresentados abaixo.

Ligação de Célula Mononuclear de Sangue Periférico Humano

[000226] Veja também: Yoshimura e outro, J. Immunol., 145:292 (1990). O ensaio de ligação de CCR-2 humano foi estabelecido com células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMCs) usando MCP-1 humana 125I como o ligante traçador. hPBMCs foram isoladas de leukopak humana (Biological Specialty Inc.) usando um protocolo padrão com Ficoll-Hypaque (Mediatech CELLGRO®). hPBMCs isoladas foram lavadas e diluídas para 1x107/ml em tampão de ligação (RPMI- 1640, 0.1% de BSA, 20 mM de Hepes, pH 7,4). 125I-MCP-1 (NEN/Perkin Elmer) foi diluída para 0,45 nM em tampão de ligação. O composto foi diluído em tampão de ligação em 3 vezes as concentrações finais usadas no ensaio de ligação. O ensaio de ligação foi realizado usando uma placa filtrante de 96 cavidades (Millipore). A ligação de 125I-MCP-1 total foi avaliada como segue: a cada reação de um volume total de 150 μl foram adicionadas 5x105 células, 0,15 nM de 125I-MCP-1, e composto tal que a concentração final variou de 0 a 100 nM. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos seguido por três lavagens com RPMI-1640, 0,1% de BSA, NaCl a 0,4 M, Hepes a 20 mM, pH 7,4 usando uma filtração por tubo a vácuo (Millipore). Após lavagem, a placa foi secada por ar durante 60 minutos em temperatura ambiente. Isto foi seguido por adição de 25 μl de Microscint 20 em cada cavidade. A placa foi selada e contada sobre o Trilux durante 1 minuto. Ligação não específica foi determinada na presença de 300 nM cold MCP-1 (PeproTech Inc.). 125I-MCP-1 específica foi calculada como a diferença entre a ligação total e não específica. Todas as condições foram testadas em duplicada. A IC50 é definida como a concentração de composto de competição requerida para reduzir a ligação específica em 50%.

[000227] O procedimento usado para ensaio de ligação de CCR-5 de célula T foi similar àqueles para ensaio de ligação de CCR-2 de hPBMC exceto que células T periféricas humanas foram usadas como uma fonte de CCR-5 (veja abaixo) e 125I-MIP-1β como um traçador (Amersham).

Isolação de Células T Periféricas

[000228] Um recente relato indica que a expressão de CCR-5 sobre células T varia consideravelmente entre indivíduos (Desmetz, C. e outro, "The strength do chemotactic response to a CCR-5 binding chemokine is determined by the level of cell surface CCR-5 Densidade", Immunology, 119(4):551-561 (2006)). Portanto, doadores de sangue foram pré-avaliados quanto a expressão de célula T elevada de CCR-5. hPBMCs foram primeiro isoladas de sangue total humano por protocolo padrão com Ficoll-Hypaque. Análise citométrica de fluxo foi então usada para medir a expressão de CCR-5 sobre células T segujindo manchamento com anticorpo anti-CCR-5 mais anticorpo anti-CD4 ou anticorpo anti-CD8. Aqueles doadores de sangue em que > 5% de células T periféricas (CD4+ e CD8+) expressam CCR-5 foram requerido para fornecer sangue novamente para isolação de PBMCs e, subsequentemente, de células T usando uma técnica de E-rosetting padrão que conta com a única capacidade de células T ligarem-se a células de sangue vermelho de ovelha (RBCs).

Quimiotaxia de CCR-2

[000229] O ensaio de quimiotaxia de CCR-2 humano foi conduzido com a cepa de célula monocítica humana, THP-1. Células THP-1 foram primeiro rotuladas com o pigmento fluorescente Calceína-AM em RPMI- 1640 libre de BSA, livre de vermelho fenol (pH 7,4) a 37 °C durante 30 minutos com suave agitação a cada 15 minutos. As células rotuladas foram então lavadas e ressuspensas a 1x105/ml em tampão de quimiotaxia (RPMI-1640 livre de vermelho fenol, 0,1% de BSA, pH 7,4). O composto teste foi diluído em tampão de quimiotaxia, tal que a concentração de ensaio final variasse de 0,01 nM a 1 μM. O ligante MCP-1 (PeproTech Inc.) foi diluído para 20 nM em tampão de quimiotaxia. Para realizar o ensaio, um volume igual de diluições de composto teste foi misturado com um volume igual de células THP-1 rotuladas (Mistura 1), e um volume igual de diluições de composto teste foi misturado com um volume igual de ligante MCP-1 diluído (Mistura 2). Ambas as misturas foram incubadas independentemente a 37 °C durante 10 minutos seguido por suave mistura. Quimiotaxia induzida por MCP-1 foi então medida em uma placa de quimiotaxia (Becton Dickinson) colocando 50 μl de Mistura 1 na câmara de topo e 225 μl de Mistura 2 na câmara de base. A placa foi coberta com uma tampa e incubada a 37 °C durante 30 minutos. 30 minutos depois, a placa foi lida em um CYTOFLUOR®. Todas as condições foram testadas em duplicata. Para sinalizar quanto à determinação de ruído, 50 μl de células de THP-1 rotuladas sozinhas (5x104/cavidade) foram semeadas na câmara de topo e 225 μl de ligante MCP-1 sozinho foram semeados na câmara de base (concentração final de 10 nM). A inibição obtida por concentrações graduadas de composto teste foi calculada como uma percentagem do controle de MCP-1 livre de composto. A IC50 é definida como a concentração de composto teste requerida para alcançar 50% de inibição de quimiotaxia celular.

Quimiotaxia de CCR-5

[000230] Um procedimento similar àquele mencionado acima foi adotado exceto que células T periféricas isoladas foram usadas como células expressando CCR-5 e MIP-1β (50 nM, PeproTech Inc.) foi o ligante.

Fluxo de hERG

[000231] Células HEK293 estavelmente expressando canais de hERG foram custivadas (37°C, 5% de CO2) em Dulbecco’s Modified Eagle’s Media suplementado com 10% de soro bovino fetal Sigma, aminoácidos não essenciais, L-glutamina a 2 mM e 500 μg/ml de G418, em incubador. Tampão de dissociação celular foi usado para extrair as células de frascos, que foram então semeadas em placas pretas/claras revestidas por poli-D-lisina CORNING® de 384 cavidades em uma densidade de 2 x 104 células por cavidade (20 μl) em 10% de meio de soro, e incubadas durante 15 a 24 horas a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%, até uma monocamada confluente de células ser obtida.

[000232] Um estoque de pigmento BTC-AM a 2 mM (Molecular Probes, Eugene, OR) foi preparado em 100% de DMSO e em seguida adicionado 1:1 a 10% (peso/volume) de ácido plurônico em DMSO no dia do ensaio. O pigmento foi em seguida diluído em tampão EP externo de hERG (NaCl a 140 mM, KCl a 4,0 mM, CaCl2 a 1,8 mM, MgCl2 a 1,0 mM, HEPES a 10 mM, pH 7,3 e glicose a 10 mM; todos os componentes de tampão obtidos de Sigma Chemical). Esta mistura de pigmento de BTC (30 μl) foi adicionada às células e produziu uma concentração de carga final de 2,5 μM. Células são incubadas a 21 °C durante 45 minutos.

[000233] O composto teste foi diluído para DMSO a 10 mM em 60 μl. O composto foi em seguida serialmente diluído em uma relação de 1:2 em DMSO em colunas 1-10 e 11-20 de uma placa de 384 cavidades. As placas prontas para o ensaio foram geradas por estampagem de 2,5 μl da placa serialmente diluída de DMSO, que foi preparada no Velocity 11 BIOCEL®. Placas aquosas foram criadas adicionando-se 48 μl de tampão EP e em seguida foram diluídas 30 - 45 minutos antes do ensaio ser lido no FLIPR®. Após carga de pigmento, composto diluído aquoso foi adicionado às células das três placas replicadas (10 μl) produzindo uma faixa de concentração de dez pontos de 80 μM a 0,156 nM. Concentração de DMSO final no ensaio é de 1%. Placas aquosas prontas para o ensaio foram preparadas e diluídas em um manipulador de líquido CyBio.

[000234] Células carregadas com pigmento foram lidas no FLIPR®384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), que estimula o pigmento usando a linha de 488 nm de um laser de argônio. A emissão foi filtrada usando um filtro de passagem de faixa de 540 ± 30 nm. Canais de hERG são estimulados para abrir pela adição de 20 μl/cavidade de tampão de EP contendo 66 mM de K2SO4 e 1,3 mM de Tl2SO4 (Sigma/Aldrich). Para cada placa, dados foram coletados a cada segundo durante um período de 12 segundos, em cujo tempo o tampão de estímulo contendo Tl+ foi adicionado. A coleção de dados prosseguiu a cada Segundo durante 48 segundos, e em seguida continuou a cada três segundos durante mais 2 minutos.

