BR102020025455A2 - Composição de vacina de subunidade contra dengue - Google Patents

Abstract

composição de vacina de subunidade contra dengue. a presente invenção diz respeito a uma composição de vacina de subunidade contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão de uma proteína não-estrutural 1 delta c (ns1¿c ou ns1¿c truncada) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de ns3c (ou ns3c truncada) e/ou domínio iii consenso da proteína do envoltório (cediii), aumentando assim a proteção contra o desafio com o vírus da dengue (denv) e amenizando efeitos patológicos associados.

Description

COMPOSIÇÃO DE VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA DENGUE ANTECEDENTES Campo da Invenção

[0001] A presente invenção diz respeito a uma composição de vacina de subunidade, e, mais especificamente, a presente invenção está relacionada a uma composição de vacina de subunidade recombinante contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão de uma proteína não estrutural 1 delta C (NS1ΔC ou NS1ΔC truncada) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de NS3c (ou NS3c truncada) e/ou ao domínio III consenso da proteína do envoltório (cEDIII).

Descrição da Técnica Relacionada

[0002] O vírus da dengue (DENV) é a doença viral transmitida por artrópodes mais importante na saúde pública em todo o mundo (WHO, 2016). O DENV é transmitido às pessoas pelos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus, estimando-se causar 390 infecções por ano, das quais 96 milhões de casos com manifestações aparentes e 500.000 casos de febre hemorrágica da dengue ou síndrome do choque da dengue (DHF/DSS) (Bhatt et al., 2013; Diamond e Pierson, 2015; Katzelnick et al., 2017). Até a presente data, a transmissão do DENV tem sido relatada em mais de 128 países, afetando principalmente os trópicos e subtrópicos das regiões da Ásia e da América Latina. Portanto, o desenvolvimento da vacina da dengue é de extrema importância para se controlar a doença da dengue (Wan et al., 2013).

[0003] A primeira vacina no mundo contra a dengue, Dengvaxia® (também chamada de CYD-TDV), foi lançada pela Sanofi Pasteur em dezembro de 2015; entretanto, a segurança nos receptores soronegativos da vacina permanece como uma preocupação (Wichmann et al., 2017; Normile, 2017; Sridhar et al., 2018; Gubler and Halstead, 2019). Duas vacinas adicionais contra a dengue, TV003/TV005, desenvolvida pelo National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), EUA, e a TAK-003, desenvolvida pela Takeda, estão na fase III dos ensaios clínicos (Kirkpatrick et al., 2015; Biswal et al., 2019). Estas três vacinas são vacinas vivas atenuadas (Screaton et al., 2015; WHO, 2016). Devido às questões de segurança do atual programa de vacinação contra a dengue da Dengvaxia®, outros candidatos à vacina viva atenuada tendem a passar por um exame mais rigoroso (Normile, 2017). O desenvolvimento de vacinas e/ou terapias antivirais aprimoradas contra o DENV continua sendo uma prioridade da saúde pública global.

[0004] Para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade contra a dengue, os estudos anteriores sugeriram que a proteína do envoltório (E) é um antígeno majoritário para induzir respostas de anticorpos protetoras. O domínio III da proteína E (EDIII), que contém sítios de reconhecimento de receptores de superfície celular, é considerado como um potencial alvo para a vacina de subunidade (Guzman et al., 2010). Entretanto, os anticorpos contra E não apenas são neutralizantes, mas também melhoram a infecção por DENV através do potencialização dependente de anticorpos (ADE) (Guzman et al., 2015). Um imunógeno EDIII consenso (cEDIII) foi preparado através do alinhamento de sequências de diferentes isolados dos quatro sorotipos de DENV. Estudos mostraram que o cEDIII provocou respostas de anticorpos que geram a neutralização cruzada dos quatro sorotipos de DENV (Leng et al., 2009). Em um estudo com primatas não-humanos, os macacos que receberam o cEDIII com fosfato de alumínio desenvolveram uma resposta de anticorpos significativamente forte e duradoura contra o DENV2. A resposta das células T específicas com produção de citocina também foi induzida e correlacionada com a resposta de anticorpos (Chen et al., 2013).

[0005] A proteína NS1 é dimerizada após a modificação pós-traducional no lúmen do retículo endoplásmico (ER) e é expressada na superfície das células infectadas. A NS1 também é secretada como um hexâmero solúvel associado a lipídios, que se torna um alvo importante da imunidade humoral (Flamand et al., 1999; Muller and Young, 2013). Ficou provado que níveis maiores de NS1 associados ao DHF e à NS1 persistem por uma duração maior nos indivíduos com extravasamento vascular (Adikari et al., 2016; Malavige and Ogg, 2017). A NS1 secretada pode ativar as células, liberando citocinas pró-inflamatórias que causam tempestade de citocinas, contribuindo assim para o extravasamento vascular (Beatty et al., 2015; Modhiran et al., 2015). A NS1 secretada rompe o glicocálice endotelial, o que leva à hiperpermeabilidade (Puerta-Guardo et al., 2016; Chen et al., 2016; Chen et al., 2018). Um estudo recente mostrou que a NS1 também pode ativar plaquetas através de TLR4, levando à trombocitopenia e hemorragia (Chao et al., 2019). Baseado nessas descobertas, há, portanto, cada vez mais atenção no sentido de focar-se na NS1 como um candidato para o desenvolvimento de vacina e estratégia terapêutica (Halstead, 2013; Amorim et al., 2014; Glasner et al., 2018).

[0006] Entretanto, os anticorpos gerados contra a NS1 do DENV reconhecem epítopos comuns em proteínas, plaquetas e células endoteliais relacionadas à coagulação. Estudos anteriores dos inventores indicaram que os anticorpos anti-DENV NS1 realizam reação cruzada com plaquetas humanas, bem como células endoteliais, e causam seu dano e disfunção (Lin et al., 2001, 2003, 2005, 2011; Chen et al., 2013). As regiões de homologia entre a DENV NS1 e os antígenos de superfície celular estão predominantemente localizadas nos resíduos de aminoácidos C-terminal 311 a 352 (Cheng et al., 2009). A deleção da região C-terminal de NS1 para gerar NS1ΔC reduziu em grande medida a reatividade cruzada (Chen et al., 2009). A imunização passiva com anticorpos policlonais ou monoclonais anti-NS1ΔC reduziu o tempo de sangramento prolongado induzido por DENV e a hemorragia (Wan et al., 2014; Wan 2017). Portanto, é necessário determinar os efeitos protetores da proteína de fusão de cEDIII-NS1ΔC como potenciais candidatos a vacina de subunidade.

SUMÁRIO

[0007] Um aspecto da invenção proporciona uma composição de uma vacina de subunidade contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão de um polipeptídeo de proteína não-estrutural 1 delta C (NS1ΔC) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c e/ou um domínio III consenso da proteína do envoltório (cEDIII), e opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0008] Outro aspecto da invenção proporciona uma composição de uma vacina de subunidade contra a dengue compreendendo um polipeptídeo NS3c e uma proteína de fusão do domínio III consenso da proteína do envoltório e da proteína não-estrutural 1 delta C (cEDIII-NS1ΔC), e opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0009] Um aspecto adicional da invenção proporciona uma composição de uma vacina de subunidade contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão de NS1ΔC e NS3c, opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0010] Em vista do aspecto anterior, a invenção proporciona uma composição de vacina de subunidade contra a dengue, que compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo NS1ΔC conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c e/ou um polipeptídeo cEDIII. Nesta modalidade, o polipeptídeo NS1ΔC pode ser listado como as SEQ ID NOs: 2 ou 5, o polipeptídeo cEDIII pode ser listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4, e o polipeptídeo NS3c pode ser listado como as SEQ ID NOs: 3 ou 6. Ademais, a proteína de fusão opcionalmente junto com os um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0011] Em vista do aspecto anterior, a invenção também proporciona uma composição de vacina de subunidade contra a dengue. A composição compreende uma proteína de fusão incluindo um polipeptídeo cEDIII da SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo NS1ΔC da SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo NS3c incluindo a SEQ ID NO: 3; e opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0012] Em uma modalidade, a proteína de fusão supramencionada pode estar em uma ordem de cEDIII-NS1ΔC a partir do N-terminal para o C-terminal. Em um exemplo, a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS1ΔC.

[0013] Na modalidade, a proteína de fusão em uma ordem de NS1ΔC-cEDIII a partir do N-terminal para o Cterminal pode ser conjugada para o polipeptídeo NS3c. Em um exemplo, um segundo conector pode ser conjugado entre o polipeptídeo NS1ΔC e o polipeptídeo NS3c.

[0014] Na modalidade, a proteína de fusão pode estar em uma ordem de NS1ΔC-cEDIII a partir do N-terminal para o C-terminal. Em um exemplo, a proteína de fusão pode incluir um primeiro conector entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS1ΔC.

[0015] Em uma modalidade, a proteína de fusão em uma ordem de NS1ΔC-cEDIII a partir do N-terminal para o C-terminal pode ser conjugada para o polipeptídeo NS3c. Em um exemplo, um segundo conector pode ser conjugado entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS3c.

[0016] Em uma modalidade, a composição da vacina de subunidade contra a dengue pode adicionalmente incluir um adjuvante.

[0017] Em vista do aspecto anterior, a invenção adicionalmente proporciona uma composição de vacina de subunidade contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão do polipeptídeo NS1 truncado da SEQ ID NO: 5 e do polipeptídeo NS3c truncado da SEQ ID NO: 6, e opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0018] Na modalidade, a proteína de fusão está em uma ordem de NS1 truncada-NS3c truncada a partir do Nterminal para o C-terminal.

[0019] Em uma modalidade, a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre a NS1 truncada e o polipeptídeo NS3c truncado.

[0020] Em uma modalidade, a proteína de fusão está em uma ordem de NS3c truncada-NS1 truncada a partir do N-terminal para o C-terminal.

[0021] Em uma modalidade, a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre a NS1 truncada e o polipeptídeo NS3c truncado.

[0022] Em uma modalidade, a composição adicionalmente compreende um polipeptídeo cEDIII listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4. Nesta modalidade, o polipeptídeo NS1 truncado da proteína de fusão pode ser opcionalmente conjugado com o polipeptídeo cEDIII. Em alguns exemplos, o polipeptídeo NS3c truncado da proteína de fusão pode ser opcionalmente conjugado com o polipeptídeo cEDIII. Em outros exemplos, o polipeptídeo cEDIII pode ser opcionalmente conjugado entre o polipeptídeo NS1 truncado e o polipeptídeo NS3c truncado.

[0023] Com a aplicação da composição supramencionada da vacina de subunidade contra a dengue, que compreende a proteína de fusão de cEDIII-NS1ΔC e o polipeptídeo NS3c, ou uma proteína de fusão do polipeptídeo NS1 truncado e do polipeptídeo NS3c truncado, aumenta-se assim a proteção contra o desafio por DENV e aliviam-se efeitos patológicos associados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A revelação pode ser compreendida mais plenamente através da leitura da descrição detalhada seguinte da modalidade, tomando como referência os desenhos acompanhantes como se segue.

[0025] As FIGS. 1A a 8B representam várias subunidades da composição de vacinas de subunidade contra a dengue de acordo com as modalidades da presente invenção.

[0026] As FIGS. 9A a 9C representam os resultados das respostas de anticorpos induzidas por imunização com as proteínas recombinantes cEDIII-NS1ΔC, cEDIII mais DJ NS1 e DJ NS1. (FIG. 9A) O diagrama mostra cEDII, NS1ΔC, DJ NS1 e uma fusão linear das proteínas recombinantes cEDIII-NS1ΔC. (FIG. 9B) Camundongos foram imunizados subcutaneamente três vezes com 25 µg de cEDIIINS1ΔC/camundongo, 5 µg de cEDIII + 20 µg DJ NS1/camundongo ou 25 µg de proteína NS1 DJ/camundongo com alume como adjuvante. (FIG. 9C) Soros de camundongos foram coletados e títulos de anticorpos foram determinados três dias após a segunda e terceira imunização. (n = 3).

