"Procédé d'obtention de cellules hybrides productrices d'un anticorps spécifique et procédé de production d'anticorps, cellules hybrides et anticorps spécifiques ainsi obtenus" L'invention concerne un procédé pour préparer ou obtenir des cellules hybrides productrices d'un anticorps, procédé selon lequel :
<EMI ID=1.1>
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture pour las hybrides formés, on cultive les hybrides formes et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent les anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène, et
(f) on isole éventuellement les hybrides, le procédé étant caractérisé en ce que, à l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et l'on injecte éventuellement les hybrides [qui ont été sélectionnés à l'étape (d)]dans la cavité abdominale ou péritonéale de souris (qui ont été, a.u préalable,
traitées par un stimulateur de tumeurs) , on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui se sont multipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) et (f) de sous-clonage et d'isolement.
Pour l'immunisation, pour l'isolement d'un mélange
de lymphocytes de la rate, pour effectuer une fusion ou une hybridation, pour cultiver les hybrides et les sélectionner, pour sous-cloner les hybrides qui produisent l'anticorps voulu, et pour isoler ces hybrides ou l'anticorps, l'homme du métier dispose de procédés correspondants. Pour effectuer une fusion ou hybridation et pour cultiver les hybrides formés, on peut
<EMI ID=2.1>
(Londres), 256 (1975) 495-497 ; Kohler et collaborateurs, Eur. J. Immune) .,.'6 (1976) 511-519 et Hochkeppel et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442.
Pour sélectionner, sous-cloner ou mono-cloner et pour isoler les hybrides et l'anticorps, on peut se référer par exemple à Secher et collaborateurs, Nature (Londres), 285
(1980) 446-450 et Hochkeppel et collaborateurs, loc. cit.,
<EMI ID=3.1>
portera enfin à Vernon et collaborateurs dans : Mishell & Shiigi,Selected Methods in Cellular Immunology [Méthodes choi-
<EMI ID=4.1>
Francisco 1980. Lors de l'étape du sous-clonage ou du monoclonage, on peut suivre à l'aide d'un test d'activité de l'anticorps (inhibition de l'activité de l'antigène), par exemple selon les méthodes de Havell et collaborateurs, J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972) 476-484, l'apparition d'une lignée cellulaire stable capable d'une production d'anticorps stables.
A propos de la notion des cellules de myélome, voir, par exemple., Milstein, Scientific American, 243 (Octobre 1980)
56-64. On peut obtenir des cellules de myélome par exemple selon Groth & Scheidegger, J. Immunological Methods, 35 (1980) 1-21. Des exemples de cellules de myélome B ressortent du tableau suivant.
L'homme du métier peut rechercher une souche convenable de souris en vérifiant si les cellules de myélome B qu'il a choisies peuvent former des hybrides avec des lymphocytes B de la souris d'essai. Avantageusement, on utilise des souris Balb/c et des cellules de myélome B de souris Balb/c, car ces souris sont tout à fait classiques dans les essais
sur les animaux. On peut obtenir de telles souris dans le commerce et elles peuvent provenir par exemple du "Zentralinsti-
<EMI ID=5.1>
maux d'essai)/Hannovre.
Il peut être avantageux d'introduire l'antigène servant à l'immunisation sous forme adsorbée sur un tamis moléculaire.
De préférence, on effectue plus d'une fois l'immunisation. Dans le cas de l'interféron humain, on effectue la dernière immunisation de préférence à l'aide d'interféron hu-main dont la partie sucre a été enlevée. On peut effectuer l'enlèvement de la partie sucre, par exemple selon les méthodes de Bose et collaborateurs, J. Biol. Chem., 251 (1976)
1659-1662. On effectue la dernière immunisation de préférence quatre jours environ avant l'isolement du mélange des lymphocytes.
Avantageusement, on isole le mélange de lymphocytes de souris femelles, en particulier des souris Balb/c femelles. Les souris femelles présentent une immuno-réaction plus rapide.
<EMI ID=6.1>
Lorsque l'on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et/ou sans macrophages, les cellules hybrides formées sont particulièrement ménagées. Le terme "méthylcellulose" englobe également des méthylcelluloses substituées comme, par exemple, de la carboxyméthylcellulose. Un exemple de méthylcellulose est "Methocel MC" (4000 cP ; Fluka). Un exemple d'un milieu convenable est le milieu HAT ; voir Hochkeppel et collaborateurs, endroit cité.
On peut obtenir une bonne stabilisation des hybrides sélectionnés lorsque l'on injecte les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale de souris qui ont été au préalable pré-traitées à l'aide d'un stimulant de tumeur. On peut par exemple sélectionner durant quatre jours environ avant d'in-jecter les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale
de souris. Les hybrides qui se sont multipliés et ont été retirés de la cavité péritonéale sont ensuite soumis aux étapes de sous-clonage et d'isolement du procédé selon l'invention. Un exemple d'un stimulant usuel de tumeur sera encore indiqué dans ce qui suit. L'homme de l'art est familiarisé avec les méthodes à appliquer ; voir, par exemple, Secher et collaborateurs, Nature (Londres), 285 (1980) 446-450. Par exemple, les souris Balb/c admettent un hybride qui a été obtenu à partir de lymphocytes B de souris Balb/c et de cellules de myélome B de souris Balb/c.
En outre, on peut obtenir de bons résultats lorsque l'on injecte un stimulant de tumeur ou un adjuvant puis des hybrides sous-clonés, producteurs de l' anticorps, dans la cavité péritonéale de souris, que l'on retire les hybrides qui
se sont multipliés et que l'on isole éventuellement l'anticorps. Les développements précédemment exposés pour l'injection d'hybrides sélectionnés valent de manière correspondante. Le tétraméthyl-2,6,10,14 pentadécane constitue un exemple d'un stimulant usuel de tumeur et l'adjuvant de Freund constitue un exemple d'un adjuvant usuel.
Pour l'injection d'hybrides sélectionnés ou d'hybrides producteurs de l'anticorps, on utilise de préférence des souris femelles, notamment des souris Balb/c.
L'invention concerne en outre un hybride producteur d'anticorps (dirigé spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains = Hu-IFN-bêta), que l'on peut obtenir en :
(a) immunisant des souris à l'aide d'interféron de fibroblastes humains et puis, de façon connue en soi
(b) isolant un mélange de lymphocytes des souris,
(c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en sélectionnant par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dirigé spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains, et
(f ) en isolant éventuellement ces hybrides.
L'invention concerne en outre des hybrides présentant les caractéristiques essentielles de ceux déposés sous la
<EMI ID=7.1>
à activité dirigée spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains, et les hybrides provenant de ce dépôt.
L'invention concerne en outre des hybrides producteurs d'un anticorps (dont l'activité est dirigée spécifiquement contre de l'immun-interféron humain = Hu-IPN-gamma), ces hybrides pouvant être obtenus lorsque :
(a) on immunise des souris avec de l'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi .
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport à des cellules de myélome B non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immun-interféron humain, et
(f) on isole éventuellement ces hybrides.
L'invention concerne en outre des hybrides producteurs d'un anticorps (dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains) ou un anticorps (dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'immun-interféron humain), que l'on peut obtenir en effectuant, dans l'étape (d) la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et en injectant éventuellement les hybrides
<EMI ID=8.1>
péritonéale de souris (qui ont été au préalable pré-traitées
1 à l'aide d'un stimulant de tumeur), en retirant de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et en effectuant ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isolement.
L'invention concerne en outre un anticorps mono-clonal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron
<EMI ID=9.1>
en :
(a) immusisant des souris à l'aide d'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi
(b) isolant un mélange de lymphocytes des souris,
(c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec ses cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées,
(e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l' anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains, et
(f) éventuellement en isolant l'anticorps.