[000235] A faixa dinâmica do ensaio foi determinada de cavidades vazias e totais. As cavidades totais (colunas 21 e 22) definem a ativação máxima de hERG para a placa (no composto teste presente), e as cavidades vazias (colunas 23 e 24) definem 100% de inibição de hERG. As cavidades vazias contêm 400 nM de qualquer dos inibidores de hERG padrões dofetilida (Ficker e outro, 1998) ou E-4031. Os pontos de dados brutos em cada cavidade de amostra foram primeiro corrigidos para variação de célula/sinal, base de controle negativo (vazios), e normalizados para os controles positivos (totais) usando o software FLIPR® online. As curvas de resposta à concentração de composto teste para os dados de fluxo de hERG Tl+ foram então ajustadas usando Excel Fit (ID Business Solutions Limited, Surrey, UK) com uma equação logística de único sítio, Y= A + ((B-A)/1 + ((C/X) A D))) onde A= inibição máxima. Os dados foram analisados por ajuste de amplitudes máximas de mudança em fluorescência para fluxo de Tl+ para uma determinada condição de composto teste. Potências (valores IC50) de composto foram calculadas da media de cavidades triplicadas.

Canal de Sódio, Ensaio de Ligação de Sítio 2

[000236] Veja também: Catterall, W.A. e outro J. Biol. Chem., 256:8922 (1981). O tampão de ligação padrão conteve HEPES a 50 mM, Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, cloreto de colina a 130 mM, KCl a 5,4 mM, MgCl2 a 0,8 mM, glicose a 5,5 mM, 40 μg/mL de LqT. Reações de ligação foram iniciadas por adição de sinaptossomas (preparadas de cérebro de rato Wistar) à mistura reacional contendo 5 nM de [3H]- batracotoxina em um tampão de ligação padrão e o composto a ser testado na concentração desejável. As amostras foram então misturadas e incubadas a 37 °C durante 60 minutos. As reações foram interrompidas adicionando-se tampão de lavagem gelado contendo HEPES a 50 mM, Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, CaCl2 a 1,8 mM, MgCl2 a 0,8 mM e 1 mg/mL de albumina de soro bovino. As sinaptossomas foram imediatamente coletadas sobre filtros de fibra de vidro e lavadas 3 vezes com tampões de lavagem. A radioatividade de [3H]-batracotoxina restante sobre os filtros foi contada usando espectrômetros de cintilação líquida. Ensaio de Permeabilidade de Membrana Artificial Paralela (PAMPA)

[000237] O Ensaio de Permeabilidade de Membrana Artificial Paralela (PAMPA) consiste em uma combinação de lipídeo com base em lecitina especialmente formulada referida como o lipídeo do trato gastrointestinal (GIT). O lipídeo GIT é usado para formar uma membrane em uma montagem de placa sanduíche similar àquela usada nos ensaios Caco-2. O lipídeo GIT intimamente se parece com a composição de membrana in vivo e desempenho como medido por compostos padrões que são conhecidos serem passivamente absorvidos em humanos. PAMPA é amplamente usado como um modelo in vitro para avaliação da permeabilidade de compostos da invenção. A taxa de passagem de compostos através da membrana PAMPA é usada para determinar o coeficiente de permeabilidade (Pc), que pode ser relacionado à permeabilidade passiva in vivo do composto.

[000238] O coeficiente de permeabilidade (Pc) de um composto particular é examinado em um cenário dependente do pH com pH apical e basolateral de 7,4. Todos os experimentos são conduzidos em determinações triplicadas.

[000239] O composto teste (estoques a 10 mM em 100% de DMSO) foi diluído 1:100 em tampão de cavidade doadora pH 7,4 (pION CAT # 110151), fornecendo uma solução de ensaio de 100 μM em 1% de DMSO. O composto diluído em tampão de cavidade doadora foi transferido para uma placa Whatman UNIFILTER® e filtrado antes de dispensar 200 μl na cavidade doadora da placa de ensaio (pION CAT #110163). A membrana PAMPA foi formada por pipetaqgem de 4 μl da solução de lipídeo (pION CAT #110169) sobre a placa filtrante (VWR CAT #13503). A membrana foi em seguida coberta com 200 μl de tampão de cavidade aceptora a pH 7,4 (pION CAT #110139). A placa de ensaio PAMPA (lado doador e lado aceptor) foi combinada e deixada incubar em temperatura ambiente durante 4 horas. A placa foi em seguida desmontada e as placas espectrofotômetro (VWR CAT #655801) foram carregadas (150 μl/cavidade). As pladas doadora, aceptora, Referência, e vazia foram lidas na leitora de placa de UV SPECTRAMAX®. Os dados foram capturados pelo software pION, que analisa os espectros e gera valores Pc.

Grampo de Emplastro hERG

[000240] Grampo de emplastro de célula total foi usado para diretamente medir as correntes de hERG em células HEK-293 estavelmente expressando a subunidade α de canal de potássio de hERG clonado. O composto foi testado em um tampão aquoso com pH 7,4 em temperatura ambiente. Pulsos de teste repetitivos (0,05 Hz) foram aplicados de um potencial de retenção de -80 mV a +20 mV durante 2 segundos e correntes de descarga foram eliciadas segundo os pulsos de teste por escalonamento da voltagem para -65 mV. Os efeitos do composto foram calculados medindo-se a inibição de corrente de descarga máxima.

Grampo de Emplastro de Canal de Sódio

[000241] Grampo de emplastro de célula total foi usado para diretamente medir as correntes de sódio de internas em células HEK- 293 expressando o canal de sódio cardíaco humano, SCN5A. O composto foi testado em um tampão aquoso livre de proteína. Para determinar a inibição de estado constante, as correntes de sódio foram eliciadas a cada 5 segundos usando o seguinte protocolo de voltagem: as células foram mantidas em um potencial de -90 mV e escalonadas para -20 mV durante 60 ms. Os efeitos foram calculados medindo-se a inibição de corrente maxima durante o pulso de teste para -20 mV. A dependência de inibição da taxa foi avaliada por estimulação em frequências de 1 Hz e 4 Hz.

Farmacosinéticos de Dose Única em Ratos

[000242] Ratos Sprague-Dawley machos (250-300 g) foram usados para os estudos farmacocinéticos. Os ratos foram jejuados durante a noite antes da dosagem PO e alimentados 4 horas após a dose. Amostras de sangue (~0,3 mL) foram coletadas da veia jugular em tubos contendo K2EDTA e em seguida centrifugadas a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. Em um estudo de biodisponibilidade oral, 2 grupos de animais (N=2-3 por grupo) receberam o composto teste como uma infusão intravenosa (IV) (durante 10 minutos) por meio da veia jugular ou por gavagem oral. Amostras de sangue seriais foram obtidas a 0,17 (para IV apenas), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 horas após a dose. Amostras de plasma, obtidas por centrifugação a 4 °C (1500-2000xg), foram armazenadas a -20 °C até análise por LC/MS/MS.

Farmacocinéticos de Dose Única em Macados

[000243] Os farmacocinéticos de vários compostos testículos foram avaliados em macacos cinomolgos machos em um projeto de cruzamento. Os macacos foram jejuados antes da dosagem PO e alimentados 4 horas após a dose. Um grupo de 1 a 3 animais (3 a 5 kg) recebeu o composto por infusão IV (durante 10 minutos) por meio de uma veia femoral e por gavagem oral, com um intervalo de 1 semana entre os tratamentos. Amostras de sangue seriais (~0.3 mL) foram coletadas de uma artéria femoral a 0,17 (IV apenas), 0.25, 0,5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 horas após a dose, e centrifugadas a 4 °C (1500-2000xg) para obter plasma. As amostras foram armazenadas a -20 °C até análise por LC/MS/MS.

Análise de Dados para Ensaios Farmacocinéticos

[000244] Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos por análise não compartimental de concentração de plasma versus dados de tempo (Kinetica software, Versão 4.2, InnaPhase Corporation, Philadelphia, PA). A concentração máxima (Cmax) e tempo para Cmax foram registrados diretamente de observações experimentais. A área sob a curva de tempo zero ao último tempo de amostragem (AUC(0-T)) foi calculada usando uma combinação de adições lineares e log trapezoidais. A clearance de plasma total (CLTp), volume de estado constante de distribuição (Vss), meia-vida de eliminação aparente (T1/2) e tempo de residência médio (MRT) foram estimados após a administração IV. Estimativa de T1/2 foi feita usando um mínimo de 3 pontos do tempo com concentrações quantificáveis. A biodisponibilidade oral absoluta (F) foi estimada como a relação de valores AUC de normalizados pela dose seguindo doses oral e IV.