[0027] As FIGS. 10A a 10D representam os resultados da determinação de títulos de anticorpos neutralizantes contra quatro sorotipos de DENV no soro de camundongos imunizados com cEDIII-NS1ΔC ou proteína NS1 DJ misturada com alume. Diluições em série duplas de soro controle, soro com alume, soro com cEDIII-NS1ΔC e soro com NS1 DJ foram misturadas com 50 a 80 PFU de DENV1 (FIG. 10A), DENV2 (FIG. 10B), DENV3 (FIG. 10C) ou DENV4 (FIG. 10D) por 1 h à temperatura ambiente, seguido de inoculação em 1 × 105 células BHK-21. Os anticorpos neutralizantes contra DENV foram determinados pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT). Os dados de cada grupo são expressados como a porcentagem média de produção de placas com barra de desvio padrão (n = 3).

[0028] As FIGS. 11A a 11D representam os resultados do soro de camundongos imunizados com proteína cEDIII-NS1ΔC ou NS1 DJ misturada com alume causando citólise mediada por complemento nas células infectadas por quatro sorotipos diferentes de DENV. Células HMEC-1 foram infectadas individualmente com DENV1 (FIG. 11A), DENV2 (FIG. 11B), DENV3 (FIG. 11C) ou DENV4 (FIG. 11D) (MOI = 20) por 48 h. As células foram então incubadas com diluição de 1:200 de soro controle, soro com alume, soro com cEDIIINS1ΔC e soro com NS1 DJ com ou sem complemento por 6 h a 37°C. Os sobrenadantes celulares foram coletados e examinados quanto à liberação de lactato desidrogenase (LDH). As médias de culturas triplicatas ± desvio padrão são apresentadas. **: p < 0.01; ***: p < 0.001 (n = 3).

[0029] As FIGS. 12A e 12B representam um design experimental e títulos de anticorpos em camundongos imunizados com proteína cEDIII-NS1ΔC antes de diferentes sorotipos de infecção por DENV. (FIG. 12A) Camundongos foram imunizado subcutaneamente (s.c.) três vezes com 25 μg/camundongo de proteína cEDIII-NS1ΔC misturada com alume. Soros de camundongos foram coletados e títulos de anticorpos foram determinados três dias após a 2a e 3a imunização. (n = 2 para o grupo controle, n = 3 para o grupo DENV sozinho, n = 4 para DENV mais grupo alume e DENV mais cEDIII-NS1ΔC misturada com alume). (FIG. 12B) Camundongos foram inoculados com 1 × 108 PFU de DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 por via intravenosa (i.v.) no dia 24. Após 2 dias pós-infecção, os camundongos foram examinados quanto ao tempo de sangramento prolongado e os soros foram coletados para determinar os títulos virais e os níveis de NS1 solúvel como ilustrado nas FIGS. 13A a 14D.

[0030] As FIGS. 13A a 13D representam como a imunização ativa com cEDIII-NS1ΔC reduz o tempo de sangramento prolongado induzido por DENV. O modelo de camundongo da imunização é ilustrado na FIG. 12A. Os camundongos foram inoculados com 1 × 108 PFU de DENV1 (FIG. 13A), DENV2 (FIG. 13B), DENV3 (FIG. 13C), e DENV4 (FIG. 13D) por via intravenosa no dia 24. O tempo de sangramento de cauda de camundongos foi determinado em 2 dias pósinfecção. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; ns: não significativo.

[0031] As FIGS. 14A a 14D representam a imunização ativa com cEDIII-NS1ΔC para reduzir títulos virais em soros de camundongos. Camundongos foram inoculados com 1 × 108 PFU of DENV1 (FIG. 14A), DENV2 (FIG. 14B), DENV3 (FIG. 14C) e DENV4 (FIG. 14D) por via intravenosa (i.v.) no dia 24. Os camundongos foram sacrificados em 2 dias após a infecção. Os soros foram coletados para detectar os títulos virais por ensaio de foco fluorescente (FFA). **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; ns: não significativo.

[0032] As FIGS. 15A a 15D representam os resultados dos níveis de imunização ativa (%) com NS1 DJ e NS3 induzindo ativação de ambas as células T CD4+ e CD8+ em resposta à estimulação por antígeno NS1 DJ ou NS3 ex vivo. Camundongos C3H/HeN foram imunizados subcutaneamente com diferentes doses de imunógeno, isto é, 25 μg de NS1 DJ mais 12,5 μg de NS3/mouse, 25 μg de NS1 DJ/camundongo, 12,5 μg de NS3/camundongo, alume isoladamente ou PBS no dia 0 e reforçados no dia 14. Os camundongos foram sacrificados no dia 21 e células do gânglio linfático (LN) foram coletadas e reestimuladas com 5 μg/mL de proteínas NS1 DJ ou NS3 por 3 dias e incubadas com anticorpos anti-CD3/CD28 pelas 4 h finais, em seguida triplamente coradas com anti-CD25 marcado com PE, anti-CD4 marcado com FITC e anti-CD8 marcado com PE/Cy7 para analisar a expressão de CD25 das células T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo. (FIG. 15A) Porcentagem de CD25+ em células T CD4+ em resposta à estimulação por antígeno NS1 DJ. (FIG. 15B) Porcentagem de CD25+ em células T CD4+ em resposta à estimulação por antígeno NS3. (FIG. 15C) Porcentagem de CD25+ em células T CD8+ em resposta à estimulação por antígeno NS1 DJ. (FIG. 15D) Porcentagem de CD25+ em células T CD8+ em resposta à estimulação por antígeno NS3. n = 5 para NS1 DJ mais grupo NS3 e n = 4 para outros grupos. As médias de cada grupo ± desvio padrão são apresentadas. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, conforme determinado por análise de variância simples (one-way ANOVA) com o teste post hoc de Tukey.

[0033] As FIGS. 16A a 16C representam os resultados da imunização ativa com NS1 DJ e NS3 induzindo respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) contra células L929 expressando NS3. (FIG. 16A) Design experimental do ensaio de viabilidade celular de CTL Células de gânglios linfáticos foram coletadas e reestimuladas com 5 μg/mL de proteínas NS1 DJ ou NS3 por 3 dias como células efetoras. (FIG. 16B) células L929 expressando NS1 foram co-cultivadas com células efetoras à razão E:T de 20:1. Após 4 h, as células alvo foram coletadas e examinadas quanto à morte celular por coloração com PI e citometria de fluxo. Os níveis de expressão de NS1 foram detectados por Western blotting. (FIG. 16C) NS2B/3 com S135A foi usado para células expressando NS3, e a atividade de protease prejudicada das construções mutadas foi confirmada por meio da análise da ausência de autoprocessamento de NS2B3 por Western blotting. Células L929 expressando NS3 foram cocultivadas com células efetoras à razão E:T de 20:1. Após 4 h, as células alvo foram coletadas e examinadas quanto à morte celular por coloração com PI e citometria de fluxo. n = 5 para NS1 DJ mais grupo NS3 e n = 4 para outros grupos. As médias de cada grupo ± desvio padrão são apresentadas. *p < 0.05, **p < 0.01, conforme determinado por análise variância simples (one-way ANOVA) com o teste post hoc de Tukey.

[0034] As FIGS. 17A a 17B representam os resultados da expressão aumentada de CD107a, um marcador para atividade de células T CD8+ citotóxicas, nos camundongos NS1 DJ e NS3 imunizados após estimulação de antígenos de NS1 DJ (FIG. 17A) ou NS3 (FIG. 17B) ex vivo. Os camundongos foram sacrificados no dia 21 e células do gânglio linfático foram coletadas e reestimuladas com 5 μg/mL de proteínas NS1 DJ ou NS3 por 3 dias, e então incubados com anticorpos anti-CD3/CD28, monensina, e brefeldina A para as 4 h finais para realizar a coloração de superfície da expressão de CD107a em células T CD8+ por citometria de fluxo. n = 5 para NS1 DJ mais grupo NS3 e n = 4 para outros grupos. As médias de cada grupo ± desvio padrão são apresentadas. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, conforme determinado por análise variância simples (one-way ANOVA) com o teste post hoc de Tukey.

[0035] As FIGS. 18A a 18C representam os resultados da imunização ativa com NS1 DJ e NS3 para reduzir títulos virais no soro de camundongos infectados com DENV. (FIG. 18A) Design experimental do modelo de camundongo de imunização é apresentado (n = 3/grupo). Camundongos C3H/HeN foram inoculados por via intravenosa com 1 × 108 PFU da cepa de DENV2 454009A no dia 17. (FIG. 18B) Ilustra-se a imunização ativa com NS1 DJ e NS3 reduzindo a tendência de sangramento causado por DENV. Os camundongos foram inoculados por via intravenosa com 1 × 108 PFU da cepa de DENV2 454009A no dia 17. O tempo de sangramento de cauda é determinado em 2 dias após a infecção. (FIG. 18C) Os camundongos foram sacrificados no dia 19 e amostras de soro foram coletadas para determinar os títulos virais por FFA. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, conforme determinado por análise variância simples (one-way ANOVA) com o teste post hoc de Tukey.

[0036] A FIG. 19 representa um modelo esquemático das respostas imune e efeitos protetores induzidos por imunização ativa com NS1 DJ e NS3. A incorporação de proteínas NS1 DJ e NS3 para imunização pode induzir de modo sinérgico respostas imunes mais efetivas, como demonstrado pela geração de respostas CTL específicas a NS3 e expressão de CD107a elevada, além de promover respostas de células T específicas a NS1 e títulos de anticorpos. Os mecanismos protetores incluem o extermínio direto das células infectadas por DENV pelos CTLs e a neutralização dos efeitos patogênicos induzidos por NS1 pelos anticorpos anti-NS1.

[0037] As FIGS. 20A a 20D representam níveis de expressão da proteína de fusão NS1ΔC-cEDIII-NS3c truncada (FIGS. 20A e 20B, MW=49 kDa) e da proteína de fusão NS1ΔC truncada-NS3c truncada (FIGS. 20C e 20D, MW=35 kDa) detectados por SDS-PAGE (FIGS. 20A e 20C) e Western blotting (FIGS. 20B e 20D) de acordo com várias modalidades da presente invenção.

[0038] As FIGS. 21A a 21D representam o design experimental (FIG. 21A) e os resultados (FIGS. 21B a 21D) da imunização ativa com proteína de fusão NS1ΔC truncadacEDIII-NS3c truncada (ou chamada de NS1f∆C-cEDIII-NS3cf) e proteína de fusão NS1ΔC truncada-NS3c truncada (ou chamada de NS1f∆C-NS3cf), ambas purificadas a partir de células 293F de mamíferos, para reduzir títulos virais (FIG. 21B), citotoxicidade dependente de complemento (CDC; FIG. 21C) e tempo de sangramento (FIG. 21D) nos camundongos infectados por DENV.

[0039] As FIGS. 22A a 22D representam o design experimental (FIG. 22A) e os resultados (FIGS. 22B a 22D) da imunização ativa com proteína de fusão NS1ΔC truncadacEDIII-NS3c truncada (ou chamada de NS1f∆C-cEDIII-NS3cf) e proteína de fusão NS1ΔC truncada-NS3c truncada (ou chamada de NS1f∆C-NS3cf), ambas purificadas a partir de células S2 de Drosófilas, para reduzir títulos virais (FIG. 22B), citotoxicidade dependente de complemento (CDC; FIG. 22C) e tempo de sangramento (FIG. 22D) nos camundongos infectados por DENV.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0040] As modalidades da invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada seguinte, a qual prossegue com referência aos desenhos acompanhantes, nos quais as mesmas referências se relacionam aos mesmos elementos.

[0041] Todas as publicações aqui são incorporadas a título de referência tal como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse indicado específica e individualmente como sendo incorporado a título de referência. Quando uma definição ou uso de um termo em uma referência incorporada for inconsistente ou contrário à definição desse termo aqui apresentado, a definição desse termo aqui apresentada se aplica e a definição desse termo na referência não se aplica.

