BR112012002707A2 - método para a fabricação de produtos de dissociação de carboidrato a partir de um material lignocelulósico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE PRODUTOS, DE DISSOCIAÇÃO DE CARBOIDRATO A PARTIR DE UM MATERIAL, LIGNOCELULÓSICO. A presente invenção refere-se a um método para fabricação de produtos de dissociação de carboidrato, caracterizado pela combinação das medidas nas quais o material lignocelulósico é tratado com uma solução : aquosa que contém álcool, particularmente C14-álcool ou um fenol, e que apresenta um pH entre 11,0 e 14,0, é tratado a fim de dissociar Iignocelulose e remover produtos de dissociação a partir do material, sendo obtido um material enriquecido com celulose e hemiceluse, e o material obtido enriquecido com celulose e hemicelulose é tratado com pelo menos uma enzima dissociadora de carboidrato a fim de obter os produtos de dissociação de carboidrato.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE PRODUTOS DE DISSOCIAÇÃO DE CARBOI!- . DRATOAPARTIRDE UM MATERIAL LIGNOCELULÓSICO". A presente invenção refere-se a um método para a fabricação de ' & produtos de dissociação de hidrato de carbono, especialmente açúcares, tais como pentoses e hexoses, a partir de um material lignocelulósico. A inven- * ção refere-se ainda a um método para obtenção de álcool a partir dos açúca- res. Para fins da presente descrição e reivindicações, o termo "açúcar" deve : compreender também "oligômeros de açúcar", Em vista da escassez de petróleo bruto e da discussão acerca de cereais como fornecedores de energia, a matéria prima renovável (palha, madeira, aparas de papel, etc) adquiriu grande importância como material de partida para combustível ou produtos químicos. A conversão da lignocelulo- se pode ser feita por duas vias fundamentalmente diferentes: 1) da "plataforma termoquímica", na qual a lignocelulose é gasei- ficada e os gases de síntese são sintetizados formando produtos desejados, ê 2) a "Sugar Platform", na qual o interesse principal reside na ex- ploração do açúcar ligado nos polímeros celulose e hemicelulose, enquanto aligninaé utilizada ainda predominantemente de forma energética. A pre- sente invenção destina-se à segunda via.

Diferentemente do amido, os açúcares da lignocelulose estão presentes em estruturas estreitamente reticuladas, poliméricas, cristalinas da celulose e hemicelulose, que são envolvidas por um revestimento de lignina, resultando, assim, um complexo extremamente denso. A via mais próxima para obter açúcar a partir de lignocelulose, seria a utilização direta de celula- ses e hemicelulases. Isso, porém, é dificultado na matéria prima palha ou madeira pela densidade do complexo acima referido. Através de seu peso molecular elevado as enzimas não podem penetrar pelos poros estreitos na lignocelulose. Isso significa que é necessária uma primeira etapa, que au- mente a porosidade da lignocelulose e assim possibilite a sacarificação en- zimática posterior.

Esta primeira etapa é chamada de "Pretreatment (tratamento preliminar, esclarecimento). Ela é em geral muito dispendiosa, de forma que, . porexemplo, na fabricação de "second generation biofuels" até 1/3 dos cus- tos de produção precisam ser empregados o que interfere negativamente na & rentabilidade. Os métodos aplicados pretendem ou liquefazer primeiramente as hemiceluloses (por exemplo, steam explosion-, dilute acidpretrteatment) * ou obter o aumento da porosidade pela liquefação de lignina (por exemplo lime-, ammonia-pretreatment). : O substrato de lignocelulose divulgado pode ser tratado posteri- ormente para a obtenção de açúcares ou de seus oligômeros enzimatica- mente tratados posteriormente, sendo que o tipo do tratamento preliminar pode ter forte influência sobre a atividade enzimática e o rendimento. No ca- so de temperaturas de reação elevadas formam-se produtos de decomposi- ção bem mais tóxicos (por exemplo, furfural), que no caso de uma fermenta- çãode etanol imediatamente em seguida, podem impedir leveduras; vide por exemplo Chandra et al, Advances em Biochemical Enginee- ring/Biotechnology, 108:67, 2007; Mansfield et a/., Biotechnol. Prog. 15:804,

1999. Esses métodos apresentam a desvantagem grave de eles serem dispendiosos em termos de energia e transcorreram, sobretudo, sob tempe- raturas pouco abaixo de 200ºC.

