BE560486A

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Description


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  NOUVEL ANTIBIOTIQUE ET PROCEDE POUR SA   PREPARATION.   



  Lettre rectificative jointe pour valoir comme de droit à la date du 14/1/58; Page 8, ligne 19, lire : "de 103 au lieu de :   ' de     -   103  " Page 8, ligne 21, Lire : "vaut-112 " au lieu de :     vaut     -   112 " Page 8, ligne 22, lire " = - 121 " au Lieu de : "=   -   121 ". 

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   La. présente invention concerne la préparation d'un nouvel antibiotique. Elle concerne plus particulièrement des pro- 
 EMI2.1 
 cédés pour préparation par .1.. t. des procédas pour ce es pour sa, prepar8 lon -on,-(, er:18n vé'. lon, des procp. JeS pour sa séparation et sa puri±1-cat<-on, COT2e tel ou sous la for-^¯e de ses sels d'addition d'acides. 



   Le nouvel antibiotique produit   conformément   à l'in- 
 EMI2.2 
 vention, est appelé l;:2.n8:1;rcine, et est efficace comme inhibiteur de la croissance de bactéries 2. Cs1"2¯ positif, à Grà,"1 n4g#tif et résistant aux r,cS-6.es, telles cwe le 1'itrC12.::ctZ';11=- tur'e.;r.ÇulgÊis,.!. 



  Suivant la présente .t1'TPT-i("\"r on prépare 1= lr,né1]'lY- cine par culture à '1.9.ne souche r.ov, speç. dons une solution aqueuse d'h;ror".t8s de ^"Z''0113 contenant 

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 un aliment azoté,, dans des conditions aérobicues   jusque à   ce que une activité antibactérienne substantielle soit conférée à la solution, on sépare ensuite l'antibiotique et, si c'est néces-   saire,   on le purifie. 



   Le micro-organisme oui produit l'antibiotique de la présente invention, a été isolé d'un échantillon de sols re- cueillis dans la préfecture de Nagano, Japon, et constitue un nouveau type de genre StrEPTOMYCES,   dénommé   streptoryces canany- ceticus. 



   Le Streptomyces kanamyceticus possède les   caractéristi,   ques suivantes:   1.-   Examen microscopique: le mycélium de substrat a environ 1 micron de large et est ramifié. Le mycélium aérien se développe à partir de branches de mycélium submergées et porte le sporophore à son extrémité. On n'observe d'ordinaire pas de ver- ticilles   ni ,de   spires. 



     2.-   Agar de Czapek-glycérine   (27 C):   la. croissance est tout d'abord incolore, puis jaune citron. Le verso a la couleur foin. Le mycélium aérien est blanc à jaune, avec éventuellement une teinte verdâtre ou rose pâle. Il contient occasionnellement un pigment brun clair soluble. 



   3. - Agar asparagine glucose de   Xrainsky     (27 C):   la croissance est incolore à jaune, et le verso est   blenc,   blanc légèrement rosé, jaune ou couleur foin. Le   mycélium   aérien est petit, se développe en général à partir du centre de la colonie, et est blanc, blanc légèrement rosé, jaune légérement verdâtre ou   j aune.   En général, on ne trouve pas de pigment soluble. 



     4.- Agar   malate de calcium (27 C): même observation      que pour l'agar d'asparagine glucose de   Krainsky,   mais la crois-   sancè   est plus faible. Il ne se produit parfois aucune   croissance   
5. - Plateau d'amidon (27 C): à   -)eu   près le même que sur l'agar d'asparagine glucose de krainsky, mais la croissance est res' sinte et il n'existe pas de mycélium aérien. L'amidon   lest. hydrolysé    

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   6.-   Tampon de pomme de terre (27 C) la' croissance est plissée,.à surface granuleuse, brun jaunâtre pâla à jaune. 



   Le mycélium aérien est nul ou petit et blanc. Il n'existe pas de pigment soluble. Le tampon en dessous de la croissance est occa- sionnellement foncé. 



   7. - Tampon de ca.rotte (27 C): la croissance est en général petite. Quand elle s'est développée, elle est à peu près la même que sur un tampon de pomme de terre. 