[0042] Para fins de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições irão se aplicar e , sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice versa. Definições adicionais são apresentadas por toda a descrição detalhada.

[0043] Os termos “um”, “uma”, “o", “a”, “os”, “as”, “referido” e “referida”, tais como empregados aqui, são definidos no sentido de “um ou mais” e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado.

[0044] A presente invenção revela uma composição de vacina de subunidade contra a dengue, a qual compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo de proteína não-estrutural 1 delta C (NS1ΔC) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c e/ou domínio III consenso da proteína do envoltório (cEDIII), aumentando assim a proteção contra o desafio com o vírus da dengue (DENV) e amenizando efeitos patológicos associados. Ademais, a invenção proporciona uma composição de uma vacina de subunidade contra a dengue compreendendo um polipeptídeo NS3c e uma proteína de fusão do domínio III consenso da proteína do envoltório e da proteína não-estrutural 1 delta C (cEDIII-NS1ΔC). Alternativamente, a invenção proporciona uma composição de uma vacina de subunidade contra a dengue compreendendo uma proteína de fusão do polipeptídeo NS1 truncado (ou chamado de NS1f∆C) e do polipeptídeo NS3c truncado (ou chamado de NS3cf). Como alternativa, a composição também compreende segmentos de polinucleotídeos codificando os polipeptídeos supramencionados.

[0045] O termo “vacina de subunidade contra a dengue” aqui empregado inclui uma proteína de fusão do polipeptídeo NS1 do vírus da dengue truncado conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c e/ou um polipeptídeo cEDIII, e quando formada junto com um veículo e um adjuvante farmaceuticamente aceitáveis, oferece assim melhor proteção contra o desafio pelo vírus da dengue (DENV) e ameniza efeitos patológicos associados.

[0046] Em algumas modalidades, o termo “proteína de fusão” aqui citado se refere a um polipeptídeo NS1ΔC (ou NS1ΔC truncado) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c (ou NS3c truncado) e/ou um polipeptídeo cEDIII em qualquer ordem, por exemplo, cEDIII-NS1ΔC, NS1ΔC-cEDIII, NS1ΔC-NS3c, NS3c-NS1ΔC, cEDIII-NS1ΔC-NS3c, NS1ΔC-cEDIII-NS3c, NS3c-cEDIIINS1ΔC, diretamente através de uma ligação peptídica convencional, ou seja, sem nenhum conector adicional, ou através de pelo menos um conector adicional, tal como o conector-1 e o conector-2, variantes das proteínas de fusão que são ilustradas nas FIGS. 1A a 8B.

[0047] Em certas modalidades, o polipeptídeo “cEDIII” pode ser exemplificado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4. O polipeptídeo “NS1ΔC” pode ser exemplificado como as SEQ ID NOs: 2 ou 5. O polipeptídeo “NS3c” pode ser exemplificado como as SEQ ID NOs: 3 ou 6.

[0048] Em outras modalidades, o polipeptídeo NS1 truncado da proteína de fusão pode ser listado como a SEQ ID NO: 5, e o polipeptídeo NS3c truncado da proteína de fusão pode ser listado como a SEQ ID NO: 6. Nessas modalidades, a composição pode adicionalmente incluir um polipeptídeo cEDIII listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4. Em certas modalidades, a proteína de fusão pode opcionalmente incluir um polipeptídeo cEDIII listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4, antes, após ou entre o NS1ΔC e o NS3c em qualquer ordem.

[0049] Em algumas modalidades, o conector, tal como o conector-1 ou o conector-2 mencionados aqui, tem de ser compreendido indistintamente como “conector” ou “espaçador”, como regularmente utilizado em biologia molecular. O conector pode ser qualquer oligopeptídeo ou composto conhecido para conjugar ou conectar NS1ΔC (ou NS1ΔC truncado, NS1f∆C) a pelo menos um polipeptídeo de NS3c (ou NS3c truncado, NS3cf) e cEDIII. Em alguns exemplos, o conector pode conter pelo menos um aminoácido, aminoácido modificado, ou elemento que seja um aminoácido não-humano. Ele pode conter, por exemplo, um ou vários dos seguintes elementos: ácido amino-3-oxapentanoico, PEG1, PEG2, PEG4, beta-aminoácido, gama-aminoácido, ácido aminohexanoico ou ácido amino-3,6-dioxaoctanoico.

[0050] O termo “vacina de subunidade contra a dengue” pode se referir às composições tais como supramencionadas, para oferecer melhor proteção contra o desafio por DENV e amenizar efeitos patológicos associados.

[0051] O termo “sujeito” inclui animais humanos e não-humanos. Dentre os animais não-humanos estão todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e nãomamíferos, tais como primadas não-humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado, os termos “paciente” ou “sujeito” são usados aqui de maneira intercambiável.

[0052] Certas modalidades ilustrativas de acordo com a presente revelação são descritas como se segue, mas estas modalidades não devem ser consideradas como limitando a presente invenção. Várias modificações e alterações podem ser feitas por aqueles minimamente capacitados na técnica à qual pertence a presente invenção, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

EXEMPLOS Definição do Modelo Animal de Teste

[0053] Camundongos C3H/HeN foram obtidos junto ao Charles River Breeding Laboratories. Eles foram mantidos com alimentação convencional de laboratório e água no Centro de Laboratório Animal do National Cheng Kung University Medical College. Sua prole com 6 a 8 semanas de idade ou 3 semanas de idade foi usada para a geração de anticorpos e experimentos de infecção. O protocolo de uso animal foi revisto e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). As modalidades a seguir foram aprovadas pelo Comitê de Ética para Experimentos em Animais da National Cheng Kung University.

Preparação das proteínas recombinantes e soros

[0054] O Exemplo construiu o cEDIII-NS1ΔC por meio da fusão do fragmento de DNA de NS1ΔC com a construção cEDIII (proveniente do Dr. Hsin-Wei Chen) usando os sítios Not I e Xho I no plasmídeo pET21b. Como resultado, a extremidade C-terminal da proteína recombinante contém uma marca de hexahistidina adicional (Marca His). Para expressar a proteína, a construção foi transformada nas cepas BL21 de Escherichia coli para gerar E. coli que expressou a proteína de fusão cEDIII-NS1ΔC. As bactérias foram cultivadas em caldo Luria, induzido com 0.5 mM de isopropil tiogalactosídeo (IPTG) e peletizadas. Subsequentemente, as bactérias foram submetidas à lise após sonicação. Uma vez que as proteínas cEDIII-NS1ΔC foram recuperadas como agregado insolúvel a partir dos corpos de inclusão, o cEDIII-NS1ΔC foi desnaturado no tampão uréia (área de 8 M, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl). As proteínas recombinantes foram primeiro purificadas por níquel (coluna de Ni2+) e então renaturadas por meio da diluição lenta dos reagentes desnaturantes na presença de L-arginina, EDTA, PMSF, glutationa reduzida e glutationa oxidada. O Exemplo a concentrou usando uma Unidade de Filtro Centrífugo Ultra-30 com membrana Ultracel-30 (Millipore). Além disso, NS1ΔC (deleção dos aminoácidos 271-352) e NS1 DJ (aminoácidos 1-270 do NS1 de DENV e aminoácidos 271-352 de NS1 JEV) cDNA foram clonados no vetor pET28a com a Marca His. Esses plasmídeos foram preparados pela Proteomic Research Core Facility, Academia Sinica. O plasmídeo cEDIII obtido a partir do Dr. Hsin-Wei Chen foi expressado em BL21 de E. coli. Após a purificação, as proteínas foram examinadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio a 10% ou 12% (SDS-PAGE). O cEDIIINS1ΔC purificado foi misturado com alume como adjuvante para imunizar os camundongos C3H/HeN subcutaneamente três vezes. Os soros dos camundongos foram coletados e os títulos de anticorpos foram determinados sete dias após a primeira imunização, e três dias após a segunda e terceira imunização. Após o sacrifício, os soros de camundongos também foram coletados e armazenados a −20°C.

[0055] O cDNA de NS1 DJ (aminoácido 1-270 de NS1 DENV fusionado ao aminoácido 271-352 de NS1 JEV) foi clonado no vetor pET28a com a marca His (Wan et al., 2014). O plasmídeo foi preparado pela Proteomic Research Core Facility, Academia Sinica, Taiwan. Após a introdução dos plasmídeos em BL21 de E. coli BL21, as proteínas recombinantes foram induzidas por 1 mM de isopropil B-D-1- tiogalaactopiranosídeo (IPTG) (Calbiochem, San Diego, CA), solubilizadas em tampão uréia (8 M de uréia, 500 mM de NaCl, e 20 mM de Tris-HCl) e púrificadas em uma coluna de afinidade de Ni2+-NTA (GE Healthcare Life Science, Reino Unido). Após a purificação, as proteínas foram examinadas por SDS-PAGE, seguido de coloração com azul brilhante Coomassie R250. As proteínas purificadas foram dialisadas em tampão de renaturação (50 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 250 mM de L-arginina, 10 mM de GSH [glutationa, reduzida], e 1 mM de GSSG [glutationa, oxidada], e glicerol a 5%) e concentradas por Filtros Ultra-Centrífugos Amicon (Millipore, Billerica, MA).

[0056] O cDNA de NS3 de DENV foi clonado no vetor pET21b com a marca His (fornecida pelo Dr. Chia-Yi Yu, National Health Research Institutes). Os plasmídeos foram usados para transformar BL21 de E. coli. As células foram cultivadas à noite a 37°C em meio de Luria-Bertania (LB) contendo 100 μg/mL de ampicilina. As culturas à noite foram diluídas 100 vezes no meio LB com 100 μg/mL de ampicilina e adicionalmente incubadas a 37°C até que o OD a 600 nm alcançasse 0.5. A expressão de NS3 de DENV2 foi então induzida pela adição de 1 mM de IPTG por 6 h a 30°C. Para analisar a expressão da proteína NS3, as amostras foram centrifugadas a 8,000 × g por 30 min a 4°C. As células foram colhidas por centrifugação e os pellets foram armazenados a −80°C até o uso. Os pellets bacterianos foram coletados e analisados por eletroforese. Para purificação de proteínas, os pellets foram ressuspensos em PBS e foram lisados por sonicação em gelo. A suspensão celular foi centrifugada a 13.000 × g por 30 min. O pellet contendo corpos de inclusão foi ressuspenso em tampão de ligação (8 M de uréia, 0,5 M de NaCl, e 20 mM de Tris-HCl, pH 6.95) e lisado por sonicação em gelo novamente e clarificado por centrifugação a 13.000 × g por 45 min a 4°C. O sobrenadante contendo proteína solúvel foi carregado em uma coluna de Ni2+. A coluna foi lavada com tampão de lavagem (8 M de uréia, 0,5 M de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, e 120 mM de imidazol, pH 6.95). Proteínas marcadas com His foram eluídas com tampão de eluição (8 M de uréia, 0,5 M de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, e 300 mM de imidazol, pH 6.95). Após a purificação, as proteínas foram examinadas por SDS-PAGE. As proteínas purificadas foram destituídas de uréia por diálise em tampão de renaturação (50 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 250 mM de L-arginina, glicerol a 10%, 10 mM de GSH e 1 mM de GSSG, pH 6.95) e concentradas por Filtros Ultra-Centrífugos Amicon (Millipore).

[0057] Para misturar o antígeno com Alume, o Exemplo primeiramente adicionou Alume Imject (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) gota a gota com mistura constante à solução de antígeno de modo que a razão de volume final do Alume Imject para o antígeno fosse de 1:1 (100 μL de Alume Imject para 100 μL de Ag). Em seguida, continuou-se a mistura durante a noite a 4°C para permitir a adsorção completa do Alume Imject-antígeno. Outros clones foram clonados pelos métodos supramencionados e suas identidades de sequência foram apresentadas na Tabela 1.

