"Procédé d'obtention de cellules hybrides productrices d'un anticorps spécifique et procédé de production d'anticorps, cellules hybrides et anticorps spécifiques ainsi obtenus" L'invention concerne un procédé pour préparer ou obtenir des cellules hybrides productrices d'un anticorps, procédé selon lequel :
<EMI ID=1.1>
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture pour las hybrides formés, on cultive les hybrides formes et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent les anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène, et
(f) on isole éventuellement les hybrides, le procédé étant caractérisé en ce que, à l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et l'on injecte éventuellement les hybrides [qui ont été sélectionnés à l'étape (d)]dans la cavité abdominale ou péritonéale de souris (qui ont été, a.u préalable,
traitées par un stimulateur de tumeurs) , on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui se sont multipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) et (f) de sous-clonage et d'isolement.
Pour l'immunisation, pour l'isolement d'un mélange
de lymphocytes de la rate, pour effectuer une fusion ou une hybridation, pour cultiver les hybrides et les sélectionner, pour sous-cloner les hybrides qui produisent l'anticorps voulu, et pour isoler ces hybrides ou l'anticorps, l'homme du métier dispose de procédés correspondants. Pour effectuer une fusion ou hybridation et pour cultiver les hybrides formés, on peut
<EMI ID=2.1>
(Londres), 256 (1975) 495-497 ; Kohler et collaborateurs, Eur. J. Immune) .,.'6 (1976) 511-519 et Hochkeppel et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442.
Pour sélectionner, sous-cloner ou mono-cloner et pour isoler les hybrides et l'anticorps, on peut se référer par exemple à Secher et collaborateurs, Nature (Londres), 285
(1980) 446-450 et Hochkeppel et collaborateurs, loc. cit.,
<EMI ID=3.1>
portera enfin à Vernon et collaborateurs dans : Mishell & Shiigi,Selected Methods in Cellular Immunology [Méthodes choi-
<EMI ID=4.1>
Francisco 1980. Lors de l'étape du sous-clonage ou du monoclonage, on peut suivre à l'aide d'un test d'activité de l'anticorps (inhibition de l'activité de l'antigène), par exemple selon les méthodes de Havell et collaborateurs, J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972) 476-484, l'apparition d'une lignée cellulaire stable capable d'une production d'anticorps stables.
A propos de la notion des cellules de myélome, voir, par exemple., Milstein, Scientific American, 243 (Octobre 1980)
56-64. On peut obtenir des cellules de myélome par exemple selon Groth & Scheidegger, J. Immunological Methods, 35 (1980) 1-21. Des exemples de cellules de myélome B ressortent du tableau suivant.
L'homme du métier peut rechercher une souche convenable de souris en vérifiant si les cellules de myélome B qu'il a choisies peuvent former des hybrides avec des lymphocytes B de la souris d'essai. Avantageusement, on utilise des souris Balb/c et des cellules de myélome B de souris Balb/c, car ces souris sont tout à fait classiques dans les essais
sur les animaux. On peut obtenir de telles souris dans le commerce et elles peuvent provenir par exemple du "Zentralinsti-
<EMI ID=5.1>
maux d'essai)/Hannovre.
Il peut être avantageux d'introduire l'antigène servant à l'immunisation sous forme adsorbée sur un tamis moléculaire.
De préférence, on effectue plus d'une fois l'immunisation. Dans le cas de l'interféron humain, on effectue la dernière immunisation de préférence à l'aide d'interféron hu-main dont la partie sucre a été enlevée. On peut effectuer l'enlèvement de la partie sucre, par exemple selon les méthodes de Bose et collaborateurs, J. Biol. Chem., 251 (1976)
1659-1662. On effectue la dernière immunisation de préférence quatre jours environ avant l'isolement du mélange des lymphocytes.
Avantageusement, on isole le mélange de lymphocytes de souris femelles, en particulier des souris Balb/c femelles. Les souris femelles présentent une immuno-réaction plus rapide.
<EMI ID=6.1>
Lorsque l'on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et/ou sans macrophages, les cellules hybrides formées sont particulièrement ménagées. Le terme "méthylcellulose" englobe également des méthylcelluloses substituées comme, par exemple, de la carboxyméthylcellulose. Un exemple de méthylcellulose est "Methocel MC" (4000 cP ; Fluka). Un exemple d'un milieu convenable est le milieu HAT ; voir Hochkeppel et collaborateurs, endroit cité.
On peut obtenir une bonne stabilisation des hybrides sélectionnés lorsque l'on injecte les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale de souris qui ont été au préalable pré-traitées à l'aide d'un stimulant de tumeur. On peut par exemple sélectionner durant quatre jours environ avant d'in-jecter les hybrides sélectionnés dans la cavité péritonéale
de souris. Les hybrides qui se sont multipliés et ont été retirés de la cavité péritonéale sont ensuite soumis aux étapes de sous-clonage et d'isolement du procédé selon l'invention. Un exemple d'un stimulant usuel de tumeur sera encore indiqué dans ce qui suit. L'homme de l'art est familiarisé avec les méthodes à appliquer ; voir, par exemple, Secher et collaborateurs, Nature (Londres), 285 (1980) 446-450. Par exemple, les souris Balb/c admettent un hybride qui a été obtenu à partir de lymphocytes B de souris Balb/c et de cellules de myélome B de souris Balb/c.
En outre, on peut obtenir de bons résultats lorsque l'on injecte un stimulant de tumeur ou un adjuvant puis des hybrides sous-clonés, producteurs de l' anticorps, dans la cavité péritonéale de souris, que l'on retire les hybrides qui
se sont multipliés et que l'on isole éventuellement l'anticorps. Les développements précédemment exposés pour l'injection d'hybrides sélectionnés valent de manière correspondante. Le tétraméthyl-2,6,10,14 pentadécane constitue un exemple d'un stimulant usuel de tumeur et l'adjuvant de Freund constitue un exemple d'un adjuvant usuel.
Pour l'injection d'hybrides sélectionnés ou d'hybrides producteurs de l'anticorps, on utilise de préférence des souris femelles, notamment des souris Balb/c.
L'invention concerne en outre un hybride producteur d'anticorps (dirigé spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains = Hu-IFN-bêta), que l'on peut obtenir en :
(a) immunisant des souris à l'aide d'interféron de fibroblastes humains et puis, de façon connue en soi
(b) isolant un mélange de lymphocytes des souris,
(c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en sélectionnant par rapport aux cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dirigé spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains, et
(f ) en isolant éventuellement ces hybrides.
L'invention concerne en outre des hybrides présentant les caractéristiques essentielles de ceux déposés sous la
<EMI ID=7.1>
à activité dirigée spécifiquement contre l'interféron de fibroblastes humains, et les hybrides provenant de ce dépôt.