   8.- Eau de peptone avec 0,2% de nitrate de sodium (27 C): la croissance de surface en anneau est incolore à jaune- blanc, et blanche au fond. Un mycélium aérien blanc se produit occasionnellement. Il se forme du nitrite à partir du nitrate. 



   Il n'existe pas de pigment soluble. 



     9.-   Agar extrait de viande-peptone (37 C): la crois-   sa.nce   est plissée, blanche à jaune. Il n'existe pas de mycélium aérien ni de pigment   soluble-,,   
10.- Agar de sang (37 C): la croissance est plissée, brun rougeâtre avec nuance grisâtre. Il n'existe pas de mycélium 'aérien ni de pigment soluble. 



   Il.- Lait (37 C): il ne produit presque pas de change ment, et en général aucune croissance ne s'observe à la surface. 



   12. - Sérum coagulé de   Loeffler   (37 C): la croissance est restreinte, blanche à jaune-citron. Il n'existe pas de mycé- lium aérien ni de pigment soluble. 



   13. - Milieu d'oeufs (37 C): la croissance est plissée. 



   Il n'existe pas de mycélium aérien. 



   14.-   Gélatine:   liquéfaction; pas de pigment soluble. 



   15..- Utilisation de sources de carbone: les sources de carbone suivantes ont été utilisée en milieu de base de 
Czapek salin : arabinose ; dextrine, fructose, galactose, glucose, glycérine, maltose,'mannitol, mannose, raffinose, amidon, sucro- se, succinate. Les sources de carbone non assimilées compren- nent l'a   -sitol,   inuline, lactose, rhamnose, sorbose, xylose,      

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 acétate. Sources de carbone peu- assimilées : esculine,, salicine, sorbitol, citrate. 



   16. - Production de l'antibiotique kanamycine. 



     . Les   caractéristiques qui précèdent suffisent à distin- guer le micro-organisme des espèces de streptomyces décrites jus- qu'à présent, et à montrer que la souche K2-J appartient à une nouvelle espèce. Il faut s'attendre à une variation ou mutation naturelle de l'organisme décrit ci-dessus, qui constitue une pro- priété commune aux organismes de streptomyces. 



   Les caractéristiques de cette espèce peuvent être ré-   sumées   comme   suit:'la   croissance de la colonie est incolore à jaune, avec ou sans nuance verdâtre ou rosée. Le verso de la colonie sur l'agar synthétique est incolore, blanc, blanc légère-   ment ,rosé,  jaune blanchâtre ou couleur foin. Le mycélium aérien est blanc à jaune; il re se forme pas de spirales ni de verticil- les. Il se produit un pigment soluble brun pâle, occasionnellement sur un milieu synthétique. La gélatine est liquéfiée et l'amidon est hydrolysé . 



   Le Streptomyces kanamyceticus comprend la souche type n    K2-J   décrite ci-dessus, et toutes ses variétés ou mutants na- turels ou artificiels. 



   Production de kanamycine par fermentation. 



   Streptomyceskanamyceticus (k2-J) a d'abord été cul- tivé dans des flacons à secousses, dans les milieux suivants: (a);0,755 d'extrait de viande; 0,75% de peptone, 0,3%   NaCl   avec 1%   d'amidon,   dextrine,   maltose,   glucose,, lactose, sucrose ou glycérine; (b) 2,0% de farine de fèves de soya, 0,05% KCl,   0,05   MgSO4.7H2O, 0,5% NaCl, 0,2%   NaN03   avec 1,0% d'amidon, dextrine, maltose, glucose, lactose, sucrose, ou glycérine. Le pH initial de chaque milieu a été réglé à   7,0. Après     24-48   heures de traite ment par secousses, le pH diminue dans certains cas jusque 6,0- 6,8 environ, mais à partir de 72-120 heures, le pH augmente et atte 7,5- 8, 6. 