L'invention concerne en outre un anticorps monoclonal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immuninterféron humain (Hu-IFN-gamma) et que l'on peut obtenir en :
(a) immunisant des souris à l'aide d'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi <EMI ID=10.1> ( ) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en y cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immun-interféron humain, et
(f) éventuellement en isolant l'anticorps.
L'invention concerne en outre des anticorps monoclonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement dirigée contre de l'immun-interféron humain, et que l'on peut obtenir lorsque, dans l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et que l'on injecte éventuellement les hybrides (qui ont été sélectionnés au cours de l'étape (d)) dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable prétraitées par un stimulant de tumeur), que l'on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et que l'on effectue ensuite les étapes (e) de sousclonage et (f) d'isolement.
Pour d'autres détails concernant la possibilité d'obtenir des hybrides qui produisent des anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement contre de l'immun-interféron humain, ou concernant la possibilité de produire de tels anticorps, on se reportera au procédé général selon l'invention pour obtenir des cellules hybrides qui produisent un anticorps.
Les anticorps s'édifient à partir d'un domaine qui leur est commun à tous et d'un domaine variable par lequel ils se distinguent. Dans le cas des anticorps mono-clonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement contre de l'immuninterféron humain, le domaine variable est spécifique de l'interféron de fibroblastes humains ou de l'immun-interféron humain,; voir, par exemple, Milstein, Scientific American, 243
(Octobre 1980) 56-64. Pour identifier de l'interféron de fibroblastes humains, voir par exemple Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Research, 8 (18) (1980) 4057-4074 et, pour identifier de l'immun-interféron humain, voir par exem-
<EMI ID=11.1> (1981) 1601 - 1605.
Cellules de myélome B (FO) et cellules d'hybridome utilisées.
Les cellules utilisées ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Micro organismes/Paris, et elles ont reçn les désignations suivantes de dépôt :
<EMI ID=12.1>
Obtention et description des cultures :
(1) Obtenues à l'origine par Groth & Scheidegger, Journal of Immunological Methods, tome 35 (1980) 121.
(2) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocytes B de souris Balb/c, qui ont été immunisées avec de l'interféron de fibroblastes humains.
(3) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocytes B de souris Balb/c qui ont été immunisées avec de l'immuninterféron humain.
Milieu utilisé pour la culture :
Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves (IMDM), Gibco
<EMI ID=13.1>
Sérum utilisé pour la croissance des cellules :
sérum de foetus de veau à 10 % (Seromed Co.).
Composition des solutions pour les dispersions de cellules : également du milieu IMDM avec 10 % de sérum de foetus de veau.
<EMI ID=14.1>
Croissance de la culture en suspension :
La concentration des cellules de départ se situe au
<EMI ID=15.1>
1 <EMI ID=16.1>
pace de temps entre le début de la culture et la récolte est d'environ une semaine.
Transfert des cellules :
Les cellules peuvent adhérer partiellement à la surface du récipient de culture de tissus. Pour le transfert, on ne doit pas utiliser de trypsine mais au contraire détacher avec précaution les cellules de la surface en appliquant à la surface plusieurs gouttes du milieu de culture de tissus.
Congélation des cellules :
On sépare les cellules par centrifugation, on verse le milieu IMDM et l'on ajoute 1 ml de sérum de foetus de veau/
<EMI ID=17.1>
de sérum de foetus de veau et 5 % de DMSO ; la concentration des cellules est de 106 cellules/ml.
Décongélation des cellules :
On verse les cellules dans IMDM glacé, puis l'on centrifuge à 1000 tr/min durant 10 minutes et l'on remet en
<EMI ID=18.1>
Remarques :
On doit fournir du milieu tous les trois jours environ aux cellules en cours de croissance. Au bout d'une semaine environ, il est néce.ssaire de remplacer complètement le milieu. Puisque toutes les cellules n'adhèrent pas à la surface, il faut séparer les cellules par centrifugation lorsque l'on remplace le milieu.
L'invention sera maintenant décrite plus en détail en regard des sept figures annexées et de deux exemples.
