Procédé de production et d'isolement
de la L-phénylalanine.
La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine. Plus particulièrement, elle concerne un perfectionnement à la production de la L-phénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium catalysée par la L-phénylalanine ammonia-lyase (PAL).
La L-phénylalanine est un aminoacide essentiel pour l'être humain et est donc un constituant important des formulations nutritives à usage entérique ou parentéral. De plus, cet aminoacide est utile comme matière première pour d'autres produits, comme l'aspartame, qui est un édulcorant artificiel. Différents procédés microbiens pour produire la phénylalanine sont connus. Par exemple, le brevet E.U.A. 3.660.235 décrit la production de la phénylalanine au moyen de souches de Brevibacterium, de Corynebacterium, d'Arthrobacter, de Bacillus et de Candida résistantes aux analogues de la phénylalanine. La production de cet aminoacide par des mutants de certaines souches de Brevibacterium, de Corynebacterium, d'Arthrobacter et d'Escherichia qui ont besoin de tyrosine est également connue. On peut se référer à ce propos aux brevets E.U.A. 3.654.079 et
3.909.353.
Le PAL catalyse la décomposition de la Lphénylalanine en acide trans-cinnamique et en ammoniac. Cette réaction enzymatique est réversible et le brevet anglais 1.489.468 décrit un procédé pour produire la Lphénylalanine qui met en jeu la réaction catalysée par le PAL de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium produisant la L-phénylalanine. Cette réaction s'est révélée utile pour la production industrielle de la L-phénylalanine et il reste en permanence nécessaire d'adapter le procédé en vue d'optimaliser la fabrication. Sous ce rapport, il est particulièrement nécessaire d'améliorer l'isolement de la L-phénylalanine hors du mélange de bioréaction.
Suivant le brevet anglais précité, la L-phénylalanine est initialement isolée en étant précipitée à son point isoélectrique (pH 5,5), ou en variante en étant absorbée sur une résine échangeuse de cations à un pH bas et dont elle est éluée au moyen d'hydroxyde d'ammonium à un pH élevé. La L-phénylalanine est ensuite débarrassée des ions ammonium par chauffage de la solution. Ce brevet décrit aussi un procédé d'isolement qui revient à convertir la L-phénylalanine en son ester méthylique in situ et à cristalliser celui-ci sous la forme de son chlorhydrate. Les procédés d'isolement décrits dans le brevet anglais 1.489.468 n'ont pas donné parfaite satisfaction pour une fabrication à l'échelle industrielle.
La simple précipitation de la L-phénylalanine à son point isoélectrique conduit à un rendement en produit et à une pureté de celui-ci qui n'atteignent pas l'idéal. Bien que la chromatographie par échange d'ions donne un produit relativement pur, elle est incommode à l'échelle industrielle.
Yamada, S. et al. décrivent dans Applied and Environmental Microbiology, novembre 1981, pages 773-
778, des procédés de laboratoire pour produire la Lphénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium sous la catalyse par le PAL. Dans le procédé décrit dans cet article, la L-phénylalanine est isolée du mélange de bioréaction contenant les cellules suivant un mode opératoire en plusieurs stades qui comprend la centrifugation séparant les cellules et les solides, l'élimination sous vide de l'ammoniac en excès du liquide surnageant, l'ajustement du pH à 1,8 pour la précipitation de l'acide transcinnamique (qui est ensuite séparé par filtration), la chromatographie par échange de cations permettant d'absorber la L-phénylalanine et l'élution de la L-phénylalanine à l'aide d'une base.
Les auteurs mentionnent un rendement de 69% pour ce procédé. Bien que la L-phénylalanine produite de cette façon soit très pure, comme indiqué précédemment, la chromatographie sur colonne est incommode pour une production à l'échelle industrielle.
Il reste donc intéressant d'améliorer les techniques d'isolement de la L-phénylalanine hors des mélanges de bioréaction dans lesquels elle a été produite sous catalyse par le PAL.
