UA112837C2

UA112837C2 - Спосіб одержання продуктів розщеплення вуглеводів з лігноцелюлозних матеріалів

Info

Publication number: UA112837C2
Application number: UAA201202582A
Authority: UA
Inventors: Карін Факлер; Курт Месснер; Чуларат Кронгтаєв; Ортвін Ертл
Original assignee: Анніккі Гмбх
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2016-11-10
Also published as: AT508725A1; AT508724A1

Abstract

Винахід стосується способу одержання продуктів розщеплення вуглеводів, який полягає в тому, що лігноцелюлозний матеріал обробляють водним розчином, що містить спирт, зокрема Сспирт або фенол, при температурі від 40 °С до 100 ºС, крім 60 °С, та при значенні рН від 11,0 до 14,0. При цьому одержаний збагачений целюлозою й геміцелюлозою матеріал, обробляють щонайменше одним ферментом, що розщеплює вуглеводи, для того, щоб одержати продукти розщеплення вуглеводів.

Description

Даний винахід стосується способу одержання продуктів розщеплення вуглеводів, зокрема цукрів, таких як пентози й гексози, з лігноцелюлозних матеріалів. Далі, винахід стосується способу одержання спирту із цукрів. Для цілей даного опису й даної заявки поняття "цукор" включає також поняття "олігомери цукру".

У зв'язку з дефіцитом сирої нафти й обговоренням можливості застосування зерна як джерела енергії, поновлювана сировина лігноцелюлоза (солома, деревина, паперові відходи й т.д.) здобуває велике значення як вихідний матеріал для пального або хімічних продуктів.

Перетворення лігноцелюлози може відбуватися двома основними різними шляхами: 1) "Тпегтоспетіса! Ріаногт" (термохімічна платформа), у якому лігноцелюлозу спочатку газифікують і із синтезу-газу синтезують бажані продукти, і 2) "Зидаг Ріацопт" (цукрова платформа), у якому головний інтерес для використання представляє зв'язаний у полімерах целюлози й геміцелюлози цукор, у той час як лігнін переважно використовується для енергетичних цілей. Даний винахід стосується другого шляху.

На противагу крохмалям цукор лігноцелюлози перебуває в тісно зв'язаних полімерних кристалічних структурах целюлози й геміцелюлози, які додатково захищені оболонкою лігніну, внаслідок чого виходить найвищою мірою щільний комплекс. Самим очевидним способом одержання цукрів з лігіноцелюлози було б безпосереднє використання целюлаз і геміцелюлаз.

Однак даний спосіб є скрутним для соломи або деревини як вихідної сировини через щільність вищезгаданого комплексу. Через високу молекулярну масу ферменти не здатні проникати через вузькі пори лігноцелюлози. Це означає, що в першу чергу необхідно прийняти міри для підвищення пористості лігноцелюлози, щоб внаслідок цього уможливити наступне ферментне перетворення в цукор.

Цю першу стадію позначають як "Ргеїгеайтепі" (попередня обробка, підготовка). Дана підготовка завжди є дуже дорогою, так, наприклад, при одержанні "зесопа депегаїйоп Біоїчеї5" (удруге перероблене біопаливо) на підготовку витрачаються до 1/3 виробничих витрат, що негативно впливає на рентабельність. Метою застосовуваних способів є або перетворення вихідної геміцелюлози в рідкий стан (наприклад, 5іват ехріозіоп, айїше асіа-ргеїгеаїтепі) (паровий вибух, попередня обробка розведеними кислотами) або підвищення пористості шляхом перетворення в рідкий стан лігніну (наприклад, Ійте-, аттопіа-ргеігеайтеп) (обробка вапном, аміаком).

Субстрат з обробленої лігноцелюлози може піддаватися подальшій ферментній обробці для одержання цукрів або їх олігомерів, причому вид попередньої обробки може сильно впливати на ферментативну активність і вихід продукту. При високій температурі реакції часто утворюються токсичні продукти розкладання (наприклад фурфурол), які у випадку безпосередньо наступного за цим етанольного зброджування можуть перешкоджати дріжджам; див. наприклад, Спапага еї а!., Адмапсез іп Віоспетіса! Епдіпеегіпо/Віогїесппооду, 108:67, 2007;

Мапзвіїє!а еї а!., Віотесппо!. Ргоа. 15:804,1999.

