BR102019024756A2 - levedura recombinante para a produção de pululanase, seu processo de obtenção e uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a construção e obtenção de uma enzima recombinante especialmente engenheirada biotecnologicamente para ser utilizada para fins laboratoriais, clínicos e industriais. Trata-se de uma pululanase da bactéria Pyrococcus furiosus expressa em células da levedura Pichia pastoris. Essa enzima recombinante pode ser utilizada em campos de aplicação da biotecnologia, como por exemplo, aplicações industriais baseadas em amido, em particular àquelas voltadas para a produção de glicose, como indústrias alimentícias, farmacêuticas e cervejeiras.

Description

LEVEDURA RECOMBINANTE PARA A PRODUÇÃO DE PULULANASE, SEU PROCESSO DE OBTENÇÃO E USO CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[01] O presente pedido de patente de invenção se situa no campo técnico da Biotecnologia. Trata-se do desenvolvimento de uma linhagem da levedura Komagaetella pastoris para a superprodução de pululanase, uma enzima de degradação de carboidratos complexos, a partir de metanol como fonte de carbono. As pululanases podem ser utilizadas em vários campos de aplicação da biotecnologia, como por exemplo, aplicações industriais baseadas em amido, em particular àquelas voltadas para a produção de glicose, como indústrias alimentícias, farmacêuticas e cervejeiras.

ESTADO DA TÉCNICA

[02] As pululanases (EC 3.2.1.41) pertencem à superfamília das hidrolases glicosídicas que promovem a desramificação do amido através da hidrólise dessas ligações em dextrina, amilopectina, pululana e outros oligossacarídeos relacionados. Segundo seu mecanismo catalítico e os produtos resultantes, as pululanases podem ser classificadas em dois grupos: o tipo I (pululanase), que é específico para a ligação α-1,6-glicosídica, e o tipo II (amilopululanase), que atua em ligações α-1,6- e α-1,4-glicosídicas em polissacarídeos ramificados (WANG, X.; NIE, Y.; XU, Y. Industrially produced pullulanases with thermostability: discovery, engineering, and heterologous expression. Bioresource Technology, v. 278, s. n., p. 360-371, 2019).

[03] As pululanases possuem potencial em aplicações industriais baseadas em amido, em particular, àquelas voltadas para a produção de glicose, como indústrias alimentícias, farmacêuticas e cervejeiras. De uma forma geral, o processo de hidrólise do amido abrange a liquefação e a sacarificação, ambas em altas temperaturas. Para que haja maior sustentabilidade e viabilidade econômica, o amido precisa ser hidrolisado completamente durante o processo de sacarificação. Porém, como a maioria das amilases é específica para ligações α-1,4-glicosídicas, enzimas como a pululanase e amilopululanase, que clivam também a ligação α-1,6-glicosídica, são de grande valia para decompor de forma efetiva e completa o amido em oligossacarídeos e açúcares (KAHAR, U. M.; CHAN, K.; SANI, M. H.; NOH, N. I. M.; GOH, K. M. : Effects of single and coimmobilization on the product specificity of type I pullulanase from Anoxybacillus sp. SK3-4. International Journal of Biological Macromolecules, v. 104, s. n., p. 322-332, 2017).

[04] Nos últimos anos, pesquisas biotecnológicas vêm sendo realizadas a fim de se descobrir e expressar pululanases, porém, poucas apresentam características industriais desejáveis.

[05] Na década de 1990, enzimas de Pyrococcus furiosus foram identificadas com relevante interesse tecnológico em razão de suas termoestabilidades aplicáveis em diversas áreas industriais (BROWN, S.H.; COSTANTINO, H.R.; KELLY, R.M. Characterization of Amylolytic Enzyme Activities Associated with the Hyperthermophilic Archaebacterium Pyrococcus furiosus. Appl Environ Microbiol. V. 56, s. n., p.1985–199191, 1990. JORGENSEN, S.; VORGIAS, C.E.; ANTRANIKIAN, G. Cloning, sequencing, characterization, and expression of an extracellular alpha-amylase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J Biol Chem. v. 272, s. n., p.16335–16342, 1997). Mais recentemente, Wang e colaboradores (2016) descreveram uma α-amilase extracelular de P. furiosus expressa em Bacillus amyloliquefaciens, no qual, através da engenharia genética foi possível a obtenção de altas quantidades da enzima com potencial biotecnológico, por possuir estabilidade térmica e pH ótimo de 5,0 (WANG, P.; WANG, P.; TIAN, J.; YU, X.; CHANG, M.; CHU, X.; WU, N. A new strategy to express the extracellular α-amylase from Pyrococcus furiosus in Bacillus amyloliquefaciens. Scientific Reports. v.6, sn n., p.1-10, 2016).