La présente invention a pour objet un procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium en présence de phénylalanine ammonia-lyase dans les conditions de la production de la L-phénylalanine, et d'isolement de la L-phénylalanine ainsi produite, suivant lequel on utilise le carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium. L'utilisation de ce sel comme source des ions ammonium facilite beaucoup les techniques d'isolement du fait que le cation et aussi l'anion constitutifs du sel peuvent être éliminés du mélange de réaction par volatilisation.
Suivant le procédé de l'invention, de la phénylalanine ammonia-lyase produite par voie microbienne est mise en contact avec de l'acide trans-cinnamique et des ions ammonium pour donner de la L-phénylalanine. La phénylalanine ammonia-lyase peut être contenue dans un bouillon aqueux contenant les cellules microbiennes ou dans les cellules qui en ont été séparées ou bien être présente à l'état de l'enzyme isolée. De plus, les cellules entières ou l'enzyme isolée peuvent être immobilisées sur un support solide. Le PAL est produit par culture d'un micro-organisme producteur de PAL dans un milieu nutritif approprié.
Les souches microbiennes qui produisent le PAL et les procédés microbiologiques dans lesquels ces souches sont utilisées sont connus et décrits, par exemple, dans le brevet anglais et l'article précité de Yamada, de même que dans les demandes de brevet E.U.A. n[deg.] 432.182 (ler octobre 1982) et 547.129 (31 octobre 1983).
La réaction enzymatique est généralement conduite par mise en contact du PAL avec une solution de substrat. Antérieurement à la présente invention, la solution de substrat était normalement préparée par dissolution d'acide trans-cinnamique dans une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium. De l'eau et un acide minéral étaient ensuite ajoutés pour ajuster le volume et le pH du substrat, respectivement. En variante, les ions ammonium ont été introduits dans la solution de substrat sous la forme d'un sel d'ammonium tel que le chlorure d'ammonium. La demande de brevet E.U.A.
432.182 précitée mentionne que les ions halogénure ont un effet nuisible sur la L-phénylalanine ammonia-lyase et préconise donc d'utiliser des solutions de substrat sensiblement exemptes d'halogène.
Il y est dès lors indiqué que les sels d'ammonium préférés sont notamment le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium.
La présente invention a pour objet l'utilisation du carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium dans la solution de substrat. De manière générale, la solution de substrat peut être préparée par mélange d'ammoniac, sous forme de gaz ou d'hydroxyde d'ammonium, avec du carbonate d'ammonium pour établir la concentration souhaitée en carbonate d'ammonium. Suivant une variante préférée pour préparer la solution de substrat, l'acide trans-cinnamique est dissous dans une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium dans laquelle du dioxyde de carbone est ensuite introduit par barbotage jusqu'à ce que la solution ait le pH souhaité. La concentration en ions ammonium dans cette solution de substrat est avantageusement d'environ 0,1 à environ 9,0 moles par litre et de préférence d'environ 5,0 à environ 8,0 moles par litre.
La solu-tion de substrat contient aussi l'acide transcinnamique. La concentration en acide trans-cinnamique de la solution est ajustée de manière que la réaction catalysée par l'enzyme progresse à une vitesse utile, mais sans que la concentration soit élevée au point que le substrat inhibe l'activité enzymatique. En règle générale, la concentration en acide trans-cinnamique s'échelonne d'environ 5 à environ 25 et de préférence environ 10 à environ 20 g par litre. Le pH est ajusté de façon que les conditions de la production de la Lphénylalanine soient maintenues lorsque le catalyseur est amené au contact de la solution de substrat. Ce pH est avantageusement d'environ 9 à 11 et de préférence environ 10,4 à 10,8.
Après que le PAL a été mis en contact avec la 'solution de substrat pendant une durée suffisante pour convertir une fraction sensible de l'acide trans-cinnamique en L-phénylalanine, celle-ci peut être isolée et purifiée. Au pH de la solution de substrat, tant l'acide trans-cinnamique que la L-phénylalanine sont solubles. Par conséquent, les cellules et les autres solides peuvent être séparés par centrifugation ou filtration en laissant subsister une solution clarifiée. Celle-ci peut être dessalée, avantageusement par volatilisation de l'ammoniac et du dioxyde de carbone qui ont été apportés par l'hydroxyde d'ammonium et le carbonate d'ammonium initialement ajoutés à la solution de substrat.