Дані способи мають істотний недолік, що полягає в тім, що вони є енергозатратними й переважно протікають при температурах майже 20076.

Технологічне вдосконалення в даній області, наприклад за допомогою розробки низькотемпературного способу, (тобто протікаючого при температурі до 1002С), означало б вирішальний прогрес у будь-якому застосуванні лігноцелюлози як сировини. Це є завданням даного винаходу.

З ЕР 1025305 ВІ1 відомий хімічний спосіб деполімеризації лігніну (Си-система). Даний спосіб грунтується на каталітичній дії міді, яка утворює комплекси, в сполученні з пероксидом водню або органічними гідропероксидами, і уможливлює розщеплювати лігнін окислюванням при температурі нижче 1007С. Застосовувані при цьому комплексоутворювачі являють собою похідні піридину. Для синтетичних моделей лігніну було підтверджено, що при застосуванні

Нг2О2 як окислювача відбувається розщеплення простих ефірних зв'язків молекул лігніну, внаслідок чого полімери лігніну розпадаються на олігомери. При застосуванні Си-систем з надлишком органічних гідропероксидів можливо делігнофікувати деревину. Заснована на НгО» система була технічно краще в реалізації, випробовувалася як вибілююча добавка при перекисному вибілюванні крафтцелюлози й приводила до поліпшення делігнофікування й підвищення ступеня білизни.

Далі, з "Охідайоп ої мой апа ії сотропепіб5 іп уга(ег-огдапіс теаіа", СпирКа еї аї.,

Ргосеєдіпд5: бЗемепій Іпіегтпайопа! бЗутровзішт оп ужоой апа риїріпуд спетівігу, Мої. 3, 373-382,

Веїїпу Р.А. Спіпа, 25.-28. Мау 1993, відомо, що ефективність лужного каталізу окислювання деревини й лігніну значно зростає, якщо до водного реакційного середовища додавали органічний розчинник, наприклад ЮОМ5О, ацетон, етанол. Далі автори вказують, що при бо значеннях рН більше 11 відбувався різкий ріст окислювання деревини й лігніну.

З МО 01/059204 відомий спосіб одержання целюлози, у якому вихідний матеріал піддається попередній обробці, причому даний матеріал обробляють із буферним розчином і каталізатором делігнофікування (перехідний метал). Делігнофікування проводять у присутності кисню, пероксиду водню або озону.

На противагу цьому, відповідно до способу по винаходу, одержання продуктів розщеплення вуглеводів, зокрема цукрів, відрізняється тим, що: - лігноцелюлозні матеріали обробляють водяними розчинами, які містять спирт, зокрема С-.- а-спирт або фенол, і мають значення рН від 11,0 до 14,0 для того, щоб розщепити лігноцелюлозу й відокремити продукти розщеплення від матеріалу, при цьому одержують матеріал, насичений целюлозою й геміцелюлозою; і - отриманий, насичений целюлозою й геміцелюлозою матеріал обробляють ферментом, що розщеплює вуглеводи, для того, щоб одержати продукти розщеплення вуглеводів.

Як спирти придатні аліфатичні або циклоаліфатичні, одно- або багатоатомні спирти або феноли, як наприклад, Сі спирти, зокрема Сі-4« спирти, такі як метанол, етанол, пропанол і бутанол, включаючи їхні ізомери; гліколі (етандіол, пропан-, бутан-, пентан-, гександіолі), гліцерин, пропенол, бутенол, циклопентанол, циклогексанол, бензиловий спирт; або феноли, такі як феноли, крезоли, катехоли, нафтоли, а також аміноспирти, такі як етанолумін, метанолумін і гексаноламін. Кращими є С.і.4 спирти. Для цілей даної заявки феноли включені у видове поняття "спирти".

Крім того спиртові розчини екстрактів лігніну виявляють вигідні переваги в наступній переробці продуктів розщеплення лігніну або ксилану.

Відповідно до способу по винаходу спирт перебуває у водяному розчині переважно в кількості від 10 до 70 об. 95, наприклад від 20 до 50 об. 95, переважно від 30 до 40 об. 95.

Відповідно до способу по винаходу лігноцелюлозні матеріали перебувають у водяному розчині переважно в концентрації від З до 40 мас. 95, наприклад, від 5 до 40 мас. 95, зокрема від 5 до 2095 мас. 95.

Краще розщеплення лігноцелюлози відбувається при температурі нижче 100"С, наприклад, нижче 80"С або нижче 60"С.

Значення рн можна встановлювати основою, переважно неорганічною основою, наприклад

Зо розчином їдкого натру.

Даний винахід грунтується на даних, що лігноцелюлозні матеріали, оброблені основним водяним розчином, що містить спирт, зокрема Сі-4 спирт або фенол і має значення рН від 11,0 до 14,0, можуть бути ферментативно перероблені з більше високим виходом продуктів розщеплення вуглеводів, таких як цукрів, а також інших видів делігнофікованих матеріалів, зокрема без додавання спиртів.

Як продукти розщеплення вуглеводів переважно утворюються цукри, головним чином пентоза й гексоза. Кращими цукрами є також ксилоза й глюкоза.

Кращий варіант здійснення способу по винаходу відрізняється тим, що матеріали, насичені целюлозою й геміцелюлозою обробляють ксиланазою і целюлазою для того, щоб одержати цукор.

У якості лігноцелюлозних матеріалів переважно застосовують солому, енергетичні злаки, такі як просо прутковидне, міскантус, абака, сизаль, багасса, або нетипові лігноцелюлозні матеріали, такі як оболонка зерна (лузга), наприклад рисова лузга; переважно використають солому, енергетичні злаки, багассу або лузгу, особливо переважно застосовують солому або багассу, наприклад, солому. Солома має сильно гідрофобну поверхню, так що змочування водяними розчинами представляє проблему. Виявили, що за допомогою використання спирту стало можливим, без застосування тиску вводити реакційний розчин у пори матеріалу й наявне повітря заміщати реакційним розчином. Надалі виявилося, що спирт прискорює екстракцію продуктів розщеплення із соломи й сприяє тому, щоб продукти розщеплення лігніну залишалися в розчині. Надалі виявилося, що на противагу цьому через спирт розчинність геміцелюлози й продуктів її розщеплення знижується й, таким чином, геміцелюлоза залишається в матеріалі.

Завдяки видавлюванню рідкої фази із субстрату, відповідно до способу розщеплення, концентрація субстрату підвищується, внаслідок чого потрібна менша кількість ферментів для ферментативного гідролізу або для іншої наступної ферментативної переробки.

При виробництві спирту вартість ферментів є вирішальним чинником витрат. Наявність спирту приводить до того, що розчинність у лужному середовищі протягом реакції вивільнених додатково до лігніну геміцелюлози і її продуктів розщеплення сильно знижується й вони залишаються зв'язаними із субстратом. Перевагою для процесу є висока вибірковість витягу лігніну, у випадку відділення екстракційного розчину від твердих речовин концентрація бо геміцелюлози й продуктів її розщеплення в екстракційному розчині занадто низька, тому що геміцелюлоза залишається у твердій речовині й, внаслідок цього зберігається для ферментативного гідролізу й одержання цукру.

Спиртовий розчин екстракту лігніну надає гарні можливості для подальшої переробки лігніну й одержання продуктів з лігніну.

Надалі виявилося, що розкладання геміцелюлози значною мірою запобігається при застосуванні спирту, зокрема, С1.4 спирту або фенолу, у випадку лужної підготовки при менш ніж 100"С, так що майже вся геміцелюлоза залишається для наступного ферментативного розщеплення й перетворення ксилози в більш цінні продукти й не розкладається частково при підготовці, як в інших способах, і виділяється як суміш лігнін/цукор.

Завдяки підготовці до проведення делігнофікування пористість стінок клітин лігноцелюлозних матеріалів підвищується, наприклад, у випадку соломи пористість підвищується настільки високо, що майже вся ксилоза стає доступною для ксиланази, приблизно 10095 ксиланів гідролізується й вся ксилоза може бути отримана. Цей факт робить даний спосіб відповідно до даного винаходу особливо придатним для того, щоб робити більше цінні продукти в сполученні з ферментативним перетворенням ксилози. Ферментативне перетворення може при цьому відбуватися або безпосередньо в суміші розчину ксилози й твердих речовин, або у відділеному від твердих речовин розчині ксилози.

Відповідно до способу по винаходу надалі за ферментативним гідролізом ксиланів і перетворенням ксилози в ксилітол виробництвом спирту із твердих речовин, що залишилися, вартість ферментів є вирішальним чинником витрат. Частково витрати випливають із неспецифічних зв'язків ферментів з лінгніном, див., наприклад, Спапага еї аї!., 2007. Часткове видалення лігніну скорочує цю втрату активності й мало відбивається на витратах.

Перевагою наступного ферментативного способу є, наприклад те, що з високої вибірковості витягу лігніну при майже повнім збереженні полімерів цукру потрібна дуже низька концентрація геміцелюлози й продуктів її розщеплення в екстракційному розчині, геміцелюлоза залишається у твердих речовинах і внаслідок цього зберігається для ферментативного гідролізу й одержання цукру, а також для їхнього наступного перетворення. Виходячи із цього одержують відповідно до способу по винаходу максимальний відсоток використання матеріалу й, наприклад, у сполученні із застосуванням ксилозодегідрогенази, високу рентабельність описаного процесу.

Зо Проведення процесу перетворення ксилози в ксилітол може відбуватися після ферментативного вивільнення ксилози безпосередньо у твердій речовині/рідкій суміші, які одержують відповідно до способу по винаходу, що підвищує рентабельність загального процесу.

У випадку перетворення з одержанням ксилітолу може бути використаний спирт, що залишився, із процесу підготовки, після віджиму твердих речовин, безпосередньо як субстрат для алкогольдегідрогенази для відновлення МАЮ в МАОН. Якщо процес розрахований таким чином, що для цього витрачаються залишки спирту, що залишаються в реакційній суміші зі стадії підготовки (частково), видалення зайвого спирту з розчину продуктів (частково) більш непотрібно й внаслідок цього збільшується ефективність загального процесу.

У випадку перетворення продуктів розщеплення лігніну спирт діє як КадікаІ-самепдег (акцептор радикалів) і розчинник для продуктів розщеплення, отриманих у ході ферментативної, біомиметичної або хімічної деполімеризації високомолекулярних продуктів розщеплення лігніну в низькомолекулярні.

Незначний вміст геміцелюлози й продуктів її розщеплення в екстракті й підвищена розчинність лігніну, підвищують норми пропускної здатності при відділенні твердих речовин від продуктів перетворення, а також при їхній фільтрації.

Відповідно до способу по винаходу можна, наприклад, розділяти три основних компоненти соломи, а саме глюкози, ксилози, а також лігніну в дуже бідних речовиною масових потоках і потім перетворювати їх у цінні продукти, такі як ксилітол, і виконувати в такий спосіб вимоги ідеального способу біопереробки.

Наступна перевага способу по винаходу порівняно з іншими способами підготовки, які головним чином протікають у температурному діапазоні від 1507С до 200"С, полягає в тому, що температура може залишатися нижче 100"Сб. Низькі енерговитрати дозволяють використовувати отриманий при підготовці лігнін не як джерело енергії для процесу підготовки, а як цінний матеріал.

Після обробки водяним розчином спирту, зокрема С:і-4 спирту або фенолу, який містить

НгО», відповідно до способу по винаходу, розчин, що містить лігнін відокремлюють і підготовлену тверду речовину переважно обробляють ксиланазою, наприклад, 6-72 годин при 30-907С, і потім відокремлюють рідку фазу від твердої речовини, після чого рідку фазу 60 переважно перетворюють, з утворенням побічних продуктів, наприклад, ксилітолу.

Після відділення рідкої фази тверду речовину, що залишається, переважно обробляють целюлозою, причому за допомогою наступної ферментації твердої речовини/розчину глюкози можна одержувати етанол, бутанол або інші продукти ферментації; або тверду речовину, що залишилася, піддають термічному або термохімічному перетворенню й відокремлюють отримані продукти, такі як компоненти палива, присадки до палива й/або інші хімічні продукти, як наприклад феноли; або тверду речовину, що залишилася, піддають мікробіологічному перетворенню за допомогою бактерій, дріжджів або грибів; або тверду речовину, що залишилася, піддають наступної стадії делігнофікування з метою одержання целюлозних волокнистих матеріалів.

Тверде паливо, що залишилося, можна ферментувати в пристрої для одержання біогазу й переробляти в біогаз.