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   Dans le milieu (b) ci-dessus, contenant 2,0% d'amidon après 3 jours de culture à secousses, le pH monte à 8,2 et 250   mcg/ml   de kanamycine ont été produits. En culture en cuve avec-le milieu contenant 2,0% d'amidon, 0,5% de glucose, 1, ,2% de farine de 'fèves de soya, 0,05% KCL,   0,05%   MgSO4, 0,1% K2PO4, 0,3% NaCL, 0,3%   , de   peptone et 0,3%   CaC03,   le pH diminue légèrement   (6,6)  au début puisaugmente de nouveau et atteint 8,0 après 43 heures ; on produit 273 mcg/ml de kanamycine après 78 heures. 



   Comme matière de départ pour la production de kanainy- cine, on peut utiliser des bouillies de fermentation telles que décrites ci-dessus ou des produits bruts obtenus par   traitement.   des bouillies de fermentation. 



   En ternes généraux, on produit la kanamycine de préfé- rence dans des milieux contenant des sources d'azote organique,' telles que la farine de fèves de soya, la farine de graines de co, ton, la farine d'arachide, l'extrait de viande, la peptone, la liqueur de trempage de grains ou l'extrait de levure. Les sources de carbone qui peutvent être utilisées comprennent   l'amidon,   dex- trine, maltose, glucose, sucrose, lactose et glycérine. On a cons- taté que la combinaison d'amidon et de   fa.rinede   fèves de soya est l'une des meilleures, et est préférée; l'addition de liqueur de trempage de grains, de peptone, d'extrait de levure ou de nitrate à cette combinaison, favorise la production de kanamycine.

   L'ad- dition de sulfate de magnésium, chlorure de manganèse ou sulfate de zinc, est favorable; le rendement maximum est obtenu lorsque le pH de la bouillie de culture devient légèrement alcalin. On peut faire varier la. température de la culture dans une large gamme, 25  - 35 C, dans laquelle l'organisme peut croître, mais on préfère une température de 27 -32 ,C. En général, on poursuit la culture   jusqu'à   ce qu'une quantité substantielle de kanamycine se soit accumulée dans le milieu. En culture submergée aérée pro- fonde, cela nécessite, en général, deux à sept jours, la produc- tion   maxime   se produisant généralement les Troisième à cinquiéme 

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   jours.'On   -trouve la kanamycine dans la portion liquide de la bouillie de   f ermentation.   



   Méthodes expérimentales. 



   Culture à secousses: On dispose 150 ml du milieu dans un flacon d'une capacité de 500 ml, et on le stérilise. On   l'ino-'   .cule à l'aide des mycéliums et spores de l'organisme producteur de kanamycine sur le milieu d'agar, ou à l'aide de mycélium obtenu à partir d'une culture à secousses de 48 heures, puis on le soumet à une culture à secousses dans une machine alternative à secous- ses, à 120 courses par minute et 8 cm d'amplitude, à 27-29 . 



   Culture en cuve: on utilise un appareil de fermenta- tion en acier inoxydable, d'une capacité de 400 1. On y introduit cent quatre vingt litres ou deux cents litres du milieu, et on le stérilise à   120 C   pendant 20 à 30 minutes. La vites-se d'aération est de 200 1 d'air par minute, et le nombre de tours de l'agitateur est de 200 par minute. On utilise comme antimousse des silicones, de l'huile de fèves de soya ou de la paraffine liquide. 



   Extraction et purification de kanamycine. 



   Suivant un procédé d'extraction préféré- on peut extraire la kanamycine existant dans la phase liquide de la   bouil--   lie de fermentation par du butanol en présence d'un support tel que l'acide laurique ou l'acide stéarique. L'antibiotique est transféré dans le butanol au pH 6-8, et de la phase de solvant à la phase aqueuse au pH   2-4.   En l'absence de support, la kanamy- cine n'est pas transférée de façon notable dans le butanol, 1' acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le benzène, etc.   L'extrac'   tion par ces solvants peut donc être utilisée à l'extraction d' autres substances et impuretés co-existantes. 



   Suivant un autre'procède de séparation de la   kanamyci-   ne d'une bouillie de fermentation, on concentre la bouillie par évaporation dans le vide ou séchage par pulvérisation. On peut extraire la kanamycine du résidu par de l'eau, du méthanol, de l'éthano- ou de l'acétone. L'acidification par l'acide   chlorhydri.   