La possibilité d'éliminer ces espèces ionogènes de la solution par volatilisation est l'avantage principal de l'utilisation du carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium. Un autre avantage important du procédé de l'invention est que l'ammoniac et le carbonate d'ammonium peuvent être récupérés et réutilisés. La récupération de ces agents chimiques améliore l'économie d'ensemble du procédé et réduit au minimum la pollution par ces agents dans le milieu extérieur. Le dessalement est généralement exécuté par chauffage de la solution clarifiée jusqu'à une température qui facilite la volatilisation du carbonate d'ammonium. Des températures d'environ 10 à 120[deg.]C et de
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régnant dans le réacteur, conviennent à cette fin. L'évaporation sous vide, l'entraînement par l'air ou l'entraînement par la vapeur d'eau permettent d'accélérer efficacement la volatilisation du carbonate d'ammonium en ammoniac et dioxyde de carbone. L'évaporation sous vide à des températures d'environ 40 à 60[deg.]C constitue la technique préférée. Un mode opératoire particulièrement préféré consiste à chauffer la solu-
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absolue d'environ 100 mm Hg et à séparer l'ammoniac et le dioxyde de carbone par évaporation. Initialement, il se dégage de l'ammoniac gazeux, ce dégagement d'ammoniac fait baisser le pH de la solution. Lorsque le pH atteint une certaine valeur, le dioxyde de carbone commence à se dégager à son tour et compense la baisse du pH. Sensiblement la totalité de l'ammoniac et du dioxyde de carbone peut être éliminée efficacement de la solution de cette façon, si la chose est souhaitée, et les gaz peuvent être récupérés par condensation des vapeurs.
L'élimination du sel hors de la solution par volatilisation permet de concentrer davantage la solution exempte de sel résultante pour faire cristalliser la L-phénylalanine avec un rendement élevé.
La cristallisation de la L-phénylalanine est effectuée par évaporation de la solution, par exemple à une température d'environ 10 à environ 120[deg.]C jusqu'à ce que la concentration en L-phénylalanine soit d'environ
75 à environ 300 g par litre et de préférence d'environ 150 à environ 200 g par litre. Un mode opératoire préféré est d'évaporer la solution sous pression réduite à une température d'environ 20 à environ 70[deg.]C, jusqu'à ce que la concentration souhaitée en L-phénylalanine soit atteinte. Pendant cette évaporation, un pH du domaine alcalin est entretenu pour éviter la précipitation de l'acide trans-cinnamique qui reste en solution et pour porter au maximum le rendement en Lphénylalanine. Ce pH est généralement situé entre environ 6 et 9 et de préférence entre environ 7,0 et 8,5.
La dispersion résultante de L-phénylalanine est ensuite refroidie graduellement jusqu'à une température qui provoque la cristallisation sensible de la L-phénylalanine. La solution est refroidie de préférence jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C. Les cristaux de L-phénylalanine ainsi obtenus peuvent être ensuite isolés, par exemple par filtration ou centrifugation, lavés à l'eau froide et séchés. Une seconde récolte de cristaux peut être obtenue par poursuite de la concentration et du refroidissement de la liqueur mère, si la chose est souhaitée. L'acide trans-cinnamique subsistant éventuellement dans la liqueur mère peut être recueilli par acidification et précipitation et est alors avantageusement recyclé au bioréacteur.
Suivant une variante de l'invention, il est parfois avantageux de séparer et recueillir l'acide trans-cinnamique du mélange de réaction avant de recueillir la L-phénylalanine.
Avant la précipitation de la L-phénylalanine, la solution dessalée est avantageusement acidifiée au moyen d'un acide minéral fort, comme l'acide sulfurique ou chlorhydrique, jusqu'au pH où l'acide trans-cinnamique précipite. Ce pH est généralement d'environ 1,0 à environ 3,0 et de préférence d'environ 1,5 à 2,5. Une précipitation sensiblement quantitative de l'acide trans-cinnamique peut être obtenue par refroidissement de la solution jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C et de préférence d'environ 0 à 5[deg.]C. L'acide cinnamique précipité peut être recueilli par filtration ou centrifugation et utilisé à nouveau, si la chose est souhaitée.