Mobilização de Cálcio CCR-2

[000245] Ensaio de fluxo de cálcio intracelular mediado por CCR-2 humano foi estabelecido com a cepa de célula monocítica humana cepa de célula monocítica THP-1. Células THP-1 foram primeiro carregadas com fluoroforo ressuspendendo-as em um PBS tamponado por glicose e HEPES (pH 7,4) contendo 4 μM de fluo-3 (Molecular Probes) e Probenecid a 1,25 mM e em seguida incubadas durante 60 minutos a 37°C. Após lavagem uma vez para remover o excesso de fluo-3, as células foram ressuspensas em tampão de lavagem (contendo RPMI livre de vermelho fenol) com Probenecid a 1,25 mM, e semeadas em placa de 96 cavidades a 2 x 105/cavidade. A placa foi colocada em um FLIPR®-1 (Molecular Devices) que usa um laser de íon de argônio para estimular as células e roboticamente adicionar o composto teste e MCP- 1 humana, ao mesmo tempo em que monitorando mudanças em fluorescência. Diluições de composto teste com uma faixa de concentração de 0 a 100 nM ou tampão apenas foram adicionadas a cada cavidade, centrifugadas e incubadas durante 10 minutos. MCP-1 humana recombinante (PeproTech Inc.) foi em seguida adicionada para uma concentração final de 10 nM. A mudança de fluorescência foi monitorada e a excursão de base-para-pico computada automaticamente. Todas as condições foram testadas em duplicata. A inibição obtida por concentrações graduadas de composto foi calculada como uma percentagem do controle de MCP-1 livre de composto.

Mobilização de Cálcio CCR-5

[000246] Um procedimento similar à mobilização de cálcio de CCR-2 mencionado acima foi adotado, exceto que MIP-1β (50 nM) foi o ligante e a cepa celular foi HT1080/CCR-5 em que CCR-5 endógeno é super- regulado por ativação aleatória de tecnologia de expressão de gene (RAGE).

Permuta de GTP-YS de CCR-2

[000247] A ligação dependente de MCP-1 de [35S]-GTPyS a CCR-2 foi determinada usando membranas preparadas da cepa de célula humana HT1080 em que CCR-2 endógeno foi super-regulado por tecnologia RAGE (Athersys). Cada reação (200 μL) conteve Na-HEPES a 20 mM, MgCl2 a 10 mM, NaCl a 50 mM, 0,1% de BSA (Sigma), 1% de DMSO, e 10 μM de GDP (pH 7,4). A EC50 para ligação dependente de MCP-1 de [35S]-GTPyS foi determinada por variação das concentrações de MCP- 1 de 1 pM a 1 μM. As reações foram incubadas durante 90 minutos em temperatura ambiente e complexos de [35S]-GTPyS/Gαi foram coletados em uma placa filtrante de 96 cavidades Millipore MAFC 96. A inibição de ligação de [35S]-GTPyS dependente de MCP-1 a membranas de CCR-2 pelo composto teste foi determinada a MCP-1 a 1 nM sob condições idênticas. Os dados foram analisados usando o software de ligação de ligante de Graphpad Prism 4.

Permuta de GTP-yS de CCR-5

[000248] Um procedimento similar ao procedimento de permuta de GTP-yS de CCR-2 mencionado acima foi adotado, exceto que MIP-1α /LD78β foi o ligante e a cepa celular foi CCR-5/HT1080. MIP-1α /LD78β foi usado como o ligante de CCR-5 por que é fornecida uma maior relação sinal para ruído do que o MIP-1β.

Super-regulação de Integrina de Sangue Total de CCR-2 (CD11b)

[000249] Um ensaio de super-regulação de CD11b dependente de CCR-2 foi estabelecido com sangue total humano. Sangue total (100 μl) foi pré-incubado com uma faixa de concentração de exemplo 1 a 37°C durante 10 minutos. MCP-1 recombinante humana (10 μl de 100 nM) foi então adicionada a cada reação para uma concentração final de 10 nM, exceto para reações de controle não estimulado. As reações foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Após incubação, 1 ml de tampão FACS gelado (PBS com 10% de FBS) foi adicionado, e as amostras foram centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos e ressuspensas em 50 μl de tampão FACS. As células foram em seguida incubadas com 20 μl de solução anti-CD14-FITC/anti-CD11b-PE durante 20 minutos sobre gelo no escuro seguido por adição de 1 ml de solução de lise de 1x FACS (Becton Dickinson) a cada reação. As amostras foram em seguida incubadas durante 30 minutos sobre gelo no escuro. Seguindo fixação e lise de célula sanguínea vermelha, as células foram centrifugadas e ressuspensas em 200 μl de solução de lise de FACS. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em 1 hora de manchamento usando um citômetro de fluxo FACSCalibur. Aquisição e análise de dados foram realizadas usando o software CellQuestPro. Uma estratégia de fechamento sequencial foi usada para analisar a população de monócito CD14elevada CD11b+. Para análise, CD11b foi medido como intensidade de fluorescência média (MFI).

Super-regulação de CD11 b de Sangue Total de CCR-5

[000250] Procedimento similar ao procedimento de super-regulação de CD11b de sangue total de CCR-2 mencionado acima foi adotado, exceto que MIP-1β (50 nM) foi usado como o ligante.

[000251] Encontre abaixo dados para compostos comparados (Veja WO 2008/014381 A1, WO 2008/014360 A1 e WO 2008/014361 A1). Os dados comparativos mostram a combinação inesperada de características farmacológicas desejáveis e inibitórias de receptor equipotente dual CCR-2 e CCR-5. TABELA 2 Dados Comparativos In vitro

TABELA 3 Dados Comparativos Adicionais In vitro

TABELA 4 Dados Comparativos Adicionais In vitro

TABELA 5 Dados Comparativos Adicionais In vitro

TABELA 6 Dados Farmacocinéticos Comparativos In vivo no Rato

TABELA 7 Dados Farmacocinéticos Comparativos In vivo no Macaco

[000252] Surpreendentemente, descobriu-se que o exemplo 1 da presente invenção não é predominantemente ativo contra CCR-2 ou CCR-5, porém, em vez disso, é antagonista dual equipotente, como medido por sua capacidade de ligação a CCR-2 e CCR-5, e possui características farmacológicas benéficas. Veja as tabelas 2 a 5. Por exemplo, veja a Tabela 5, em que o exemplo 1 é equipotente contra CCR-2 e CCR-5, enquanto que o exemplo 1 de WO 2008/014381 e WO 2008/014360 é predominantemente ativo contra CCR-2.

UTILIDADE

[000253] Os compostos dos exemplos são demonstrados serem moduladores de atividade de receptor de quimiocina usando ensaios conhecidos por aqueles versados na técnica. Nesta seção, descrevemos tais ensaios e damos suas referências de literatura. Mais ensaios são descritos aqui na seção entitulada "Características Farmacológicas Comparativas", supra. Mostrando atividade nestes ensaios de antagonismo de MCP-1, compostos dos exemplos são supostos serem úteis no tratamento de doenças humanas associadas com quimiocinas e seus receptores cognatos. A definição de atividade nestes ensaios é um composto demonstrando um IC50 de 30 μM ou menor em concentração quando medido em um ensaio particular.

Antagonismo de Influxo de Cálcio induzido por MCP-1

[000254] (Sullivan e outro, Methods Mol. Biol., 114:125-133 (1999))

[000255] Pelo menos um composto descrito nos exemplos tem atividade no antagonismo de ensaio de influxo de cálcio induzido por MCP-1 descrito aqui.

[000256] Mobilização de cálcio é medida usando o pigmento indicador de Ca2+ fluorescente, Fluo-3. Células são incubadas em 8 x 105 células/ml em salina tamponada por fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, tampão de Hepes a 20 mM, glicose a 5 mM, 1% de soro bovino fetal, 4 μM de Fluo-3 AM e Probenecid a 2,5 mM durante 60 minutos a 37 °C. As células usadas para tais ensaios de cálcio podem incluir monócitos humanos isolados como descrito por Weiner e outro, J. Immunol. Methods, 36:89-97 (1980) ou cepas celulares que expressam o receptor CCR-2 endógeno tais como THP-1 e MonoMac- 6. As células são então lavadas três vezes em salina tamponada por fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, Hepes a 20 mM, glicose a 5 mM e Probenecid a 2,5 mM. As células são ressuspenssas em salina tamponada por fosfato contendo 0,5% albumina de soro bovino, Hepes a 20 mM e Probenecid a 2,5 mM em uma concentração final de 2-4 x 106células/ml. Células são semeadas em microplacas de paredes pretas, de 96 cavidades (100 μl/cavidade) e as placas centrifugadas a 200 x g durante 5 minutos. Várias concentrações de composto são adicionadas às cavidades (50 μl/cavidade) e após 5 minutos, 50 μl/cavidade de MCP-1 é adicionado para fornecer uma concentração final de 10 nM. Mobilização de cálcio é detectada pelo uso de uma leitora de placa de imageamento fluorescente. A monocamada da célula é estimulada com um laser de argônio (488 nM) e fluorescência associada à célula medida durante 3 minutos, (a cada segundo durante os primeiros 90 segundos e a cada 10 segundos durante os seguintes 90 segundos). Os dados são gerados como unidades de fluorescência arbitrária e a mudança em fluorescência para cada cavidade determinada como o diferencial máximo-mínimo. A inmibição dependente do composto é calculada com relação à resposta de MCP-1 sozinho.