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 que facilite la dissolution. L'antibiotique peut être obtenu par adsorption sur du   carbon.activé   à partir de solution aqueuse neu- tre ou alcaline, suivie, de désorption dans de l'alcool absolu ou aqueux, ou de   lacétone   aqueuse, réglée au pH 2,0 par de l'acide chlorhydrique.

   La kanamycine est également adsorbée à un pH d' .environ 6,0¯à 9,0 par des résines d'échange de cations du type des acides carboxyliques, telles qu'un   copolym.ère   d'acide méthacryli- que et de divinylbenzène. Quand il est adsorbé sur une résine d' échange de cations, l'antibiotique peut être élutrié par de l'aci- de chlorhydrique aqueux, de l'acide sulfurique aqueux, ou des sol- vants organiques aqueux, par exemple par HCL   1N-acétone   aqueux à. 



  10%. La kanamycine est également élutriée par l'hydroxyde D'AMMO-   nium. '    
On peut concentrer l'éluat ainsi obtenu par évaporation dans le vide ou par séchage par congélation, et précipiter ensui- te la kanamycine de la solution concentrée en ajoutant un solvant dans lequel la kanamycine ou son sel est pratiquement insoluble. 



   Suivant un procédé de purification encore différent, on peut appliquer la chromatographie en colonne avec de l'alumine ou du carbone actif. On peut par exemple faire passer une solution aqueuse de kanamycine au ph 8,0, obtenue-par répétition du procé- dé aux résines d'échange de cations, à travers une colonne conte- nant du carbone actif et, après lava.ge de la colonne par de l'eau distillée on effectue l'élutriation par de l'acide sulfurique 0,5N, On ajoute la fraction la plus active de l'éluat à du mé- thanol et on précipite du sulfate de kanamycine cristallisé. 



   Nature de la kanamycine. 



   On obtient la   kanamycin'e   sous Tome de son chlorhydra- te ou sulfate, et on obtient la base libre de kanamycine à partir de ces sels, par exemple en séparant l'ion sulfurique de la solu- tion de sulfate de kanamycine par de la,baryte. 



   Le chlorhydrate de kanamycine est aisément soluble dans l'eau, 1-   éthanol,   légèrement soluble dans l'éthanol et insolu- 

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 EMI9.1 
 1?le dans l'acétone, 1-lac'tate,.d-léthyle, l'acétate de butyle, 'le benzène, l'éther ou l'éther de   pétrole.   



   Le sulfate de kanamycine est soluble dans l'eau et in- 
 EMI9.2 
 soluble dans le méthanol, l'êthanol, l'acétone, 1-'acétate d'éthyle et le   b enzène.   



   La base kanamycine est soluble dans l'eau et pratique?- ment insoluble dans le n-butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther, le chlore-forme et   le b enzène.   



   La kanamycine dissoute dans la pyridine, et soumise à des essais, donne une   réac,%ion   positive à la ninhydrine. Les es- sais de Tollens, Sakaguchi, Fehling,   Molisch   et de glucosamine 
 EMI9.3 
 (Elson-2organ) sont négatifs; même après hydrolyse, l'essai 2 la glucosamine est négatif. Quand on effectue la chromatographie sur ,ruban de papier, avec un papier filtre Toyo n  50, et une solution 
 EMI9.4 
 de 0,2jÉ d'acide p-toluènesulfonique-butanol saturée d'eau, la valeur de Rf de la kanamycine est de 0,21 - 0,26. 



   La kanamycine possède une activité optique. Quand on effectue la mesure sur du chlorhydrate de kanamycine purifié en solution aqueuse à 1%, cd17. a une valeur de -103  et si on effectue la mesure sur une solution aqueuse à 1% de la base libre, D 17 vaut -112 ; une solution aqueuse à 1,0% de sulfate de kanamycine cristallin donne D23 = -121 . Des résultats d'analyse de la base libre sont les suivants: 
 EMI9.5 
 Calculés sur la formule:CH23N3011:C,.O,$; H,7,04; N,10,12;0,2,37 
Résultats trouvés: C, 43, 17; H, 6,95;   N,   9.82. 