Uma melhoria tecnológica nessa área, por exemplo, através do desenvolvimento de métodos a baixas temperaturas (ou seja, a uma tempe- ratura inferior a 100ºC), significaria um avanço decisivo para qualquer utili- zação material da matéria prima lignocelulose. Esta é a tarefa da presente invenção.

É conhecido a partir do documento EP 1 025 305 B1 um método químico para a despolimerização de lignina (sistema Cu). Ele refere-se à ação catalítica de cobre complexado em conexão com peróxido de hidrogê- nioou hidroperóxidos orgânicos e pode dissociar lignina oxidativamente sob temperaturas abaixo de 100ºC. Os complexantes neste caso utilizados são derivados de piridina, Com base em modelos de lignina sintética, pode-se comprovar que utilizando-se H;yO> como agente de oxidação é feita uma dis- sociação de ligações éter da molécula de lignina, em que o polímero de lig- . ninase decompõe formando subunidades oligoméricas.

Quando da utiliza- - ção do sistema Cu com um excesso de hidroperóxidos orgânicos é possível B 5 deslignificar madeira.

O sistema a base de HO, parece ser melhor tecnica- mente conversível, foi testado como aditivo de branqueamento no branque- * amento de peróxido de pasta Kraft e produziu uma taxa de deslignificação melhorada e grau de brancura maior. ' Além disso, é conhecido a partir de "Oxidation of wood and its componentes in water-organic media", Chupka et al., Proceedings: Seventh International symposium on wood and pulping chemistry, Vol. 3, 373-382, Beijing P.R.China, 25-28.Mai 1993, que a eficiência de uma catálise alcalina da oxidação de madeira e lignina aumenta consideravelmente, se for adicio- nado ao agente de reação um solvente orgânico, por exemplo, DMSO, acetona, etanol.

Além disso, os autores indicam que com valores de pH acima de 11 ocorre uma nítida elevação da oxidação da madeira e da lignina.

É conhecido a partir do documento WO 01/059204 um método para a fabricação de pasta química, no qual o material de partida é submeti- doaum tratamento preliminar, sendo que o material é tratado com uma so- lução-tampão e um catalisador de deslignificação (material de transição). À deslignificação é realizada na presença de oxigênio, peróxido de hidrogênio ou ozônio.

Em contrapartida, o método, de acordo com à invenção, para a fabricação de açúcares é caracterizado pela combinação das medidas, em que - o material lignocelulósico é tratado com uma solução aquosa, que contém um álcool, especialmente um C14 álcool ou um fenol, e apresen- ta um valor de pH entre 11,0 e 14,0, para dissociar lignocelulose e separa produtos de dissociação do material, sendo obtido um material enriquecido com celulose e hemicelulose. - o material obtido, enriquecido com celulose e hemicelulose é tratado com pelo menos uma enzima de carboidrato para obter os produtos de dissociação de carboidrato. 2 Como álcool são indicados alcoóis alifáticos ou cicloalifáticos, mono- ou polivalentes ou fenóis, por exemplo, C1.6-alcoóis, especialmente um Ci,Áálcool, como metanol, etanol, propanol e butanol, inclusive seus isômeros; glicóis (etanodióis, propanodióis, butanodióis, pentanodióis, hexa- * nodióis), glicerina, propenol, butenol, ciclopentanol, ciclohexanol, álcool ben- Zílico ou fenóis, tais como fenóis, cresóis, catecóis, naftóis, mas também a- ' minoalcoóis, tais como etanolamina, metanolamina e hexanolamina. É prefe- rido um Ci4álcool. Para os fins do presente pedido de patente, são incluí- dos fenóis no conceito genérico "álcool".

A solução alcoólica do extrato de lignina oferece, além disso, opções vantajosas no processamento posterior dos produtos de dissociação de lignina, ou de xilano.

O álcool está presente em uma solução aquosa no método, de acordo com a invenção, preferivelmente em uma faixa de 10 a 70% em vo- lume, por exemplo, 50% em volume, preferivelmente de 30 a 40% em volu- me.