Culturas celulares

[0058] Células dos rins de hamster bebê (BHK21) foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo antibiótico e FBS 5%. As células C6/36 e as células L929 foram cultivadas em DMEM contendo antibiótico e FBS 10%. Os linfócitos foram coletados a partir dos gânglios linfáticos de camundongos e cultivados em meio RPMI-1640 contendo antibiótico, FBS 10%, aminoácidos nãoessenciais 1%, piruvato de sódio 1%, e 50 μM de 2-ME a 37°C em 5% CO2. As células HMEC-1 foram obtidas junto aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and Prevention, EUA), e foram passadas em frascos de cultura com meio de crescimento de células endoteliais M200 (Invitrogen) suplementado com 1 μg/mL de hidrocortisona, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico, 3 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico, 10 μg/mL de heparina, e antibiótico. As células foram separadas usando tampão separador com 1000 U/mL de tripsina e 0,5 mM de EDTA.

Cultura do vírus

[0059] A cepa de DENV2 454009A foi originalmente isolada a partir de um paciente com dengue em Taiwan e mantida nas células C6/36. Resumidamente, monocamadas de células C6/36 foram incubadas com DENV em um multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 e incubadas a 28°C em CO2 a 5% por 5 dias. O meio cultivado foi coletado e o resíduo celular foi removido por centrifugação a 1000 × g por 10 min. O sobrenadante viral foi coletado e armazenado a −70°C até o uso. O título viral foi determinado por ensaio de placa usando células BHK-21. Resumidamente, as células BHK-21 foram plaqueadas em placas de 12 poços (8 × 104 células/poço) e cultivadas em DMEM sob condições enriquecida com CO2. Após adsorção com vírus diluído em série por 1 h, o inóculo foi substituído por DMEM fresco contendo FBS a 2% e metil celulose a 0,8%. Cinco dias após a infecção, o meio foi removido, e as células foram fixadas e coradas com solução de cristal violeta consistindo de cristal violeta a 1%, NaCl a 0,64% e formalina a 2%.

Ensaio de placa

[0060] As células BHK21 foram semeadas em placas de 12 poços (1 × 105 células/poço) em DMEM com FBS a 5% durante a noite a 37°C sob condição de CO2 a 5%. O meio foi então removido, diluições em série de sobrenadantes virais em DMEM com FBS a 2% foram adicionadas (0,4 mL/poço), e as células foram incubadas por 1 h a 37°C. Subsequentemente, adicionou-se DMEM contendo FBS a 2% e metil celulose a 0,8% (Sigma-Aldrich; 1 mL/poço), e as placas foram incubadas a 37°C por 5 dias. Cinco dias após a infecção, o meio foi removido, e as placas foram visualizadas após serem fixadas e coradas com solução de cristal violeta (cristal violeta a 1%, NaCl a 0,64%, formaldeído a 2%) por 1.5 h à temperatura ambiente. As concentrações virais foram determinadas como PFU/mL e usadas para calcular a multiplicidade de infecção (MOI) nos experimentos de infecção.

Teste de neutralização por redução de placas

[0061] O teste de neutralização por redução de placas (PRNT) foi realizado com a cepa de DENV1 8700828, a cepa de DENV2 16681, a cepa de DENV3 8700829 e a cepa de DENV4 8700544 e diferentes soros nas células BHK-21 de maneira análoga à descrita acima para o ensaio de placa. Diluições em série em duas vezes dos soros (após 1 h inativados por complemento a 56°C) foram misturadas com 50- 80 PFU/poço de DENV por 1 h à temperatura ambiente. Subsequentemente, misturas de vírus-soro foram adicionadas a monocamadas de células BHK-21 por 1 h, e então as misturas foram substituídas por DMEM contendo FBS a 2% e sobrecamada de metil celulose a 0,8%. Cinco dias depois, as sobrecamadas foram removidas, e as placas foram visualizadas após serem fixadas e coradas com solução de cristal violeta (cristal violeta a 1%, NaCl a 0,64%, formaldeído a 2%) por 3 h à temperatura ambiente. Por último, a concentração de soro para reduzir o número de placas em 50% comparado ao vírus livre de soro designado como PRNT50 foi representada graficamente utilizando o software Prism.

Determinação do título de anticorpos

[0062] Proteínas NS1 DJ ou NS3 foram revestidas em placas de 96 poços a 0,2 μg/poço em tampão de cobertura (Na2CO3 1,59 g, NaHCO3 2,93 g, pH 9.6, em 1 L de ddH2O) a 4°C durante a noite. As placas foram bloqueadas com BSA a 5% em PBS a 4°C durante a noite, e então lavadas três vezes com Tween 20 a 0,05% em PBS. Os soros de camundongos foram diluídos em série e os soros de camundongos diluídos foram adicionados a poços revestidos com proteína, e incubados a 4°C durante a noite. Após lavagem três vezes, adicionou-se IgG (Signaling, Danvers, MA) ou IgM (KPL, Gaithersburg, MD) anti-camundongo conjugado a HRP em cada poço, incubado por 2 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, adicionou-se ABTS em cada poço e a absorbância foi medida por leitora de microplacas a 405 nm (leitora de microplacas Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Análise para célula dendrítica e ativação de células T CD4+ e CD8+

[0063] Nos estudos ex vivo, células do gânglio linfático em pool foram duplamente coradas ou triplamente coradas com anti-CD11c conjugado a PE (eBioscience, San Diego, CA), combinado com anti-CD40 ou CD86 conjugado a APC (BioLegend, São Diego, CA), anti-CD80 conjugado a PE-Cy7 (BioLegend), e anticorpos MHC classe I ou II conjugados a FITC (BioLegend) para determinar a ativação de células dendríticas. As células foram analisadas por citometria de fluxo (CytoFLEXs, Beckman Coulter, Brea, CA).

[0064] As células do gânglio linfático em pool (5 × 105 células/ml) foram cultivadas em placas de 24 poços e estimuladas com NS1 DJ ou NS3 (5 μg/mL) por 3 dias. As células foram coletadas e coradas triplamente com anti-CD25 conjugado a PE (eBioscience), anti-CD4 conjugado a FITC, e anticorpos anti-CD8 conjugados a PE-Cy7 (BD Biosciences, San Jose, CA) para determinar a ativação de células T. As células foram analisadas por citometria de fluxo (CytoFLEXs).

Análise para CD107a de superfície das células T CD8+

[0065] As células do gânglio linfático em pool (5 × 105 células/ml) foram cultivadas em placas de 24 poços e estimuladas com NS1 DJ ou NS3 (5 μg/mL) por 3 dias. No dia 3, as células foram adicionalmente estimuladas com anti-CD3/CD28 (0,5 μg/mL) (eBioscience), e anticorpos CD107a conjugados a PerCP/cy5.5 (BioLegend) foram adicionados às células antes da estimulação. As culturas foram incubadas por 4 h a 37°C em CO2 a 5% na presença do inibidor de secreção, Brefeldina (BioLegend), e monensina (BD Biosciences) para inibir a acidificação de grânulos citotóxicos e a endocitose mediada por receptor retendo o CD107a na superfície celular. As células foram colhidas e coradas triplamente com anticorpos anti-CD8 conjugados a PE-Cy (BD Biosciences) para determinar a desgranulação das células T. As células foram analisadas por citometria de fluxo (CytoFLEXs).

Coloração intracelular da expressão de NS3 em células L929

[0066] Células L929 expressando NS3 (5 × 105 células/mL) foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente por 10 min. Após lavagem com PBS, as células foram permeabilizadas com tampão permeabilizado (0,5 g de saponina, 5 g de BSA e 0,5 g de NaN3 em 500 mL de PBS) e coradas com anticorpo anti-NS3 durante a noite a 4°C. Após lavagem com tampão permeabilizado, as células foram incubadas com IgG anticamundongo conjugado a Alexa-488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 1 h à temperatura ambiente. Após duas lavagens com PBS, as células foram analisadas por citometria de fluxo (CytoFLEXs).

Imunização ativa e modelo de camundongo de infecção por DENV

[0067] Camundongos com três semanas de idade foram imunizados subcutaneamente com 25 μg/camundongo de proteína NS1 DJ com alume, 12,5 μg/camundongo de proteína NS3 com alume, 25 μg de proteína NS1 DJ mais 12,5 μg de NS3/camundongo com alume, alume isoladamente, e controle PBS nos dias 0 e 14. Os soros de camundongos e as células de gânglios linfáticos foram coletados no dia 21 para ensaios. Para o modelo de infecção por DENV, os camundongos foram desafiados por via intravenosa com DENV2 (1 × 108 PFU/camundongo) no dia 17, e sacrificados, e o plasma e os tecidos foram coletados no dia 19.

Análise de títulos virais

[0068] Para determinar os títulos virais nos soros de camundongos, realizou-se o ensaio de foco fluorescente (FFA). Em suma, os soros foram diluídos em série com meio RPMI com FBS a 2% e incubados com células BHK-21 a 37°C por 2 h. Em seguida, a monocamada foi substituída por DMEM contendo FBS a 2% e metilcelulose a 0,8% e incubada a 37°C. Após 2 a 3 dias, as sobrecamadas foram removidas e os focos virais foram corados com anticorpo anti-NS1 (mAb 33D2, obtido junto ao Dr. Trai-Ming Yeh). IgG anti-camundongo de cabra conjugado a 488 Alexa (Invitrogen) foi adicionado e visualizado com um microscópio de fluorescência.

ELISA quantitativa de NS1

[0069] Para quantificar a concentração de NS1 no sangue de camundongos, realizou-se o ELISA tipo “sanduíche” caseiro de NS1. Em suma, 5 μg/mL de mAb antiNS1 33D2 foram depositados sobre placas de 96 poços à 4˚C durante a noite. Após bloqueio por 1 h com BSA a 1% em PBS, soros de camundongo (diluição de 1:5) foram co-incubados com 1 μg/mL de mAb 31B2 anti-NS1 conjugado a biotina (obtido junto ao Dr. Trai-Ming Yeh) em poços a 37˚C por 1 a 2 h. Adicionou-se solução de estreptavidina marcada com HRP (1:40) (R&D Systems, Minneapolis, MN) nos poços a 37˚C por 20 min. Após lavagem com PBST (PBS contendo Tween 20 a 0,01%) 3 vezes, realizou-se a revelação de cores e visualização com tetrametilbenzidina (TMB). A absorbância foi lida após a adição de solução de parada (2N H2SO4) por leitora de microplacas a OD 450 nm (leitora de microplacas Emax, Molecular Devices).

Tempo de sangramento

[0070] O tempo de sangramento foi determinado antes da eutanásia em dois dias após a infecção por DENV. Para medir o tempo de sangramento de cauda de camundongo, uma ponta de cauda de 3 mm foi retirada. O tempo de sangramento foi realizado com uma transecção de ponta de cauda de 3 mm. Gotículas de sangue foram coletadas em papel-filtro a cada 30 seg. O tempo de sangramento foi registrado quando o ponto de sangue era menor do que 0,1 mm de diâmetro.

Imunoensaio enzimático (ELISA)

[0071] Placas de ELISA foram revestidas com 100 µL das proteínas recombinantes (cEDIII, NS1ΔC, DJ NS1 ou cEDIII-NS1ΔC) diluídas em tampão de cobertura a uma concentração de 2 µg/mL. As placas foram incubadas à 4°C durante a noite. As placas foram incubadas com 200 µL de BSA 5%/tampão de cobertura por 2 h à temperatura ambiente, e então lavadas três vezes com 200 µl de PBST (tween 20 a 0,05% em PBS). Antissoro diluído em série duas vezes (100 µL) foi adicionado e incubado a 37°C por 2 h ou a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com 200 µl de PBST. O anticorpo secundário conjugado a HRP (100 µL, 1:5000 em PBS) foi adicionado e incubado a 37°C por 2 h. Após lavagem com 200 µL de PBST por três vezes, a reação foi visualizada com a adição de ABTS (100 µL). Após a revelação suficiente da cor, a absorbância foi detectada pela leitora ELISA a 415 nm.