[06] Brown e Kelly (1993) purificaram uma pululanase a partir do sobrenadante de células de P. furiosus, mostrando crescimento ótimo a 98ºC, pH 5,5 e massa molecular de 110kDa (BROWN, S.H.; KELLY, R.M. Characterization of Amylolytic Enzymes, Having Both ox-1,4 and ao-1,6 Hydrolytic Activity, from the Thermophilic Archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis. Applied and Environmental Microbiology. v.59, s. n., p. 2614-2621, 1993). Uma amilopululanase de P. furiosus também foi clonada, caracterizada e expressa em Escherichia coli por Dong, et. al., 1997, exibindo uma atividade ótima a 105ºC e pH 5,5. O gene para esta enzima codifica uma proteína com 827 resíduos de aminoácidos com peso molecular de 89kDa (DONG, G.; VIEILLE, C.; ZEIKUS, J.G. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. Appl Environ Microbiol. v.63, s. n., p.3577–3584, 1997).

[07] Por sua vez, o pedido de patente CN107475140 reivindica a utilização da levedura Pichia pastoris recombinante, para produzir pululanase oriunda de Bacillus deraffificans resistente a condições ácidas. A patente CN105802943 reivindica a utilização da levedura Pichia pastoris para produzir uma pululanase quimérica com grande rendimento de produção. Já a patente US6355457 reivindicam a proteção de enzimas de degradação do amido por P. furiosus, incluindo amilases e pululanases. Entretanto, a utilização de organismos como a P. furiosus dificulta o escalonamento da produção, uma vez que essas bactérias, por serem extremofílicas, o controle de temperatura de cultivo deve ser rígido e elevado, elevando os custos de produção enzimática.

[08] Estudo de caracterização bioquímica de pululanases da arqueobactéria P. furiosus são extremamente raros na literatura. Características enzimáticas de espécies extremofílicas como a P. furiosus contidas no domínio Archaea incluem a capacidade de utilizar substratos, tais como o amido, como fontes de carbono. P. furiosus é um microrganismo extremofílico que possui capacidade de crescimento ótimo a 98ºC, podendo metabolizar uma variedade de substratos complexos por meio de ações de enzimas amilolíticas extracelulares, como amilases e pululanases. Geralmente essas enzimas operam altas temperaturas, facilitando a quebra do substrato.

[09] À vista disso, o uso de pululanases que sejam termoestáveis e resistentes é desejável, e, nesse sentido, possuem uma grande aplicabilidade industrial.

[010] Por outro lado, o cultivo da bactéria P. furiosus em ambientes industriais pode ser oneroso e não resultar em boa produção enzimática para atender a Industria. Além disso, a bactéria P. furiosus, por não possuir certificação da sua utilização em alimentação humana e animal (Status GRAS), não pode ser empregada em processos biotecnológicos que visam produzir produtos para essas aplicações.

[011] Para contornar os problemas de cultivo e produção, uma alternativa é a produção heteróloga de pululanases por meio de leveduras com grande capacidade de produção.

[012] Quando se almeja produzir grandes quantidades de proteínas de interesse, a levedura Komagaetaella pastoris (denominada anteriormente como Pichia pastoris) é uma das mais indicadas por possuir promotores fortemente regulados e eficientes e uma grande taxa de crescimento com forte tendência para a respiração aeróbica em oposição ao processo fermentativo. Estas duas características impactam positivamente na grande produção heteróloga de proteínas.

[013] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas técnicos supracitados para alcançar um microrganismo mais vantajoso do ponto de vista industrial e competitivo em relação as tecnologias existentes. Descreve o desenvolvimento por meio de engenharia genética, de uma cepa recombinante de Komagataella pastoris capaz de produzir uma pululanase de Pyrococcus furiosus, resultando em um microrganismo recombinante de fácil manipulação e crescimento. Essas características reunidas em um único microrganismo impactam positivamente em um menor custo e em uma maior produtividade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[014] A Figura 1 mostra um desenho esquemático do vetor recombinante (APUPF: pPIC9) construído na presente invenção. Em amarelo, a ORF (APUPF) que codifica a amilolupululanase (Apupf), em azul, o peptídeo sinal que codifica para o fator α de secreção de proteínas, em laranja, a sequência terminadora do processo de transcrição e, em verde, os promotores AOX 5´e 3´.

[015] A Figura 2 mostra a atividade enzimática em placa contendo pululana 1% dos clones de Komagataella pastoris expressando a pululanase recombinante.

[016] A Figura 3 mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) contendo SDS (SDS-PAGE) mostrando a expressão da proteína recombinante.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[017] A presente invenção se refere à construção de uma linhagem recombinante de Komagataella pastoris capaz de expressar uma pululanase de Pyrococcus furiosus, sendo capaz de utilizar pululana como única fonte de carbono.

[018] A sequência da ORF que codifica para a pululanase de P. furiosus (APUPF) foi obtida no banco de dados GeneBank ( Acession number :AF016588). APUPF foi submetida a programas de bioinformática para a remoção do peptídeo sinal (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para a expressão extracelular em P. pastoris. Além disso, a ORF também foi submetida ao programa NEBcutter 2.0 (http://www.labtools.us/nebcutter-v2-0/) para assegurar que as enzimas de restrição XhoI e NotI não cortavam no gene. Baseado nessas informações, iniciadores 5’ e 3’ foram sintetizados em empresas especializadas com o objetivo de amplificar, por PCR, a ORF APUPF usando DNA gênomico da bactéria P. furiosus.

[019] O primer 5’ tem sítio para a enzima de restrição XhoI na extremidade seguido da sequência que restabelece o sitio KEX2 da levedura P. pastoris. O Oligo 3’ tem sítio para a enzima de restrição NotI de modo que a ORF seja clonada em fase no vetor de expressão de K. pastoris pPIC9. Desta forma, as etapas de produção da levedura recombinante se dividem em:

• a) Amplificação por PCR da ORF APUPF;
• b) Clonagem da ORF no vetor pGEM-T;
• c) Subclonagem da ORF no vetor pPIC9;
• d) Linearização do plasmídeo recombinante APUPF::pPIC9;
• e) Transformação da levedura K. pastoris com o plasmídeo recombinante APUPF::pPIC9

[020] A amplificação do gene APUPF se deu por reação em cadeia da DNA polimerase usando as seguintes condições: 94°C/1min, 55°C/1min, e 72°C/3min. por 35 ciclos. O produto da PCR (amplicon) foi visualizado em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. O amplicon foi purificado do gel usando o kit de purificação plasmidial e em seguida foi utilizado em uma reação de ligação com o objetivo de clonar a ORF inicialmente no vetor de clonagem pGEM-T Em seguida, parte dessa reação foi utilizada para transformar células de Escherichia coli DH5α. Após a transformação, as placas foram incubadas a 37°C por 16-18 horas. A análise das placas mostrou o aparecimento de 2 colônias. Cada uma dessas colônias foi submetida a uma minipreparação de plasmídeo e em seguida os plasmídeos foram digeridos com a enzima PvuII para confirmação da clonagem do gene APUPF no vetor pGEM-T. Para ter certeza que o clone escolhido continha um fragmento correspondente a APUPF (aproximadamente 2.5 kb), foi feita uma digestão com a enzima Xho e NotII para liberação desse fragmento.

[021] Escolhido o clone de E. coli recombinante, foi realizada uma minipurificação do plasmídeo contendo o gene APUPF clonado no vetor pGEM-T. Em seguida, foi realizada uma reação de digestão com as enzimas XhoI e NotI para liberação do inserto e posterior purificação. Após a purificação do inserto, foi realizada uma reação de ligação da ORF APUPF no vetor de expressão pPIC9. Essa reação de ligação foi incubada por 16°C, durante a noite. Em seguida, parte dessa reação de ligação foi utilizada para transformar células de E. coli DH5α. As placas foram incubadas a 37°C por 18 horas. Após esse tempo, constatou-se o aparecimento de três colônias. O DNA plasmidial dessas colônias foram extraídos e purificados. Em seguida foi realizada reações de digestão desses plasmídeos com as enzimas de restrição XhoI e NotI para confirmar a clonagem da ORF APUPF no vetor pPIC9.