   Des résultats d'analyse effectuée sur le chlorhydrate sont les . suivants: 
 EMI9.6 
 Calculé sur la formule Cl,H29N 30il* 311cl: Ci32,0.; H,6,15; N,8,Ol; C1,   20,27;   o, 33,54 Trouvé: C,31,31; H, 6,07;   N,8,21;   c1,   18,03.   



  Résultats d'analyse du sulfate de kanamycine (amorphe): 
 EMI9.7 
 Calcule sur la formule: C1H29N3011.32 ESO : C, 29,89; H, 5;731 N, '7,4.. S, 8,57; 0, 48;35 

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 Trouvé: C, 30;20; H, 5,88; N, 7,43. 



  Résultats d'analyse de   N-acétyl     kanamycine:   Calculé sur la formule C14H26N3O11.3CH3CO; C,   44,36;   H, 6,51; N,   7,76;   0,   41,36   Trouvé : C,   44,39;   H,6,01; N,   7,49   Résultats d'analyse sur le reineckate de kanamycine: Calculé sur la formule C14H29N3O11.3(C4H8N6S4Cr); C,   22,68;   H,   3,88;   N,   21,37;   S,   27,95;   Cr,   11,33;   0,   12,78 .   



  Trouvé : C, 21,44; H,   4,31;   N, 19,93; Cr,   Il,40   (d'après la teneur en cendres) Résultats d'analyse sur le sulfate de kanamycine cristallisé: 
Calculé sur la formule: C14H29N3O11.H2SO4; 
C,   36,21;   H,   6,51;   N,   9, 05;   S, 3,44;   0,44,79   
Trouvé: C, 35,97; H, 6,51; N,9,13;   S,3,47.   



   La base kanamycine n'accuse aucune absorpiton de lu- mière ultraviolette entre 220 millimicrons et 400 millimicrons. 



   La Figure du dessin annexé représente le spectre d'ab- sorption infra-rouge d'hémisulfate de kanamycine cristallisé, gra- nulé dans du bromure de potassium. 



   Il est clair d'après le dessin, que le nouvel antibioti- que possède une configuration nouvelle et caractéristique. Les ban- des d'absorption caractéristiques émises dans la région de l'infra- rouge du spectre, correspondent aux longueurs d'onde suivantes, ex- primées en microns: 2,85; 3,03; 3,20; 3,30 ; 3,43 ; 3,63 ; 3,70;   3,83;   4,70 (large) ; 6,05; 6,17; 6;27; 6,60; 6,90; 7,15 ; 7,35; 7,52j 
7,60 ; 7,95; 8,18; 8,76; 8,95; 9,08; 9,40; 9,70;   10,20;     la,48;   
10,75; 11,13; 11,50; 11,90, 12,35;   12,80   et 13,15. 



   Parmi les antibiotiques connus,   les'néocymes   B et C, la néamine et la caténuline ont certaines caractéristiques com-   munes   avec la kanamycine. Mais les caractéristiques suivantes dif- férencient nettement la kanamycine de ces antibiotiques. L'essai à la   glucosamine   sur la néomycine, décrit dans l'ouvrage:"Assay 
Methods of Antibiotics," de D. C.Grove et W.ARandall, 146 pages (Medica   'ncyclopedia   Inc.New-York), est négatif pour la kana-      

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 mycine. Cette réaction est positive pour les néomycines et la caténuline. La chromatographie sur papier à l'aide d'une solution à 2.0% d'acide p-toluènesulfonique-butanol saturée d'eau, différen cie la kanamycine de la néamine.

   Si on utilise du'papier filtre   .Toyo   n  50, l'indice Rf de la kanamycine est de 0,21-26 et celui de la néamine de 0,75-0,85. Par le procédé de dilution de bouillie, la   kanamycine'arrête   la croissance de   Klébsiella   pneumoniae à 3 mcg/ml, la néamine à 25 mcg/ml., la néomycine B à 3,mcg/ml, la caténuline à 1,5 mcg/ml. A l'essai sur plaque cylindrique avec du B. subtilis,. l'obtention d'un diamétre d'inhibition de 20 mm néces site 30 mcg/ml de kanamycine, 25 mcg/ml de néamine, 170 mcg/ml de néomycine B, 250   mcg/ml   de néomycine C ou 18 mcg/ml de caténuline. 