L'invention concerne en outre des hybrides producteurs d'un anticorps (dont l'activité est dirigée spécifiquement contre de l'immun-interféron humain = Hu-IPN-gamma), ces hybrides pouvant être obtenus lorsque :
(a) on immunise des souris avec de l'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi .
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, on cultive les hybrides formés et on les sélectionne par rapport à des cellules de myélome B non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immun-interféron humain, et
(f) on isole éventuellement ces hybrides.
L'invention concerne en outre des hybrides producteurs d'un anticorps (dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains) ou un anticorps (dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'immun-interféron humain), que l'on peut obtenir en effectuant, dans l'étape (d) la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et en injectant éventuellement les hybrides
<EMI ID=8.1>
péritonéale de souris (qui ont été au préalable pré-traitées
1 à l'aide d'un stimulant de tumeur), en retirant de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et en effectuant ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isolement.
L'invention concerne en outre un anticorps mono-clonal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron
<EMI ID=9.1>
en :
(a) immusisant des souris à l'aide d'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi
(b) isolant un mélange de lymphocytes des souris,
(c) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec ses cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées,
(e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l' anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains, et
(f) éventuellement en isolant l'anticorps.
L'invention concerne en outre un anticorps monoclonal, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immuninterféron humain (Hu-IFN-gamma) et que l'on peut obtenir en :
(a) immunisant des souris à l'aide d'immun-interféron humain puis, de façon connue en soi <EMI ID=10.1> ( ) fusionnant ou hybridant des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) transférant le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture des hybrides formés, en y cultivant les hybrides formés et en les sélectionnant par rapport à des cellules de myélome B non hybridées, (e) en sous-clonant pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'immun-interféron humain, et
(f) éventuellement en isolant l'anticorps.
L'invention concerne en outre des anticorps monoclonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement dirigée contre de l'immun-interféron humain, et que l'on peut obtenir lorsque, dans l'étape (d), on effectue la sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et que l'on injecte éventuellement les hybrides (qui ont été sélectionnés au cours de l'étape (d)) dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été au préalable prétraitées par un stimulant de tumeur), que l'on retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et que l'on effectue ensuite les étapes (e) de sousclonage et (f) d'isolement.
Pour d'autres détails concernant la possibilité d'obtenir des hybrides qui produisent des anticorps dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement contre de l'immun-interféron humain, ou concernant la possibilité de produire de tels anticorps, on se reportera au procédé général selon l'invention pour obtenir des cellules hybrides qui produisent un anticorps.
Les anticorps s'édifient à partir d'un domaine qui leur est commun à tous et d'un domaine variable par lequel ils se distinguent. Dans le cas des anticorps mono-clonaux, dont l'activité est spécifiquement dirigée contre de l'interféron de fibroblastes humains ou spécifiquement contre de l'immuninterféron humain, le domaine variable est spécifique de l'interféron de fibroblastes humains ou de l'immun-interféron humain,; voir, par exemple, Milstein, Scientific American, 243
(Octobre 1980) 56-64. Pour identifier de l'interféron de fibroblastes humains, voir par exemple Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Research, 8 (18) (1980) 4057-4074 et, pour identifier de l'immun-interféron humain, voir par exem-
<EMI ID=11.1> (1981) 1601 - 1605.
Cellules de myélome B (FO) et cellules d'hybridome utilisées.
Les cellules utilisées ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Micro organismes/Paris, et elles ont reçn les désignations suivantes de dépôt :
<EMI ID=12.1>
Obtention et description des cultures :
(1) Obtenues à l'origine par Groth & Scheidegger, Journal of Immunological Methods, tome 35 (1980) 121.
(2) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocytes B de souris Balb/c, qui ont été immunisées avec de l'interféron de fibroblastes humains.
(3) Obtenues par fusion de (1) avec des lymphocytes B de souris Balb/c qui ont été immunisées avec de l'immuninterféron humain.
Milieu utilisé pour la culture :
Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves (IMDM), Gibco
<EMI ID=13.1>
Sérum utilisé pour la croissance des cellules :
sérum de foetus de veau à 10 % (Seromed Co.).
Composition des solutions pour les dispersions de cellules : également du milieu IMDM avec 10 % de sérum de foetus de veau.
<EMI ID=14.1>
Croissance de la culture en suspension :
La concentration des cellules de départ se situe au
<EMI ID=15.1>
1 <EMI ID=16.1>
pace de temps entre le début de la culture et la récolte est d'environ une semaine.
Transfert des cellules :
Les cellules peuvent adhérer partiellement à la surface du récipient de culture de tissus. Pour le transfert, on ne doit pas utiliser de trypsine mais au contraire détacher avec précaution les cellules de la surface en appliquant à la surface plusieurs gouttes du milieu de culture de tissus.
Congélation des cellules :
On sépare les cellules par centrifugation, on verse le milieu IMDM et l'on ajoute 1 ml de sérum de foetus de veau/
<EMI ID=17.1>
de sérum de foetus de veau et 5 % de DMSO ; la concentration des cellules est de 106 cellules/ml.
Décongélation des cellules :
On verse les cellules dans IMDM glacé, puis l'on centrifuge à 1000 tr/min durant 10 minutes et l'on remet en
<EMI ID=18.1>
Remarques :
On doit fournir du milieu tous les trois jours environ aux cellules en cours de croissance. Au bout d'une semaine environ, il est néce.ssaire de remplacer complètement le milieu. Puisque toutes les cellules n'adhèrent pas à la surface, il faut séparer les cellules par centrifugation lorsque l'on remplace le milieu.
L'invention sera maintenant décrite plus en détail en regard des sept figures annexées et de deux exemples.
Voici quelques détails concernant plus spécialement les figures annexées.
<EMI ID=19.1> dans ELISA.
Sur la figure 2 : <EMI ID=20.1> cifique (quatre jours d'autoradiographie), et
(d) désigne des protéines normales, marquées par
14 C, pour la détermination du poids moléculaire (PM). La figure 3 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200") de (A) une immunoglobuline M (IgM), anticorps anti- <EMI ID=21.1>
l'activité de neutralisation (de l'activité antivirale de IFNbêta ) des fractions individuelles. Les ordonnées de droite indiquent le coefficient d'absorption, ou absorbance, à 280 nm
(courbes en trait plein), cependant que les ordonnées de gauche indiquent le pourcentage d'inhibition à la dilution de 1 :30. de l'anticorps (courbe en trait, mixte), les abscisses indiquant le numéro des fractions, et la flèche horizontale le sens de l'élution. La ligne en pointillé indique le volume vide ou d'exclusion.
La figure 4 montre le profil d'élution, sur "Sephadex G200", de l'immunoglobuline IgM anti-(Hu-IFN-gamma) (en trait plein), et de l'immunoglobuline M (IgM témoin) (en pointillé). Les abscisses indiquent le numéro de la fraction (la flèche horizontale montrant le sens de l'élution), et les ordonnées <EMI ID=22.1>
à deux têtes indiquant le volume vide ou d'exclusion.