[000257] Receptores de quimiocina mamíferos fornece um alvo para interferir com ou promover a função de célula imune em um mamífero, tal como um humano. Compostos que inibem ou promovem a função de receptor de quimiocina são particularmente úteis para modular a função de célula imune para os propósitos terapêuticos. Consequentemente, a presente invenção é direcionada a compostos que são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas, e imunorregulatórios, incluindo asma e doenças alérgicas, infecção por micróbios patogênicos (que, por definição, inclui viroses), bem como patologias autoimunes tais como a artrite reumatoide e aterosclerose.

[000258] Por exemplo, um presente composto que inibe uma ou mais funções de um receptor de quimiocina mamífero (por exemplo, um receptor de quimiocina humano) pode ser administrado para inibir (isto é, reduzir ou prevenir) inflamação ou doença infecciosa. Como um resultado, um ou mais processos inflamatórios, tais como emigração de leucócito, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação mediadora inflamatória, é inibido.

[000259] Similarmente, um presente composto que promove uma ou mais funções do receptor de quimiocina mamífero (por exemplo, uma quimiocina humana) quando administrado para estimular (induziur ou realçar) uma resposta imune ou inflamatória, tal como emigração de leucócito, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação mediadora inflamatória, resultando na estimulação benéfica de processos inflamatórios. Por exemplo, eosinófilos podem ser recrutados para combater infecções parasíticas. Além disso, tratamento das anteriormente mencionadas doenças inflamatórias, alérgicas e autoimunes podem também ser contempladas para um presente composto que promove uma ou mais funções do receptor de quimiocina mamífero se alguém contempla a liberação de suficiente composto para causar a perda de expressão de receptor sobre células por meio da indução de internalização de receptor de quimiocina ou da liberação de composto de uma maneira que resulta na direção errônea da migração de células.

[000260] Além dos primatas, tais como humanos, uma variedade de outros mamíferos pode ser tratada de acordo com o método da presente invenção. Por exemplo, mamíferos, incluindo, porém não limitados a, vacas, ovelha, cabras, cavalos, cães, gatos, cobaias, ratos ou outras espécies bovina, ovina, equina, canina, felina, roedor ou murina podem ser tratadas. Entretanto, o método pode também ser praticado em outras espécies, tais como espécies aviárias. O indivíduo tratado nos métodos acima é um mamífero, macho ou fêmea, em quem a modulação de atividade de receptor de quimiocina é desejada. "Modulação"como aqui usada destina-se a abranger antagonismo, agonismo, antagonismo parcial e/ou agonismo parcial.

[000261] Ensai Funcional com Base em Leitora de Placa de Imageamento Fluorométrico (FLIPR®)

[000262] Células HT1080 (clone 3559.1.6) foram semeadas a 10.000 células/cavidade (30 microlitros) em placas de 384 cavidades (base breta/clara BIOCOAT® PDL, Beckton Dickinson) e carregadas com 30 microlitros/cavidade de pigmento fluorescente Fluo-4 AM (preparado dissolvendo-se 1 mg de Fluo-4 AM em 440 microlitros de DMSO e diluindo com 100 microlitros de solução plurônica antes de diluir novamente com 10 mL de tampão Hanks). As células foram incubadas a 37° C com 5% CO2 durante 30 minutos antes de serem lavadas três vezes e suspensas em Tampão de Ensaio (Hepes a 20 mM, 1.2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, Probenecid a 2,5 mM, 0,5% de BSA, 1x Hanks). O artigo de teste foi serialmente diluído em DMSO e em seguida diluído 1:10 com Tampão de Ensaio antes de ser adicionado às células (10 microlitros/cavidade). Usando FLIPR®, as placas foram lidas (10 - 70 segundos) para indução de fluxo (isto é, atividade agonista). As células foram em seguida novamente carregadas com Solução Agonista (30 microlitros/cavidade; preparado por diluição de 30 microlitros de 100 microMolar MIP-1 beta em 100 mL de Tampão de Ensaio; este protocolo libera a concentração final de MIP-1 beta a 5 nM no ensaio) e as placas foram lidas usando FLIPR® durante um minuto. Atividade antagonista do artigo teste foi determinada com relação a controle negativo de 0,4% de DMSO/Tampão negative control.

ENSAIO(S) IN VIVO E EFICÁCIA

[000263] N-((1R,2S,5R)-5-(terc-Butilamino)-2-((S)-3-(7-terc- butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida (também referido como "Exemplo 1") foi avaliado no ensaio in vivo descrito abaixo.

[000264] Modelo de Peritonite Induzido por Tioglicolato (TG) 48 horas em Camundongo hCCR-2 KI

Métodos

[000265] Os camundongos hCCR-2 KI (C57BL/6-SVJ129) foram injetados intraperitonealmente com 1 mL de tioglicolato (TG) (Hardy Diagnostics). Para cada estudo oito camundongos macho por grupo foram usados. Exemplo 1 foi dosado 1 hora antes de injeção de TG. O veículo usado foi HCl a 0,01 N em água. Quarenta e oito horas após injeção de TG, lavagens peritoneais foram realizadas injetando 5 ml de PBS/10 mM de EDTA/10% de BSA na cavidade peritoneal.

[000266] Para o estudo de periotonite de TG de 48 horas, Exemplo 1 foi dosado duas vezes ao dia com a primeira dose uma hora antes da injeção de TG. Contagens celulares peritoneais totais foram obtidas sobre células isoladas por uma registradora celular. Citospinas foras realizadas para determinar as contagens de leucócito diferenciais. As células foram manchadas durante 3 minutos com Wright-Giemsa Stain (Sigma-Aldrich) e em seguida enxaguadas com água desionizada durante 5 minutos. As contagens diferenciais foram calculadas com base em um total de 200 células contadas por amostra. Sangue foi também coletado do seio retro-orbital no término de cada estudo em EDTA para determinação da concentração de fármaco.

[000267] Para análise citométrica de fluxo, células de exsudado peritoneal (1x106) foram lavadas uma vez com tampão FACS (PBS/0,5% de BSA) e ressuspensas em tampão FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de bloqueio de Fc (BD Pharmingen) sobre gelo durante 15 minutos seguido pela adição dos seguintes anticorpos (BD Pharmingen): anti-F4/80 conjugado a PE, anti-Ly6C conjugado a FITC, e anti-hCCR-2 conjugado a Alexa 647. Após 45 minutos sobre gelo, as células foram fixadas por BD CYTOFIX® durante 15 minutos sobre gelo, lavadas duas vezes com tampão FACS, e ressuspensas em 200 μl de Tampão FACS. Eventos celulares (40,000) foram adquiridos para cada amostra e os dados foram analisados usando o software FloJo (TreeStar). Uma barreira FSC/SSC foi fixada para incluir todos os monócitos (baixo SSC, maior FSC) ao mesmo tempo em que excluindo granulócitos da análise. Esta população reunida foi em seguida analisada quanto à expressão de Ly6C (FITC), F4/80 (PE). Números de monócitos/macrófagos peritoneais foram determinados multiplicando-se as contagens de célula peritoneal total obtidas pela registradora celular e a percentagem de monócitos/macrófagos identificados por células F4/80+ a partir de citometria de fluxo. Significância estatística de diferenças entre médias foi analisada usando o teste t de duas caudas com significância estabelecida em valores p abaixo de 0,05.

Resultados

[000268] O exemplo 1 foi avaliado no modelo de peritonite TG de camundongo hCCR-2 KI para determinar sua EC50 na inibição de infiltração de monócito/macrófago. Os camundongos foram administrados tioglicolato, e dosados oralmente com o exemplo 1 a 10, 50, ou 160 mg/kg BID. Quarenta e oito horas após o tratamento com TG, lavagem peritoneal foi obtida para análise de infiltrado celular por citometria de fluxo.

[000269] Uma inibição dependente da dose em infiltração de monócito/macrófago foi observada (Figura 4). Doses de 10, 50, e 160 mg/kg forneceram uma inibição de 25%, 54% e 63%, respectivamente. Dos quatro estudos separados com múltiplas doses, a inibição máxima alcançada foi de ~ 70% e a EC50 média para inibição de infiltração de monócito/macrófago por esta análise foi estimada ser de 4,9 nM, que se correlaciona bem com a IC50 in vitro (5,8 ± 2,3 nM) por exemplo, 1 inibição de ligação de MCP-1 de camundongo 125I a células expressando CCR-2 humano (hPBMCs).

[000270] Para estimar o nível in vivo de ocupação do receptor pelo exemplo 1 no modelo de peritonite de tioglicolato de 48 horas no camundongo hCCR-2 KI, níveis de plasma de ambos Exemplo 1 e camundongo MCP-1 foram medidos. O caveat para esta estimativa é que apenas CCR-2 e seu principal ligante MCP-1 foram considerados. A ocupação do receptor de um ligante na presença de um inibidor competitivo é definida pela equação Gaddum :

[000271] Visto que o exemplo 1 é um inibidor competitivo de ligação de MCP-1 a CCR-2, as quantidades de ambos complexo de receptor de camundongo MCP-1/CCR-2 e complexo de receptor de exemplo 1/CCR-2 podem ser determinadas usando os níveis de soro de ambos camundongo MCP-1 e Exemplo 1 não ligado à proteína em plasma. O Kd para ligação de camundongo MCP-1 a hCCR-2 é 0,91 +/- 0,08 nM (n=8) que foi determinado em experimentos de ligação de ligante de competição frio usando MCP-1 humana 125I. O Ki médio, para a ligação do exemplo 1 a hCCR-2 é de 2,0 nM. A fração de complexos de receptor MCP-1/CCR-2 de camundongo é determinada usando a forma da equação descrita acima. Para determinar a fração de complexos de Exemplo 1/CCR-2 a equação é é redefinida como:

[000272] Finalmente, a quantidade de CCR-2 livre é determinada de :

[000273] [CCR-2]total = [CCR-2]free + [mouse MCP-1/CCR-2] + [Exemplo 1/CCR-2]

[000274] Como mostrado na tabela 8, o percentual de inibição de infiltração de monócito/macrófago no peritôneo em 48 horas reflete a percentagem de complexo de receptor de Exemplo 1/CCR-2. TABELA 8

[000275] Determinação de Ocupação de Receptor In vivo de Exemplo 1 em Sangue de camundongos hCCR-2 KI no Modelo de Peritonite TG de 48 horas.

a dose foi selecionada de um estudo diferente de outras doses na tabela para fornecer um exemplo de inibição máxima. Esta dose forneceu uma concentração plasmátiva livre de 1,9-vezes IC90 da ligação de hCCR-2 KI.

[000276] Coletivamente, estes resultados claramente demonstram que o Exemplo 1 é um potente bloqueador de infiltração de monócito/macrófago com um EC50 de ~ 4,9 nM. A inibição máxima de infiltração de monócito/macrófago pelo Exemplo 1 pode ser obtida por 98,5% de ocupação de CCR-2 com este composto. Notavelmente, os estudos demonstraram uma redução similar (~ 70 - 80%) em infiltração de monócito/macrófago em camundongos deficientes de CCR-2.

[000277] Doenças ou condições de humanos ou outras espécies, que podem ser tratadas com inibidores de função de receptor de quimiocina, incluem, porém não estão limitadas a: doenças e condições inflamatórias ou alérgicas, incluindo doenças alérgicas respiratórias tais como asma, rinite alérgica, doenças de pulmão de hipersensibilidade, pneumonite por hipersensibilidade, celulite eosinofílica (por exemplo, Síndrome de Well), pneumonias eosinofílicas (por exemplo, Síndrome de Loeffler, pneumonia eosinofílica crônica), fasciíte eosinofílica (por exemplo, Síndrome de Shulman), hipersensibilidade do tipo retardado, doenças de pulmão intersticiais (ILD) (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática, ou ILD associada com artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, espondilite ancilosante, esclerose sistêmica, Síndrome de Sjogren, polimiosite ou dermatomiosite); anafilaxia sistêmica ou respostas de hipersensibilidade, alergias de fármaco (por exemplo, à penicilina, cefalosporinas), síndrome de eosinofilia-mialgia devido à ingestão de triptofano contaminado, alergias a ferrão de inseto; doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide, artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, diabetes de início juvenil; glomerulonefrite, tireoidite autoimune, Doença de Behcet; rejeição a enxerto (por exemplo, em transplante), incluindo rejeição a aloenxerto ou doença do enxerto versus hospedeiro; doença do intestino inflamatória, tais como doença de Crohn e colite ulcerativa; espondiloartropatias; escleroderma; psoríase (incluindo psoríase mediada por célula T) e dermatoses inflamatórias tais como uma dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, urticária; vasculite (por exemplo, vasculite necrozante, cutânea, e de hipersensibilidade); miosite eosinofílica, fasciíte eosinofílica; cânceres com infiltração de leucócito da pele ou órgãos. Outras doenças ou condições em que respostas inflamatórias indesejáveis devem ser inibidas podem ser tratadas, incluindo, porém não limitadas a, vasculite, placas vulneráveis, hiperplasia neoíntima dano de reperfusão venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arterio-venoso, aterosclerose, certas malignidades hematológicas, toxicidade induzida por citocina (por exemplo, choque séptico, choque endotóxico), polimiosite, dermatomiosite. Doenças ou condições infecciosas de humanos ou outras espécies que podem ser tratadas com inibidores de função de receptor de quimiocina, incluem, porém não estão limitadas a HIV.

[000278] Doenças ou condições de humanos ou outras espécies que podem ser tratadas com promotores de função de receptor de quimiocina, incluem, porém não estão limitadas a: imunossupressão, tal como aquela em indivíduos com síndromes de imunodeficiência tais como AIDS ou outras infecções virais, indivíduos passando por terapia de radiação, quimioterapia, terapia para doença autoimune ou terapia de fármaco (por exemplo, terapia de corticosteroide), que causa imunossupressão; imunossupressão devido à deficiência congênita em função de receptor ou outras causas; e doenças de infecções, tais como doenças parasíticas, incluindo, porém não limitadas a infecções por helminto, tais como nematódeos (vermes redondos); (Trichuriasis, Enterobiasis, Ascariasis, Hookworm, Strongyloidiasis, Trichinosis, filariasis); trematódeos (flukes) (Schistosomiasis, Clonorchiasis), cestódeos (vermes em fita) (Echinococcosis, Taeniasis saginata, Cysticercosis); vermes viscerais, hemicrânias de larva visceral (por exemplo, Toxocara), gastroenterite eosinofílica (por exemplo, Anisaki sp., Phocanema sp.), hemicrânias de larva cutânea (Ancylostona braziliense, Ancylostoma caninum). Os compostos da presente invenção são consequentemente úteis na prevenção e tratamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorregulatórias.

[000279] Além disso, tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e autoimunes anteriormente mencionadas pode também ser contemplado para promotores de função de receptor de quimiocina se alguém contempla a liberação de composto suficiente para causar a perda de expressão de receptor sobre células por meio da indução de internalização de receptor de quimiocina ou liberação de composto de uma maneira que resulta na direção errônea da migração de células.

[000280] Em outro aspecto, a presente invenção pode ser usada para avaliar os agonistas ou antagonistas específicos putativos de um receptor acoplado à proteína G. A presente invenção é direcionada ao uso destes compostos na preparação e execução de ensaios de avaliação para compostos que modulam a atividade de receptores de quimiocina. Além disso, os compostos desta invenção são úteis na estabilização ou determinação do Sítio de ligação de outros compostos a receptores de quimiocina, por exemplo, por inibição competitiva ou como uma referência em um ensaio para comparar sua atividade conhecida a um composto com uma atividade desconhecida. Quando desenvolvendo novos ensaios ou protocolos, compostos de acordo com a presente invenção podem ser usados para testar sua eficácia. Especificamente, tais compostos podem ser fornecidos em um kit comercial, por exemplo, para uso em pesquisa farmacêutica envolvendo as doenças anteriormente mencionadas. Os compostos da presente invenção são também úteis para a avaliação de moduladores específicos putativos dos receptores de quimiocina. Além disso, alguém pode utilizar compostos desta invenção para examinar a especificidade de receptores acoplados à proteína G que não são supostos serem receptores de quimiocina, ou funcionarem como exemplos de compostos que não se ligam ou como variantes estruturais de compostos ativos sobre estes receptores que podem ajudar a definir sítios específicos de interação.

[000281] Compostos descritos aqui são úteis para tartar ou prevenir distúrbios selecionados de artrite reumatoide, osteoartrite, choque séptico, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, choque hemodinâmico, síndrome sepse, dano pós reperfusão isquêmica, malária, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, infecção micobacteriana, meningite, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, doenças fibróticas, caquexia, rejeição a enxerto, doenças autoimunes, doenças inflamatórias da pele, esclerose múltipla, dano de radiação, dano alveolar hiperóxico, HIV, demência por HIV, diabetes melito não dependente de insulina, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, fibrose pulmonar idiopática, pênfigoide bolhoso, infecções parasíticas helmínticas, colite alérgica, eczema, conjuntivite, transplante, eosinofilia familiar, celulite eosinofílica, pneumonias eosinofílicas, fasciíte eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, eosinofilia induzida por fármaco, fibrose cística, síndrome Churg-Strauss, linfoma, doença de Hodgkin, carcinoma colônico, síndrome de Felty, sarcoidose, uveíte, Alzheimer, glomerulonefrite, e lúpus eritematoso sistêmico, carcinoma de célula escamosa esofágica, dor neuropática, e obesidade.

[000282] Em outro aspecto, os compostos são úteis para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatoide, osteoartrite, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, esclerose múltipla, doenças autoimunes, doenças inflamatórias da pele.

[000283] Em outro aspecto, os compostos são usados para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatoide, osteoartrite, aterosclerose, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, e esclerose múltipla.

[000284] Em outro aspecto, exemplos descritos aqui podem ser úteis para o tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo, porém não limitados aos seguintes:

[000285] carcinoma incluindo aquele da bexiga (incluindo câncer de bexiga acelerado e metastático), mama, cólon (incluindo câncer colorretal), rim, fígado, pulmão (incluindo câncer de pulmão de célula pequena e não pequena e adenocarcinoma de pulmão), ovário, próstata, testículos, trato genitourinário, sistema linfático, reto, laringe, pâncreas (incluindo carcinoma pancreático exócrino), esôfago, estômago, vesícula biliar, cérvice, tireoide, e pele (incluindo carcinoma de célula escamosa);

[000286] tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, Linfoma de célula T, Linfoma de Hodgkin, Linfoma de não-Hodgkin, linfoma de célula pilosa, linfoma histiocítico, e Linfoma de Burketts;

[000287] tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide incluindo leucemias mielogenosas agudas e crônicas, síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide, e leucemia promielocítica;

[000288] tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schuanomas;

[000289] tumores de origem mesenquimatosa incluindo fibrossarcoma, rhabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e

[000290] outros tumores incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso, ceratoactantoma, seminoma, câncer de tireoide follicular, e teratocarcinoma.

[000291] Em outra modalidade, são descritos aqui métodos de tratamento de câncer, em que o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer de fígado, câncer da próstata, e melanoma. Adicionalmente, compostos descritos aqui podem ser úteis no tratamento de câncer de ovário, e mieloma múltiplo.

[000292] A presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma variedade de doenças proliferativas não cancerosas.

[000293] Terapia combinada para prevenir e tratar distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorregulatórias, incluindo asma e doenças alérgicas, bem como patologias autoimunes tais como artrite reumatoide e aterosclerose, e aquelas patologias mencionadas acima é ilustrada pela combinação dos compostos desta invenção e outros compostos que são conhecidos para tais utilidades. Por exemplo, no tratamento ou prevenção de inflamação, os presentes compostos podem ser usados em conjunção com um agente anti-inflamatório ou analgésico tal como um agonista de opiato, um inibidor de lipoxigenase, um inibidor de ciclooxigenase-2, um inibidor de interleucina, tal como um inibidor de interleucina-1, um inibidor de fator de necrose de tumor, um antagonista de NMDA, um inhibitor ou óxido nítrico ou um inibidor da síntese de óxido nítrico, um agente anti-inflamatório não esteroidal, um inibidor de fosfodiesterase, ou um agente anti-inflamatório supressor de citocina, por exemplo com um composto tal como acetaminofeno, aspirina, codeína, fentanil, ibuprofeno, indometacina, cetorolac, morfina, naproxeno, fenacetina, piroxicam, um analgésico esteroidal, sufentanila, sunlindac, interferon alfa e similares. Similarmente, os presentes compostos podem ser administrados com um aliviador da dor; um potenciador tal como cafeína, um antagonista de H2, simeticona, hidróxido de alumínio ou magnésio; um descongestionante tal como fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudofedrina, oximetazolina, efineprina, nafazolina, xilometazolina, propilhexedrina, ou levodesóxi- efedrina; e antitussivos tais como codeína, hidrocodona, caramifeno, carbetapentano, ou dextrametorfano; um diurético; e uma anti-histamina sedativa ou não sedativa. Igualmente, os compostos descritos aqui podem ser usados em combinação com outros fármacos que são usados no tratamento/prevenção/supressão ou melhora das doenças ou condições para as quais os compostos da presente invenção são úteis. Tais outros fármacos podem ser administrados, por uma rotina e em uma quantidade comumente usada. Portanto, contemporaneamente ou sequencialmente com um composto da presente invenção. Quando um composto é usado contemporaneamente com um ou mais outros fármacos, uma composição farmacêutica contendo tais outros fármacos além do composto da presente invenção pode ser usada. Consequentemente, as composições farmacêuticas incluem aquelas que também contêm um ou mais outros ingredientes ativos, em adição a um composto da presente invenção.

[000294] Exemplos de outros ingredientes ativos que podem ser combinados com um composto da presente invenção, ou administrados separadamente ou nas mesmas composições farmacêuticas, incluem, porém não estão limitadas a: (a) antagonistas integrina tais como aquelas para selectinas, ICAMs e VLA-4; (b) esteroides tais como beclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona, e hidrocortisona; (c) imunossupressores tais como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina e outros imunossupressores do tipo FK-506; (d) anti-histaminas (antagonistas de histamina-H1) tais como bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, triprolidina, clemastina, difenidramina, difenilpiralina, tripelenamina, hidroxizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, ciproeptadina, antazolina, pirilamina de feniramina, astemizol, terfenadina, loratadina, cetirizina, fexofenadina, descarboetoxiloratadina, e similares; (e) anti- asmáticos não esteroidais tais como agonistas b2 (terbutalina, metaproterenol, fenoterol, isoetarina, albuteral, bitolterol, e pirbuterol), teofilina, sódio de comolina, atropina, brometo de ipratrópio, antagonistas de leucotrieno (zafirlucaste, montelucaste, pranlucaste, iralucaste, pobilucaste, SKB-102,203), inibidores de biossíntese de leucotrieno (zileuton, BAY-1005); (f) agentes anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) tais como derivados de ácido propiônico (alminoprofeno, benxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofênico, e tioxaprofeno), derivados de ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanac, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazac, furofenaco, ibufenaco, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinaco, tolmetina, zidometacina, e zomepirac), derivados de ácido fenâmico (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcarboxílico (diflunisal e flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxican), salicilatos (ácido acetil salicílico, sulfasalazina) e as pirazolonas (apazona, bezpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona); (g) inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2); (h) inibidores de fosfodiesterase tipo IV (PDE-IV); (i) outros antagonistas dos receptores de quimiocina; (j) agentes de redução do colesterol tais como inibidores de HMG-CoA redutase (lovastatina, sinvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, e outras estatinas), sequestrantes (colestiramina e colestipol), ácido nicotônico, derivados de ácido fenofíbrico (gemfibrozil, clofibrat, fenofibrato e benzafibrato), e probucol; (k) agentes anti-diabéticos tais como insulina, sulfonilureias, biguanidas (metformina), inibidores de a-glucosidase (acarbose) e glitazonas (troglitazona e pioglitazona); (l) preparações de interferons (interferon alfa-2a, interferon-2B, interferon alfa-N3, interferon beta-1a, interferon beta-1b, interferon gama-1b); (m) compostos antivirais tais como efavirenz, nevirapina, indinavir, ganciclovir, lamivudina, famciclovir, e zalcitabina; (o) outro composto tal como ácido 5- aminossalicílico e profármacos do mesmo, antimetabólitos tais como azatioprina e 6-mercaptopurina, e agentes quimioterapêuticos de câncer citotóxico. A relação de peso do composto da presente invenção para o segundo ingrediente ativo pode ser variada e dependerá das doses efetivas de cada ingrediente.

[000295] Geralmente, uma dose efetiva de cada será usada. Desse modo, por exemplo, quando um composto é combinado com um NSAID a relação de peso do composto da presente invenção para o NSAID geralmente variará de cerca de 1000:1 a cerca de 1:1000, ou alternativamente de cerca de 200:1 a cerca de 1:200. Combinações de um composto da presente invenção e outros ingredientes ativos geralmente também estarão dentro da faixa anteriormente mencionada, porém em cada caso, uma dose efetiva de cada ingrediente ativo deve ser usada.

[000296] Em tratamento de câncer, uma combinação de agentes quimioterapêuticos e/ou outros tratamentos (por exemplo, terapia de radiação) é frequentemente vantajosa. O segundo (ou terceiro) agente pode ter o mesmo ou diferente mecanismo de ação daquele do primeiro agente terapêutico. Pode ser especialmente útil empregar combinações de fármaco citotóxicas, em que os dois ou mais fármacos que estão sendo administrados agem de diferentes maneiras ou de diferentes fases do ciclo celular, e/ou onde os dois ou mais fármacos têm toxicidades ou efeitos colaterais coincidentes, e/ou onde cada um dos fármacos que estão sendo combinados tem uma eficácia demonstrada no tratamento do estado de doença particular manifestada pelo paciente.

[000297] Consequentemente, compostos descritos aqui (ou outras fórmulas descritas aqui) podem ser administrados em combinação com outros agentes anti-câncer e citotóxicos e tratamentos úteis no tratamento de câncer ou outras doenças proliferativas. A invenção aqui também compreende o uso dos compostos aqui (ou outras fórmulas descritas aqui), na preparação de medicamentos para o tratamento de câncer, e/ou compreende o empacotamento dos compostos inclusos juntamente com instruções de que os compostos sejam usados em combinação com outros agentes anticâncer ou citotóxicos e tretamentos para o tratamento de câncer. A presente invenção também compreende combinações dos compostos de um ou mais agentes adicionais em forma de kit, por exemplo, onde eles são empacotados juntos ou colocados em pacotes separados para serem vendidos juntos como um kit, ou onde eles são empacotados para serem formulados juntos.

[000298] O segundo (ou mais) agentes anticâncer podem ser selecionados de qualquer um ou mais dos seguintes:

[000299] agentes de alquilação (incluindo mostardas de nitrogênio, sulfonatos de alquila, nitrosoureias, derivados de etilenimina, e triazenos); antiangiogênicos (incluindo inibidores de metaloproteinase matriz); antimetabólitos (incluindo inibidores de adenosina desaminase, antagonistas de ácido fólico, análogos de purina, e análogos de pirimidina); antibióticos ou anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos de CTLA-4, antraciclinas); inibidores de aromatase;

[000300] modificadores de resposta do ciclo celular; enzimas; inibidores de farnesil-proteína transferase;

[000301] agentes hormonais e antihormonais e esteroides (incluindo análogos sintéticos, glicocorticoides, estrogênios/anti-estrogênios [por exemplo, SERMs], androgênios/anti-androgênios, progestinas, agonistas de receptor de progesterona, e agonistas e antagonistas de liberação de hormônio de luteinização [LHRH]); fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)/moduladores de sistema receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR) (incluindo inibidores de IGFR1); inibidores de sinalização de integrina; inibidores de cinase (incluindo inibidores de multi-cinase e/ou inibidores de Src kinase ou Src/abl, inibidores de cinase dependente de ciclina [CDK], anticorpos panHer, Her-1 e Her-2, inibidores de VEGF, incluindo anticorpos anti- VEGF, inibidores de EGFR, inibidores de proteína ativada por mitógeno [MAP], inibidores de MEK, inibidores de Aurora cinase, inibidores de PDGF, e outros inibidores de tirosina cinase ou inibidores de serina/treonina cinase;

[000302] agentes rompedores de microtúbulo, tais como ecteinascidinas ou seus análogos e derivados; agentes de estabilização de microtúbulo tais como taxanos, e as epotilonas de ocorrência natural e seus análogos sintéticos e semissintéticos;

[000303] agentes desestabilizantes, de ligação de microtúbulo (incluindo alcaloides vinca); e

[000304] inibidores de topoisomerase; inibidores de prenil-proteína transferase; complexos de coordenação de platina; inibidores de transdução de sinal; e outros agentes usados como agentes anticâncer e citotóxicos, tais como modificadores de resposta biológica, fatores de crescimento, e moduladores imunes.

[000305] Adicionalmente, os compostos da presente invenção podem ser formulados ou co-administrados com outros agentes terapêuticos que são selecionados quanto a sua utilidade particular em controle dos efeitos colaterais associados com as condições anteriormente mencionadas. Por exemplo, compostos da invenção podem ser formulados com agentes para prevenir náusea, hipersensibilidade e irritação gástrica, tais como antieméticos, anti-histamínicos H1 e H2.

[000306] Os outros agentes terapêuticos acima, quando empregados em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser usados, por exemplo, naquelas quantidades indicadas na Physicians’ Desk Reference (PDR) ou como de outro modo determinado por alguém versado na técnica.

[000307] Os compostos são administrados a um mamífero em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entende-se uma quantidade de um composto da presente invenção que, quando administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional a um mamífero, é eficaz para prevenir ou melhorar a condição de doença ou a progressão da doença.

DOSAGEM E FORMULAÇÃO

[000308] Os compostos desta invenção podem ser administrados em tais formas de dosagem oral como comprimidos, cápsulas (cada das quais inclui formulações de liberação sustentada ou formulações de liberação cronometrada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões. Eles podem também ser administrados em forma intravenosa (bolo ou infusão), intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular, todos usando formas de dosagem bem conhecidass por aqueles versados nas técnicas farmacêuticas. Eles podem ser administrados sozinhos, porém geralmente serão administrados com um veículo farmacêutico selecionado com base na rotina de administração escolhida e prática farmacêutica padrão.

[000309] O regime de dosagem para os compostos da presente invenção, de fato, variarão dependendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e rotina de administração; a espécie, idade, sexo, saúde, condição médica, e peso do receptor; a natureza e extensão dos sintomas; o tipo de tratamento coincidente; a frequência de tratamento; a rotina de administração, a função renal e hepática do paciente, e o efeito desejado. Um médico ou veterinário pode determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerida para tratar, neutralizar, ou interromper o progresso do distúrbio.

[000310] A título de orientação geral, a dosagem oral diária de cada ingrediente ativo, quando usado para os efeitos indicados, variará entre cerca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, ou entre cerca de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou alternativamente, entre cerca de 1,0 a 20 mg/kg/dia. Intravenosamente, as doses variarão de cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg/minute durante uma infusão de taxa constante. Compostos desta invenção podem ser administrados em uma dose única diária, ou a dosagem diária total pode ser administrada em doses divididas de duas, três, ou quatro vezes ao dia. Em uma modalidade, a dosagem oral diária do ingrediente ativo é entre 3 e 600 mg ou administrado uma vez ao dia ou em doses divididas administradas duas vezes ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado em doses de 10 a 20 mg administradas duas vezes ao dia ou 40 a 100 mg administrados uma vez ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado em dose de 12,5 mg duas vezes ao dia ou 75 mg uma vez ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado em doses de 3, 10, 30, 100, 300, e 600 mg, administrados ou uma vez ou duas vezes ao dia.

[000311] Compostos desta invenção podem ser administrados em forma intranasal por meio de uso tópico de veículos intranasais adequados, ou por meio de rotinas transdérmicas, usando emplastros de pele transdérmicos. Quando administrados na forma de um sistema de liberação transdérmica, a administração de dosagem, de fato, será contínua em vez de intermitente em todo o regime de dosagem.

[000312] Os compostos são tipicamente administrados em mistura com diluentes, excipientes, ou veículos farmacêuticos adequados (coletivamente referidos aqui como veículos farmacêuticos) adequadamente selecionados com respeito à forma pretendida de administração, isto é, comprimidos orais, cápsulas, elixíres, xaropes e similares, e consistente com práticas farmacêuticas convencionais.

[000313] Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimido ou cápsula, o componente de fármaco ativo pode ser combinado com um veículo oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte tal como lactose, amido, sacarose, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e similares; para administração oral em forma líquida, os componentes de fármaco oral podem ser combinados com qualquer veículo inerte, farmaceuticamente aceitável, não tóxico, oral tal como etanol, glicerol, água, e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, aglutinantes adequados, lubrificantes, agentes desintegrantes, e agentes colorantes podem também ser incorporados na mistura. Aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glucose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanto, ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno glicol, ceras, e similares. Lubricantes usados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, e similares. Disintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, ágar, bentonita, goma xantana, e similares.

[000314] Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de liberação de lipossoma, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes, e vesículas multilamelares. Lipossomas podem ser formadas de uma variedade de fosfolipídeos, tais como colesterol, estearilamina, ou fosfatidilcolinas.

[000315] Compostos da presente invenção podem também ser acoplados com polímeros solúveis como veículos de fármaco alvejáveis. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol, ou polietilenoóxido-polilisina substituído por resíduos de palmitoíla. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis na obtenção de liberação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido polilático, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido polilático e poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido poli-hidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidi-hidropiranos, policianoacrilatos, e copolímeros de bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogeis.

[000316] Formas de dosagem (composições farmacêuticas) adequadas para a administração podem conter de cerca de 1 miligrama a cerca de 100 miligrams de ingrediente ativo por unidade de dosagem. Nestas composições farmacêuticas o ingrediente ativo ordinariamente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 95% em peso com base no peso total da composição.

[000317] Cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente atiivo e veículos em pó, tais como lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, e similares. Diluentes similares podem ser usados para preparer comprimidos prensados. Tanto comprimidos quanto cápsulas podem ser fabricados como produtos de liberação sustentada para prover liberação contínua de medicação durante um período de horas. Comprimidos prensados podem ser revestidos com açúcar ou revestidos com película para mascarar qualuer gosto desagradável e proteger o comprimido da atmosfera, ou revestido por entérico para desintegração seletiva no trato gastrointestinal.

[000318] Formas de dosagem líquidas para administração oral podem conter colorantes e aromatizantes para aumentar a aceitação do paciente.

[000319] Em geral, água, um óleo adequado, salina, dextrose aquosa (glicose), e soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são veículos adequados para soluções parenterais. Soluções para administração parenteral podem conter um sal solúvel em água do ingrediente ativo, agentes estabilizantes adequados, e se necessário, substâncias tampão. Agentes antioxidants tais como bissulfito de sódio, sulfito de sódio, ou ácido ascórbico, ou sozinhos ou combinados, são agentes estabilizantes adequados. São também usados o ácido cítrico e seus sais e EDTA de sódio. Além disso, soluções parenterais podem conter preservativos, tais como cloreto de benzalcônio, metil- ou propil- parabeno, e clorobutanol.

[000320] Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, um texto referência padrão neste campo.

[000321] Formas de dosagem farmacêutica úteis representativas para administração dos compostos desta invenção podem ser ilustradas como segue: Cápsulas

[000322] Um grande número de cápsulas unitárias pode ser preparado enchendo cápsulas de gelatina dura de duas partes padrões, cada uma com 100 miligramas de ingrediente ativo em pó, 150 miligramas de lactose, 50 miligramas de celulose, e 6 miligramas de estearato de magnésio.

Cápsulas de Gelatina Macia

[000323] Uma mistura de ingrediente ativo em um oleo digerível tal como oleo de soja, óleo de semente de algodão ou óleo de oliva pode ser preparada e injetada por meio de uma bomba de remoção positiva dentro da gelatina para formar cápsulas de gelatina macia contendo 100 miligramas do ingrediente ativo. As cápsulas devem ser lavadas e secadas.

Comprimidos

[000324] Os comprimidos podem ser preparados por procedimentos convencionais, de modo que a unidade de dosagem é de 100 miligramas de ingrediente ativo, 0,2 miligramas de dióxido de silício coloidal, 5 miligramas de estearato de magnésio, 275 miligramas de celulose microcristalina, 11 miligramas de amido e 98,8 miligramas de lactose. Revestimentos apropriados podem ser aplicados para aumentar a palatabilidade ou retardar a absorção.

Injetável

[000325] Uma composição parenteral adequada para administração por injeção pode ser preparada por agitação de 1,5% em peso de ingrediente ativo em 10% em volume de propileno glicol e água. A solução deve ser tornado isotônica com cloreto de sódio e esterilizada.

Suspensão

[000326] Uma suspensão aquosa pode ser preparada para administração oral de modo que cada 5 mL contenha 100 mg de ingrediente ativo finamente dividido, 200 mg de carboximetil celulose de sódio, 5 mg de benzoato de sódio, 1,0 g de solução de sorbitol, U.S.P., e 0,025 mL de vanilina.

[000327] Onde os compostos desta invenção são combinados com outros agentes anticoagulantes, por exemplo, uma dosagem diária pode ser em torno de 0,1 a 100 miligramas do composto de fórmula I e cerca de 1 a 7,5 miligramas do segundo anticoagulante, por quilograma de peso corporal do paciente. Para uma forma de dosagem de comprimido, os compostos desta invenção geralmente podem estar presente em uma quantidade de cerca de 5 a 10 miligramas por unidade de dosagem, e o segundo anticoagulante em uma quantidade de cerca de 1 a 5 miligramas por unidade de dosagem.

[000328] Onde dois ou mais dos anteriores segundos agentes terapêuticos são administrados com o composto dos exemplos, geralmente a quantidade de cada componente em uma dosagem diária típica e forma de dosagem típica pode ser reduzida com relação à dosagem usual do agente quando administrado sozinho, em vista do efeito aditivo ou sinérgico dos agentes terapêuticos quando administrados em combinação.

[000329] Particularmente quando fornecidos como uma unidade de dosagem única, existe o potencial para uma interação química entre os ingredientes ativos combinados. Por esta razão, quando o composto dos exemplos e um segundo agente terapêutico são combinados em uma única unidade de dosagem, eles são formulados de modo que, embora os ingredientes ativos sejam combinados em uma única unidade de dosagem, o contato físico entre os ingredientes ativos é minimizado (isto é, reduzido). Por exemplo, um ingrediente ativo pode ser revestido por entérico. Por revestimento entérico de um dos ingredientes ativos, é possível não apenas minimizar o contato entre os ingredientes ativos combinados, porém também é possível controlar a liberação de um destes componentes no trato gastrointestinal, de modo que um destes componentes não seja liberado no estômago, porém de preferência seja liberado nos intestinos. Um dos ingredientes ativos pode também ser revestido com um material que realize uma liberação sustentada em todo o trato gastrointestinal e também funciona para minimizar o contato físico entre os ingredientes ativos combinados. Além disso, o componente de liberação sustentada pode ser adicionalmente revestido por entérico, de modo que a liberação deste componente ocorra apenas no intestino. Ainda outro método envolveria a formulação de um produto de combinação em que um componente é revestido com um polímero de liberação sustentada e/ou entérica, e o outro componente é também revestido com um polímero tal como um grau de baixa viscosidade de hidroxipropil metilcelulose (HPMC) ou outros materiais apropriados como conhecido na técnica, a fim de também separar os componentes ativos. O revestimento de polímero serve para formar uma barreira adicional para interação com o outro componente.

[000330] Estes, bem como outros meios de minimizar o contato entre os components de produtos de combinação da presente invenção, se administrados em uma única forma de dosage ou administrados em formas separadas, porém ao mesmo tempo da mesma maneira, será facilmente evidente para aqueles versados na técnica, assim que armados com a presente invenção.

[000331] Adicionalmente, certos compostos descritos aqui podem ser úteis como metabólitos de outros compostos. Portanto, em uma modalidade, compostos podem ser úteis ou como um composto substancialmente puro, que pode também então ser incorporado em uma composição farmacêutica, ou podem ser úteis como metabólito, que é gerado após a administração do profármaco daquele composto. Em uma modalidade, um composto pode ser útil como um metabólito sendo útil para o tratamento de distúrbios como aqui descrito.

[000332] "Substancialmente puro" como usado aqui destina-se a incluir um composto tendo uma pureza maior do que cerca de 90 % em peso, incluindo cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, e 100 por cento.

[000333] Como um exemplo, um composto descrito aqui pode ser substancialmente puro, pelo fato de ter uma pureza maior do que cerca de 90 por cento (em peso), onde os restantes menos do que cerca de 10 por cento de material compreende outro metabólito do composto, um profármaco do composto, e/ou reação e/ou processando impurezas que surgem de sua preparação.

[000334] Obviamente, numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis levando em consideração os ensinamentos acima. Deve, portanto, ser entendido que dentro do escopo das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de modo diferente do especificamente descrito aqui.

Claims (12)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:

N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5- a][1,3,5]triazin-4-ilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é uma forma cristalina do dito composto base livre.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a forma cristalina compreende a Forma N-1, em que a Forma N-1 é definida por parâmetros celulares unitários substancialmente iguais aos seguintes: Dimensões celulares: a = 7,3085(6) b= 16,257(1) c = 22,688(2) α° = 90 β° = 90 Y° = 90 Grupo de espaço P212121 Moléculas/célula unitária (Z): 1 Densidade, calculada g-cm-3: 1,194 em que o referido cristal está em uma temperatura de cerca de -70 °C.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita Forma N-1 está em uma forma substancialmente pura.

5. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é definido por um termograma de calorimetria de varredura diferencial substancialmente conforme mostrado na figura 2, tendo uma transição endotérmica acima de 205°C.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, opcionalmente ainda compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos um agente terapêutico adicional.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser usado no tratamento de um distúrbio selecionado a partir de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose por transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite de soro nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatoide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, câncer, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso..

10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimune, metabólica, câncer e doenças cardiovasculares.

11. Processo para a preparação de N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-3-(7-terc-butilpirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-ilamino)- 2-oxopirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, caracterizado pelo fato de que é efetuado conforme o seguinte esquema:

12. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um distúrbio selecionado a partir de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças autoimunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose por transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite de soro nefrotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatoide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, câncer, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, e hiperplasia neoíntima de desvio arteriovenoso.

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