Ensaio citolítico mediado por complemento dependente de anticorpos

[0072] Células HMEC-1 foram semeadas em placas de 96 poços (5 × 103 células/poço) e então incubadas durante a noite a 37°C em CO2 a 5% em uma incubadora a 37°C. Após descartar o sobrenadante, células HMEC-1 foram incubadas com DENV (MOI = 20) em meio M200 por 48 h. Após lavagem com PBS duas vezes, as células foram incubadas com diluição de 1:200 de soro controle, soro com alume, soro com cEDIII-NS1ΔC ou soro com NS1 DJ preparado em meio M200 isento de vermelho de fenol e então com ou sem complemento de coelho Low-Tox-M (diluição de 1:20) por 6 h a 37°C em CO2 a 5% para facilitar a lise celular mediada por complemento. A citólise foi medida pela liberação de lactato desidrogenase (LDH), uma enzima citoplásmica, com um kit comercial (kit de detecção de citotoxicidade). A densidade óptica foi determinada por uma leitora de microplacas a 490 nm.

Imunização e modelo de camundongo de infecção por DENV

[0073] Camundongos C3H/HeN foram imunizados subcutaneamente com cEDIII-NS1ΔC recombinante misturado com alume. Os soros dos camundongos foram coletados e os títulos de anticorpos foram determinados sete dias após a primeira imunização, e três dias após a segunda e terceira imunização. Quatro dias após a terceira imunização, o DENV2 foi inoculado intradermicamente em camundongos C3H/HeN na parte superior das costas. O tempo de sangramento de cauda de camundongo foi determinado e os camundongos foram sacrificados em 3 dias após a infecção, e os soros de camundongos também foram coletados e armazenados a −20°C.

Expressão das proteínas NS1f∆C-cEDIII-NS3cf e NS1f∆C-NS3cf recombinantes usando sistemas de expressão de células S2 de drosófilas e 293F de mamíferos

[0074] Duas proteínas recombinantes (NS1f∆CcEDIII-NS3cf e NS1f∆C-NS3cf) com pesos moleculares de 49 e 35 kDa, respectivamente) foram clonadas no vetor pTT5 com a marca His em ambas as extremidades da proteína. Os plasmídeos foram transfectados em células 293F, e as proteínas recombinantes foram secretadas pelas células 293F no sobrenadante. Os sobrenadantes com proteínas recombinantes foram coletados 5 dias após a transfecção e foram purificados com coluna de Ni2+ Após purificação, as proteínas recombinantes foram liofilizadas e armazenadas a -20 ˚C. A proteína recombinante das células 293F usadas em nosso experimento foi elaborada e fornecida pela Leadgene Biomedical, Inc. Adicionalmente, de modo a produzir proteínas recombinantes em uma condição mais estável e de melhor purificação, as proteínas foram clonadas no vetor pMT/BiP/V5 com a marca His e a marca Strep em duas extremidades e os plasmídeos foram transfectados em células S2 de drosófilas. O clone estável expressando a proteína recombinante das células S2 de drosófilas foi estabelecido pelo Dr. Yen-Chung Lai. As células foram primeiro cultivadas em frasco 75T em posição vertical com meio de Drosófila de Schneicher de 20 mL à temperatura ambiente (RT) e agitadas a 65 rpm. Um frasco de plástico de 1000 mL foi usado para cultivar as células após as células terem crescido à concentração de 1,5 a 2 × 107 células/mL em quatro frascos 75T. As células foram então cultivadas e agitadas a 80 rpm por 3 dias até crescerem a 3 a 5 × 106 células/mL em meio de 500 mL em frasco de Erlenmeyer de plástico. As proteínas recombinantes foram induzidas pela adição de 500 mM de sulfato de sobre em 500 μL por 3 dias à RT. Para analisar a expressão das proteínas recombinantes, as amostras foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 min à RT para coletar o sobrenadante. O sobrenadante de 500 mL coletado foi então misturado com tampão de ligação de 50 mL (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0) e passado através de um filtro de copo. O sobrenadante contendo proteína recombinante foi carregado através da coluna com Streptactina sefarose. A coluna foi lavada com tampão de lavagem (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0). As proteínas recombinantes com a marca Strep foram eluídas com tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2.5 mM destiobiotina, pH 8.0). Após a purificação, as proteínas foram examinadas usando SDS-PAGE 12% e Western blot, e foram dialisadas durante a noite usando uma membrana de diálise de 10K em base de PBS. As proteínas dialisadas foram então quantificadas pelo ensaio de proteína de Bradford e liofilizadas pela Leadgene Biomedical, Inc.

Teste de neutralização por redução de foco (FRNT)

[0075] Células BHK-21 foram semeadas em placas de 96 poços (1 × 104 células/poço) e cultivadas em incubadora a 37 ˚C por 12 a 16 h até que a confluência celular atingisse de 60 a 70%. Os soros de camundongos imunizados foram diluídos 10 vezes em meio DMEM com FBS a 2%, e 50 μl do meio viral contendo de 50 a 100 placas foram adicionados aos soros diluídos à RT por 1 h. Subsequentemente, o meio da placa de 96 poços foi removido, 100 μl da mistura de soro-vírus foram adicionados a poços contendo BHK-21 e incubados em incubadora a 37˚C por 1-1.5 h. Em seguida, 100 μl de meio de metil celulose foram adicionados diretamente nos poços e incubados por 2 a 2.5 dias. As células foram fixadas por paraformaldeído a 4% por 1 h a 37 ˚C, e então o anticorpo primário (anticorpos mAb 33D2 anti-NS1 mais anti-DENV sorotipos 1-4 em solução de Triton X-100 0,5%) foi adicionado em poços e corado durante a noite a 4 ˚C. Os focos de vírus foram corados por IgG de cabra anti-camundongo conjugado a FITC e visualizados por microscopia de fluorescência.

Análise estatística

[0076] Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. Todos os dados foram analisados usando o software Prism (GraphPad, San Diego, CA). O tempo de sangramento e os títulos virais foram analisados por análise de variância simples (one-way ANOVA). O ensaio de citólise dependente de complemento foi analisado por análise de variância dupla. A significância estatística foi definida em p < 0.05.

Resultados Imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC recombinante induz respostas de anticorpos específicas à proteína cEDIII e NS1ΔC

[0077] O diagrama das proteínas usadas nesta modalidade incluindo cEDIII, NS1ΔC, NS1 DJ e uma fusão linear das proteínas recombinantes cEDIII-NS1ΔC é ilustrado (FIG. 9A). Camundongos C3H/HeN com 6 a 8 semanas de idade foram imunizados subcutaneamente com cEDIII-NS1ΔC, NS1 DJ ou NS1 DJ mais cEDIII misturado em alume como adjuvante (FIG. 9B). Após os camundongos serem sacrificados, os títulos de anticorpos foram determinados. O exemplo revestiu as proteínas cEDIII, DJ NS1 e NS1ΔC separadamente sobre a placa de 96 poços e adicionou soro de camundongo como anticorpos primários, sendo então analisados por ELISA. Os títulos de anticorpos após a 2a dose e a 3a dose de imunização foram determinados (FIG. 9C).

O soro de camundongo imunizado por cEDIII-NS1ΔC neutraliza todos os quatro sorotipos de DENV

[0078] Os soros de camundongos induzidos pela proteína cEDIII-NS1ΔC contêm anticorpos anti-NS1ΔC e anticEDIII. Dado que os anticorpos anti-E desempenham um papel na neutralização do DENV, avaliou-se se o soro de camundongo imunizado por cEDIII-NS1ΔC poderia neutralizar todos os quatro sorotipos de DENV neste exemplo. Para validar a capacidade de neutralização do soro de camundongo imunizado, o exemplo realizou um teste de neutralização por redução de placas. Uma diluição de soro dupla de soro controle, soro com alume, soro com cEDIII-NS1ΔC e soro com NS1 DJ foi misturada com DENV1, DENV2, DENV3 ou DENV4 e então adicionada a células BHK-21, que foram semeadas em uma placa de 12 poços. Somente o grupo do soro de camundongo imunizado por cEDIII-NS1ΔC neutralizou DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 de forma dependente da dose e apresentou uma redução de 50% na contagem de placas em uma diluição de 1:128. Entretanto, o soro de camundongo imunizado por NS1 DJ não foi capaz de neutralizar nenhum dos sorotipos de DENV (FIGS. 10A a 10D).

O soro de camundongo imunizado por cEDIII-NS1ΔC destrói as células infectadas por todos os quatro sorotipos de DENV através da citólise mediada por complemento de anticorpo.

[0079] NS1 é dimerizada após a modificação pós-traducional no lúmen do retículo endoplásmico (ER) e é expressa na superfície das células infectadas. Estudos anteriores dos inventores demonstraram que os anticorpos anti-NS1ΔC poderiam oferecer proteção por citotoxicidade mediada por complemento in vitro. Por conseguinte, o exemplo indagou se o soro de cEDIII-NS1ΔC contendo anticorpos anti-NS1ΔC poderia causar citólise mediada por complemento em todos os quatro sorotipos de DENV. Assim, o exemplo conduziu um ensaio citolítico mediado por complemento dependente de anticorpos. As células HMEC-1 semeadas em placas de 96 poços foram infectadas por DENV1, DENV2, DENV3 ou DENV4. Em seguida, as células foram incubadas com diluição de 1:200 de soro controle, soro com alume, soro com cEDIII-NS1ΔC e soro com NS1 DJ com ou sem complemento. A citólise foi medida pela liberação de LDH. Tanto o soro de camundongo imunizado por cEDIII-NS1ΔC quanto por NS1 DJ misturados com complemento causaram citólise nas células infectadas por quatro sorotipos diferentes de DENV, se comparado aos outros grupos (FIGS. 11A a 11D). Uma vez que NS1ΔC foi gerado a partir de NS1 de DENV2, essa descoberta demonstrou a proteção cruzada de NS1ΔC de DENV2 para todos os sorotipos de DENV.

Imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC reduz o tempo de sangramento prolongado induzido por DENV em camundongos

[0080] Camundongos C3H/HeN foram imunizados subcutaneamente (s.c.) com proteína cEDIII-NS1ΔC recombinante misturada com alume por três vezes (FIG. 12A). Os títulos de anticorpos do soro contra cEDII e NS1 DJ foram determinados (FIG. 12B). Em seguida, testou-se o efeito protetor da proteína cEDIII-NS1ΔC, da qual camundongos foram inoculados por via intravenosa (i.v.) com diferentes sorotipos de DENV. Os resultados mostraram que os camundongos imunizados por cEDIII-NS1ΔC apresentaram tempo de sangramento de cauda de camundongo inferior induzido por quatro sorotipos diferentes de DENV quando comparado aos camundongos infectados por DENV isoladamente ou DENV mais alume (FIGS. 13A a 13D).

Imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC reduz o título de DENV no soro de camundongo

[0081] Para verificar o efeito da imunização por cEDIII-NS1ΔC sobre a replicação viral, determinou-se o título viral no soro de camundongo. Os resultados mostraram que títulos virais inferiores (FIGS. 14A a 14D) foram detectados nos soros de camundongos após a imunização por cEDIII-NS1ΔC quando os camundongos foram infectados por diferentes sorotipos de DENV se comparado aos camundongos infectados por DENV isoladamente ou DENV mais alume.

Imunização com NS1 DJ e NS3 induz ativação de células T CD4+ e CD8+ específicas em resposta ao antígeno NS1 DJ ou NS3 ex vivo

[0082] Para avaliar a ativação das células dendríticas (DC) após a imunização, o exemplo analisou a expressão de CD40, CD80, CD86, MHC I e MHC II nas células dendríticas do gânglio linfático (LNDCs). Os resultados demonstraram que a maioria das LNDCs CD11c+ expressam MHC classe I, e os camundongos imunizados com induziram LNDCs induzidos por 25 μg de NS1 DJ e 12,5 μg de NS3 apresentaram MHC classe I significativamente maior do que os outros grupos incluindo alume isoladamente, NS1 DJ isoladamente, e NS3 isoladamente. A expressão de MHC II das LNDCs CD11c+ foi aumentada nos camundongos imunizados com NS1 DJ isoladamente ou NS3 isoladamente; e embora não significante do ponto de vista estatístico, houve uma tendência de aumento nos camundongos imunizados com a combinação de NS1 DJ mais NS3. A imunização ativa com NS1 DJ isoladamente, NS3 isoladamente, ou NS1 DJ mais NS3 em camundongos induziu uma tendência de aumento da expressão de CD40 em LNDCs CD11c+, embora sem qualquer significância estatística. Todas dentre a imunização ativa com NS1 DJ isoladamente, NS3 isoladamente, ou combinação de NS1 DJ mais NS3 aumentaram a expressão de CD80 em LNDCs CD11c+ quando comparado ao controle PBS no dia 21. Somente a combinação de NS1 DJ mais NS3 aumentou significativamente a expressão de CD86 em LNDCs CD11c+ quando comparado ao alume isoladamente e ao grupo controle PBS. Assim, esses resultados indicam que a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 pode induzir a ativação das DC conforme medido pelas DCs aumentadas que expressam receptores co-estimulatórios (dados não ilustrados).

[0083] Para avaliar se NS1 DJ e NS3 podem induzir respostas de células T específicas ao antígeno, células do gânglio linfático foram coletadas a partir de camundongos imunizados e reestimuladas com 5 g/ml de proteínas NS1 DJ ou NS3 por 3 dias. Anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 foram administrados a todos os grupos para imitar parcialmente sinais TCR e amplificar respostas. A imunização ativa dos camundongos com NS1 DJ isoladamente ou NS1 DJ mais NS3 induziu significativamente a ativação de células T CD4+ em resposta à estimulação do antígeno de NS1 DJ comparado ao alume isoladamente ou ao controle PBS (FIG. 15A). Somente a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 em camundongos induziu significativamente a ativação de células T CD4+ em resposta à estimulação de antígeno de NS3 se comparado aos outros grupos (FIG. 15B). A imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 também induziu significativamente a ativação de células T CD8+ em resposta à estimulação de antígenos de NS1 DJ (FIG. 15C), bem como a estimulação de antígeno de NS3 (FIG. 15D) comparado aos outros grupos. Portanto, a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 pode induzir ativação tanto das células T CD4+ quanto CD8+ em resposta à estimulação de antígeno de NS1 DJ ou NS3.

Imunização ativa com NS1 DJ e NS3 induz respostas CTL específicas

[0084] Os estudos anteriores mostraram que as células T CD8+ poderiam contribuir diretamente para a proteção contra DENV. No estudo dos inventores, a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 induziu ativação de células T CD8+ (FIGS. 15C a 15D). Para examinar se uma resposta CTL pode ser induzida, as células do gânglio linfático isoladas a partir de camundongos imunizados e reestimuladas com proteína NS1 DJ ou NS3 e então cocultivadas com células L929 expressando NS1 DJ ou expressando NS3 como o alvo por 4 h (FIG. 16A). Para gerar células L929 expressando NS3, o exemplo estabeleceu células L929 expressando ou um NS2B3 tipo selvagem ou uma versão proteoliticamente inativa mutada, NS2B3-S135A (Rodriguez-Madoz et al., 2015). As células L929 expressando NS2B3- S135A foram então usadas como células alvo devido aos melhores níveis de expressão (dados não ilustrados). Os resultados mostraram que somente os CTLs dos camundongos imunizados com NS1 DJ mais NS3 causaram a lise das células L929 expressando NS1, entretanto, sem nenhuma diferença estatística se comparado aos outros grupos (FIG. 16B). Por outro lado, os CTLs de camundongos imunizados com NS3 isoladamente ou NS1 DJ mais NS3 lisaram significativamente as células L929 expressando NS3 (FIG. 16C).

[0085] Além de demonstrar a atividade de CTL nas células alvo, o exemplo adicionalmente determinou a atividade citotóxica das células efetoras diretamente. A bicamada de lipídios do grânulo citotóxico em células CD8+ T contém glicoproteínas de membrana associadas ao lisossomo (LAMPs), incluindo CD107a (LAMP-1); portanto, a desgranulação do CTL leva à exposição cumulativa de CD107a na superfície celular. Baseado no fato de que a desgranulação das células T CD8+ ocorre rapidamente após a estimulação por TCR, as células do gânglio linfático isoladas de camundongos imunizados foram reestimuladas com proteína NS1 DJ ou NS3 por três dias e incubadas com antiCD3 e anti-CD28 para imitar parcialmente os sinais de TCR durante as últimas 4 h. A imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 aumentou significativamente a expressão de CD107a na superfície das células T CD8+ em resposta à estimulação tanto por NS1 DJ (FIG. 17A) quanto por NS3 (FIG. 17B) comparado a NS3 isoladamente, NS1 DJ isoladamente, alume isoladamente, e controle PBS. A expressão de CD107a na superfície das células T CD8+ a partir de camundongos imunizados por NS3 também foi significativamente aumentada em resposta à estimulação por NS3 comparado ao alume isoladamente e ao controle PBS, mas foi menor do que a dos camundongos imunizados por NS1 DJ mais NS3 (FIG. 17B). Os resultados das FIGS. 16A a 17B indicam que a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 pode induzir respostas de CTL específicas ao antígeno.

Imunização ativa com NS1 DJ e NS3 oferece efeitos protetores contra infecção por DENV

[0086] O exemplo a seguir estabeleceu um modelo de infecção por DENV para avaliar a proteção oferecida pela imunização ativa com NS1 DJ mais NS3, como mostra a FIG. 18A.

[0087] Nossos estudos anteriores demonstraram que os camundongos inoculados com alto título de DENV são capazes de produzir sinais patogênicos, tal como tempo de sangramento prolongado e hemorragia local (Wan et al., 2014). Por conseguinte, o exemplo avaliou a proteção oferecida pela imunização ativa com NS1 DJ e NS3 por meio da determinação do tempo de sangramento prolongado induzido por DENV. Os resultados mostraram que a infecção por DENV causou tempo de sangramento prolongado em camundongos 48 h após a infecção por DENV isoladamente ou com alume. A imunização ativa com NS1 DJ, NS3, ou NS1 DJ mais NS3 reduziu significativamente o tempo de sangramento prolongado induzido por DENV comparado à infecção por DENV isoladamente (FIG. 18B).

[0088] O exemplo determinou os títulos virais no dia 19. A proteína NS1 DJ pode induzir respostas de anticorpos que desencadeiam a citólise mediada por complemento dependente de anticorpos das células infectadas por DENV (Wan et al., 2017). De acordo com os achados anteriores dos inventores, a imunização ativa com NS1 DJ exclusivamente reduziu consideravelmente os títulos virais comparado ao DENV2 isoladamente e ao controle com alume (FIG. 18C). A imunização ativa com NS3 isoladamente reduziu mais significativamente os títulos virais do que com NS1 DJ isoladamente. As respostas de células T específicas a NS3 apresentadas no presente estudo podem, portanto, contribuir para a eliminação viral. Os títulos virais reduzidos após a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 foram comparáveis àqueles após a imunização somente com NS3.

[0089] Estes resultados indicam que a imunização ativa com NS1 DJ ou NS1 DJ mais NS3 oferece melhores efeitos protetores contra o extravasamento vascular.

Discussão Imunização ativa com NS1 DJ e NS3 oferece efeitos protetores contra infecção por DENV

[0090] De acordo com as modalidades supramencionadas, a proteína recombinante, cEDIII-NS1ΔC, pode ser usada como um candidato a vacina de subunidade para estratégia antiviral. Como uma vacina de subunidade baseada em proteína não-replicante, ela seria considerada como uma opção mais segura.

[0091] Devido à preocupação quanto a uma mudança conformacional da cEDIII-NS1ΔC recombinante que poderia afetar a eficácia imune, a combinação das proteínas cEDIII e NS1 DJ foi usada para comparação com a proteína de fusão. Nessas modalidades, a imunização com uma combinação de cEDIII (5 µg) e NS1 DJ (20 µg) aos camundongos poderia provocar títulos de anticorpos ideais específicos para as proteínas cEDIII e NS1 DJ, que apresentaram títulos de anticorpos similares aos grupos imunizados com 25 µg de cEDIII-NS1ΔC (dados não apresentados). cEDIII-NS1ΔC foi escolhido como a seguinte estratégia de vacina.

[0092] O EDIII tem um baixo potencial de induzir anticorpos de reatividade cruzada para sorotipos de DENV heterólogos, o que tem sido implicado na patogênese de doenças severas (Chin et al., 2007). Os camundongos imunizados com proteínas EDIII DENV recombinantes que foram projetadas por quatro linhagens de vírus produziram anticorpos neutralizantes de IgG1 específicos ao sorotipo que apresentaram atividade aprimorada mensurável nas células contendo FcyR ao DENV. Uma proteína de EDIIIs “recapeados” (rsDIIIs) baseada em DENV2 apresentou ligação reduzida a anticorpos direcionados a epítopos desfavoráveis, mas mantendo alta afinidade com esses anticorpos amplamente neutralizantes de DENV. Um cEDIII, que contém uma sequência consenso de EDIII de quatro sorotipos de DENV, também seria considerado um potencial candidato a vacina. Foi relatado que os anticorpos de camundongos com a imunização de cEDIII apresentaram capacidade neutralizante a todos os sorotipos de DENV. Macacos individuais imunizados com cEDIII também apresentaram anticorpos neutralizantes elevados em soros (Chen et al., 2013; Leng et al., 2009). Neste estudo, a proteína recombinante cEDIII-NS1ΔC não apenas induziu anticorpos neutralizantes de camundongos C3H/HeN contra quatro sorotipos de DENV in vitro, mas também ofereceu uma eficácia protetora para camundongos contra a infecção por DENV in vivo. Foi observado que os camundongos possuíram menores títulos virais e NS1 solúvel nos soros dos que foram imunizados com cEDIII-NS1ΔC após a injeção de DENV quando comparado ao grupo somente com DENV.

[0093] O efeito patogênico da NS1 DENV foi enfatizado nos estudos anteriores com vários mecanismos. Portanto, NS1 foi proposta como um alvo favorável contra a patogênese causada pelo DENV. A hipermeabilidade endotelial induzida por NS1 pode ser revertida pelo tratamento com mAb anti-NS1 (Chen et al., 2016). A vacinação com NS1 também pode prevenir a permeabilidade endotelial e o extravasamento vascular desencadeado pela NS1 DENV (Beatty et al., 2015). Estudos anteriores identificaram os principais epítopos de reatividade cruzada na região Cterminal da NS1 DENV (Cheng et al., 2009). Portanto, a proteína NS1 com deleção do C-terminal foi considerada como um candidato a vacina de subunidade mais seguro para evitar autoimunidade. O estudo anterior dos inventores demonstrou que os anticorpos específicos para NS1ΔC possuíam a capacidade de citotoxicidade dependente de complemento mediada por anticorpo (Wan et al., 2014). Os camundongos imunizados com cEDIII-NS1ΔC não apenas induziram anticorpos capazes de destruir quatro sorotipos de células infectadas por DENV, mas também reduziram o tempo de sangramento prolongado induzido pelo DENV em camundongos.

[0094] Embora o papel exato das células T durante a infecção por DENV e a doença ainda seja uma questão de debate, diversas evidência sugerem um papel protetor das células T na infecção por DENV atualmente tanto em estudos em humanos quanto em camundongos (Katzelnick et al., 2017; Kao 2019). Estudos apontam que a proteína não-estrutural contém diversos epítopos de ativação de células T. A NS1 também foi mencionada por possuir um papel crítico na proteção contra o DENV na ativação das células T CD4+ e CD8+. Portanto, a resposta de células T específica da proteína cEDIII-NS1ΔC pode ser adicionalmente estudada no futuro. A NS1ΔC e NS3 combinadas foi testada como uma estratégia de vacina contra a infecção por DENV (Kao et al., 2019). No futuro, a proteína cEDIIINS1ΔC mais NS3 será uma candidata para desenvolvimento de vacina. Devido ao fato de Dengvaxia® conter os genes prM e E, mas sem proteínas não-estruturais da DENV, nenhum anticorpo específico para a proteína NS1 da dengue ou resposta de células T específica às proteínas nãoestruturais será produzido. Nessas modalidades, cEDIII contém uma sequência consenso de EDIII de quatro sorotipos de DENV e NS1ΔC foi gerada a partir da NS1 do DENV2, e esses resultados mostraram a atividade protetora cruzada da proteína cEDIII-NS1ΔC para todos os sorotipos de DENV.

[0095] Baseado nos resultados supramencionados, a proteína cEDIII-NS1ΔC induz alta resposta de anticorpos específica à proteína do envoltório e à proteína NS1 com função de citólise dependente de complemento e neutralizante contra DENV e as células infectadas por DENV, respectivamente. No modelo de proteção de camundongo, o pré-tratamento com a proteína cEDIII-NS1ΔC também induziu altos títulos de anticorpos específicos à proteína do envoltório e à proteína NS1 em camundongos. Ademais, o grupo imunizado com cEDIII-NS1ΔC reduz o tempo de sangramento induzido por DENV e o título viral nos soros de camundongo após injeção por quatro sorotipos de DENV diferentes. Portanto, a proteína cEDIII-NS1ΔC é um candidato a vacina potencial para oferecer proteção contra a infecção por DENV. A dengue é uma doença viral transmitida por mosquitos em humanos de grande importância global em termos de morbidez e impacto econômico (Bhatt et al., 2013). Apesar do impacto global da dengue, não há tratamento específico para a dengue ou vacinas seguras e eficazes, estando a prevenção atualmente restrita a medidas de controle do vetor transmissor. Ainda há diversos obstáculos ao desenvolvimento de vacinas contra a dengue e fármacos antivirais. Um deles é que a patogênese complicada ainda não está totalmente resolvida. Outro obstáculo é a falta de modelos animais apropriados (Coller et al., 2011; Wan et al., 2013). Recentemente, vários grupos geraram vacinas vivas atenuadas tetravalentes, mas a segurança e eficácia de proteção ainda carecem de comprovação. Nessas modalidades, o exemplo gerou uma proteína de fusão, cEDIIINS1ΔC, como uma vacina de subunidade para estratégia antiviral. A imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC recombinante produziu anticorpos que possuem capacidade de neutralizar DENV e destruir células infectadas por DENV. A imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC também reduziu a tendência de sangramento induzida por DENV e a concentração de NS1 solúvel no plasma de camundongos. O modo ou ações possíveis dos anticorpos gerados por cEDIII-NS1ΔC podem envolvem a capacidade de neutralização e a citólise dependente de complemento mediada por anticorpos.

[0096] Diversos anticorpos neutralizantes específicos a tipo e subtipo foram mapeados para EDIII (Gromowski et al., 2007; Wahala et al., 2009; Guzman et al., 2010), e os anticorpos anti-EDIII são reconhecidos como os bloqueadores mais potentes da infectividade viral (Gromowski et al., 2007). Os anticorpos anti-EDIII estão presentes nos soros humanos imunes a DENV primário e secundário. Entretanto, os anticorpos anti-EDIII constituíam apenas uma pequena proporção dos anticorpos totais na ligação dos soros imunes ao DENV (Wahala et al., 2009). Imagina-se que o EDIII seja responsável pela ligação ao receptor (Kuhn et al., 2002; Klein et al., 2013). O EDIII é exposto e acessível na superfície do vírion e as proteínas EDIII recombinantes inibem a infectividade do vírus (Chin et al., 2007; Guzman et al., 2010; Coller et al., 2011). É importante ressaltar que o EDIII tem um baixo potencial de indução de anticorpos de reatividade cruzada para sorotipos de DENV heterólogos, o que tem sido implicado na patogênese de doenças severas (Chin et al., 2007; Guzman et al., 2010).).

[0097] Há muitos candidatos à vacina de subunidade recombinante que se baseiam no EDIII no desenvolvimento pré-clínico. O Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia na Índia desenvolveu uma proteína de fusão EDIII quimérica tetravalente expressa em Pichia pastoris. A proteína EDIII quimérica tetravalente consiste dos domínios EDIII de DENV1, 2, 3 e 4 unidos por conectores peptídicos flexíveis. A imunização dos camundongos com o candidato à vacina tetravalente combinada com o adjuvante com montanida resultou em respostas de anticorpos neutralizantes contra todos os sorotipos de DENV. A produção de vacinas tetravalentes contra a dengue precisa ser eficaz em termos de custo para que as vacinas possam ser acessíveis em regiões mais carentes do mundo. De modo a produzir um componente multivalente único, o cEDIII que contém uma sequência consenso do EDIII dos quatro sorotipos de DENV seria um bom candidato a vacina (Leng et al., 2009; Chen et al., 2013). Os camundongos imunizados com o cEDIII recombinante desenvolveram anticorpos neutralizantes contra todos os sorotipos de DENV.

[0098] Outro grupo de anticorpos gerados pela imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC são os anticorpos anti-NS1ΔC. Os presentes inventores identificaram os principais epítopos com reatividade cruzada no C-terminal da NS1 DENV (Cheng et al., 2009; Chen et al., 2009, Wan et al., 2008). Portanto, a proteína NS1 com deleção do Cterminal seria um candidato a vacina de subunidade mais seguro para evitar a autoimunidade. Ademais, o estudo anterior dos inventores demonstrou que os anticorpos antiNS1ΔC possuíam a capacidade de citotoxicidade dependente de complemento mediada por anticorpo (Wan et al., 2014). Nesta modalidade, o soro de camundongo imunizado com cEDIII-NS1ΔC causou citólise em células HMEC-1 infectadas por quatro sorotipos diferentes de DENV. Além da citotoxicidade dependente de complemento mediada por anticorpo, outros mecanismos pelos quais os anticorpos anti-NS1ΔC contribuem para a proteção ao desafio com DENV precisam ser adicionalmente determinados, tal como a proteção da permeabilidade vascular induzida por NS1.

[0100] As vacinas ou fármacos antivirais ideais devem ser protetores contra cada um dos quatro sorotipos de DENV sem o risco de ADE (Wan et al., 2013). Anticorpos não-neutralizantes ou sub-neutralizantes contra DENV E e PrM com reatividade cruzada entre os quatro sorotipos de DENV podem melhorar a entrada e infecção viral. O NS1 de DENV não é uma proteína da estrutura de superfície do vírus, logo, os anticorpos contra NS1 não causarão ADE. Nesta modalidade, o exemplo verificou que o soro com cEDIII-NS1ΔC neutralizou todos os quatro sorotipos de DENV e destruiu as células HMEC-1 infectadas por DENV através da citólise dependente de complemento mediada por anticorpo. Para verificar o efeito protetor da proteína cEDIII-NS1ΔC, a imunização com a proteína cEDIII-NS1ΔC misturada com alume conferiu o efeito protetor ao reduzir o tempo de sangramento prolongado induzido pela infecção por DENV2.

[0101] Dengvaxia® contém somente os genes prM e E do DENV, mas nenhuma proteína NS do DENV, portanto, não é capaz de produzir anticorpo específico à proteína NS1 e não possui resposta de células T eficaz específica à proteína NS. Em contrapartida, a proteína cEDIII-NS1ΔC não apenas produz anticorpos neutralizantes, mas também produz anticorpos específicos à proteína NS1, resultando em uma proteção mais abrangente contra a infecção por DENV. A resposta de células T específica da proteína cEDIII-NS1ΔC pode ser adicionalmente estudada. Além disso, a imunização de Dengvaxia® teve relatos de efeitos colaterais. A proteína cEDIII-NS1ΔC é uma vacina de subunidade de proteína do DENV, mas não uma partícula viral completa, portanto, a probabilidade de causar efeitos colaterais graves é muito menor do que a das outras vacinas vivas atenuadas.

[0102] O preço das vacinas contra a dengue deverá ser acessível aos indivíduos que mais precisam das vacinas em regiões carentes do mundo. Nesta modalidade, a proteína cEDIII fusionada com a proteína NS1ΔC reduz os custos e acelera a purificação da proteína. Ademais, foi demonstrado que as respostas de células T CD8+ induzidas por NS3 de DENV são protetoras contra a reinfecção por DENV heterotípica, reduzindo assim o risco de ADE. Portanto, vale a pena testar a proteína cEDIII-NS1ΔC mais NS3 como candidata ao desenvolvimento de vacina. Devido a uma falta de glicosilação da vacina de subunidade expressa em E. coli, o exemplo tinha expressado as proteínas recombinantes em células de mamíferos e células de drosófilas.

[0103] Os resultados das FIGS. 9A a 18C foram resumidos na Tabela 2. A proteína de fusão cEDIII-NS1ΔC poderia oferecer efeito imunoprotetor superior ao das misturas das proteínas recombinantes NS1 DJ e NS3 com respeito à inibição do título viral, redução do nível de sNS1 e redução do tempo de sangramento prolongado.

[0104] Nesses exemplos, a NS1 combinada com NS3 modificada foi usada em uma nova estratégia de vacina e investigaram-se os mecanismos dos efeitos protetores observados contra DENV em camundongos. As vacinas de subunidade baseadas em proteína recombinante não-replicante são consideradas mais seguras e podem ser facilmente reformuladas. Em uma tentativa de resolver um problema comum da vacina de subunidade, mais especificamente, que certos antígenos altamente purificados são fracamente imunogênicos, o exemplo combinou a proteína NS1 com a proteína NS3 imunodominante. Os resultados mostram que a proteína NS3 é capaz de induzir sinergicamente respostas imune mais eficazes, incluindo não apenas a geração de respostas de CTL específicas a NS3, mas também promovendo respostas de células T específicas a NS1 e títulos de anticorpos. A imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 apresentou melhor desempenho em ambas as respostas imunes e proteção comparado a NS1 DJ isoladamente ou a NS3 isoladamente (FIG. 19).

Os efeitos protetores conferidos pela imunização com as proteínas NS1f∆C-cEDIII-NS3cf e NS1f∆C-NS3cf recombinantes contra a infecção por DENV são determinados in vitro por FRNT e CDC e in vivo pelo tempo de sangramento de cauda de camundongo

[0105] Como mencionado anteriormente, foi demonstrado que as respostas de células T CD8+ induzidas por NS3 de DENV são protetoras contra a reinfecção por DENV heterotípica, reduzindo assim o risco de potencialização dependente de anticorpos (ADE). Portanto, as proteínas de fusão com cEDIII, NS1ΔC e NS3 também foram avaliadas como candidatas para o desenvolvimento de vacina. Como ilustrado nas FIGS. 20A a 20D, as proteínas NS1f∆C-cEDIIINS3cf e NS1f∆C-NS3cf foram expressas por células 293F de mamíferos (Tabela 3) e células S2 de Drosófilas (Tabela 4). Como ilustrado nas FIGS. 21A e 22A, camundongos C3H/HeN foram imunizados subcutaneamente com 25 μg de proteínas NS1f∆C-cEDIII-NS3cf ou NS1f∆C-NS3cf três vezes usando alume como o adjuvante. Os soros de camundongos foram coletados após a segunda e terceira imunizações, e os títulos de anticorpos contra NS1, DJ, NS3 e cEDIII foram determinados (Tabelas 3 e 4). A proteína de fusão NS1fΔC-NS3cf poderia estimular títulos de anticorpos relativamente maiores do que a proteína de fusão NS1fΔC-cEDIII- NS3cf com a terceira imunização em camundongos.