La figure 5 montre une réaction ELISA de l'anti-
(Hu-IPN-gamma) humain avec Hu-IFN-gamma qui a été transféré d'un gel de polyacrylamide SDS (sans traitement préliminaire <EMI ID=23.1> a) concerne Hu-IFN-gamma plus de l'anti-(Hu-IFN- <EMI ID=24.1> b) concerne Hu-IPN-gamma plus du milieu (témoin négatif), et c) concerne des protéines témoins marquées par
14 C. Les poids moléculaires sont indiqués en PM. La figure 6 montre une réaction ELISA comme sur la figure 2, mais après un traitement préliminaire par du bêtamercaptoéthanol de Hu-IFN-gamma pour l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. a) concerne Hu-IFN-gamma plus de l'anti-(Hu-IFNgamma)mono-clonal, et b) concerne des protéines normales colorées par du noir d'amide. PM désigne les poids moléculaires. La figure 7 est un auto radiogramme d'un gel de po- <EMI ID=25.1>
mercaptoéthanol de Hu-IFN-gamma) de Hu-IFN-gamma marqué par de l'iode 125 et précipité à l'aide d'anti-(Hu-IFN-gamma).
a) concerne Hu-IFN-gamma, marqué par de l'iode 125 et spécifiquement précipité ; b) est une matière protéinique "de lavage", à adsorption non spécifique ; c) est une préparation de Hu-IFN-gamma, marqué par de l'iode 125 mais non traité ; et <EMI ID=26.1>
PM indique les poids moléculaires.
Exemple 1.
On immunise une souris femelle Balb/c quatre fois au total avec de l'interféron de fibroblastes humains (IFN-
<EMI ID=27.1>
qui est lié sur une matière pour colonnes "Blue Sepharose". On injecte chaque semaine à la souris ce complexe matière de
<EMI ID=28.1> dégradation enzymatique et l'on élève d'autre part nettement
<EMI ID=29.1>
tion est effectuée, quatre jours avant l'isolement d'un mélange de lymphocytes, à l'aide de IFN-bêta non fixé sur une colonne et dont la partie sucre a été enlevée.
Quatre jours après la dernière immunisation, on enlève la rate, on isole un mélange de lymphocytes, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de myélome B
(FO) et l'on cultive une à deux semaines dans du milieu HAT avec de la méthylcellulose. On isole ensuite à l'aide de capillaires stériles les cultures d'hybridome en cours de croissance et on les sous-clone dans un milieu HAT sans méthylcellulose. Les colonies qui se développent alors sont soumises à des essais de production d'anticorps spécifiques. Les essais sont effectués au cours d'un dosage d'interféron antiviral
sur des cellules de fibroblastes humains PS4 selon Havell et collaborateurs ; J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972)
476-484. On mesure l'inhibition, par l'anticorps mono-elonal, du pouvoir protecteur de l'interféron de fibroblastes contre du v�rus VSV (virus de stomatite vésiculaire ; voir tableau I). On établit l'existence de plusieurs lignées d'hybridones stables de souris. On ne constate pas de réactions croisées avec de l'interféron de leucocytes purifiés ; voir tableau II. L'action antivirale de l'interféron peut également, après dégradation de la partie sucre de l'interféron de fibroblastes par un mélange d'enzymes capables de dégrader du sucre, être encore inhibée par les anticorps spécifiques ; voir tableau II.
Par la réinjection de cellules stables d'hybridomes (qui séparent les anticorps mono-clonaux spécifiques) dans la cavité péritonéale de souris femelles Balb/e et l'obtention d'une tumeur ascitique, on peut extraire de la cavité abdominale
ou péritonéale des souris Balb/c, après environ quatorze à vingt et un jours, un anticorps enrichi en activité spécifique contre l'interféron de fibroblastes humains, qui est capable d'inhiber l'interféron de fibroblastes, dans un dosage anti-viral, entièrement,même à une dilution de l'anticorps de 1 :30 ; voir le tableau III.
On démontre la spécificité de l'anticorps à l'aide de la méthode connue de preuve ELISA. Pour cela, on sépare
par électrophorèse de l'interféron de fibroblastes humains partiellement purifié, tout d'abord sur un gel de SDS selon
<EMI ID=30.1>
protéines normales) puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc . Natl. Sci. USA 76 (1979)
4350-4354) sur des bandes de nitrocellulose. Alors que la partie en forme de tache comportant des protéines normales est colorée par du noir d'amide, on soumet la partie formant des taches et comportant de l'interféron de fibroblastes à la technique ELISA et, selon Towbin et collaborateurs, on visualise à l'aide d'anticorps IgG-antisouris de lapin, conjugués
<EMI ID=31.1>
d'enzyme, en une bande fortement colorée en brun ; voir figure 1 .
TABLEAU I
<EMI ID=32.1>
TABLEAU II
<EMI ID=33.1>
TABLEAU III
<EMI ID=34.1>
L'anticorps mono-clonal selon l'invention peut ser-
<EMI ID=35.1>
humains à partir d'un mélange de matières contenant cet. interféron, et ainsi à purifier l'interféron.
On a fixé de l'anticorps mono-clonal contre IFN-bêta sur de la "Sepharose-4B" activée par CNBr ; on a vérifié l'immu-
<EMI ID=36.1>
corps. Pour cela, on a marqué par 125 1 (selon Hunter et collaborateurs, Nature, 194 (1962) 495-496) un échantillon de IFNbêta non purifié. On a ensuite chargé cet échantillon de IFNbêta marqué par 125 1 sur la colonne d'anticorps et on a ensuite lavé de façon poussée avec TBS neutre (solution saline tamponnée, avec du tris) pour enlever de la protéine non spécifique- <EMI ID=37.1>
cine/HCl (pH 2,3) IFN-b�ta marqué par <1> 25 -I et spécifiquement lié, on l'a concentré par lyophilisation puis on l'a séparé par électrophorèse sur un gel de SDS-polyac rylamide, parallè-
<EMI ID=38.1>
680-685). Puis l'on a autoradiographié le gel. La figure 2 montre nettement que IPN-bêta est spécifiquement lié par la colonne de "Sépharose" traitée par CNBr et comportant de l'an-
<EMI ID=39.1>
quente sur une colonne de "Sephadex-G200". Le profil d'élution sur "Sephadex-G200" a montré qu'il s'agit, pour l'anti-(Hu-
<EMI ID=40.1>
re 3.
Exemple 2.