Voici quelques détails concernant plus spécialement les figures annexées.
<EMI ID=19.1> dans ELISA.
Sur la figure 2 : <EMI ID=20.1> cifique (quatre jours d'autoradiographie), et
(d) désigne des protéines normales, marquées par
14 C, pour la détermination du poids moléculaire (PM). La figure 3 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200") de (A) une immunoglobuline M (IgM), anticorps anti- <EMI ID=21.1>
l'activité de neutralisation (de l'activité antivirale de IFNbêta ) des fractions individuelles. Les ordonnées de droite indiquent le coefficient d'absorption, ou absorbance, à 280 nm
(courbes en trait plein), cependant que les ordonnées de gauche indiquent le pourcentage d'inhibition à la dilution de 1 :30. de l'anticorps (courbe en trait, mixte), les abscisses indiquant le numéro des fractions, et la flèche horizontale le sens de l'élution. La ligne en pointillé indique le volume vide ou d'exclusion.
La figure 4 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200", de l'immunoglobuline IgM anti-(Hu-IFN-gamma) (en trait plein), et de l'immunoglobuline M (IgM témoin) (en pointillé). Les abscisses indiquent le numéro de la fraction (la flèche horizontale montrant le sens de l'élution), et les ordonnées <EMI ID=22.1>
à deux têtes indiquant le volume vide ou d'exclusion.
La figure 5 montre une réaction ELISA de l'anti-
(Hu-IPN-gamma) humain avec Hu-IFN-gamma qui a été transféré d'un gel de polyacrylamide SDS (sans traitement préliminaire <EMI ID=23.1> a) concerne Hu-IFN-gamma plus de l'anti-(Hu-IFN- <EMI ID=24.1> b) concerne Hu-IPN-gamma plus du milieu (témoin négatif), et c) concerne des protéines témoins marquées par
14 C. Les poids moléculaires sont indiqués en PM. La figure 6 montre une réaction ELISA comme sur la figure 2, mais après un traitement préliminaire par du bêtamercaptoéthanol de Hu-IFN-gamma pour l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. a) concerne Hu-IFN-gamma plus de l'anti-(Hu-IFNgamma)mono-clonal, et b) concerne des protéines normales colorées par du noir d'amide. PM désigne les poids moléculaires. La figure 7 est un auto radiogramme d'un gel de po- <EMI ID=25.1>
mercaptoéthanol de Hu-IFN-gamma) de Hu-IFN-gamma marqué par de l'iode 125 et précipité à l'aide d'anti-(Hu-IFN-gamma).
a) concerne Hu-IFN-gamma, marqué par de l'iode 125 et spécifiquement précipité ; b) est une matière protéinique "de lavage", à adsorption non spécifique ; c) est une préparation de Hu-IFN-gamma, marqué par de l'iode 125 mais non traité ; et <EMI ID=26.1>
PM indique les poids moléculaires.
Exemple 1.
On immunise une souris femelle Balb/c quatre fois au total avec de l'interféron de fibroblastes humains (IFN-
<EMI ID=27.1>
qui est lié sur une matière pour colonnes "Blue Sepharose". On injecte chaque semaine à la souris ce complexe matière de
<EMI ID=28.1> dégradation enzymatique et l'on élève d'autre part nettement
<EMI ID=29.1>
tion est effectuée, quatre jours avant l'isolement d'un mélange de lymphocytes, à l'aide de IFN-bêta non fixé sur une colonne et dont la partie sucre a été enlevée.