La solution résultante est alors concentrée, par exemple par évaporation sous vide, jusqu'à ce qu'une concentration relativement en L-phénylalanine soit atteinte. La concentration souhaitée est une concentration telle que lors de la cristallisation ultérieure, la L-phénylalanine précipite sensiblement dans la solution. Il est préférable de réaliser la précipitation sensiblement quantitative de la L-phénylalanine. A cet effet, la concentration en L-phénylalanine s'échelonne d'environ 25 à environ 150 et de préférence environ 50 à 150 g par litre.
La cristallisation de la L-phénylalanine dans sa solution est avantageusement réalisée par ajustement du pH de la solution à peu près au point isoélectrique de la phénylalanine au moyen d' une base. Il est préférable d'utiliser l'ammoniac ou l'hydroxyde d'ammonium pour cet ajustement du pH. Le pH s'échelonne généralement de 3,5 à environ 6,5. Au cours de cet ajustement du pH, il est préféré de chauffer la solution à une température qui maintient la L-phénylalanine en solution pendant l'ajustement du pH. Par exemple, une température d'environ 40 à environ 100[deg.]C convient. Un refroidissement graduel de cette solution provoque la cristallisation de la L-phénylalanine avec une pureté élevée. La précipitation sensiblement quantitative peut être réalisée par refoidissement jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C.
Les cristaux de L-phénylalanine peuvent être ensuite recueillis par filtration ou centrifugation, puis lavés à l'eau froide et séchés.
Le procédé de l'invention s'est révélé particulièrement propre à la production industrielle. Le procédé donne la L-phénylalanine en cristaux de haute pureté et avec un bon rendement.
L'invention est davantage illustrée par les exemples non limitatifs ci-après.
EXEMPLE 1.-
Le présent exemple décrit l'isolement de la Lphénylalanine à partir d'un mélange de bioréaction suivant le procédé de l'invention. Le mélange de bioréaction est obtenu par réaction de l'acide transcinnamique sur l'ammoniac en présence de cellules de Rhodotorula Rubra contenant du PAL. La solution du substrat pour l'enzyme est préparée par dissolution d'acide trans-cinnamique dans une solution aqueuse d'ammoniaque et par ajustement du pH de 10,4 à 10,8 au moyen de dioxyde de carbone. La solution de réaction a un volume final de 1.236 litres et contient au total
51,912 kg de L-phénylalanine (42,0 g par litre).
On refroidit ce mélange de réaction à une température de 10 à 15[deg.]C pour réduire au minimum les pertes d'ammoniaque et inhiber la décomposition de la L-phénylalanine. On centrifuge le mélange et on le filtre sur un filtre-presse à feuille pour séparer les cellules. A ce moment, le filtrat (1.190 litres) a une concentration en phénylalanine de 38,2 g par litre. On chauffe ce filtrat à 40[deg.]C sous vide (635 mm Hg) de façon à le concentrer jusqu'à 485 litres. On chasse ensuite l'ammoniac et le dioxyde de carbone de la solution et on les récupère par condensation des vapeurs. La solution concentrée résultante a un pH d'environ 9,5 et une concentration en L-phénylalanine de 83,1 g par litre.
Une certaine quantité de matière particulaire s'est formée dans la solution pendant la concentration et l'élimination du sel et on l'élimine par filtration au filtre-presse à feuille avant de poursuivre les opérations. On chauffe le concentré clarifié à nouveau à 40[deg.]C sous vide (635 mm Hg) et on l'évapore jusqu'à un volume de 240 litres. On ajuste le pH à 8,7 et on refroidit ce concentré jusqu'à 5[deg.]C. On recueille par centrifugation les cristaux de L-phénylalanine qu'on lave à l'eau froide. On recueille sous forme de cristaux sensiblement purs environ 53% de la L-phénylalanine initialement contenue dans le réacteur. Une autre quantité de 25% de L-phénylalanine est contenue dans la liqueur mère et les liqueurs de lavage et on peut en récupérer une fraction sous la forme d'une seconde récolte de cristaux, si la chose est souhaitée.