On immunise selon l'exemple 1 une souris femelle Balb/c, sauf que l'on utilise de l'immun-interféron humain
(Hu-IFN-gamma) jusqu'à établir dans le sérum de la souris la présence d'un titre positif en anticorps contre Hu-IFN-gamma. Quatre jours avant l'isolement d'un mélange de lymphocytes de la rate de la souris Bal b/c immunisée, on effectue une dernière immunisation "de rappel" (Booster). Quatre jours plus tard, on isole le mélange de lymphocytes de la rate, puis l'on fusionne des lymphocytes B avec des cellules de myélome B [FO
(Groth et Scheidegger) 1980), J. Immunol. Methods 35, 1-25)]
(voir Hochkeppel et collaborateurs, Europ. J. Biochem., 118
(1981 ) 437-442) et l'on cultive durant cinq jours dans un milieu HAT avec 1 % de méthylcellulose et 20 % de sérum de foetus de veau.
Pour une meilleure multiplication des hybrides survivants et pour stabiliser les hybrides contre une perte de gènes, on injecte ensuite les hybrides dans la cavité péritonéale d'une souris Balb/c qui a été prétraitée par du "Pristan" ou tétraméthyl-2,6,10,14 pentadécane. Au bout d'une semaine, on prélève de manière stérile le liquide ascitique de la cavité péritonéale et l'on place les cellules hybrides ainsi obtenues, sans méthylcellulose, dans du milieu normal de Dulbecco modifié par Iscove et qui contient 10 % de'sérum de foetus de veau. On sous-clone ensuite les cultures d'hybridome en cours de croissance dans des plaques de culture de tissus pour monoclone de Greiner. On soumet les colonies qui se développent ainsi à des essais de détermination de la production d'anticorps spécifiques. Les essais sont effectués après un essai
de neutralisation antivirale sur des cellules CCL23 humaines. Pour cela) on provoque tout d'abord l'adsorption durant seize heures d'un anticorps dirigé contre des immunoglobulines de souris à la surface des trous d'une plaque de microtitrage immunologique, puis l'on ajoute également durant seize heures
ce qui provient ou surnage des cultures d'hybridome pour fixer sur les anticorps adsorbés les anticorps anti-Hu-IFN-gamma éventuellement obtenus et l'on ajoute enfin dix unités antivirales, par millilitre, de Hu-IFN-gamma (quatre heures). On soumet ce que l'on obtient ainsi à des essais d'activité antivirale résiduelle ou rémanente contre VSV (virus de la stomatite vésiculaire) sur des cellules humaines CCL23 contre un échantillon de Hu-IFN-gamma non traité. De cette façon, on établit l'existence de plusieurs lignées stables d'hybridomes de
<EMI ID=41.1>
mono-clonal.
Pour identifier la nature de l'immunoglobuline de l'anticorps mono-clonal, on purifie tout d'abord l'anticorps provenant de l'hybridome par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium à 40 % et par une étape subséquente de chromatographie sur une colonne de "Sephadex-G200". On identifie ainsi l'anti-(Hu-IFN-gamma) comme étant IgM qui, dans un volume d'exclusion ou d'élution de la colonne de Sephadex-G 200 s'élue de manière identique au profil d'élution d'une IgM (immunoglobuline M) témoin (figure 4). La spécificité de l'immunoglobu-line anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonaleainsi purifiée est ensuite établie indubitablement par les essais suivants de spécificité. Tout d'abord, on sépare par électrophorèse sur un gel
<EMI ID=42.1>
(1970) 680-685), sans traitement préliminaire par du bêtamercaptoéthanol, du Hu-IFN-gamma partiellement purifié parallèlement avec des protéines normales puis l'on transfère par électrophorèse selon Towbin et collaborateurs (Proc. Natl.
<EMI ID=43.1>
cellulose. Alors que la partie en forme de tache comportant les protéines normales est colorée par du noir d'amide, la partie en forme de tache comportant Hu-IFN-gamma est soumise
à la technique ELISA selon Hochkeppel et collaborateurs (Europ. J, Biochem. 118 (1981) 437-442), en faisant incuber tout d'abord la tache avec de l'anti-(Hu-IFN-gamma) mono-clonal de souris puis avec de l'anticorps IgM de lapin à activité antiIgM de souris et finalement avec de l'anticorps IgM de chèvre, à activité anti-IgM de lapin (conjugué à de la peroxydase), puis l'on visualise le Hu-IFN-gamma à l'aide d'o-di&nisidine comme substrat d'enzyme en une bande nette autour de 46 000 daltons (figure 5). On répète la même expérience avec Hu-IFNgamma, qui a été prétraité par du bêta-mercaptoéthanol/SDS. Avec une tache ELISA, on visualise à l'aide d'o-dianisidine une bande spécifique autour de 22 000 daltons (figure 6).
L'anti-(Hu-IPN-gamma) mono-clonal a donc une activité spécifiquement dirigée contre deux sous-espèces différentes de Hu-IFNgamma ou contre le dimère (figure 5) et contre le monomère
(figure 6) de la molécule de Hu-IFN-gamma, le déplacement du poids moléculaire des bandes de réaction immunologique, après un traitement préliminaire par le bêta-mercaptoéthanol indiquant plut8t qu'il s'agit du monomère et du dimère de Hu-IFNgamma.
Dans un autre essai de spécificité, on fait incuber tout d'abord du Hu-IFN-gamma partiellement purifié, qui a au préalable été marqué par de l'iode 125 selon Hunter et colla- <EMI ID=44.1>
à activité anti-IgM. On précipite ensuite le complexe avec de la protéine A de Staphylococcus-aureus spécifique de IgG
(Pansorbine). Après plusieurs lavages poussée du complexe et détachement subséquent par traitement par SDS de Hu-IFN-gamma, marqué par 125 1 et précipité spécifiquement avec de l'anti-
(Hu-IFN-gamma) mono-clonal, on sépare par électrophorèse, sans
<EMI ID=45.1>
lement avec des protéines normales marquées par 14 C. Puis, après séchage, on autoradiographie le gel. L'autoradiogramme
(figure 7) montre nettement que IFN-gamma marqué par 125 1 est
<EMI ID=46.1>
clonal et peut être visualisé sous forme d'une bande radioactive nette autour de 46 000 daltons sur l'autoradiogramme d'un gel de polyacrylamide-SDS.
Voici, à titre de remarque, des adresses permettant d'obtenir les produits dont l'utilisation est ici décrite :
Colonnes de ConA, de "Sephacryl-S-200" et de "Sephadex-G-200" : Deutsche Pharmacia GmbH, 6000 Frankfurt/Main 50
Milieu de Dulbecco modifié par Iscoves : BCK-BiokultChemie, numéro postal 21 02 65, 7500 Karlsruhe
Plaques de culture de tissus Greiner (384 fois pour des clones de cellules) : Greiner & Sonne, numéro postal 13 20,
<EMI ID=47.1>
IgM, IgG, anticorps de chèvre et de lapin ou anticorps anti-IgM : Byk-Mallinckrodt, Von-Hevesystr. 1-3, 6057 Dietzenbach 2
Gel de polyacrylamide SDS : voir Lammli, Royaume Uni, Nature (Londres) 227 (1970) 680-685 et Hochkeppel et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442
"Pansorbine" (protéine A de Staphylococcus aureus) :
Calbiochem, numéro postal 11 03 60, 6300 Giessen Cellules CCL23 : (a) Regainstitut, Minderbroederstraat
10, B-3000 Leuven (Belgique), et (b) Flow Laboratories, MUhlen-
<EMI ID=48.1>
REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir des cellules hybrides productrices d'un anticorps, selon lequel :
(a) on immunise des souris avec un antigène,
(b) on isole un mélange de lymphocytes des souris,
(c) on fusionne ou hybride des lymphocytes B avec des cellules de myélome B de souris,
(d) on transfère le mélange des hybrides formés et des cellules de myélome B non hybridées dans un milieu de culture pour les hybrides formés, on cultive les hybrides formés
et on les sélectionne par rapport aux cellules de myélome B
non hybridées,
(e) on sous-clone pour obtenir des hybrides qui produisent l'anticorps à activité spécifique contre l'antigène, et
(f) on isole éventuellement les hybrides, procédé <EMI ID=49.1>
sélection dans un milieu contenant de la méthylcellulose et
l'on injecte les hybrides sélectionnés à l'étape (d) éventuellement dans la cavité péritonéale de souris (qui ont été
au préalable traitées à l'aide d'un stimulant de tumeur), on
retire de la cavité péritonéale les hybrides qui s'y sont multipliés et l'on effectue ensuite les étapes (e) de sous-clonage et (f) d'isolement.
"Method for obtaining hybrid cells producing a specific antibody and method for producing antibodies, hybrid cells and specific antibodies thus obtained" The invention relates to a method for preparing or obtaining hybrid cells producing an antibody, method that:
<EMI ID = 1.1>
(b) a mixture of mouse lymphocytes is isolated,
(c) B cells are fused or hybridized with mouse B myeloma cells,
(d) the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells is transferred to a culture medium for the hybrids formed, the hybrids formed are cultured and selected with respect to the unhybridized myeloma B cells,
(e) subclones are obtained to obtain hybrids which produce the antibodies directed specifically against the antigen, and
(f) the hybrids are optionally isolated, the process being characterized in that, in step (d), the selection is carried out in a medium containing methylcellulose and the hybrids [which have been selected for step (d)] in the abdominal or peritoneal cavity of mice (which have been previously
treated with a tumor stimulator), the hybrids which have multiplied are removed from the peritoneal cavity and the steps (e) and (f) of subcloning and isolation are then carried out.
For immunization, for isolation of a mixture
of spleen lymphocytes, to effect a fusion or a hybridization, to cultivate the hybrids and select them, to subclone the hybrids which produce the desired antibody, and to isolate these hybrids or the antibody, a person skilled in the art has corresponding processes. To carry out a fusion or hybridization and to cultivate the hybrids formed, it is possible to
<EMI ID = 2.1>
(London), 256 (1975) 495-497; Kohler et al., Eur. J. Immune).,. '6 (1976) 511-519 and Hochkeppel et al., Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442.
To select, subclone or mono-clone and to isolate the hybrids and the antibody, one can refer for example to Secher and collaborators, Nature (London), 285
(1980) 446-450 and Hochkeppel et al, loc. cit.,
<EMI ID = 3.1>
will finally bring to Vernon and collaborators in: Mishell & Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology
<EMI ID = 4.1>
Francisco 1980. During the subcloning or monocloning stage, it is possible to follow using an antibody activity test (inhibition of the antigen activity), for example according to the methods of Havell et al., J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972) 476-484, the appearance of a stable cell line capable of producing stable antibodies.
On the concept of myeloma cells, see, e.g., Milstein, Scientific American, 243 (October 1980)
56-64. Myeloma cells can be obtained, for example, according to Groth & Scheidegger, J. Immunological Methods, 35 (1980) 1-21. Examples of myeloma B cells are shown in the following table.
Those skilled in the art can search for a suitable strain of mouse by checking whether the myeloma B cells he has chosen can form hybrids with test mouse B lymphocytes. Advantageously, Balb / c mice and myeloma B cells of Balb / c mice are used, since these mice are quite conventional in the tests.
about animals. Such mice can be obtained commercially and they can, for example, come from "Zentralinsti-
<EMI ID = 5.1>
trial ailments) / Hannover.
It may be advantageous to introduce the antigen used for immunization in adsorbed form on a molecular sieve.
Preferably, the immunization is performed more than once. In the case of human interferon, the last immunization is preferably carried out using human interferon from which the sugar part has been removed. The sugar part can be removed, for example according to the methods of Bose et al., J. Biol. Chem., 251 (1976)
1659-1662. The last immunization is carried out preferably about four days before the isolation of the lymphocyte mixture.
Advantageously, the mixture of lymphocytes from female mice, in particular female Balb / c mice, is isolated. Female mice exhibit a faster immune response.
<EMI ID = 6.1>
When the selection is carried out in a medium containing methylcellulose and / or without macrophages, the hybrid cells formed are particularly sparing. The term "methylcellulose" also encompasses substituted methylcelluloses such as, for example, carboxymethylcellulose. An example of methylcellulose is "Methocel MC" (4000 cP; Fluka). An example of a suitable medium is the HAT medium; see Hochkeppel et al, cited place.
A good stabilization of the selected hybrids can be obtained when the selected hybrids are injected into the peritoneal cavity of mice which have been pretreated beforehand with the aid of a tumor stimulant. We can for example select for about four days before injecting the selected hybrids into the peritoneal cavity
of mice. The hybrids which have multiplied and have been removed from the peritoneal cavity are then subjected to the steps of subcloning and isolation of the method according to the invention. An example of a common tumor stimulant will be further indicated in the following. Those skilled in the art are familiar with the methods to be applied; see, for example, Secher et al., Nature (London), 285 (1980) 446-450. For example, Balb / c mice admit a hybrid which was obtained from B lymphocytes from Balb / c mice and myeloma B cells from Balb / c mice.
In addition, good results can be obtained by injecting a tumor stimulant or an adjuvant and then subcloned hybrids, producing the antibody, into the peritoneal cavity of mice, which are removed from the hybrids which
have multiplied and the antibody is eventually isolated. The developments previously exposed for the injection of selected hybrids are correspondingly valid. Tetramethyl-2,6,10,14 pentadecane is an example of a common tumor stimulant and Freund's adjuvant is an example of a common adjuvant.
Female mice, in particular Balb / c mice, are preferably used for the injection of selected hybrids or hybrids producing the antibody.
The invention further relates to an antibody-producing hybrid (directed specifically against the interferon of human fibroblasts = Hu-IFN-beta), which can be obtained by:
(a) immunizing mice using interferon from human fibroblasts and then, in a manner known per se
(b) isolating a mixture of mouse lymphocytes,
(c) fusing or hybridizing B lymphocytes with mouse B myeloma cells,
(d) transferring the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells into a culture medium of the hybrids formed, by cultivating the hybrids formed and selecting with respect to the unhybridized myeloma B cells, (e) under cloning to obtain hybrids which produce the antibody directed specifically against the interferon of human fibroblasts, and
(f) possibly isolating these hybrids.
The invention further relates to hybrids having the essential characteristics of those deposited under the
<EMI ID = 7.1>
with activity directed specifically against the interferon of human fibroblasts, and the hybrids originating from this deposit.
The invention further relates to hybrids producing an antibody (whose activity is specifically directed against human immune-interferon = Hu-IPN-gamma), these hybrids being obtainable when:
(a) mice are immunized with human immune interferon and then, in a manner known per se.
(b) a mixture of mouse lymphocytes is isolated,
(c) B cells are fused or hybridized with mouse B myeloma cells,
(d) the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells is transferred to a culture medium for the hybrids formed, the hybrids formed are cultured and selected with respect to unhybridized myeloma B cells,
(e) subclones are obtained to obtain hybrids which produce the antibody whose activity is specifically directed against the human immune interferon, and
(f) these hybrids are optionally isolated.
The invention also relates to hybrids producing an antibody (whose activity is specifically directed against the interferon of human fibroblasts) or an antibody (whose activity is specifically directed against the human immune-interferon), which can be obtained by carrying out, in step (d), selection in a medium containing methylcellulose and optionally by injecting the hybrids
<EMI ID = 8.1>
peritoneal mouse (which have been pretreated beforehand
1 using a tumor stimulant), by removing from the peritoneal cavity the hybrids which have multiplied there and then carrying out the steps (e) of subcloning and (f) of isolation.
The invention further relates to a mono-clonal antibody, the activity of which is specifically directed against interferon
<EMI ID = 9.1>
in :
(a) immusing mice using human immune interferon and then, in a manner known per se
(b) isolating a mixture of mouse lymphocytes,
(c) fusing or hybridizing B lymphocytes with its mouse B myeloma cells,
(d) transferring the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells into a culture medium of the hybrids formed, by cultivating the hybrids formed and selecting them with respect to the unhybridized myeloma B cells,
(e) by subcloning to obtain hybrids which produce the antibody whose activity is specifically directed against the interferon of human fibroblasts, and
(f) optionally by isolating the antibody.
The invention further relates to a monoclonal antibody, the activity of which is specifically directed against human immuninterferon (Hu-IFN-gamma) and which can be obtained by:
(a) immunizing mice using human immune interferon and then, in a manner known per se <EMI ID = 10.1> () fusing or hybridizing B lymphocytes with mouse myeloma B cells,
(d) transferring the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells into a culture medium of the hybrids formed, cultivating the hybrids formed therein and selecting them with respect to unhybridized myeloma B cells, (e) by subcloning to obtain hybrids which produce the antibody whose activity is specifically directed against the human immune interferon, and
(f) optionally by isolating the antibody.
The invention further relates to monoclonal antibodies, the activity of which is specifically directed against human fibroblast interferon or specifically directed against human immune interferon, and which can be obtained when, in step ( d), the selection is made in a medium containing methylcellulose and the hybrids (which were selected during step (d)) are optionally injected into the peritoneal cavity of mice (which have been previously pretreated with a tumor stimulant), the hybrids which have multiplied there are removed from the peritoneal cavity and then the steps (e) of subcloning and (f) of isolation are carried out.
For further details concerning the possibility of obtaining hybrids which produce antibodies whose activity is specifically directed against interferon of human fibroblasts or specifically against human immune interferon, or concerning the possibility of producing such antibodies, reference will be made to the general method according to the invention for obtaining hybrid cells which produce an antibody.
Antibodies are built from a domain which is common to them all and from a variable domain by which they are distinguished. In the case of monoclonal antibodies, the activity of which is specifically directed against human fibroblast interferon or specifically against human immuninterferon, the variable domain is specific for human fibroblast or immune interferon - human interferon; see, for example, Milstein, Scientific American, 243
(October 1980) 56-64. To identify interferon from human fibroblasts, see for example Goeddel et al., Nucleic Acids Research, 8 (18) (1980) 4057-4074 and, to identify human immun-interferon, see for example-
<EMI ID = 11.1> (1981) 1601 - 1605.
Myeloma B (FO) cells and hybridoma cells used.
The cells used were deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms / Paris, and they received the following designations of deposit:
<EMI ID = 12.1>
Obtaining and description of cultures:
(1) Originally obtained by Groth & Scheidegger, Journal of Immunological Methods, volume 35 (1980) 121.
(2) Obtained by fusion of (1) with B lymphocytes from Balb / c mice, which were immunized with interferon from human fibroblasts.
(3) Obtained by fusion of (1) with B lymphocytes of Balb / c mice which have been immunized with human immuninterferon.
Medium used for culture:
Dulbecco medium modified by Iscoves (IMDM), Gibco
<EMI ID = 13.1>
Serum used for cell growth:
10% fetal calf serum (Seromed Co.).
Composition of solutions for cell dispersions: also IMDM medium with 10% fetal calf serum.
<EMI ID = 14.1>
Growth of the suspension culture:
The concentration of the starting cells is at
<EMI ID = 15.1>
1 <EMI ID = 16.1>
The time between the start of the crop and the harvest is about a week.
Transfer of cells:
The cells can partially adhere to the surface of the tissue culture vessel. For transfer, trypsin should not be used, but on the contrary carefully detach the cells from the surface by applying several drops of tissue culture medium to the surface.
Cell freezing:
The cells are separated by centrifugation, the IMDM medium is poured in and 1 ml of fetal calf serum is added.
<EMI ID = 17.1>
fetal calf serum and 5% DMSO; the cell concentration is 106 cells / ml.
Cell thawing:
The cells are poured into ice-cold IMDM, then centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes and returned to
<EMI ID = 18.1>
Notes:
Medium should be supplied every three days or so to growing cells. After about a week, it is necessary to completely replace the medium. Since not all cells adhere to the surface, cells must be separated by centrifugation when replacing the medium.
The invention will now be described in more detail with reference to the seven appended figures and two examples.
Here are some details concerning more particularly the attached figures.
<EMI ID = 19.1> in ELISA.
In Figure 2: <EMI ID = 20.1> specific (four days of autoradiography), and
(d) denotes normal proteins, marked with
14 C, for the determination of molecular weight (PM). FIG. 3 shows the elution profile, on "Sephadex G200") of (A) an immunoglobulin M (IgM), anti-antibody <EMI ID = 21.1>
the neutralization activity (of the antiviral activity of IFNbeta) of the individual fractions. The ordinates on the right indicate the absorption coefficient, or absorbance, at 280 nm
(solid lines), while the ordinates on the left indicate the percentage of inhibition at dilution of 1: 30. of the antibody (line curve, mixed), the abscissa indicating the number of the fractions, and the horizontal arrow the direction of the elution. The dotted line indicates the empty or exclusion volume.
FIG. 4 shows the elution profile, on "Sephadex G200", of the anti-IgM immunoglobulin (Hu-IFN-gamma) (in solid line), and of the immunoglobulin M (control IgM) (in dotted lines) . The abscissa indicates the fraction number (the horizontal arrow showing the direction of the elution), and the ordinate <EMI ID = 22.1>
with two heads indicating the empty or exclusion volume.
Figure 5 shows an anti-ELISA reaction
(Hu-IPN-gamma) human with Hu-IFN-gamma which has been transferred from an SDS polyacrylamide gel (without preliminary treatment <EMI ID = 23.1> a) relates to Hu-IFN-gamma plus anti ( Hu-IFN- <EMI ID = 24.1> b) relates to Hu-IPN-gamma plus of the medium (negative control), and c) relates to control proteins marked with
14 C. The molecular weights are indicated in PM. FIG. 6 shows an ELISA reaction as in FIG. 2, but after a preliminary treatment with betamercaptoethanol of Hu-IFN-gamma for electrophoresis on polyacrylamide-SDS gel. a) relates to Hu-IFN-gamma plus of the mono-clonal anti-(Hu-IFNgamma), and b) relates to normal proteins stained with amide black. PM stands for molecular weights. Figure 7 is an auto radiogram of a gel of po- <EMI ID = 25.1>
mercaptoethanol from Hu-IFN-gamma) from Hu-IFN-gamma labeled with iodine 125 and precipitated using anti-(Hu-IFN-gamma).
a) relates to Hu-IFN-gamma, labeled with iodine 125 and specifically precipitated; b) is a "washing" proteinaceous material, with non-specific adsorption; c) is a preparation of Hu-IFN-gamma, labeled with iodine 125 but not treated; and <EMI ID = 26.1>
PM indicates molecular weights.
Example 1.
A female Balb / c mouse is immunized a total of four times with human fibroblast interferon (IFN-
<EMI ID = 27.1>
which is linked on a material for columns "Blue Sepharose". Each week, this complex material is injected into the mouse.
<EMI ID = 28.1> enzymatic degradation and one raises on the other hand clearly
<EMI ID = 29.1>
tion is carried out, four days before the isolation of a mixture of lymphocytes, using IFN-beta not fixed on a column and from which the sugar part has been removed.
Four days after the last immunization, the spleen is removed, a mixture of lymphocytes is isolated, and then B cells are fused with B myeloma cells
(FO) and cultured one to two weeks in HAT medium with methylcellulose. The growing hybridoma cultures are then isolated using sterile capillaries and subcloned in HAT medium without methylcellulose. The colonies which then develop are subjected to tests for the production of specific antibodies. The tests are carried out during an antiviral interferon assay
on PS4 human fibroblast cells according to Havell et al; J. Antimicrob. Ag. Chemotherap., 2 (1972)
476-484. The inhibition, by the mono-elonal antibody, of the protective power of the interferon of fibroblasts against the virus VSV (vesicular stomatitis virus) is measured. See table I). Several stable hybrid mouse lines are established. There are no cross-reactions with interferon from purified leukocytes; see table II. The antiviral action of interferon can also, after degradation of the sugar part of the interferon of fibroblasts by a mixture of enzymes capable of degrading sugar, be further inhibited by specific antibodies; see table II.
By reinjecting stable hybridoma cells (which separate specific monoclonal antibodies) into the peritoneal cavity of female Balb / e mice and obtaining an ascites tumor, one can extract from the abdominal cavity
or peritoneal in Balb / c mice, after approximately fourteen to twenty-one days, an antibody enriched in specific activity against human fibroblast interferon, which is capable of inhibiting fibroblast interferon, in an anti-viral assay, fully, even at a 1: 30 dilution of the antibody; see table III.
The specificity of the antibody is demonstrated using the known ELISA method of proof. For that, we separate
by electrophoresis of partially purified human fibroblast interferon, first on an SDS gel according to
<EMI ID = 30.1>
normal proteins) and then transferred by electrophoresis according to Towbin et al. (Proc. Natl. Sci. USA 76 (1979)
4350-4354) on nitrocellulose strips. While the spot-shaped part containing normal proteins is stained with amide black, the spot-forming part comprising fibroblast interferon is subjected to the ELISA technique and, according to Towbin et al. using conjugated IgG-rabbit anti-mouse antibodies
<EMI ID = 31.1>
enzyme, in a band strongly colored in brown; see figure 1.
TABLE I
<EMI ID = 32.1>
TABLE II
<EMI ID = 33.1>
TABLE III
<EMI ID = 34.1>
The mono-clonal antibody according to the invention can be used
<EMI ID = 35.1>
humans from a mixture of materials containing this. interferon, and thus purify the interferon.
Monoclonal antibody against IFN-beta was fixed on CNBr-activated "Sepharose-4B"; we checked the immu-
<EMI ID = 36.1>
body. For this, a sample of un purified IFNbeta was marked with 125 1 (according to Hunter et al., Nature, 194 (1962) 495-496). This sample of 125 L-labeled IFNbeta was then loaded onto the antibody column and then washed thoroughly with neutral TBS (buffered saline, with tris) to remove non-specific protein - <EMI ID = 37.1>
cine / HCl (pH 2.3) IFN-b ta ta marked with <1> 25 -I and specifically bound, it was concentrated by lyophilization and then separated by electrophoresis on an SDS-polyac gel rylamide, parallel
<EMI ID = 38.1>
680-685). Then the gel was autoradiographed. Figure 2 clearly shows that IPN-beta is specifically linked by the column of "Sepharosis" treated by CNBr and comprising an-
<EMI ID = 39.1>
quente on a column of "Sephadex-G200". The elution profile on "Sephadex-G200" has shown that, for the anti-(Hu-
<EMI ID = 40.1>
re 3.
Example 2.
A female Balb / c mouse is immunized according to example 1, except that human immune interferon is used.
(Hu-IFN-gamma) until establishing in the mouse serum the presence of a positive antibody titer against Hu-IFN-gamma. Four days before the isolation of a mixture of lymphocytes from the spleen of the immunized Bal b / c mouse, a final "booster" immunization is carried out (Booster). Four days later, the lymphocyte mixture is isolated from the spleen, then B cells are fused with B myeloma cells [FO
(Groth and Scheidegger) 1980), J. Immunol. Methods 35, 1-25)]
(see Hochkeppel et al., Europ. J. Biochem., 118
(1981) 437-442) and cultured for five days in a HAT medium with 1% methylcellulose and 20% fetal calf serum.