[022] Assim, foi realizada uma purificação do vetor recombinante APUPF:pPIC9 em grandes quantidades com o objetivo de transformar células da levedura K. pastoris. Inicialmente foi realizada a linearização do vetor recombinante (APUPF:pPIC9 ) utilizando a enzima de restrição Bgl II. Uma colônia da cepa K. pastoris GS115 isolada foi inoculada em meio YPD, de modo que as células foram lavadas com água gelada estéril seguidas vezes. Após isto, o pellet foi ressuspendido e centrifugado. O sobrenadante foi descartado. A reação para a transformação continha células competentes e DNA recombinante linearizado. A solução foi transferida para uma cubeta e mantida no gelo. As células foram eletroporadas e em seguida foi adicionado sorbitol ao meio para que elas pudessem ser plaquedas. As placas foram levadas para a estufa e incubadas. Após isso, foi observado o crescimento de colônias recombinantes, das quais foram selecionados os clones que apresentaram maior tamanho em relação às colônias vizinhas.

Claims (21)

1. LEVEDURA RECOMBINANTE caracterizada por expressar a enzima pululanase nativa de Pyrococcus furiosus para o meio extracelular;
2. LEVEDURA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a levedura hospedeira ser preferencialmente do gênero Komagataella sp.;
3. LEVEDURA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações de 1 a 2, caracterizada por conter plasmídeo contendo nucleotídeos (SEQ ID NO 01) que codificam a enzima pululanase;
4. LEVEDURA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizada por conter plasmídeo cuja sequência de nucleotídeos codificam a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO 02) que sintetizam a enzima pululanase;
5. PLASMÍDEO RECOMBINANTE de levedura, conforme definição em uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por conter a sequência de nucleotídeos modificados (SEQ ID NO 01) que codificam a enzima pululanase de Pyrococcus furiosus;
6. PLASMÍDEO RECOMBINANTE de levedura, de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizado por conter as sequências de nucleotídeos (SEQ ID NO 01) que reestabelecem o sitio de Kex2 para a secreção da proteína para o meio extracelular;
7. PLASMÍDEO RECOMBINANTE de levedura, de acordo com as reivindicações de 8 a 10, caracterizado por conter a sequências de nucleotídeos (SEQ ID NO 01) que apresenta sítios para enzimas de restrição XhoI e NotI nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente;
8. PLASMÍDEO RECOMBINANTE de levedura, de acordo com as reivindicações de 1 a 9, caracterizado por ser um vetor de expressão celular ou in vitro;
9. PROCESSO DE PRODUÇÃO DA ENZIMA PULULANASE RECOMBINANTE por levedura recombinante, conforme definido em uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a) Amplificação da ORF ( APUPF ) por PCR;
   • b) Clonagem da ORF no vetor pGEM-T;
   • c) Subclonagem da ORF no vetor pPIC9;
   • d) Linearização do vetor recombinante APUPF::pPIC9
   • e) Transformação da levedura K. pastoris com o plasmidio recombinante APUPF::pPIC9
10. PROCESSO DE PRODUÇÃO DA ENZIMA PULULANASE RECOMBINANTE por levedura recombinante, conforme definido em uma das reivindicações de 1 a 7, caraterizado por a indução da proteína ocorrer na faixa entre 10 minutos a 10 horas;
11. ENZIMA RECOMBINANTE caracterizada por ser geneticamente modificada e conter nucleotídeos para expressão da enzima pululanase de Pyrococcus furiosus;
12. ENZIMA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações de 1 a 11, caracterizada por ser geneticamente modificada e conter aminoácidos para expressão da enzima pululanase de Pyrococcus furiosus;
13. ENZIMA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizada por as sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 02 restabelecerem o sitio de Kex2 para a secreção da proteína para o meio extracelular;
14. USO da levedura recombinante, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizada por expressar a enzima pululanase nativa de Pyrococcus furiosus para o meio extracelular;
15. USO do plasmídeo recombinante de levedura, de acordo com as reivindicações 5 a 8, caracterizado por ser útil na produção de enzima pululanase recombinante;
16. USO de levedura recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por ser útil na produção de enzima pululanase recombinante;
17. USO de enzima pululanase recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por ser um método de atividade biológica em testes de atividade enzimática em placa contendo como substrato algum sacarídeo;
18. USO de enzima pululanase recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por ser um método de atividade biológica em testes de atividade enzimática contendo o substrato pululana;
19. USO de enzima recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por apresentar aplicações em preparações enzimáticas;
20. USO de enzima pululanase recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por apresentar aplicações em preparações enzimáticas para finalidades acadêmicas, laboratoriais e indústrias, sobretudo, nas indústrias de amidos;
21. USO de enzima pululanase recombinante, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado por apresentar aplicações em preparações enzimáticas farmaceuticamente aceitáveis.

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