EXEMPLE 2.-
On répète le mode opératoire de l'exemple 1 dans tous ses détails essentiels. Le mélange de réaction initial a un volume de 1.245 litres et contient
39 g par litre de phénylalanine. On recueille au total
38,0 kg de L-phénylalanine (78,3%) sous la forme d'un premier lot de cristaux isolés de la solution concentrée dessalée. La liqueur mère de la cristallisation de la L-phénylalanine contient 9,0 kg (18,5%) de L-phénylalanine et on la recycle à une fermentation ultérieure, comme inducteur de PAL. En outre, la liqueur mère contient 16,5 kg d'acide trans-cinnamique qu'on recycle aussi à une bioréaction ultérieure.
EXEMPLE 3.-
Le présent exemple décrit l'isolement de la Lphénylalanine d'un mélange de bioréaction suivant une forme de réalisation de l'invention où l'acide transcinnamique est séparé avant la précipitation de la Lphénylalanine.
On centrifuge et on filtre pour en séparer les cellules, un mélange obtenu par bioréaction de l'acide trans-cinnamique avec l'ammoniac en présence de cellules de R.rubra contenant du PAL. Avant la centrifugation, le mélange a un pH de 10-,52, une température
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contient, par litre, 21,0 g de L-phénylalanine et
15,3 g d'acide trans-cinnamique.
On centrifuge le mélange de réaction et on le filtre pour en séparer les cellules, puis on le transfère dans des récipients munis de dispositifs de chauffage et d'agitation. On chauffe la solution
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On récupère l'ammoniac et le carbonate d'ammonium par condensation des vapeurs. On entretient le barbotage d'air jusqu'à ce que le volume soit d'environ 350-
375 litres et que la concentration en L-phénylalanine soit de 70 à 80 g par litre. On transfère le concentré ensuite dans un autre récipient où on ajuste le pH à 2,0-2,1 au moyen d'acide sulfurique à 50%. On refroidit la solution acidifiée jusqu'à 0-10[deg.]C et on la met à reposer pendant 4 heures. On sépare les cristaux résultants d'acide trans-cinnamique de la solution par centrifugation. On transfère la liqueur mère dans un autre récipient, on la conserve à 23-24[deg.]C pendant 1 heure et on ajoute 8 kg d'un auxiliaire de filtration. On sépare l'auxiliaire de filtration et l'acide trans-cinnamique résiduel en filtrant la solution au filtre-presse.
Le filtrat (augmenté des liqueurs de lavage) a un volume de 270 litres et contient, par litre, 1,88 g d'acide trans-cinnamique et 59,5 g de Lphénylalanine. On transfère ce filtrat en parties égales dans deux récipients où on ajuste le pH à 3,53,6 au moyen d'ammoniaque aqueuse à 29%, après quoi on chauffe la solution à 60-70[deg.]C. On fait le vide (175 mm Hg) et on évapore le contenu des récipients jusqu'à ce que la concentration en L-phénylalanine soit de 200 g par litre. On refroidit le mélange concentré à
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le maintient à cette température pendant 4 heures. On sépare par centrifugation les cristaux résultants de Lphénylalanine qu'on lave à l'eau désionisée froide et qu'on sèche. On rassemble la liqueur mère et les liqueurs de lavage avec les solutions correspondantes d'une opération antérieure d'isolement et on en isole une seconde récolte de cristaux par concentration et refroidissement des mélanges de la façon décrite cidessus. Le rendement pour la première récolte de cristaux est d'environ 70%.
REVENDICATIONS
1.- Procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine par réaction d'acide trans-cinnamique avec des ions ammonium en présence de phénylalanine ammonia-lyase dans les conditions de la production de la L-phénylalanine, et d'isolement de la L-phénylalanine hors du mélange de bioréaction ainsi obtenu, caractérisé en ce qu'on utilise le carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium.