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formée par SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S. p. A. pour : "Procédé de préparation de L-carnitine et produits inter- médiaires utilisés à cet effet" Priorité de deux demandes de brevet aux Etats-Unis
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d'Amérique déposées les 6 décembre 1982, sous le n 171 et 21 octobre 1983, sous le nO au nom de Charles J. Sih.
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"Procédé de préparation de L-carnitine et produits inter- médiaires utilisés à cet effet"
La présente invention est relative à des procédés de préparation de la L-carnitine. D'une manière plus spécifique, elle est relative à un procédé de réduction microbiologique d'esters ou d'amides acétoacétiques y-substitués en leurs dérivés d'acide L-Y-hydroxy-Y- substitué-butyrique respectifs, lesquels dérivés peuvent être aisément convertis en chlorure de L-carnitine. L'in- vention se rapporte également à de nouveaux intermédiaires chimiques utilisés dans ledit procédé.
Ainsi que cela est bien connu, la carnitine (acide P-hydroxy-y-triméthyl-amino butyrique) contient un centre d'asymétrie et, par conséquent, la carnitine existe sous deux formes stéréoisomères, à savoir les formes D et L.
La L-carnitine est normalement présente dans le corps où elle sert à véhiculer les acides gras libres à longue chaine, activés à travers la membrane mitochondriale. Puisque la membrane mitochondriale est imperméable aux dérivés d'acyl CoA, les acides gras libres à longue chaîne ne peuvent entrer que lorsque l'estérification avec la L-carnitine a eu lieu.
La fonction de transporteur de la L-carnitine est exercée à la fois par le transport des acides gras-à longue chaîne actifs
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des sites de leur biosynthèse, à titre d'exemple les microsomes, vers les mitochondries où ils sont oxydés, et par le transport d'acétyl CoA des mitochondries, où elle s'est formée, vers les sites extramitochondriaux où se produit la synthèse des acides gras à longue chaîne, par exemple dans les microsomes où l'acétyl CoA peut être utilisée pour la synthèse de cholestérol et d'acides gras.
Bien que l'on ait établi que l'isomère lévogyre (L-carnitine) est exclusivement la forme biologique (la D-carnitine n'a jamais été décelée jusqu'à présent dans les tissus de mammifères), on a utilisé le racémate de D, L-carnitine pendant un certain nombre d'années pour différentes indications. Par exemple, la D, L-carnitine est vendue en Europe comme stimulant de l'appétit, et on a rapporté que cette substance avait un effet sur le taux de croissance des enfants ; voir, par exemple, Borniche et coll., Clinica Chemica Acta, 5,171-176, 1960 et Alexander et coll.,"Protides in the Biological fluids", 6ème Colloque, Bruges, 1958,306-310.
Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 30830. 931 spécifie que l'on peut souvent obtenir des améliorations de la contractivité myocardique et du rythme systolique dans des insuffisances cardiaques par l'administration de D, L-carnitine.
Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 968.241 décrit l'utilisation de la D, L-carnitine dans les arythmies cardiaques. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.810. 994 décrit l'utilisation de la D, L-carnitine dans le traitement de l'obésité.
Toutefois, récemment, on a insisté de plus en plus sur l'importance d'utiliser exclusivement l'isomère
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lévogyre de la carnitine pour au moins certaines des applications thérapeutiques. On a, en fait, montré que la D-carnitine est un inhibiteur compétitif d'enzymes liées à la carnitine, telles que la carnitine acétyl transférase (CAT) et la carnitine palmityl transférase (PTC). De plus, des travaux récents font supposer que la D-carnitine peut anéantir la L-carnitine du tissu cardiaque. Par conséquent, il est essentiel que l'on administre exclusivement de la L-carnitine aux patients sous traitement médical pour des maladies cardiaques ou un abaissement des lipides du sang.
Plusieurs procédés ont été proposés pour produire de la carnitine à l'échelle industrielle. Toutefois, la synthèse chimique de la carnitine mène inévitablement à un mélange racémique des isomères D et L. Par conséquent, on a dû utiliser des méthodes de dédoublement pour obtenir les antipodes optiques séparées du racémate. Ces méthodes de dédoublement sont toutefois ennuyeuses et coûteuses.
Un but de la présente invention est de produire de la L-carnitine dans un bon rendement par une combinaison de procédés microbiologique et chimique.
Un but de la présente invention est de prévoir un procédé amélioré pour la synthèse de L-carnitine à partir de matières premières d'un coût modéré, aisément disponibles.
Un autre but de la présente invention est de décrire la préparation de nouveaux intermédiaires optiquement actifs, intéressants pour la synthèse de la Lcarnitine et de ses sels ou esters.
Un autre but de la présente invention est de
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prévoir des procédés de préparation de L-carnitine via le déplacement par de la triméthylamine du groupe halo d'un 4-halo-3 (R)-hydroxybutyrate.
Encore un autre but de la présente invention est de prévoir un procédé de production de 4-iodo ou de 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrates à partir de 4-chloro-3 (R)hydroxybutyrates.
Ces buts et d'autres détails de l'invention ressortiront d'une manière plus évidente de la description ci-après.
Les avantages de la présente invention apparaîtront aisément aux spécialistes de la technique en fonction de la description détaillée suivante.
Il est connu de réduire par hydrogénation sur
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Pt/C la fonction en position 3 des dérivés d'acide y-substitué-acétoacétique (par exemple voir brevet des Etats-Unis d'Amérique nO Toutefois, le composé hydroxy résultant de ce procédé est racémique.
Par contre, en utilisant l'action fermentaire d'un microorganisme suivant le procédé de la présente invention, on peut réaliser l'hydrogénation de la fonction oxo en position 3 de façon stéréosélective pour donner des dérivés d'acide P-hydroxybutyrique y-substitués optiquement actifs.
En particulier, par un choix approprié (tel que décrit ci-après) du substrat à exposer à l'action fermentaire des micro-organismes suivant le procédé de la présente invention, on obtient la configuration épimère 3 (R) ou L. Cette configuration est requise pour la conversion en L-carnitine naturelle.
D'une manière générale, la présente invention
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comprend l'utilisation de l'enzyme réductase microbienne, la L-P-hydroxyacyl CoA déshydrogénase [EC 1.1. 1. 35], pour catalyser l'hydrogénation stéréosélective de dérivés d'acide acétoacétique y-substitués tels que définis ci-après.
Par conséquent, suivant son aspect le plus large, le procédé de la présente invention pour la préparation de dérivés d'acide P-hydroxybutyrique y-substitués, optiquement actifs répondant à la formule :
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dans laquelle X représente Cl, Br, I ou OH et R est un radical à chaîne droite, à chaîne ramifiée ou de configuration cyclique choisi dans le groupe comprenant les radicaux alcoxy comportant de 1 à environ 15 atomes de carbone, les radicaux alkylamino comportant environ 5 à environ 15 atomes de carbone, les radicaux cycloalcoxy et les radicaux cycloalkylamino comportant environ 5 à environ 12 atomes de carbone, les radicaux phénoxy et phénylalcoxy comportant 7 à environ 14 atomes de carbone,
et les radicaux phénylamino et phénylalkylamino répondant aux formules ?
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dans lesquelles Y et Z sont choisis parmi H, les groupes alkyle comportant de 1 à environ 8 atomes de carbone, le phényle et le benzyle et A est choisi parmi H, CH , Cl et Br, à partir d'esters ou d'amides d'acide acétoacétique
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y-substitués, consiste à soumettre ces esters ou amides d'acide acétoacétique y-substitués à l'action enzymatique fermentaire d'un micro-organisme qui produit de la L-p- hydroxyacyl CoA déshydrogénase [EC 1.1. 1. 35], et à récupérer les dérivés d'acide ss-hydroxybutyrique y-substi- tués optiquement actifs, désirés.
En particulier, afin de préparer des dérivés d'acide 3 (R) -hydroxybutyrique y-substitués, optiquement actifs répondant à la formule et à la configuration 3 (R) :
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le procédé consiste à soumettre des composés répondant à la formule :
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dans laquelle X et R ont les significations susmentionnées, à la condition que si R représente un radical alcoxy il comporte de 5 à environ 15 atomes de carbone, à l'action enzymatique fermentaire d'un micro-organisme qui produit de la L-ss-hydroxyacyl CoA déshydrogénase LEC 1. 1.
1. 35], et à récupérer les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique 4-substitués optiquement actifs, désirés du mélange de réaction fermentairc.
On a constaté que n'importe quel micro-organisme qui produit l'enzyme désiré peut servir à catalyser la réduction stéréosélective. Des micro-organismes particulièrement intéressants sont ceux de la classe des Ascomycètes, des ordres desEndomycétales, Mucorales,
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Moniliales et Eurotiales, et du genre Saccharomyces.
Le Saccharomyces Cerevisiae s'avère particulièrement intéressant.
Pour préparer des esters de 3 (R)-hydroxybutyrate 4-substitués optiquement actifs contenant 1 à 4 atomes de carbone, il est nécessaire d'utiliser de la L-D-hydroxy- acyl CoA déshydrogénase purifiée [EC 1.1. 1. 35], telle que celle de coeur de porc, parce que les micro-organismes intacts contiennent des oxydo-réductases de configuration opposée, qui interfèrent. Par conséquent, la réduction microbienne de,. par exemple, des esters 4-chloroacétoacétiques de 1 à 4 atomes de carbone donne des 4-chloro- 3-hydroxybutyrates de puretés optiques insatisfaisantes.
Par conséquent, la présente invention prévoit également un procédé de préparation de dérivés d'acide 3 (R) hydroxybutyrique y-substitués, optiquement actifs répondant à la formule et à la configuration 3 (R) :
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où X représente Cl, Br, I ou OH et R représente un radical alcoxy comportant de l à 4 atomes de carbone, qui consiste à soumettre des composés répondant à la formule :
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dans laquelle X et R ont les significations susmentionnées, à l'action enzymatique de L-ss-hydroxyacy1 CoA déshygénase [EC 1.1. 1. 35J sous une forme purifiée, et à récupérer les dérivés d'acide 3 (R)-hydroxybutyrique y-subs- titués optiquement actifs, désirés du mélange de réaction
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enzymatique.
La présente invention prévoit donc des composés répondant à la formule et à la configuration 3 (R) :
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EMI9.2
où X représente Cl, Br, I ou OH et R représente un radical à chaîne droite, à chaîne ramifiée ou de configuration cyclique choisi dans le groupe comprenant les radicaux alcoxy comportant de 1 à environ 15 atomes de carbone, les radicaux alkylamino comportant environ 5 à environ 15 atomes de carbone, les radicaux cycloalcoxy et cycloalkylamino comportant environ 5 à environ 12 atomes de carbone, les radicaux phénoxy et phénylalcoxy comportant de 7 à environ 14 atomes de carbone et les radicaux phénylamino et phénylalkylamino répondant aux formules
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dans lesquelles Y et Z sont choisis parmi H, les groupes alkyle comportant de 1 à environ 8 atomes de carbone, le phényle et le benzyle et A est choisi parmi H, CH ,
Cl et Br.
On peut ensuite faire réagir les dérivés d'aci- de y-substitué-L-P-hydroxybutyrique optiquement actifs avec de la triméthylamine pour donner le dérivé d'acide Y-triméthylammonium-L-P-hydroxybutyrique correspondant, que l'on peut aisément convertir en L-carnitine par traitement avec des acides aqueux. On donne ci-après un schéma des étapes réactionnelles de ce procédé.
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OH q 0 x x/1 /1 arganismn R 1 CoA déshydrogénase II X=C1, Br, I, OH 1) C3,-N CH-. v 3 1.... , - y* 3 IN L-Car
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On a constaté que la réaction précédente Il se faisait plus facilement lorsque X = Cl. Toutefois, puisque la réaction suivante IIIII se produit avec de meilleurs rendements lorsque X représente de l'iode ou du brome, il est préférable de préparer d'abord le dérivé Cl et de le convertir ensuite en le dérivé I ou Br correspondant.
La présente invention est également relative à un procédé amélioré qui comprend tout d'abord la conversion de l'ester 4-cbloro-3 (R)-hydroxybutyrate en les 4-iodo-ou 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrates Pour une raison de simplicité, on se référera ci-après au dérivé I. On peut faire réagir doucement l'iodhydrine (V) avec de la triéthylamine à la température ambiante pour donner le composé VI, que l'on convertit aisé-
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ment en L-carnitined'après la séquence réactionnelle suivante :
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HO, "0. ci II OR R H ca ester C. 43 1 MeOH 1 CH3 CH3 OH 0 3-.. - 7 3-1 1 CH f CH3-1- 'OR CH VI L-carmtine
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Le procédé précédent tel qu'exemplifié par
H O HO¯, ol'équation est l'objet d'un grand nombre de variantes.
Quelle que soit la forme sous laquelle il est alors disponible, on fait réagir l'ester avec de l'iodure de sodium dans un solvant approprié, tel que de la 2-butanone, de l'acétone, du butanol, etc. La réaction principale désirée à ce moment dans la réaction avec l'iodure de sodium est une réaction de déplacement qui forme l'iodhydrine V sans perturber le centre d'asymétrie sur l'atome de carbone adjacent. Pour cette réaction, il est nécessaire d'utiliser une quantité au moins suffisante d'iodure de sodium pour déplacer la totalité du chlorure du produit II. D'une manière générale, on utilise un léger excès d'iodure de sodium.
On peut réaliser la réaction de V avec la trimé-
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thylamine à des températures douces (par exemple 250C) (voir S. G. Boots et M. R. Boots, J. Pharm. Sci., 64, 1262,1975), dans une série de solvants, tels que du méthanol ou de l'éthanol contenant un excès de triméthylamine. On notera que suivant le solvant alcoolique utilisé, un échange d'ester se produira. Par exemple, lorsque l'on utilise le méthanol comme solvant, on obtient de l'ester méthylique de L-carnitine dans la réaction. Cette réaction d'échange s'avère avantageuse parce qu'il est connu que l'ester méthylique de L-carnitine peut être transformé directement en la base libre de L-carnitine en le faisant passer dans une colonne d'échange ionique (OH) [voir E. Strack et J. Lorenz, J. Physiol. Chem. (1966) 344, 276 J.
On peut voir d'après la description des procédés précédents que l'on forme un certain nombre de nouveaux intermédiaires optiquement actifs, hautement intéressants. S'avèrent particulièrement intéressants les esters alkyliques d'acide 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrique dans lesquels les groupes alkyle comportent chacun de 6 à 10 atomes de carbone. L'ester octylique est particulièrement intéressant.
On connaît bien dans la technique microbiologique les micro-organismes qui ont l'activité d'oxydo-réductase désirée et on peut utiliser n'importe lequel de ces micro-organismes pour réaliser le procédé de la présente invention [voir K. Kieslich,"Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic compounds" (Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976)], l'un quelconque des genres de micro-organismes spécifiés dans le cadre de la présente invention s'avérant particulièrement intéressant.
On
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a constaté que des micro-organismes aisément disponibles et bon marché du genre Saccharomyces, par exemple la levure de bière, la levure de pain et la levure de vin (Saccharomyces vini) produisaient de la L-P-hy- droxyacyl CoA déshydrogénase [EL 1.1. 1. 35J et s'avéraient particulièrement avantageux pour réaliser le procédé de l'invention. L'enzyme est décrite par S. J. Wakil et E. M. Barnes Jr. dans Comprehensive Biochemistry volume 185 (1971), pages 57-104.
On peut incorporer le substrat acétoacétique 4-substitué dans un milieu nutritif de composition standard, dans lequel ces organismes sont cultivés et les conditions usuelles de fermentation peuvent alors être utilisées pour effectuer la transformation par réduction.
Ou bien, on peut séparer le principe actif de la culture de croissance du micro-organisme, par exemple par une lyse des cellules pour libérer les enzymes, ou par la mise en suspension des cellules restantes dans un système aqueux frais. Par l'une ou l'autre de ces techniques, la fonction P-céto sera réduite sélectivement, aussi longtemps que l'enzyme active produite par les microorganismes est présente dans le milieu. Evidemment, les conditions de température, de durée et de pression sous lesquelles on réalise la mise en contact du dérivé acétoacétique 4-substitué avec l'enzyme de réduction sont interdépendantes, ainsi que cela paraîtra évident aux spécialistes de la technique.
Par exemple, avec un chauffage doux et à la pression atmosphérique, le temps requis pour effectuer la conversion par réduction sera inférieur à celui qui sera nécessaire si on réalise cette conversion à la température ambiante sous des conditions par ail-
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lairs identiques. Evidemment, ni la température, ni la pression, ni la durée ne doivent être élevées au point qu'il en résulte une dégradation du substrat. Lorsque l'on utilise une culture de croissance du micro-organisme, les conditions de traitement doivent être suffisamment douces pour que l'organisme ne soit pas tué avant qu'il n'élabore suffisamment d'enzymes hydrolytiques pour permettre à la réaction de se développer.
D'une manière générale, à la pression atmosphérique, la température peut aller d'environ 100C à environ 350C, et le temps d'environ 12 heures à environ 10 jours.
Dans les exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer la présente invention et qui ne constituent en aucun cas une limitation à celle-ci, on prépare les dérivés d'acide y-halo-acétoacétique comme substrats à soumettre à la réduction microbiologique à partir de dicétène suivant le procédé général de C. D. Hurd et H. L. Abernethy (J. Am. Chem. Soc., 62,1147, 1940) pour les dérivés
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y-chloro-acétoacétiques et de S. Chick, N. T. M. Wilsmore [J. Chem. Soc., 1978 (1910)] pour les dérivés acétoacétiques via la séquence réactionnelle suivante :
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o n X2 T - < "r*TT ) O-C=O/ tshe..
0 f) )'t OÙ X = Cl ou 3r y R précédemment
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Ou bien, si on le désire, on peut préparer les dérivés d'acide y-halo acétoacétique à partir d'esters y-halo acétiques via une réaction de Grignard ordinaire. Par exemple, on prépare aisément l'ester ychloro acétoacétique octylique par chauffage au reflux d'ester y-chloro octylique avec deux équivalents de magnésium dans de l'éther pendant 48 heures. Après séparation du solvant, on récupère l'ester acétoacétique octylique dans un rendement d'environ 70%.
On prépare les dérivés d'acide y-hydroxy acétoacétique à partir de leurs dérivés d'acide y-bromoacétoacé- tique correspondants par agitation dans une solution de dioxane-eau (1/1) contenant du caca à 25 C pendant 12 heures.
Chacun des produits obtenus suivant les exemples ci-après est identifié quant à sa structure par l'utilisation de la résonance magnétique nucléaire (RMN), des spectres infrarouges et par les mobilités chromatographiques en couche mince. La pureté optique et la configuration absolue des produits sont établies par leur conversion en L-carnitine ainsi que par la conversion en leurs esters, qui sont aisément analysés par spectrométrie RMN et rotation optique.
Exemple 1 (levures)
On prépare de l'ester octylique d'acide (+) 4chloro-3 (R)-hydroxybutyrique de la façon suivante :
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A. Fermentation
Une croissance en surface provenant d'une culture couchée à l'agar de Candida keyfr. NRRL Y-329 d'une
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semaine, que l'on fait croître sur de l'agar répondant à la composition suivante :
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<tb>
<tb> qr
<tb> Agar <SEP> 20
<tb> Glucose <SEP> 10
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 2,5
<tb> K2HPO4
<tb>
Eau distillée, quantité suffisante pour faire 1 litre (stérilisé 15 min. à 0,138 MPa) est mise en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,85%. 0n utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer un récipient d'Erlenmeyer de
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250 ml (stade F-l) contenant 50 ml du milieu suivant (milieu de Vogel) :
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<tb>
<tb> qr
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5
<tb> Casaminoacides <SEP> 5
<tb> Dextrose <SEP> 40
<tb> Citrate <SEP> de <SEP> Na-5 <SEP> 1/2 <SEP> H20 <SEP> 3
<tb> KH2PO4 <SEP> 5
<tb> NH4NO3 <SEP> 2
<tb> CaCl2.2H2O <SEP> 0,1
<tb> MgS0407H20 <SEP> 0,2
<tb> Solution <SEP> d'éléments <SEP> à <SEP> l'état <SEP> de <SEP> traces <SEP> 0,1 <SEP> ml
<tb>
Eau distillée, quantité suffisante pour taire 1 litre pH 5,6 (stérilisé pendant 15 min. à 0,138MPa)
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<tb>
<tb> Solution <SEP> d'éléments <SEP> à <SEP> l'état <SEP> de <SEP> traces <SEP> gr/100 <SEP> ml
<tb> Acide <SEP> citrique <SEP> -1H2O <SEP> 5
<tb> ZnSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 7
<tb> Fe <SEP> (NH4)2(SO4)2 <SEP> .6H2O <SEP> 1
<tb> CuSO4. <SEP> 5H2O <SEP> 0,25
<tb> MnSO4.
<SEP> 1H2O <SEP> 0,05
<tb> H3BO3 <SEP> 0,05
<tb> NaH2MoO4. <SEP> 2H2O <SEP> 0,05
<tb>
On incube le récipient à 25 C sur une secoueuse rotative (250 cycles/minute-rayon de 5,08 cm) pendant 24 heures, après quoi on effectue un transfert de 10% en volume dans un autre récipient d'Erlenmeyer de 250 ml (stade F-2) contenant 50 ml de milieu de Vogel.
Après 24 heures d'incubation sur une secoueuse rotative, on ajoute 150 mg d'ester octylique d'acide y-chloroacétoacétique dans 0,1 ml de Tween 80 à 10%. Le récipient du stade F-2 est ensuite incubé pendant 24 heures supplémentaires sous les conditions utilisées dans l'incubation des récipients du stade F-l.
B. Isolement : 24 heures après l'addition de l'ester octylique d'acide y-chloroacétoacétique, on sépare les cellules par centrifugation. On extrait à fond le surnageant avec trois fois 50 ml d'acétate d'éthyle. On sèche l'acétate d'éthyle sur Na2S04 et on l'évapore de manière à obtenir un résidu huileux (186 mg). On dissout le résidu dans 0,5 ml de la phase mobile et on l'introduit dans une colonne (1 fois 25 cm) de gel de silice (MN-kieselgel 60). On élue la colonne avec un mélange de Skellysolve B et d'acétate d'éthyle (8/1) et on recueille des fractions de 14 ml. Les fractions 6 et 7 contenant le produit désiré sont rassemblées
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et concentrées à sec pour donner 120 mg de résidu cristallin.
Une recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane donne 107 mg d'ester octylique
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2 d'acide 4-chloro-3 (c=4, 45) ; RMP 0, 88 [3H, tr. distortionnel, CH-(CH.)-] 1, 28 [10H, s,-(CH.)-] 1, 65 (2H, m, j n b (R)-hydroxybutyrique;[a] 23 +13, 3 -CH-CH-CH 0-C-) ; 2, 62 (2H, d, J = 6 Hz,-CH-CH.-COOR) ; 2 -2 2 il 4-2
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0 OH 3, 22 (1H, br.,-OH) 3, 60 (2H, d, J = 6 Hz, ; 2 1 OH
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Analyse : Calculé pour C12H2303Cl : C : 57,47 ; H : 9,25.
Trouvé : C : 57,52 ; H : 9,07. [CCM : Rf-0, 5 ; plaque de gel de silice Brinkmann de 0,25 cm EM ; Skelly B : acétate d'éthyle (5/1) J.
Exemple 2
Cellules restantes On met en suspension 100 g de levure de panification fraîche du commerce Saccharomyces cerevisiae (Red Star) dans 250 ml d'eau du robinet à laquelle on a ajouté 10 g de sucrose et 3,6 g d'. ester octylique d'acide y-chloroacétoacétique. Après avoir incubé le contenu à 25 C sur une secoueuse rotative (250 cycles/minute ; rayon de 5,09 cm) pendant 24 heures, on ajoute 10 g supplémentaires de sucrose au récipient et on laisse la réaction se poursuivre pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite séparées par filtration à travers un tampon de célite.
Les cellules sont lavées avec de l'eau et de l'acétate d'éthyle. Les lavages sont combinés avec le filtrat et extraits à fond avec de l'acétate d'éthyle. La couche
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à l'acétate d'éthyle est séchée sur MgSO et évaporée pour donner un résidu huileux, que l'on chromatographie sur-une colonne de gel de silice pour donner 2,52 g d'ester octylique d'acide 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique, sous la forme d'un solide à bas point de fusion ;
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[a]23+l3, (c=4, 0 ; CHC1).
Exemple 3 0n prépare de l'ester benzylique d'acide (+) 4-chloro-3 (R) hydroxybutyrique de la façon suivante :
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A. Fermentation : On met en suspension une croissance superficielle obtenue à partir d'une culture couchée à l'agar de Gliocladium virens ATCC 13362 d'une semaine, que l'on a fait croître sur agar de la composition suivante :
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<tb>
<tb> gr
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 20
<tb> Glucose <SEP> 20
<tb> Peptone <SEP> 1
<tb> Agar <SEP> 20
<tb>
Eeu distillée, quantité suffisante pour faire 1 litre (stérilisé 15 min. à 0,138 MPa) dans 5 ml d'une solution saline à 0, 85%. On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer un récipient d'Erlenmeyer de 250 ml (stade F-l) contenant 50 ml du milieu suivant (milieu de soja et de dextrose) :
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<tb>
<tb> Farine <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> KH2HP04 <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Levure <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
pH ajusté à 7, 0 à 0,103 MPa pendant 15 minutes 0n incube le récipient à 25 C sur une secoueuse rotative (250 cycles/minute ; rayon de 5,08 cm) pendant 24 heures, après quoi on effectue un transfert de 10% en volume dans un autre récipient d'Erlenmeyer de 250 ml (stade F-2) contenant 50 ml de milieu de soja et de dex-
EMI20.2
trose. Après 24 heures d'incubation sur une secoueuse rotative, on ajoute 150 mg d'ester benzylique dans 0,1 ml de Tween 80 à 10%.
On incube ensuite le récipient du stade F-2 pendant 24 heures supplémentaires sous les conditions utilisées dans l'incubation des récipients du stade F-l.
B. Isolement 24 heures après l'addition de l'ester benzylique d'acide y-chloroacétoacétique, on sépare les mycéliums par filtration. On extrait le filtrat à fond trois fois avec 50 ml d'acétate d'éthyle. On sèche la couche à l'acétate d'éthyle sur MgS04 et on la concentre sous vide pour donner un résidu (160 mg). On chromatographie le résidu sur une colonne de gel de silice (MN-Kieselgel 60) 1 x 25 cm). On élue la colonne avec un mélange de Skelly B et d'acétate d'éthyle (10/1) et on recueille des fractions de 12 ml.
Les fractions 11-16 contenant le produit désiré sont rassemblées et concentrées à sec pour donner 115 mg d'ester benzylique d'acide 4-
EMI20.3
chloro-3 (R)-hydroxybutyrique ; [a]3+8, (c 5, 26 ; CHC13) D 3
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
RMP (6 2, 65 (2H, d, J = 6 Hz, 20 3 OH"2 (1H, br,-OH) 54 (2H, d, J = 6 Hz, Cl-'CH2CH) ; 4, 20 (1H, -OH 0H m,-CH-CH-CH.-), 7, 31 (5H, H s, 5 protons aromatiques) 0 Analyse : calculé pour CllH1303Cl : C : 57,77 ; H : 5,73.
Trouvé : C : 57,64 ; H : 5, 67. [CCM : plaque de gel de silice EM Brinkmann, 0,25 cm, RT = 0,43, Skelly B acétate d'éthyle (5/1)].
Exemple ; 4-23 0n répète le procédé de l'Exemple 1 avec chacun des organismes précités dans le Tableau I, à l'exception que l'on ajoute l'ester octylique d'acide y-chloroacétoacétique à une concentration de 1 mg/ml. On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester octylique d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique. On répète les procédés de ces exemples en ajoutant de fa- çon continue le substrat au milieu de levure. Le rapport en poids substrat/levure est de l'ordre de 1/1,5 avec une excellente conversion en le produit désiré.
Exemples 24 à 48
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec chacun des organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise l'ester octylique d'acide ychloroacétoacétique (1 mg/ml). On obtient la transformation en le composé désiré, à savoir l'ester octylique d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 49 à 68
On répète le procédé de l'Exemple 1 avec chacun des organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on utilise l'ester benzylique d'acide y-chloro-
<Desc/Clms Page number 22>
acétoacétique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester benzylique d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 69 à 93
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec chacun des organismes mentionnés dans le Tableau II, en utilisant l'ester benzylique d'acide y-chloroacétoacé- tique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la transformation en le composé désiré, à savoir l'ester benzylique (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemple 94
On prépare de l'anilide d'acide (+) 4-chloro- 3 (R)-hydroxybutyrique suivant le procédé de l'Exemple 2, à l'exception que l'on utilise le 4-chloroacétoacétanilide à une concentration de 1 mg/ml :
EMI22.1
comme substrat pour la conversion en le produit optiquement actif désiré ; point de fusion de 110 -111 C ; [α]23
EMI22.2
+17, 5 (c= 0 H 3, 0 ; ; RMP (6CD3CCD3) 2, 67 (2H, d, J= 6 Hz,-HOHCHCONHR) ; 3, 66 (2H, d, J = 6 Hz, 4, 43 (1H, m,-CH-CHOH-CH-) 7, 03-7, 44 (3H, m, protons aromatiques, méta et para) ; 69 (2H, d, J = 6 Hz, protons aromatiques, ortho) ; 24 (1H, br,-C-N-). n '-T''JL 0
CHC13)Analyse : calculé pour C10H12NO2Cl : C : 56,21 ; H : 5,66.
Trouvé : C : 56,17 ; H : 5, 47.
<Desc/Clms Page number 23>
Exemples 95 à 114
On répète le procédé de l'Exemple 1 avec chacun des organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on ajoute du y-chloroacétoacétanilide à une concentration de 1 mg/ml. Dans tous les cas, on obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'anilide d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 115 à 139
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II. On introduit du y-chloroacétoacétanilide à une concentration de 1 mg/ ml. Dans tous les cas, on réalise la conversion en l'anilide d'acide (+) 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique désiré.
Exemples 140 à 159
On répète le procédé de l'Exemple 1 avec les organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on utilise de l'ester octylique d'acide y-bromoacéto- acétique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester octylique d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 160 à 184 0n répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise l'ester octylique d'acide y-bromoacétoacétique (1 mg/ml). On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester octylique d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 185 à 204 0n répète le procédé de l'Exemple 1 avec les organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on
<Desc/Clms Page number 24>
utilise l'ester benzylique d'acide y-bromoacétoacétique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester benzylique d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 205 à 229
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise l'ester benzylique d'acide y-bromoacéto- acétique (1 mg/ml). On obtient la conversion en le produit désiré, à savoir l'ester benzylique d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemples 230 à 249 0n répète le procédé de l'Exemple 1 avec les or- ganismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on utilise le y-bromoacétanilide (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'anilide d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique désiré.
Exemples 250 à 274 0n répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise le y-bromoacétanilide (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'anilide d'acide (+) 4-bromo-3 (R)-hydroxybutyrique désiré.
Exemples 275 à 294
On répète le procédé de l'Exemple 1 avec les organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on utilise l'ester octylique d'acide y-hydroxyacétique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'ester octylique d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique.
<Desc/Clms Page number 25>
Exemples 295 à 319
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise l'ester octylique d'acide y-hy- droxyacétique (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'ester octylique d'acide 4-hydroxy-3 (R)hydroxybutyrique désiré.
Exemples 320 à 339
On répète le procédé de l'Exemple 1 avec les organismes mentionnés dans le Tableau I, à l'exception que l'on utilise le y-hydroxyacétoacétanilide (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'anilide d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique désiré.
Exemples 340 à 364
On répète le procédé de l'Exemple 3 avec les organismes mentionnés dans le Tableau II, à l'exception que l'on utilise le y-hydroxyacétoacétanilide (1 mg/ml) comme substrat. On obtient la conversion en l'anilide d'acide 4-hydroxy-3 (R)-hydroxybutyrique.
Exemple 365 Méthyl-4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate (VIII)
EMI25.1
On incube du 4-chloroacétoacétate de méthyle (VII) (100 mg) avec 29 unités de coeur de porc (EC 1.1. 1.
35), de la ss-hydroxyacy1 CoA déshydrogénase (Sigma, H4626) et 1,36 g de NADH (Sigma, 90%) dans 30 ml de tam-
<Desc/Clms Page number 26>
pon phosphate de sodium 0,1 M, de pH 6, 5.
Après 30 heures à 25 C, on extrait quatre fois le mélange de réaction avec 30 ml d'acétate d'éthyle.
On sèche la couche organique sur du sulfate de sodium et on l'évapore à sec sous pression réduite. On chromatographie le résidu (90 mg) sur une colonne de gel de silice (12 g) (1,3 x 34 cm). On élue la colonne avec un système de solvants formé d'un mélange de Skelly B et d'acétate d'éthyle (8/1) et on recueille des fractions de 20 ml. Les fractions 9 à 11 contenant le 4-chloro- 3 (R)-hydroxybutyrate de méthyle (VIII) désiré, tel que 2 révélé par chromatographie sur couche mince [α]23 + 23, 50 (c=5,2 ; CHCl3) sont rassemblées.
Exemple 366 0n répète le procédé de l'Exemple 365 en utilisant le 4-chloroacétoacétate d'éthyle comme substrat pour donner le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'éthyle,
EMI26.1
La] + (c=4, 7, CHC13).
D 3
Exemple 367
On répète le procédé dé l'Exemple 365 en utilisant le 4-chloroacétoacétate de n-propyle comme subs-
EMI26.2
trat pour donner le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-propyle, 3 + 21, 5 (c=5, 0 ; D 3
Exemple 368
On répète le procédé de l'Exemple 365 en utilisant le 4-chloroacétoacétate de n-butyle comme substrat pour donner le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-butyle,
EMI26.3
la] + 20, 10 (c=3, l ;
D 3 Procédé général pour la conversion d'esters et d'amides 4-halo-3 (R)-hydroxy-butyriques en Lcarnitine
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Exemple 369
On chauffe un mélange d'ester octylique d'acide 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrique (1,5 g), d'éthanol (3 ml) et de triméthylamine (solution à 25% en poids) dans de l'eau (3 ml) à 80 -90 C pendant environ 2 heures. 0n évapore à sec sous vide les solvants et l'excès de triméthylamine pour donner 1,8 g de résidu brut. On chauffe le produit brut (1 g) à 80 -90 C dans une solution d'HCl à 10% (7 ml) pendant 1,5 heure. Après évaporation des solvants sous pression réduite, on extrait deux fois le produit brut avec de l'éthanol absolu (10 ml) et on évapore sous vide l'éthanol.
On dissout le résidu cristallin dans une petite quantité d'éthanol et on précipite le chlorure de L-carnitine par l'addition d'éther en une bonne production (320 mg), point de fusion de 142 C (décomposition) ; [a]-23, 7 (c=4,5 ; H20).