  Ces caractéristiques, aussi bien que la propriété de faible toxi- cité et les formules empiriques confirment le fait que la kanamy- cine est différente des néomycines, néamine et caténuline, et est un nouvel antibiotique. 



   Activité de la kanamycine. 



   La kanamycine, soumise à l'essai par le procédé de dilution à l'agar présente le spectre   antibactériel   suivant : 
 EMI11.1 
 
<tb> Concentration <SEP> minimum <SEP> pour <SEP> l'inMicroorganismes <SEP> hibition <SEP> compléte, <SEP> en <SEP> mcg/ml
<tb> 
<tb> S, <SEP> lutea <SEP> PCI-1001 <SEP> 1,8
<tb> M.pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> . <SEP> 2,2 <SEP> 
<tb> M.pyogenes <SEP> var.aureus <SEP> Terajima <SEP> 0,4
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 9.0
<tb> B.subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> 4,5
<tb> B.subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> 4,5
<tb> B.subtilis <SEP> Tracy <SEP> 9.0
<tb> E.

   <SEP> Coli <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> S.paratyphi <SEP> A <SEP> 3,1
<tb> S.dysenteriae <SEP> 1.6
<tb> Proteus <SEP> vularis <SEP> 6,2
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 3,1
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 2,2
<tb> Saccharomyces <SEP> sake <SEP> 300
<tb> Saccharomyces <SEP> 300
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 300
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 300
<tb> 
 
Dans le milieu de   Kircbner,   il inhibe la souche h2 du Mycobacterium tuberculosis à 2 mcg/m1. Le   E.coli,   résistant à la   strept.   ine et le Mycobacterium tuberculosis hominis, résistant 

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 à la streptomycine, sont sensibles à la kanamycine. 



   .Les souris supportent l'injection intraveineuse de 
150   mk/k.   Les doses létales Ld50's i.v. chez les. souris, rats et lapins, sont de 150-250   mg/Kg.   Des souris supportent journelle- ment une injection sous-cutanée de 200 mg;kg pendant 30 jours. 



   Aucune réaction secondaire n'est observée à la suite d'injection journalière de 100-200 mg/kg de kanamycine cnez les chiens pen- dant 30 jours. Une injection intrapérITONALE de plus de 50 mcg/ souris toutes les quatre heures, protège des souris infectées par   10,000   mld de Diplococcus pneumoniae ou 1,000   MLD   de   Salonella   typhosa. Une injection sous-cutanée journalière de   100mg/kg   de kanamycine, accuse l'effet d'inhibition sur des souris infectées par du Mycobacterium tuberculosis (souche de Ravenel). 



   On donne   ci*-dessous   des exemples spécifiques, qui il- lustrent des aspects particuliers de l'invention. Toutefois, il est bien entendu après ce qui précède, que la présente invention n'est pas limitée aux procédés décrits dans les exemples. Les caractéristiques de la. kanamycine étant décrites ici, il est évi- dent qu'on peut apporter des variations et modifications à l'in- vention sans sortir de son cadre. 



   EXEMPLE   1. -   
On ajoute du glucose, glycérine, lactose, maltose, su- crose, amidon ou dextrine à raison de 2,0% au milieu de base con- tenant   0,75%   d'extrait de viande, 0,75% de peptone et 0,3% de   chlo.   rure de sodium; on stérilise le milieu et, après stérilisation, on règle le pH à 7,0. On inocule le milieu à l'aide d'une loupe de culture inclinée de Czapek dans la glycérine de Strentomyceskana- myceticus. et=on le soumet à une culture à secousses à 27 -29 C. 