For better multiplication of the surviving hybrids and to stabilize the hybrids against loss of genes, the hybrids are then injected into the peritoneal cavity of a Balb / c mouse which has been pretreated with "Pristan" or 2,6-tetramethyl, 10.14 pentadecane. At the end of a week, the ascites fluid from the peritoneal cavity is taken in a sterile manner and the hybrid cells thus obtained, without methylcellulose, are placed in normal Dulbecco medium modified by Iscove and which contains 10% of serum calf fetus. The hybridoma cultures being grown are then subcloned into tissue culture plates for Greiner monoclone. The colonies which thus develop are subjected to tests for determining the production of specific antibodies. The tests are carried out after a test
of antiviral neutralization on human CCL23 cells. To do this) the adsorption of an antibody directed against mouse immunoglobulins to the surface of the holes of an immunoassay microtiter plate is first carried out for sixteen hours, then it is also added during sixteen hours.
what comes from or supernatant from hybridoma cultures to fix on the adsorbed antibodies the anti-Hu-IFN-gamma antibodies which may be obtained and finally ten antiviral units, per milliliter, of Hu-IFN-gamma (four hours) are added . What is thus obtained is subjected to tests of residual or residual antiviral activity against VSV (vesicular stomatitis virus) on CCL23 human cells against an untreated sample of Hu-IFN-gamma. In this way, we establish the existence of several stable lines of hybridomas of
<EMI ID = 41.1>
mono-clonal.
To identify the nature of the monoclonal antibody immunoglobulin, the antibody from the hybridoma is first purified by precipitation using 40% ammonium sulfate and by a subsequent step of chromatography on a column of "Sephadex-G200". The anti-(Hu-IFN-gamma) is thus identified as being IgM which, in an exclusion or elution volume of the Sephadex-G 200 column elutes identically to the elution profile of a control IgM (immunoglobulin M) (FIG. 4). The specificity of the monoclonal anti-(Hu-IFN-gamma) immunoglobu-line thus purified is then undoubtedly established by the following specificity tests. First, we separate by electrophoresis on a gel
<EMI ID = 42.1>
(1970) 680-685), without preliminary treatment with betamercaptoethanol, Hu-IFN-gamma partially purified in parallel with normal proteins and then transferred by electrophoresis according to Towbin et al. (Proc. Natl.
<EMI ID = 43.1>
cellulose. While the spot-shaped portion with normal proteins is stained with amide black, the spot-shaped portion with Hu-IFN-gamma is subjected
to the ELISA technique according to Hochkeppel et al. (Europ. J, Biochem. 118 (1981) 437-442), by first incubating the spot with mono-clonal anti (Hu-IFN-gamma) from mouse then with rabbit IgM antibody with mouse antiIgM activity and finally with goat IgM antibody with anti rabbit IgM activity (conjugated with peroxidase), then visualize the Hu-IFN -gamma using o-di & nisidine as enzyme substrate in a clear band around 46,000 daltons (Figure 5). The same experiment is repeated with Hu-IFNgamma, which has been pretreated with beta-mercaptoethanol / SDS. With an ELISA spot, a specific band around 22,000 daltons is visualized using o-dianisidine (FIG. 6).
The mono-clonal anti- (Hu-IPN-gamma) therefore has an activity specifically directed against two different subspecies of Hu-IFNgamma or against the dimer (FIG. 5) and against the monomer
(FIG. 6) of the molecule of Hu-IFN-gamma, the displacement of the molecular weight of the immunological reaction bands, after a preliminary treatment with beta-mercaptoethanol indicating rather that it is the monomer and dimer of Hu- IFNgamma.
In another specificity test, partially purified Hu-IFN-gamma is first incubated, which has been previously labeled with iodine 125 according to Hunter et al. <EMI ID = 44.1>
with anti-IgM activity. The complex is then precipitated with protein A of Staphylococcus aureus specific for IgG
(Pansorbine). After several thorough washes of the complex and subsequent detachment by treatment with SDS of Hu-IFN-gamma, marked with 125 l and specifically precipitated with anti
(Hu-IFN-gamma) mono-clonal, separated by electrophoresis, without
<EMI ID = 45.1>
Lement with normal proteins marked with 14 C. Then, after drying, the gel is autoradiographed. The autoradiogram
(Figure 7) clearly shows that IFN-gamma marked with 125 1 is
<EMI ID = 46.1>
clonal and can be viewed as a clear radioactive band around 46,000 daltons on the autoradiogram of a polyacrylamide-SDS gel.
Here, as a remark, addresses allowing to obtain the products whose use is described here:
Columns of ConA, "Sephacryl-S-200" and "Sephadex-G-200": Deutsche Pharmacia GmbH, 6000 Frankfurt / Main 50
Middle of Dulbecco modified by Iscoves: BCK-BiokultChemie, postal number 21 02 65, 7500 Karlsruhe
Greiner tissue culture plates (384 times for cell clones): Greiner & Sonne, postal number 13 20,
<EMI ID = 47.1>
IgM, IgG, goat and rabbit antibodies or anti-IgM antibodies: Byk-Mallinckrodt, Von-Hevesystr. 1-3, 6057 Dietzenbach 2
SDS polyacrylamide gel: see Lammli, United Kingdom, Nature (London) 227 (1970) 680-685 and Hochkeppel et al., Eur. J. Biochem., 118 (1981) 437-442
"Pansorbine" (protein A of Staphylococcus aureus):
Calbiochem, postal number 11 03 60, 6300 Giessen CCL23 cells: (a) Regainstitut, Minderbroederstraat
10, B-3000 Leuven (Belgium), and (b) Flow Laboratories, MUhlen-
<EMI ID = 48.1>
CLAIMS
1. Method for obtaining hybrid cells producing an antibody, according to which:
(a) mice are immunized with an antigen,
(b) a mixture of mouse lymphocytes is isolated,
(c) B cells are fused or hybridized with mouse B myeloma cells,
(d) the mixture of the hybrids formed and the unhybridized myeloma B cells is transferred to a culture medium for the hybrids formed, the hybrids formed are cultured
and we select them from myeloma B cells
not hybridized,
(e) subclones are obtained to obtain hybrids which produce the antibody with specific activity against the antigen, and
(f) optionally isolating the hybrids, method <EMI ID = 49.1>
selection in a medium containing methylcellulose and
the hybrids selected in step (d) are optionally injected into the peritoneal cavity of mice (which have been
previously treated with a tumor stimulant),
the hybrids which have multiplied therein are removed from the peritoneal cavity and the steps (e) of subcloning and (f) of isolation are then carried out.