Quatre jours après la dernière immunisation, on enlève la rate, on isole un mélange de lymphocytes, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de myélome B
(FO) et l'on cultive une à deux semaines dans du milieu HAT avec de la méthylcellulose. On isole ensuite à l'aide de capillaires stériles les cultures d'hybridome en cours de croissance et on les sous-clone dans un milieu HAT sans méthylcellulose. Les colonies qui se développent alors sont soumises à des essais de production d'anticorps spécifiques. Les essais sont effectués au cours d'un dosage d'interféron antiviral
sur des cellules de fibroblastes humains PS4 selon Havell et collaborateurs ; J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972)
476-484. On mesure l'inhibition, par l'anticorps mono-elonal, du pouvoir protecteur de l'interféron de fibroblastes contre du v�rus VSV (virus de stomatite vésiculaire ; voir tableau I). On établit l'existence de plusieurs lignées d'hybridones stables de souris. On ne constate pas de réactions croisées avec de l'interféron de leucocytes purifiés ; voir tableau II. L'action antivirale de l'interféron peut également, après dégradation de la partie sucre de l'interféron de fibroblastes par un mélange d'enzymes capables de dégrader du sucre, être encore inhibée par les anticorps spécifiques ; voir tableau II.
Par la réinjection de cellules stables d'hybridomes (qui séparent les anticorps mono-clonaux spécifiques) dans la cavité péritonéale de souris femelles Balb/e et l'obtention d'une tumeur ascitique, on peut extraire de la cavité abdominale
ou péritonéale des souris Balb/c, après environ quatorze à vingt et un jours, un anticorps enrichi en activité spécifique contre l'interféron de fibroblastes humains, qui est capable d'inhiber l'interféron de fibroblastes, dans un dosage anti-viral, entièrement,même à une dilution de l'anticorps de 1 :30 ; voir le tableau III.
On démontre la spécificité de l'anticorps à l'aide de la méthode connue de preuve ELISA. Pour cela, on sépare
par électrophorèse de l'interféron de fibroblastes humains partiellement purifié, tout d'abord sur un gel de SDS selon
<EMI ID=30.1>
protéines normales) puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc . Natl. Sci. USA 76 (1979)
4350-4354) sur des bandes de nitrocellulose. Alors que la partie en forme de tache comportant des protéines normales est colorée par du noir d'amide, on soumet la partie formant des taches et comportant de l'interféron de fibroblastes à la technique ELISA et, selon Towbin et collaborateurs, on visualise à l'aide d'anticorps IgG-antisouris de lapin, conjugués
<EMI ID=31.1>
d'enzyme, en une bande fortement colorée en brun ; voir figure 1 .
TABLEAU I
<EMI ID=32.1>
TABLEAU II
<EMI ID=33.1>
TABLEAU III
<EMI ID=34.1>
L'anticorps mono-clonal selon l'invention peut ser-
<EMI ID=35.1>
humains à partir d'un mélange de matières contenant cet. interféron, et ainsi à purifier l'interféron.
On a fixé de l'anticorps mono-clonal contre IFN-bêta sur de la "Sepharose-4B" activée par CNBr ; on a vérifié l'immu-
<EMI ID=36.1>
corps. Pour cela, on a marqué par 125 1 (selon Hunter et collaborateurs, Nature, 194 (1962) 495-496) un échantillon de IFNbêta non purifié. On a ensuite chargé cet échantillon de IFNbêta marqué par 125 1 sur la colonne d'anticorps et on a ensuite lavé de façon poussée avec TBS neutre (solution saline tamponnée, avec du tris) pour enlever de la protéine non spécifique- <EMI ID=37.1>
cine/HCl (pH 2,3) IFN-b�ta marqué par <1> 25 -I et spécifiquement lié, on l'a concentré par lyophilisation puis on l'a séparé par électrophorèse sur un gel de SDS-polyac rylamide, parallè-
<EMI ID=38.1>
680-685). Puis l'on a autoradiographié le gel. La figure 2 montre nettement que IPN-bêta est spécifiquement lié par la colonne de "Sépharose" traitée par CNBr et comportant de l'an-
<EMI ID=39.1>
quente sur une colonne de "Sephadex-G200". Le profil d'élution sur "Sephadex-G200" a montré qu'il s'agit, pour l'anti-(Hu-
<EMI ID=40.1>
re 3.
Exemple 2.
On immunise selon l'exemple 1 une souris femelle Balb/c, sauf que l'on utilise de l'immun-interféron humain
(Hu-IFN-gamma) jusqu'à établir dans le sérum de la souris la présence d'un titre positif en anticorps contre Hu-IFN-gamma. Quatre jours avant l'isolement d'un mélange de lymphocytes de la rate de la souris Bal b/c immunisée, on effectue une dernière immunisation "de rappel" (Booster). Quatre jours plus tard, on isole le mélange de lymphocytes de la rate, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de myélome B [FO
(Groth et Scheidegger) 1980), J. Immunol. Methods 35, 1-25)]
(voir Hochkeppel et collaborateurs, Europ. J. Biochem., 118
(1981 ) 437-442) et l'on cultive durant cinq jours dans un milieu HAT avec 1 % de méthylcellulose et 20 % de sérum de foetus de veau.
Pour une meilleure multiplication des hybrides survivants et pour stabiliser les hybrides contre une perte de gènes, on injecte ensuite les hybrides dans la cavité péritonéale d'une souris Balb/c qui a été prétraitée par du "Pristan" ou tétraméthyl-2,6,10,14 pentadécane. Au bout d'une semaine, on prélève de manière stérile le liquide ascitique de la cavité péritonéale et l'on place les cellules hybrides ainsi obtenues, sans méthylcellulose, dans du milieu normal de Dulbecco modifié par Iscove et qui contient 10 % de'sérum de foetus de veau. On sous-clone ensuite les cultures d'hybridome en cours de croissance dans des plaques de culture de tissus pour monoclone de Greiner. On soumet les colonies qui se développent ainsi à des essais de détermination de la production d'anticorps spécifiques. Les essais sont effectués après un essai
de neutralisation antivirale sur des cellules CCL23 humaines. Pour cela) on provoque tout d'abord l'adsorption durant seize heures d'un anticorps dirigé contre des immunoglobulines de souris à la surface des trous d'une plaque de microtitrage immunologique, puis l'on ajoute également durant seize heures
ce qui provient ou surnage des cultures d'hybridome pour fixer sur les anticorps adsorbés les anticorps anti-Hu-IFN-gamma éventuellement obtenus et l'on ajoute enfin dix unités antivirales, par millilitre, de Hu-IFN-gamma (quatre heures). On soumet ce que l'on obtient ainsi à des essais d'activité antivirale résiduelle ou rémanente contre VSV (virus de la stomatite vésiculaire) sur des cellules humaines CCL23 contre un échantillon de Hu-IFN-gamma non traité. De cette façon, on établit l'existence de plusieurs lignées stables d'hybridomes de
<EMI ID=41.1>
mono-clonal.
Pour identifier la nature de l'immunoglobuline de l'anticorps mono-clonal, on purifie tout d'abord l'anticorps provenant de l'hybridome par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium à 40 % et par une étape subséquente de chromatographie sur une colonne de "Sephadex-G200". On identifie ainsi l'anti-(Hu-IFN-gamma) comme étant IgM qui, dans un volume d'exclusion ou d'élution de la colonne de Sephadex-G 200 s'élue de manière identique au profil d'élution d'une IgM (immunoglobuline M) témoin (figure 4). La spécificité de l'immunoglobu-line anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonaleainsi purifiée est ensuite établie indubitablement par les essais suivants de spécificité. Tout d'abord, on sépare par électrophorèse sur un gel
<EMI ID=42.1>
(1970) 680-685), sans traitement préliminaire par du bêtamercaptoéthanol, du Hu-IFN-gamma partiellement purifié parallèlement avec des protéines normales puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc. Natl.
<EMI ID=43.1>
cellulose. Alors que la partie en forme de tache comportant les protéines normales est colorée par du noir d'amide, la partie en forme de tache comportant Hu-IFN-gamma est soumise
à la technique ELISA selon Hochkeppel et collaborateurs (Europ. J, Biochem. 118 (1981) 437-442), en faisant incuber tout d'abord la tache avec de l'anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonal de souris puis avec de l'anticorps IgM de lapin à activité antiIgM de souris et finalement avec de l'anticorps IgM de chèvre, à activité anti-IgM de lapin (conjugué à de la peroxydase), puis l'on visualise le Hu-IFN-gamma à l'aide d'o-di&nisidine comme substrat d'enzyme en une bande nette autour de 46 000 daltons (figure 5). On répète la même expérience avec Hu-IFNgamma, qui a été prétraité par du bêta-mercaptoéthanol/SDS. Avec une tache ELISA, on visualise à l'aide d'o-dianisidine une bande spécifique autour de 22 000 daltons (figure 6).
L'anti-(Hu-IPN-gamma) mono-clonal a donc une activité spécifiquement dirigée contre deux sous-espèces différentes de Hu-IFNgamma ou contre le dimère (figure 5) et contre le monomère
(figure 6) de la molécule de Hu-IFN-gamma, le déplacement du poids moléculaire des bandes de réaction immunologique, après un traitement préliminaire par le bêta-mercaptoéthanol indiquant plut8t qu'il s'agit du monomère et du dimère de Hu-IFNgamma.
Dans un autre essai de spécificité, on fait incuber tout d'abord du Hu-IFN-gamma partiellement purifié, qui a au préalable été marqué par de l'iode 125 selon Hunter et colla- <EMI ID=44.1>
à activité anti-IgM. On précipite ensuite le complexe avec de la protéine A de Staphylococcus-aureus spécifique de IgG
(Pansorbine). Après plusieurs lavages poussée du complexe et détachement subséquent par traitement par SDS de Hu-IFN-gamma, marqué par 125 1 et précipité spécifiquement avec de l'anti-
(Hu-IFN-gamma) mono-clonal, on sépare par électrophorèse, sans
<EMI ID=45.1>
lement avec des protéines normales marquées par 14 C. Puis, après séchage, on autoradiographie le gel. L'autoradiogramme
(figure 7) montre nettement que IFN-gamma marqué par 125 1 est
<EMI ID=46.1>
clonal et peut être visualisé sous forme d'une bande radioactive nette autour de 46 000 daltons sur l'autoradiogramme d'un gel de polyacrylamide-SDS.
Voici, à titre de remarque, des adresses permettant d'obtenir les produits dont l'utilisation est ici décrite :
Colonnes de ConA, de "Sephacryl-S-200" et de "Sephadex-G-200" : Deutsche Pharmacia GmbH, 6000 Frankfurt/Main 50
Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves : BCK-BiokultChemie, numéro postal 21 02 65, 7500 Karlsruhe
Plaques de culture de tissus Greiner (384 fois pour des clones de cellules) : Greiner & Sonne, numéro postal 13 20,
<EMI ID=47.1>
IgM, IgG, anticorps de chèvre et de lapin ou anticorps anti-IgM : Byk-Mallinckrodt, Von-Hevesystr. 1-3, 6057 Dietzenbach 2
Gel de polyacrylamide SDS : voir Lammli, Royaume Uni, Nature (Londres) 227 (1970) 680-685 et Hochkeppel et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442
"Pansorbine" (protéine A de Staphylococcus aureus) :
Calbiochem, numéro postal 11 03 60, 6300 Giessen Cellules CCL23 : (a) Regainstitut, Minderbroederstraat
10, B-3000 Leuven (Belgique), et (b) Flow Laboratories, MUhlen-
<EMI ID=48.1>
REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir des cellules hybrides productrices d'un anticorps, selon lequel :
(a) on immunise des souris avec un antigène,
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture pour les hybrides formés, on cultive les hybrides formés
et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B
non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps à activité spécifique contre l'antigène, et
(f) on isole éventuellement les hybrides, procédé <EMI ID=49.1>
sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et
l'on injecte les hybrides sélectionnés à l'étape (d) éventuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été
au préalable traitées à l'aide d'un stimulant de tumeur), on
retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isolement.