Одним із самих економічно цікавих побічних продуктів ксилози є ксилітол.

Основне джерело для одержання ксилози являє собою варильний луг із целюлозного виробництва, що містить безліч продуктів розщеплення, переважно лігніну й геміцелюлози, внаслідок чого ксилозу повинні одержувати в ході дорогих стадій відділення й очищення. Так, наприклад, у роботі Н. Напт5 "УМ/ІІКоттеп іп дег пашгіснеп У/еїї моп І епгіпа меїмей тОйгепа іп дег СейПшозетазег Тесппоїодіє", Негозцадмто дег бвієїтеіспізспеп Рарієгіпдивігіє, Екапізспаснп (15.11.2007) описане одержання ксилози з концентрованого лугу способом гель-фільтрації, технічно дуже складним способом, що звичайно не знаходить застосування для масових продуктів. Отриману в такий спосіб ксилозу перетворюють потім у ксилітол.

У наступному аспекті способу по винаходу отримана ксилоза вільно за допомогою ферментації перетворюється в ксилітол перетворенням із ксилозоредуктазою, наприклад, із ксилозодегідрогеназою, наприклад з Сапаїда їепиїх5, причому при необхідності до розчину ксилози додають ксилозоредуктазу косубстрат для регенерації кофактора, алкогольдегідрогеназу, МАС(Р)Н; при цьому отриманий ксилітол відокремлюють фільтрацією від продуктів розщеплення лігніну.

Наступним прикладом 1 і порівняльним прикладом ТА підтверджується вплив попередньої обробки в присутності спирту на вихід відновленого цукру після ферментативного гідролізу.

Приклад 1

Зо Попередня обробка соломи пшениці.

Солому пшениці подрібнювали до часток розміром близько 2 см. 5 г здрібненої соломи пшениці суспендували в реакційній посудині обсягом 500 мл в 200 мл розчину, що складається з 49,595 води, 5095 етанолу й 0,595 пероксиду водню. Суспензію нагрівали на водяній бані до 50"С, термостатували й установлювали значення рН суспензії водяним розчином Маон на кінцеве значення рН, рівне 12. Суміш безупинно перемішували на магнітній мішалці зі швидкістю 200 обертів у хвилину, при 60"С, 24 години. Потім тверду частину фільтрували й промивали 1 л дистильованої води.

Для ферментативного гідролізу паралельно в кожних 100 мг підготовленого субстрату встановлювали рН за допомогою 9,8 мл 50 мМ буферного розчину ацетату натрію на значення 4,8 і змішували з 200 мкл суспензії АссеПегазе 1000 (ммли.депепсог.сот). АссеПегазе являє собою суміш ферментів із целлюлази й геміцелюлази. Ферментативний гідроліз проводили при

БОС у вібро-водяной бані. Вивільнені після 48 годин розчинні мономери з гексози й пентозь визначали у вигляді відновленого цукру ДНК методом (Мійег еї аї., Апаїумйса! Спетівігу 31(3):426,1959) в 1 мл рідкої фракції, відносили до маси зваженого, попередньо обробленого субстрату й переводили у відсотки від максимального теоретичного виходу продукту.

Теоретичний максимальний вихід відновленого цукру визначали окремо, і він склав 705 мг-/-5965 на г непідготовленої соломи.

За один експеримент проводили 5 паралельних дослідів. Вихід відновленого цукру склав 999о-/-490.

Порівняльний приклад їА

Повторювали приклад 1, тільки без додавання спирту. Вихід відновленого цукру склав лише 6б490-/-3990.

Приклад 2

Попередня обробка соломи пшениці.

Солому пшениці подрібнювали до часток розміром близько 2 см. 2,5 г здрібненої соломи пшениці суспендували в реакційній посудині обсягом 500 мл в 200 мл розчину, що складає з 49,595 води, 5095 ізопропанолу. Суспензію нагрівали на водяній бані до 50"С, термостатували й установлювали значення р суспензії водяним розчином Маон на кінцеве значення рн, рівне 13 (або 14). Суміш безупинно перемішували на магнітній мішалці зі швидкістю 200 обертів у хвилину, при б6б0"С, 24 години. Потім тверду частину фільтрували й промивали 1 л дистильованої води.

Для ферментативного гідролізу паралельно в кожних 100 мг підготовленого субстрату встановлювали рН за допомогою 9,8 мл 50 мМ буферного розчину ацетату натрію на значення 4,8 і змішували з 200 мкл суспензії АссеПегазе 1000 (ммлму.депепсог.сопт). АссеїПегазе являє собою суміш ферментів із целюлози й геміцелюлози. Ферментативний гідроліз проводили при 50"С у вібро-водяній бані. Вивільнені після 48 годин розчинні мономери з гексози й пентози визначали у вигляді відновленого цукру ДНК методом в 1 мл рідкій фракції, відносили до маси зваженого, попередньо обробленого субстрату й переводили у відсотки від максимального теоретичного виходу продукту.

За один експеримент проводили 5 паралельних дослідів. Вихід відновленого цукру склав 979о--/-4990.

Приклад З

Робили ферментативний ксилітол з розчину ксилози, що була отримана із соломи відповідно до способу, описаному в прикладі 2. У якості косубстрату застосовували ізопропанол.

Реакційний розчин містив 5 мг/мл ксилози.

Ксилозоредуктаза (ХК) з Сапаїда їепиіз відновлює ксилозу до ксилітолу. Дана ХК має потребу в коферменті МАОН (нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений), що при реакції окислюється до коферменту МАЮО-. Відновлення окисленого кофактора відбувається за допомогою паралельної дії алкогольдегідрогенази (АОН: зв'язана регенерація ферментів). У якості косубстрату застосовували ізопропанол. Ізопропанол й МАО. за допомогою АН перетворюються в МАЮН й ацетон, ж показано на схемі реакції 1:

СХЕМА РЕАКЦІЇ 1 сно сноюн он он хе но но он | ' он

Сн.он снОн

Ксилоза МАН Н" МАГ" Ксиліт о АК но

АН

Ацетон Ізопропанол

У таблиці 1 представлені реакційні співвідношення в 5 різних дослідах Мо 049, Мо 050, Мо 051, Мо 052, Мо 053 й Мо 054:

Таблиця 1

Номер реакції 049 | 2050 | 2052 | 2053 | 2054

Зразок субстрата | |мкл

ХВ С.епиіз 2 Е/мл |мклі і |50|50| |50 20 ММ МАСН (|мклі і |5|50| |50

АОН І..Кеїйїг 5 Е/мл |мклі | |50| |5

Ізопропанол |мкл| | |5 | |50 мМ Ма-фосфат буферний розчин, рН 7.0 (мкл)

Загальний обсяг: 1 мл

Температура: 263270

Магнітна мішалка: 200 обертів у хвилину

Тривалість: 15 годин.

Для деактивації ферментів всі проби нагрівали 15 хвилин до 95"С і центрифугували для підготовки для наступного аналізу НРІ С (високопродуктивна рідинна хроматографія).

Аналіз НРІ С:

Колона БОСАК 5РО810-попередня колона БЮОСАК 5Р-А

Детектор: детектор показника переломлення

Злюент: дейонізована НгОо

Потік: 0,75 мл/хв

Кількість зразка: 10 мкл

НРГС точність кількісного вираження: 1090

Час утримання:

Ксилоза: 13,97 хв

Ксилітол: 37,73 хв

Ізопропанол: 16,69 хв

Ацетон: 16,54 хв

Результати:

Концентрацію субстрату зразка Ме049 визначали за допомогою НРІС і вона склала 0,9 мг/мл.

Реакційна суміш Ме050 містила тільки ксилозоредуктазу (0,1 Е/мл) і МАСН (1 мм). Після 15 годин продовження реакції було витрачено 0,085 мг ксилози. Концентрація ксилітолу перебувала нижче порога визначення.

Реакція Ме052 порівнянна з реакцією Ме050, однак з тією відмінністю, що в цьому випадку застосовували систему регенерації. Внаслідок чого відбувалося повне перетворення ксилози.

Використовувані концентрації: ХК (0,1 Е/мл), МАОСН (1 мм), АСН (0,25 Е/мл) і ізопропанол (590).

Концентрація ксилози в зразку Ме053 була визначена як 2,121 мг/мл, що відповідає

Зо очікуваній концентрації ксилози.

Реакція Ме054 порівнянна з реакцією Ме052, однак початкова концентрація ксилози була у два рази більше (5095 субстрату в реакції). Концентрацію отриманого ксилітолу визначили як 0,945 мг ксилітолу. Використовувані концентрації: ХК (0,1 Е/мл), МАОСН (1 мм), АСН (0,25 Е/мл) і ізопропанол (5965).

У таблиці 2 представлені загальні результати реакцій засновані на даних вимірів НРІ С (використана ксилоза й отриманий ксилітол; и.0.І. означає "нижче порога визначення"):

Таблиця 2

Ксилозаперед реакцією (мг/мл! гг |109|10815| 08 221 То

Ксилозапісля реакціїмг/мл| 77777771 | 10815 - Тов

Ксилоза, використання вреакціїмимл! гг | - Шо - 0932

Одержаний ксилитолімг/мл| 77777111 | шо 0994| - 0945 (Вихід ксилітола по відношенню до концентрації ксилози|96| | - |ш0р| 100 | - | 479

Приклад 4

Ферментативний ксилітол одержували з розчину ксилози, що була отримана із соломи відповідно до способу, описаному в прикладі 2. У якості косубстрату використали етанол.

Обсяг розчину субстрату (порівняльний приклад 2) за допомогою ротаційного випарника зменшили до 5095 для того, щоб підвищити концентрацію ксилози («10 мг/мл ксилози).

Відновлення окисленого кофактора відбувалося за допомогою дії доданої ксилозоредуктазь (ХК) з Сапаїда їепіи5 і додатково дією доданої альдегідодегідрогенази з Засспаготусе5 сегемівзіає (Зідта-Аїадси: Каїаїосодпиттег АбЗ338; (ЕС) Митрбег: 1.2.1.5; САБ Митрбег: 9028-88-0).

При цьому мова йде як про об'єднані субстрати, так і про об'єднану реакцію ферментів. У якості косубстрату використали етанол. Етанол й МАЮО-- на першій стадії під дією ХК перетворювалися в МАОН й ацетальдегід. На другій стадії ацетальдегід й МАЮ» під дією альдегідодегідрогенази (АІ4ОН) перетворювалися в ацетат (див. Зідпта-АїЇйгісй: Каїаіюдпиттег Аб338; або "Спагасіегігайоп апа Роїепійа! Роїе5 ої Суїюзоїїс апа Міоспопага! АіІдепуде Оенуайгодепазез іп

ЕШапо! Меїаброїїзт іп Засспаготусез сегемівіає", Мапа еї аї!., МоіІесшаг Сіопіпа, 1998, Чошитаї ої

Васіепоіоду, р. 822-830). На один моль прореагировавшего косубстрату в цьому випадку повинні утворюватися 2 моль відновлювальних еквівалента (МАОН) (див. схему реакції 2).

СХЕМА РЕАКЦІЇ 2 сн о нон но но он он сн.он но сн.он

Ксипоза Ксиліт лев я Я м їй МАО

Ацетальдегід ХА Етанол

МА

АшОН й

МАНІ" сно:

Аніон оцтової кислоти

У таблиці З представлені реакційні співвідношення 4 різних дослідних реакцій 247, 249, 250 й 253. Використовували різні концентрації етанолу й АІЯДОН. Концентрації кофактора й субстрату були постійними.

Таблиця З

Номер реакції

Зразок субстрата ІІ (мклі| 300 (56 мМ) 300 (56 мМ) | 300 (56 мМ) | 300 (56 мм)

ХВ С. іепійв 5 Е/мл |мклі 25(0,25 Е/мл). 25 (0,25 Е/мл) вм 25 (0,25 Е/мл) 20 МАО: |мклі| 10 (0,4 мм) 10 (04 мМ) | 10 (0,4 мМ 10 (0,4 мМ)

АІДОН 5.сегуізіає 5 Е/мл |мкл| 25(025Е/мл) |25(025Е/МЛЇ 0000010

Етанол 5095 (мклі| 751286 мМ) | 70 (1200мМ) | 75 (1286 мМ) | 70 (1200 мМ) 50 мМ ТтгізНеЇ

Загальний обсяг: 0,5 мл температура: 2542"

Термомішалка: 500 обертів у хв.

Тривалість: 112 годин

Для деактивації ферментів всі проби нагрівали 15 хвилин до 70"С, потім центрифугували й фільтрували (РМОЕ; 0,2 мкм) для підготовки для наступного аналізу НРІ С (високопродуктивна рідинна хроматографія).

Аналіз НРІ С:

Колона БОСАК 5РО810--попередня колона БОСАК 5Р-С

Температура колони 9070.

Детектор: детектор показника переломлення

Злюент: дейонізована НгОо

Потік: 0,90 мл/хв

Кількість зразка: 10 мкл

НРГС точність кількісного вираження: ж1090

Результати:

Максимального виходу продукту (реакція 249) досягали при концентрації етанолу 1,2 моль/л. При цьому всього було отримано 1,38 мг/мл ксилітолу, що відповідає виходу ксилітолу 21,295 від теоретичного.

У таблиці 4 об'єднані результати реакцій не основі даних вимірів НРІ С.

Таблиця 4

З результатів очевидно, що етанол можна застосовувати як косубстрат. Як видно з порівняння реакції 249 (реакційна суміш містить АІЯОН) і 253 (реакційна суміш без АІЯОН), однозначно добавка альдегідодегідрогенази приводить до явного підвищення виходу ксилітолу.

Відмінність кількості ксилози, перетвореної в ксилітол, становить «895. Цей результат у сполученні з вищезгаданими літературними цитатами дозволяє зробити висновок про те, що утворюється з АІаОН у першій частині відновлення ацетальдегід далі окислюється до оцтової кислоти (див. схема реакції 2). Дана енергетично сприятлива реакція й разом з нею підвищення, що відбувається, концентрації МАЮН зрушують рівновагу від вихідних речовин у напрямку продукту реакції - ксилітолу в першій частині реакції.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання продуктів розщеплення вуглеводів, який передбачає - обробку лігноцелюлозного матеріалу водним розчином, що містить спирт і має значення рн від 11,0 до 14,0 при температурі між 40 "С і менше 100 "С, розщеплення лігноцелюлози й відділення продуктів розщеплення від матеріалу, при цьому одержують збагачений целюлозою й геміцелюлозою матеріал, і Зо - обробку отриманого збагаченого целюлозою й геміцелюлозою матеріалу щонайменше одним ферментом, що розщеплює вуглеводи, для того, щоб одержати продукти розщеплення вуглеводів, - за умови, що таку обробку здійснюють при температурі, іншій ніж 60 "С.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що водний розчин має значення рнН від 11,0 до 13,0.

3. Спосіб за одним із пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що як лігноцелюлозний матеріал використовують солому, багассу, енергетичні злаки й/або лузгу.

4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, який відрізняється тим, що лігноцелюлозні матеріали у водному розчині знаходяться у концентрації 5-40 мас. 9о.

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що спиртом є С:-4 спирт або фенол.

б. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що продуктами розщеплення вуглеводів є цукри.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняється тим, що збагачені целюлозою й геміцелюлозою матеріали обробляють ксиланазою й/або целюлазою для того, щоб одержати цукор.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що отриманий цукор зброджують у спирт, який потім відокремлюють і відділяють.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, який відрізняється тим, що підготовлену тверду речовину піддають взаємодії із ксиланазою, і отриману рідку фазу перетворюють в ксилітол, і тверду речовину, що залишилась, - далі піддають взаємодії із целюлазою з утворенням різних продуктів ферментації; або - піддають термічному або термохімічному перетворенню; або - піддають мікробіологічному перетворенню з бактеріями, дріжджами або грибами; або

- піддають подальшій стадії делігнофікування з метою одержання целюлозно-волокнистих матеріалів.

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що підготовлену тверду речовину піддають взаємодії із ксиланазою й отриману рідку фазу за допомогою ксилозодегідрогенази перетворюють в ксилітол, і тверду речовину, що залишилась, - далі піддають взаємодії із целюлазою з утворенням різних продуктів ферментації; або - піддають термічному або термохімічному перетворенню; або - піддають мікробіологічному перетворенню з бактеріями, дріжджами або грибами; або - піддають подальшій стадії делігнофікування з метою одержання целюлозно-волокнистих матеріалів.

11. Спосіб за будь-яким із пп. 9 або 10, який відрізняється тим, що після відділення продуктів ферментації тверду речовину, що залишилась, ферментують в установці для одержання біогазу й далі переробляють у біогаз.