[0106] Para validar a capacidade de neutralização do soro de camundongo imunizado, realizamos um teste de neutralização por redução de placas (FRNT). Diluições de soro em dez vezes de soro controle, soro imunizado somente com alume, soro imunizado com NS1f∆CcEDIII-NS3cf e soro imunizado com NS1f∆C-NS3cf foram misturadas com DENV2, e então adicionadas a células BHK-21 que foram semeadas em uma placa de 96 poços. O grupo de soro de camundongo imunizado com NS1f∆C-cEDIII-NS3cf, mas não o soro imunizado com NS1f∆C-NS3cf, o soro imunizado com alume ou o soro controle simulado, neutralizou o DENV (FIGS. 21B e 22B).

[0107] NS1 é expressada na superfície das células infectadas. Os inventores se indagaram se o soro de camundongo imunizado com NS1f∆C-cEDIII-NS3cf e NS1f∆C-NS3cf contendo anticorpos anti-ΔC NS1 poderia causar citólise mediada por complemento em células infectadas por DENV. Células Huh-7 semeadas em placas de 96 poços foram infectadas por DENV2. Em seguida, as células foram incubadas com diluição de 1:20 de soro controle, soro imunizado somente com alume, soro imunizado com NS1f∆CcEDIII-NS3cf ou soro imunizado com NS1f∆C-NS3cf, com ou sem complemento. A citólise foi medida pela liberação de LDH. Tanto os soros de camundongo imunizados com NS1f∆C-cEDIIINS3cf quanto com NS1f∆C-NS3cf misturados com complemento causaram citólise em células infectadas por DENV quando comparado aos outros grupos (FIGS. 21C e 22C).

[0108] Em seguida, os inventores testaram o efeito protetor conferido pela imunização com as proteínas ∆C-cEDIII-NS3cf e NS1f∆C-NS3cf, das quais camundongos foram inoculados por via intravenosa com o DENV. Resultados mostraram que os camundongos imunizados com NS1f∆C-cEDIIINS3cf e NS1f∆C-NS3cf apresentaram tempo de sangramento de cauda de camundongo inferior induzido por DENV se comparado aos camundongos infectados somente com DENV ou DENV mais alume (FIGS. 21D e 22D).

[0109] Estudos anteriores mostraram que as respostas induzidas por Th1 dominadas por IFN-γ estão associadas a menos infecção por DENV secundária severa, ao passo que a produção de células T de TNFα está associada à infecção mais severa. Outros estudos confirmaram que a proteína NS3 DENV2 recombinante induziu respostas Th1 com um IFN-γ/TNFα superior. Entretanto, um estudo clínico anterior demonstrou a associação de respostas de células T robustas com a febre hemorrágica da dengue (DHF), particularmente contra NS3. Esta discrepância precisa ser adicionalmente investigada. No estudo dos inventores, a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 induz a expressão de CD 107a na superfície de células T CD8+ em resposta à estimulação com NS1 DJ, revelando que a combinação de NS1 DJ com NS3 promove o desenvolvimento de atividade citotóxica contra NS1 DJ. De acordo com os resultados do ensaio CTL, a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 induziu citotoxicidade não apenas contra L929 expressando NS3, mas também contra células L929 expressando NS1 DJ. Um estudo anterior indicou que a produção concomitante da expressão de IFN-γ e CD107a com a nova síntese da proteína perforina é capaz de promover citotoxicidade em células T CD8+ específicas ao antígeno. Entretanto, os mecanismos detalhados da ação citotóxica ainda precisam ser elucidados.

[0110] Uma vez que a imunização ativa com NS3 também induz altos títulos de IgM e IgG anti-NS3, o exemplo não pode excluir o possível papel dos anticorpos anti-NS3 neste modelo de infecção. Estudos anteriores mostraram os efeitos protetores por anticorpos direcionados contra NS3. Embora tenham sido detectados anticorpos anti-NS3, os quais não são anticorpos neutralizantes, nos soros de pacientes com infecção por DENV primária e secundária, o papel dos anticorpos anti-NS3 continua sendo adicionalmente investigado.

[0111] Os sintomas clínicos da infecção por DENV variam de febre da dengue clássica, assintomática, até DHF severa potencialmente letal, que são caracterizadas principalmente por aumento do extravasamento vascular levando a hemorragias, hipovolemia, hipotensão e também síndrome do choque. Neste modelo de infecção por DENV, camundongos apresentaram viremia, tempo de sangramento prolongado, alteração vascular e hemorragia. O tempo de sangramento prolongado pode refletir anormalidades de coagulação, incluindo trombocitopenia e distúrbio do sistema de coagulação. Em adultos, as contagens de plaquetas estão significativamente associadas a manifestações de sangramento da infecção por DENV. Os mecanismos envolvidos na trombocitopenia e no sangramento durante a infecção por DENV não são totalmente compreendidos, embora diversas hipóteses tenham sido sugeridas. Neste modelo de infecção por DENV, a imunização ativa tanto com NS1 DJ quanto com NS3 pode encurtar o tempo de sangramento prolongado associado ao DENV (FIG. 18B). A NS1 DJ induz anticorpos neutralizantes de NS1 que bloqueiam diretamente a patogênese de sNS1 (dados não ilustrados) e também causa citólise mediada por complemento com anticorpos anti-NS1 contra células infectadas por DENV (Wan et al., 2017). Por outro lado, a imunização ativa com NS3 induz CTL específica a NS3 para reduzir títulos virais, bem como níveis de sNS1 no soro para encurtar o tempo de sangramento prolongado. Coletivamente, a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 pode encurtar significativamente o tempo de sangramento prolongado associado ao DENV através de múltiplos mecanismos.

[0112] A patogênese e proteção do extravasamento vascular e da hemorragia são complexos. sNS1 pode complementar diretamente contra células endoteliais e induzir apoptose das células endoteliais (Amorim et al., 2014). Estudos recentes mostraram que a sNS1 pode se ligar a TLR4 e então levar à liberação celular de citocinas próinflamatórias que contribuem para o extravasamento vascular (Modhiran et al., 2015). Foi demonstrado ainda que sNS1 ativa TLR2 e TLR6, levando à produção aumentada de citocinas pró-inflamatórias (Chen et al., 2015). Além disso, o fator inibitório de migração de macrófagos induzido pela infecção por DENV ou NS1 pode potencializar a replicação do DENV através de autofagia, o que também pode contribuir para o extravasamento vascular pela ruptura das junções rígidas das células endoteliais tanto em humanos quanto em camundongos (Chen et al., 2018; Chuang et al., 2011; Chen et al., 2016). NS1 também pode romper diretamente o glicocálice endotelial, levando à hipermeabilidade (Puerta-Guardo et al., 2016; Chen et al., 2018). Assim, sNS1 pode ser um fator principal que contribui direta ou indiretamente ao extravasamento vascular e à hemorragia. Como mostram os resultados, a imunização ativa somente com NS1 DJ ou NS1 DJ mais NS3 preveniu significativamente a alteração da permeabilidade vascular associada ao DENV. Em contrapartida, a imunização ativa somente com NS3 não preveniu a alteração vascular. Esses resultados realçam os papéis essenciais dos anticorpos de neutralização de NS1 na prevenção do extravasamento vascular e da hemorragia.

[0113] Baseado nas observações clínicas de que a doença da dengue é mais severa em infecções heterotípicas secundárias, qualquer vacina de êxito precisaria induzir uma resposta imune protetora e durável a todos os quatro sorotipos de DENV simultaneamente para evitar a ADE (Pang et al., 2017). O candidato a vacina, NS1 DJ mais NS3, não causará ADE. Ademais, o exemplo demonstrou que a imunização ativa com NS1 DJ mais NS3 induziu respostas de células TCD8+ específicas, que recentemente demonstraram ser capazes de serem protetoras contra reinfecção por DENV heterotípica. Após uma infecção pelo Zika vírus (ZIKV) emergente, vários estudos mostraram que a infecção por DENV anterior pode causar ADE da infecção por ZIKV por anticorpos específicos ao DENV. Por outro lado, outra modalidade demonstrou que cinco células T CD8+ específicas ao epítopo do DENV conferem proteção cruzada contra a infecção por ZIKV subsequente (Wen et al., 2017). O componente NS3 da vacina candidata contém um dos cinco epítopos, que pode mediar a proteção cruzada contra a infecção por ZIKV subsequente, e pode evitar a ADE do ZIKV. Entretanto, a proteção cruzada contra a infecção por ZIKV conferida pelo candidato a vacina precisa ser adicionalmente investigada.

[0114] Em conclusão, a presente invenção explora uma nova estratégia de vacina da DENV combinando a proteína de fusão cEDIII-NS1ΔC e a proteína NS3 que oferece proteção aprimorada contra o desafio por DENV e os efeitos patológicos associados.

[0115] Embora a presente invenção tenha sido descrita aqui com referência às modalidades específicas da mesma, uma multiplicidade de modificações, alterações e substituições são possíveis nas revelações anteriores, e será apreciado que, em alguns casos, certos aspectos das modalidades da invenção serão empregados sem um uso correspondente de outros aspectos sem que isso constitua um afastamento do escopo e espírito da invenção tal como exposto. Portanto, o espírito e escopo das reivindicações não deverão se restringir à descrição das modalidades exemplificadas demonstradas acima.

Claims (19)

1. Composição de vacina de subunidade contra a dengue, caracterizada por compreender:
   uma proteína de fusão de um polipeptídeo de proteína não-estrutural delta C (NS1ΔC) conjugando ou conectando-se a pelo menos um polipeptídeo de um polipeptídeo NS3c e/ou um polipeptídeo de domínio III consenso da proteína do envoltório (cEDIII), em que o polipeptídeo NS1ΔC é listado como as SEQ ID NOs: 2 ou 5, o polipeptídeo cEDIII é listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4, e o polipeptídeo NS3c é listado como as SEQ ID NOs: 3 ou 6; e
   opcionalmente junto com os um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
2. Composição de vacina de subunidade contra a dengue, caracterizada por compreender:
   uma proteína de fusão incluindo um polipeptídeo cEDIII e um polipeptídeo NS1ΔC, em que o polipeptídeo cEDIII é listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4, o polipeptídeo NS1ΔC é listado como as SEQ ID NOs: 2 ou 5; um polipeptídeo NS3c incluindo as SEQ ID NOs: 3 ou 6; e
   opcionalmente junto com os um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão está em uma ordem de cEDIII-NS1ΔC a partir do N-terminal para o Cterminal.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS1ΔC.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é conjugada ao polipeptídeo NS3c.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que um segundo conector é conjugado entre o polipeptídeo NS1ΔC e o polipeptídeo NS3c.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão está em uma ordem de NS1ΔC-cEDIII a partir do N-terminal para o Cterminal.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS1ΔC.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é conjugada ao polipeptídeo NS3c.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que um segundo conector é conjugado entre o polipeptídeo cEDIII e o polipeptídeo NS3c.
11. Composição de vacina de subunidade contra a dengue, caracterizada por compreender:
    uma proteína de fusão do polipeptídeo NS1 truncado das SEQ ID NOs: 5 e do polipeptídeo NS3c truncado das SEQ ID NOs: 6, e opcionalmente junto com um ou mais veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão está em uma ordem de NS1 truncado-NS3c truncado a partir do Nterminal para o C-terminal.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre o NS1 truncado e o polipeptídeo NS3c truncado.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão está em uma ordem de NS3c truncado-NS1 truncado a partir do Nterminal para o C-terminal.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão inclui um primeiro conector entre o polipeptídeo NS1 truncado e o polipeptídeo NS3c truncado.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por adicionalmente compreender um polipeptídeo cEDIII listado como as SEQ ID NOs: 1 ou 4.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo NS1 truncado da proteína de fusão é conjugado ao polipeptídeo cEDIII.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo NS3c truncado da proteína de fusão é conjugado ao polipeptídeo cEDIII.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo cEDIII é conjugado entre o polipeptídeo NS1 truncado e o polipeptídeo NS3c truncado.

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