No processo de acordo com a invenção, o material lignocelulósi- co está presente preferivelmente em uma densidade aparente de 3-40% em peso, tal como 5-40% em peso, especialmente, 5-20% em peso.

Preferivelmente, a lignocelulose é dissociada a uma temperatura inferior a 100ºC, tal como inferior a 60ºC, por exemplo.

O valor de pH pode ser ajustado com uma base, preferivelmente uma base inorgânica, por exemplo, uma solução de de soda cáustica.

A presente invenção refere-se ao conhecimento de que um ma- terial lignocelulósico tratado com uma solução aquosa, básica, que contém um álcool, especialmente um C14-álcool ou um fenol, e que apresenta um valor de pH entre 11,0 e 14,0, pode ser processado enzimaticamente em rendimentos mais elevados formando produtos de dissociação de carboidra- to, como um material deslignifizado em um outro tipo, especialmente sem a adição de álcool.

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Como produtos de dissociação de carboidrato podem ser forma- dos pentoses e hexoses.

Açúcares preferidos incluem xilose e glicose. , Uma concretização preferida do processo de acordo com a in- venção é caracterizado pelo fato de o material enriquecido com celulose e hemicelulose ser tratado com uma xilanase e uma celulase a fim de obter os açúcares. ' Como material lignocelulósico é utilizado preferivelmente palha, bagaços, ervas energéticas ou glumas, especialmente preferivelmente palha ' ou bagaço, como por exemplo, palha.

A palha apresenta uma superfície for- temente hidrófoba, de forma que a molhagem com soluções aquosas repre- senta um problema.

Verificou-se que é possível através do uso de álcool trazer a solução de reação nos poros do substrato e substituir o ar presente por solução de reação.

Além disso, verificou-se que o álcool acelera a extra- ção dos produtos de dissociação provenientes de palha, contribuindo para manter os produtos de dissociação de lignina em solução, Além disso, verifi- cou-se ainda que, em contrapartida, o álcool reduz a solubilidade da hemice- lulose e de seus produtos de dissociação, e, portanto, a hemicelulose é man- tida no substrato.

Através da prensagem da fase líquida do substrato, após o processo de desintegração, a concentração de substrato é aumentada, de forma que são necessárias quantidades menores de enzima para a hidrólise enzimática, ou para outros processamentos posteriores enzimáti- cas.

Na produção de álcool, os custos de enzima são um fator de despesas decisivo.

O álcool faz com que a solubilidade das hemiceluloses liberadas eventualmente na faixa alcalina durante a reação adicionalmente em relação à lignina e seus produtos de dissociação é fortemente reduzida, e estas permanecem ligadas ao substrato.

As vantagens para o processo são a elevada seletividade da decomposição de lignina, para o caso de uma separação da solução de extração da matéria sólida, uma concentração mui- to pequena de hemicelulose e seus produtos de dissociação na solução de extração, depois, a hemicelulose permanece na porção de matéria sólida e,

desse modo, para a hidrólise enzimática e obtenção de açúcar. A solução alcoólica do extrato de lignina oferece, ainda, melho- . res possibilidades no processamento posterior da lignina e na fabricação de produtos feitos de lignina. Verificou-se, ainda, que através do uso de álcool, especialmente de um C1-4-álcool ou de um fenol, durante a desagregação alcalina abaixo 7 de 100ºC, a decomposíição das hemiceluloses é amplamente impedida, de forma que aproximadamente toda a hemicelulose fica disponível para a dis- : sociação enzimática posterior e conversão da xilose em produtos superiores enãoé decomposta, a exemplo de outros métodos, parcialmente durante a desintegração, e precipita como mistura de lignina/açúcar.

Através da deslignificação realização na desintegração, a poro- sidade das paredes celulares do material lignocelulósico é aumentada, por exemplo, no caso de palha, ela aumenta de forma que aproximadamente toda a xilose torne-se acessível para a xilanase e, aproximadamente, 100% do xilano é hidrolisado e pode ser obtida xilose. Isso torna o método, de a- cordo com a presente invenção, especialmente adequado para fabricar em conexão com uma conversão enzimática da xilose produtos superiores. A conversão enzimática, neste caso, pode ser feita ou diretamente na mistu- raapartirda solução de xilose e matéria sólida, ou com a solução de xilose separada da matéria sólida.

No caso de uma produção posterior de álcool subsequente após hidrólise enzimática e da conversão de acordo com a invenção da xilose formando xilitol, a partir da matéria sólida remanescente, os custos de enzi- ma são um fator decisivo para despesas. Esses custos resultam em parte também de ligações inespecíficas de enzimas à lignina, vide, por exemplo, B. Chandra et al., 2007, ibidem. A remoção parcial da lignina reduz essa perda de atividade e é favorável em termos de custos.

As vantagens para um processo enzimático subsequente são, porexemplo, que, a partir da elevada seletividade da decomposição de ligni- na em caso de uma obtenção quase que completa dos polímeros de açúcar, tem-se uma concentração muito pequena de hemicelulose e seus produtos de dissociação na solução de extração, a hemicelulose permanece na por- ção de matéria sólida e desse modo para a hidrólise enzimática e obtenção , — de açúcarassim como para sua posterior conversão. Disso resulta, de acor- do com a invenção, uma taxa de aproveitamento de substância máxima e, por exemplo, em conexão com a aplicação de xilose desidrogenase, alta rentabilidade do processo descrito. " A realização de um processo de conversão de xilose em xilitol pode ocorre após a liberação enzimática da xilose diretamente na matéria só- lida/mistura de líquido, que é obtida de acordo com o método de acordo com a invenção, o que aumenta, além disso, a rentabilidade do processo todo.

No caso da conversão em xilitol, o álcool remanescente no subs- trato após a prensagem da matéria sólida pode ser utilizado a partir do pro- cesso de desagregação diretamente como substrato para a álcool desidrogenase para fins de regeneração de NAD em NADH. Se o processo fordimensionado de tal forma que para tanto o álcool remanescente na mis- tura de reação for consumido a partir da desagregação (parcialmente), será desnecessária uma remoção de álcool da solução de produto (parcialmente) e a eficiência de todo o processo será assim ainda mais elevada.

No caso da conversão dos produtos de dissociação de lignina, o álcool atua como varredor de radical e solvente para produtos de dissocia- ção a partir de uma despolimerização química ou biomimética, enzimática dos produtos de dissociação de lignina de elevado peso molecular para bai- xo peso molecular.

A porcentagem pequena de hemicelulose e seus produtos de dissociação no extrato e a elevada solubilidade da lignina, aumentam as ta- xas de débito no caso de uma separação da matéria sólida dos produtos de conversão, assim como seu processamento por filtração.

O processo, de acordo com a invenção permite, por exemplo, a separação dos três componentes principais da palha, a saber, da glicose, da xilose assim como da lignina em fluxos de material pobre em substâncias interferentes, e atente portanto as exigências de um método ideal de biorre- finaria.

Uma outra vantagem do método, de acordo com a invenção, em comparação com outros métodos de desagregação, que transcorrem sobre- . tudo na faixa de temperatura entre 150ºC e 200ºC, é sua temperatura de reação abaixo de 100ºC. O baixo gasto de energia permite utilizar a lignina obtida durante a desagregação não como fonte de energia para o método de desagregação, mas como material reciclável. 7 Após o tratamento com a solução aquosa contendo um álcool, especialmente um C;,4álcool ou um fenol, e H2O>, de acordo com o método “da presente invenção, a solução contendo lignina é separada e a matéria sólida desagregada é tratada preferivelmente com uma xilanase, por exem- plo, 6-72 horas sob 30-90ºC e a fase líquida é separada da matéria sólida, em que a fase líquida continua sendo reagida formando produtos derivados, por exemplo, xilitol.

A matéria sólida remanescente após a separação da fase líquida é preferivelmente tratada com celulase, sendo que através de fermentação posterior podem ser obtidos a matéria sólida/solução de glicose etanol, bu- tanol ou outros produtos de fermentação; ou a matéria sólida remanescente é submetida a uma conversão de material térmica ou termoquímica e os produtos formados, tais como componentes de combustível, aditivos de combustível e/ou outros produtos químicos, como, por exemplo, fenóis, são separados; ou a matéria sólida remanescente é submetida a uma conversão de material microbiana através de bactérias, levedura ou fungo, ou a matéria sólida remanescente é submetida a uma outra etapa de deslignificação para fins de obtenção de um material de fibra celulósica.

A matéria sólida remanescente pode ser fermentada em uma instalação de gás biológico e processada posteriormente formando gás bio- lógico.

Um dos produtos derivados mais interessantes economicamente da xilose é o xilitol.

As fontes principais para obtenção de xilose são licores de cozi- nha provenientes da indústria de pasta química, que contém uma carga de produtos de decomposição, principalmente da lignina e da hemicelulose, de forma que a xilose precise ser obtida primeiramente através de etapas de separação e de purificação dispendiosas.

Assim sendo, por exemplo, H. . Harms em "Wilkommen in der natúrliichen Welt von Lenzing, weltweit fúhrend in der Cellulosefaser Technologie", Convenção de Outuno da Indús- triade Papel Austríaca, Frantschach (15,11,2007) descreve a obtenção de xilose a partir da lixívia espessa por filtração em gel, um método tecnicamen- "te muito complexo, que normalmente não é aplicado para produtos a granel.

A xilose obtida desse modo é então convertida cataliticamente formando xili- “tor.

Em um outro aspecto a xilose obtida de acordo com a presente invenção é convertida livre de fermentação em xilitol, através da conversão com uma xilose-reductase, por exemplo um xilose desidrogenase, por e- xemplo de Candida tenuis, sendo que opcionalmente uma xilose redutase e opcionalmente um cossubstrato é adicionado para a regeneração do cofator e opcionalmente álcool desidrogenase e opcionalmente ND(P)H à solução de xilose, especialmente, sendo que o xilitol obtido é separado por filtração dos produtos de dissociação de lignina.

Através do exemplo 1 a seguir e exemplo comparativo 1A, a in- fluência do tratamento preliminar é documentada na presença de álcool so- breorendimento de açúcares redutores após a hidrólise enzimática.

Exemplo 1 Tratamento prévio de palha de trigo.

A palha de trigo é fragmen- tada em um tamanho de partícula de aproximadamente 2 cm. 5g de palha de trigo fragmentada é suspensa em um recipiente de reação de 500 m! em 200 mlde uma solução, composta de 49,5% de água, 50% de etanol e 0,5% de peróxido de hidrogênio.

A suspensão é aquecida a 50ºC em banho-maria, e O valor de pH da suspensão é ajustado com solução aquosa de NaOH para um valor de pH de partida 12. A mistura é agitada a 200 rpm, a 60ºC, duran- te 24 horas continuamente magneticamente.

Em seguida a porção de maté- riasólida é removida por filtração e lavada com 1 L de água destilada.

Para a hidrólise enzimática, por cada teste paralelo 100 mg de substrato previamente tratado foram ajustados com 9,8 ml de tampão aceta-

to de sódio 50 mM para um pH de 4,8 e misturados com 200 ul de suspen- são de acelerase 1000 (www.genencor.com). A acelerase é uma mistura de . enzimafeita de celulases e hemicelulases.

A hidrólise enzimática foi realiza- da a 50ºC em um banho-maria com agitação.

Os monômeros solúveis libe- rados após 48 horas de hexoses e pentoses foram determinados na forma de açúcar redutor de acordo com o método DNS (Miller et al., Analytical - Chemistry 31(3): 426, 1959), pesado com relação à quantidade de substrato pesado, previamente tratado e expresso em porcento dos rendimentos má- ximos teóricos.

O rendimento máximo teórico de açúcar redutor foi especialmen- te determinado e é 705 mg +/- 5% por g de palha não tratada.

Por preparação de teste foram realizados respectivamente 5 tes- tes paralelos.

O rendimento de açúcares redutores foi de 99% +/- 4%. Exemplo Comparativo 1A O exemplo 1 foi repetido, porém sem adição de álcool.

O rendi- mento de açúcares redutores foi de meramente 64% +/- 3%. Exemplo 2 Tratamento Preliminar de Palha de Trigo A palha de trigo é fragmentada até um tamanho de partícula de aproximadamente 2 cm. 2,5 g de palha de trigo fragmentada são suspensos em um recipiente de reação de 500 ml! em 200 ml de uma solução, composta de 49,5% de água e 50% de isopropanol.

A suspensão é aquecida a 50ºC, em banho-maria, termoestatizada e o valor de pH da suspensão é ajustado com solução de NaOH para um valor de pH de partida 13 (ou 14). A mistura é agitada magneticamente continuamente com 200 rpm, a 60ºC, durante 24 horas.

Em seguida, a porção de matéria sólida é removida por filtração com 1L de água destilada.

Para a hidrólise enzimática foram ajustados por cada teste para- lelo, 100 mg de substrato previamente tratado e misturados com 9,8 ml de tampão de acetato de sódio SOmMM para o valor de pH 4,8 e com 200 ul de suspensão de acelerasse 1000 (www.genencor.com). A acelerase é uma mistura enzimática feita de celulase e hemicelulase.

A hidrólise enzimática

11A7 foi realizada a 50ºC em banho-maria com agitação.

Os monômeros solúveis, liberados após 48 horas, derivados de hexoses e pentoses foram determina- . — dos na forma de açúcar redutor de acordo com o método DNS em 1 ml de sobrenadante líquido, referidos à quantidade de substrato pesado, previa- mentetratadoe expressos em porcentagem do rendimento máximo teórico.

O rendimento máximo teórico de açúcar redutor foi separada- ” mente determinado e perfaz 705 mg +/- 5% por g de palha não tratada.

Por preparação de teste foram realizados respectivamente 5 tes- “tes paralelos.

Os rendimentos de açúcares redutores foi de 97% +/- 4%. Exemplo3 Produção de xilitol enzimático a partir de uma solução de xilose, que foi fabricada a partir de palha de acordo com o método descrito no exemplo 2. Como cossubstrato é empregado isopropanol.

A solução de reação contém 5 mg/ml de xilose, que foi prepara- daa partir de palha de acordo com o método descrito no exemplo 2. Como cossubstrato é empregado isopropanol.

A solução de reação contém 5 mg//ml de xilose.

A xilose redutase (XR) derivada de Candida tenuis reduz xilose formando xilitol.

Essa XR necessita como coenzima de NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida), que é oxidada na reação formando a coen- zima NAD+. A regeneração do cofator oxidado é feita por atividade paralela de um álcool-desidrogenase (ADH: regeneração enzima-acoplada), Como cossubstrato é utilizado isopropanol.

O isopropanol e NAD+ são convertidos pela ADH formando NADH, conforme mostrado no esquema de reação 1:

ESQUEMA DE REAÇÃO 1 co cnom OH oH xR 7 no no. oH / . OH cHoH . Xilose NADH +H* NAD* Xilita o AN no

ADH Acetona Isopropanol Na tabela 1 aparecem indicadas as razões de reação nas 5 dife- rentesreações de teste f049, %050, 051, 4052, 4053 e H£054 : Tabela 1 fera asian fo e foro To o Volume total: 1 ml Temperatura: 26 + 2ºC Agitador magnético: 200 rpm

Tempo: 15 horas Para a desativação das enzimas, todas as amostras foram . aquecidasa 95ºC e centrifugadas como preparação para a análise HPLC subsequente, Análise — HPLC: Coluna SUGAR SPO0810 + pré-coluna SUGAR SP-G ' Detetor: detector de índice de refração Eluente: H2O desionizado ] Fluxo: 0,75 mi/min Quantidade de amostra: 104l Precisão de quantificação HPLC: +10 Tempo de retenção: Xilose: 13,97 min Xílitol: 37,73 min Isopropanol: 16,69 min Acetona: 16,54 min Resultados: A concentração de substrato de amostra %049 foi determinada por HPLC e situa-se em 0,9 mg/mL.

A mistura de reação %050 contém somente xilose redutase (0,1 U/ML) e NADH (1 mM). Após reação com duração de 15 horas foram con- sumidos 0,085 mg de xilose. A concentração de xilitol ficou abaixo do limite de detecção.

A reação f052 é comparável coma reação %050, porém com a diferença que neste caso é empregado o sistema de regeneração. Obtêm-se uma conversão total da xilose utilizada. Concentrações empregadas: XR (0.1 UML), NADH (1 mM), ADH (0.25 U/mL) e Isopropanol (5%).

A concentração de xilose da amostra 4053 foi determinada com 2,121 mg/mL, o que corresponde à concentração de xilose esperada.

A reação f054 é comparável à reação 052, porém contém uma concentração de partida de xilose aumentada pelo fator 3 (50% de substrato na reação). A concentração do xilitol gerado foi medida com 0,945 mg de xilitol. Concentrações empregadas: XR (0.1 U/uml), NADH (1 mM), ADH (0,25 U/mL) e Isopropanol (5%).

. Na tabela 2 estão indicados os resultados das reações com base nos dados medidos HPLC (xilose consumida e xilitol obtido; "u.D.L" significa "abaixodolimitee detecção"): Tabela 2 “ememdernção — foro fome foca loss lose | omnes be fas be fes | men — | sbt fes | mm) pe] | fe premente] fee a NNE concentração de xilose [% u.D.L. 47,9 Exemplo 4 Produção de xilitol enzimática a partir da solução de xilose, que foi preparada a partir de palha de acordo com o processo descrito noexemplo2. Como cossubstrato é empregado etanol.

O volume da solução de substrato foi reduzido (vide exemplo 2) por meio de um evaporador rotatório em 50%, para elevar a concentração de xilose (- 10 mg/mL de xilose).

A regeneração do cofator oxidado foi realizada através da ativi- dadeda xilose-redutase utilizada (XR) a partir de Candida tenius e a ativida- de adicional de uma aldeido-desidrogenase utilizada a partir de Saccha- romyces cerevisiae (Sigma-Aldrich: número de catálogo A6338; (EC) Núme- ro: 1.2.1.5; número CAS: 9028-88-0). Neste caso, trata-se tanto de uma rea- ção substrato acoplada como também de uma reação enzima-acoplada.

Como cossubstrato é utilizado etanol. O etanol e NAD+ são convertidos na primeira etapa através da atividade da XR formando NADH e acetaldeído. Na segunda etapa, acetaldeíido e NAD+ são convertidos pela atividade da . — aldeidodesidrogenase (AldDH) formando acetato (vide neste caso Sigma- - — Aldrich: número de catálogo A6338; ou "Characterization and Potential Roles 8 of Cytosolicand Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenases in Ethanol Meta- bolism in Saccharomyces cerevisiae", Wang et al., Molecular Cloning, 1998, * Journal of Bacteriology, p. 822 - 830). Por mol de cossubstrato convertido, ” se formariam neste caso 2 moles de equivalente de redução (NADH) (vide ' esquema de reação 2) Esquema de Reação 2 cao cnou XxR OH

E ZS o o Los cno Nose NADH + H* NAD e cH;cHO ASA CH,CH,OH Acetaldeido xR Etanol

NAD AIdDH C NADH + H- CH,COO * AÁnionde ácido acético Na tabela 3, aparecem indicadas as razões de reação das 4 dife- rentes reações de teste 247, 249, 250 e 253. Foram empregadas diferentes concentrações de etanol e concentrações AldDH. As concentrações de cofa- tor e substrato foram mantidas constantes.

Tabela lnamero deeação — fer Bo Bo o | - femsmonacadamço soe soocssmma — Jaco ceman lacocemaa | : foruns — fios fiopamio — fronamo — froamn | ndo s.cenisae sumL vt] jas (nzsuima fesiozsumo do lo ==> | Eme po EE pH 7,0 [ul] Volume total: 0,5 mL Temperatura: 25 + 2ºC Termomisturador: 500 rpm Tempo: 112horas Para a desativação das enzimas foram aquecidas todas as amostras a 70ºC por 15 minutos e centrifugadas como preparação para a análise HPLC subsequente e filtradas (PVDF; 0,2 um). Análise - HPLC: Coluna SUGAR SPO0810 + pré-coluna SUGAR SP-G Temperatura de coluna 90ºC Detector: detector de índice de refração Eluente: H20 desionizada Fluxo: 0.90 mL/min Quantidade de amostra: 10 ul HPLC precisão de quanticação: +10% Resultados: O rendimento máximo (reação 249) pode ser obtido com uma concentração de etanol de 1,2 mol/L.

Neste caso, foram formados, no total, 1,38 mg/ML de xilitol, o que corresponde a um rendimento de 21,2% da teo- ria de xilitol.

Na tabela 4 aparecem indicados os resultados das reações com base em dados medidos HPLC.

Tabela 4 [Nomero da reação — ú=ú>ú>úÚúÚúlaz as |aso sz | | - “Duoseapósareação mami] — — 5.057 5,046 15,385 [5.365 | ' bxilose consumida na reação | consumida na reação na amo am are are Po : ' Verifica-se, a partir dos resultados, que o etanol pode ser em- pregado como cossubstrato.

Conforme podemos observar através da com- paração da reação 249 (mistura de reação contendo AIdDH) e 253 (mistura de reação sem AldDH) de forma inequívoca, a adição da aldeído- desidrogenase acarreta um nítido aumento do rendimento de xilitol.

A dife- rença de xilose convertida em relação a xilitol é de -8%. Esse resultado em conexão com as citações da literatura especializada acima mencionada permite apenas concluir que AIdDH oxida o acetaldeído que se forma na primeira redução parcial formando ácido acético (vide esquema de reação 2). Essa reação energeticamente favorável e a concentração assim elevada de NADH deslocam o equilíbrio do duto na direção do produto xílitol na pri- meira reação parcial.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a fabricação de produtos de dissociação de , carboidrato, especialmente açúcares, caracterizado pela combinação das . medidas em que - o material lignocelulósico é tratado com uma solução aquo- sa, que contém álcool, especialmente em C,,4-álcool ou um fenol, e apresen- ta um valor de pH entre 11,0 e 14,0, para dissociar a lignocelulose e separar ' os produtos de dissociação do material, sendo obtido um material enriqueci- do com celulose e hemicelulose, e - o material enriquecido com celulose e hemicelulose, assim obtido é tratado com pelo menos uma enzima dissociadora de carboidrato a ; fim de obter os produtos de dissociação de carboidrato.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- - lo fato de a solução aquosa apresentar um valor de pH entre 11,0 e 13,0.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza- do pelo fato de a dissociação ser feita sob uma temperatura abaixo de 100ºC.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pe- lo fato de a dissociação ser feita sob uma temperatura abaixo de 40ºC.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser utilizado como o material lignocelulósico palha, bagaço, ervas energéticas e/ou glumas.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de o material lignocelulósico estar presente na solução aquosa em uma densidade material de 5-40% em peso.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o material enriquecido com celulose e hemi- celulose ser tratado com uma xilanase e/ou uma celulase a fim de obter os açúcares.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de os açúcares obtidos serem fermentados for- mando álcool, que é separado e obtido.

í ?* 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de a matéria sólida desintegrada ser convertida - com uma xilanase e a fase líquida, formando xilitol e a matéria sólida rema- » nescente Ss - —continuar a ser convertida com celulase para obtenção de di- ferentes produtos de fermentação; * ou : - "ser submetida a uma transformação material termoquímica ou térmica; ou - ser submetida a uma transformação material microbiana através de bactérias, leveduras ou fungos; ' ou . - —ser submetida a uma outra etapa de deslignificação com o objetivo de obter um material fibroso celulósico.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a matéria sólida desintegrada ser convertida com uma xilanase e a fase líquida obtida ser convertida por meio de xilose desidrogenase for- mando xilitol, e a matéria sólida remanescente - —ainda ser convertida com celulase para obtenção de diferen- tes produtos de fermentação; ou - —ser submetida a uma transformação material térmica ou ter- moquimica; ou - ser submetida a uma transformação material microbiana através de bactérias, leveduras ou fungos; ou - —ser submetida a uma outra etapa de deslignificação para fins deobtençãode uma material fibroso celulósico. *

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri- : zado pelo fato de, após separação dos produtos (de fermentação), a matéria sólida remanescente ser fermentada em um equipamento de biogás e, em seguida, processada formando biogás. .

12. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretiza- % ções ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente % reveladano pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados. , «