0n peut aisément convertir le chlorure de Lcarnitine en le sel interne de L-carnitine préféré du point de vue pharmaceutique par des moyens d'échange ionique, ainsi que cela est bien connu dans la technique.
Exemple 370
4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'octyle (IX)
EMI27.1
On chauffe au reflux pendant 24 heures un mélange de 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'octyle (II) (1,426 g) et de NaI anhydre (1,2 g) dans 15 ml de méthyl éthyl cé-
<Desc/Clms Page number 28>
tone. On évapore le mélange à l'évaporateur rotatif et on le fait réagir avec de l'éther (100 ml) et de l'eau (50 ml). On sépare la phase organique, on la lave avec une solution de thiosulfate de sodium à 10% (150 ml), de la saumure (150 ml) et on la sèche sur du sulfate de sodium anhydre.
On évapore le solvant sous pression réduite pour obtenir 1,762 g de produit IX sous la forme d'une huile jaune pale ; IR (film mince) 3460 cm-1 (OH) et 1730 cm (ester C=0) ; RMP (CDC13) : 3,93-4, 27 (m, 3H) ; 3,17 (d, 2H) ; 2,50 (d, 2H) ; 1,50-1, 87 (m, 2H) ; 1,30 (bs, 12H) ; 0,93 (m, 3H).
Transformation de 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'octyl (IX) en L-carnitine
EMI28.1
EMI28.2
i 1 L-Carniti e
On ajoute une solution aqueuse à 25% de triméthylamine (8 ml) à une solution de IX (1,593 g) dans du
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méthanol (15 ml). On agite le mélange à 270C pendant 20 heures. On chasse par évaporation les solvants et l'excès de triméthylamine sous pression réduite pour donner un solide semi-cristallin X. On lave ce résidu avec de petites quantités d'éther pour séparer l'octanol, on le dissout ensuite dans de l'eau et on le fait passer dans une colonne Dowex l-x4 de 2,5 x 15 cm (forme OH- - 0, 290-0, 147 mm). On lave la colonne avec de l'eau distillée.
La séparation du solvant sous vide des 200 premiers ml de l'éluat donnent de la L-carnitine sous la forme d'un solide cristallin blanc (490 mg ; rendement
EMI29.1
de 65%) ; [a] - ; H20).
D 2
Exemple 371 0n répète le procédé de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'hexyle pour donner le 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'hexyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Exemple 372 0n répète le procédé de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'heptyle pour donner le 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'heptyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Exemple 373 0n répète le procédé de l'Exemple 370 en utili-
EMI29.2
sant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de décyle pour donner le 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate de décyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Exemple 374 0n répète le procédé de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de méthyle (VIII) pour donner du 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate de méthyle, que
<Desc/Clms Page number 30>
l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Exemple 375
EMI30.1
On répète le procédé de l'Exemple 370 en utilisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate d'éthyle pour donner du 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate d'éthyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Exemple 376 0n répète le procédé de l'Exemple 370 en uti-
EMI30.2
lisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-propyle pour donner du 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate de n-propyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
4xemple 377
On répète le procédé de l'Exemple 370 en uti-
EMI30.3
lisant le 4-chloro-3 (R)-hydroxybutyrate de n-butyle pour donner du 4-iodo-3 (R)-hydroxybutyrate de n-butyle, que l'on convertit ensuite en L-carnitine.
Des levures caractéristiques qui produisent l'enzyme désirée sont données dans le Tableau I et des champignons caractéristiques sont donnés dans le Tableau II.
<Desc/Clms Page number 31>
TABLEAU I (levures) 1. Candida lipolytica NRRL Y-1095 2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264 3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615 4. Torula lactosa NRRL Y-329 5. Geotrichum candidum NRRL Y-552 6. Hansenula anomala NRRL Y-366 7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683 8. Pichia alcoholochila NRRL Y-2025 9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12, 632 10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140 11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12,624 12.
Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253
EMI31.1
13. ATCC 20109 14. Cryptococus 15. Rhodotorula 15. Candida albicans ATCC 117. Dipodascus albidus i18. (du commerce-Red Star)
Kioeckera corticis'19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592 20. Oospora lactis ATCC 14318 NRRL-Northem Regional Research Lab. à P- Illinois.
ATCC - American Type Culture Collection à Rcckville,
Maryland.
<Desc/Clms Page number 32>
EMI32.1
TABLEAU II (champignons) 1.
2. 3. Linderina 4. Aspergillus ochraceus NRRL 405 5. Trichoderma lignorum ATCC 8678
EMI32.2
6. Heterocechalum 16328 7. Entcmophthora 8. Scoculariocsis constantie 1860 9. Zygorhynchus 10. Scoculariopsis brevicaulis 11. Rhizocus arrhizus NRRL 12. Pénicillium 13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088 14. Byssochlamvs ! 16. 24942 17. Penicillium islandicum ATCC 18. Curminghamella elegans ATCC 10028a 19. Cunninchamella 11585a 20. Aspergillus autantiacum ATCC21. Aspergillus amstelodami NRRL 90 22. Gliocladium roseum ATCC 10521 23. Aspergillus gigantaus ATCC 10059 24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b 25.
Penicillium rogueforti NRRL 849a
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.