   On détermine la production de kanamycine par le procédé de la pla- que cylindrique,.avec. du mYCOBACTERIUM 607, et on obtient les ré-   sultats   suivants- : 

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 EMI13.1 
 
<tb> pH <SEP> final <SEP> et <SEP> nombre <SEP> de <SEP> jours
<tb> Production <SEP> maximum <SEP> de <SEP> culture <SEP> à <SEP> secousses <SEP> pour
<tb> Source <SEP> de <SEP> carbone <SEP> de <SEP> kanamycine, <SEP> atteindre <SEP> la <SEP> production
<tb> ---------------- <SEP> maximum
<tb> 
<tb> Amidon <SEP> 3250 <SEP> mcg/ml <SEP> 7,8 <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Dextrine <SEP> 200 <SEP> 8,0 <SEP> 5
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4
<tb> Glucose <SEP> 200 <SEP> 8,2 <SEP> 4
<tb> lactose <SEP> 100 <SEP> 8,6 <SEP> 4
<tb> Sucrose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 4
<tb> Glycérine <SEP> 100 <SEP> 8,0 <SEP> 4
<tb> 
 Quand on ajoute un hydrate de carbone,

   comme   indiquer   au milieu de base contenant 1,0% de farine de fèves de soya,   0,05%   KCL, 
 EMI13.2 
 0,05; MgS04-7H20 et 0,3% NaCl3 on obtient les résultats suivants: 
 EMI13.3 
 
<tb> pH <SEP> final <SEP> et <SEP> nombre <SEP> de
<tb> 
<tb> jours <SEP> de <SEP> culture <SEP> 2 <SEP> secous-
<tb> 
<tb> Production <SEP> maximum <SEP> ses <SEP> pour <SEP> atteindre <SEP> la <SEP> pro-
<tb> 
 
 EMI13.4 
 Source -de carbone de kananycine duction maxiwt.. 
 EMI13.5 
 
<tb> A-idon <SEP> 250 <SEP> mcg/ml <SEP> 7,6 <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1,-.-;

  trine <SEP> 250 <SEP> 8,0 <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 100 <SEP> 8,2 <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Sucrose <SEP> 150 <SEP> 8,4 <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Glycérine <SEP> 70 <SEP> 8,2 <SEP> 4
<tb> 
   EXEMPLE 2.-   
 EMI13.6 
 On inocule le milieu contenant 2.$0-14o d'amidon, 1,2; de farine de fèves de soya, 005% KCl, 0,05% MgS04.7H20, 0,1% K2 HPO4 0.,3% NaCl, Oe3% de peptone, et 0,5% CaC03, le pH initial étant de 'l,0 par la croissance d'une sous-culture sélectionnée de S.Kanao.yceticus (souche K2-J) sur de l'agar Czapek à la glycérine et on le cultive.

   Après quatre jours de culture à secousses, le pH est de 8,2 et des essais par le procédé cylindre---olacue, sur le B.subtilis et le i-177-cobacteriu--i 607, accusent une production de 550   mcg/ml   de kanamycine. 



    EXEMPLE 3.-    
 EMI13.7 
 On introduit 180 1 de milieu contenant 20% d'widon, l.,0% de glucose, 1,2;: de farine de fèves de soya, 03; NaCl, 0,05fi KC1, 0,05% MgSO,.7HÔ 01% K2HP04' 0,2; CaC03, 03% NaN03, O.,002% 'In.SO.'7H20 et 0, 002 ô ZnS0,7E0 dans un fermentateur de 400 1 de capaci+'. on le règle au pH z4 0n le'stérilise pendant 30 minu- 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 
 EMI14.1 
 tes à 120 C, on l'inocule par 1000 ml de bouillie de S.kanpype- ticus soumis à une culture secousses pendant 40 heures, (sous- culture sélectionnée de souche K2-J) et on le cultive en cuve à 27 -29 C. On ajoute comme agent antimousse 0.04% d'huile de fè- ves de soya, et 0,04% de silicone.

   Les résultats obtenus sont les suivants: 
 EMI14.2 
 
<tb> Kanamycine <SEP> Sucre <SEP> réducteur <SEP> % <SEP> Azote <SEP> ammoniacal <SEP> m
<tb> 
 
 EMI14.3 
 Heures ¯mçgLml dans le liauid dans le liquide.. 



  0 6, 6 --- z20 z, 5 
 EMI14.4 
 
<tb> 24 <SEP> 6,9 <SEP> --- <SEP> 1,50 <SEP> 10,7
<tb> 
<tb> 36 <SEP> 7,6 <SEP> 150 <SEP> 0,4 <SEP> 1,2
<tb> 
<tb> 48 <SEP> 7,6 <SEP> 200 <SEP> 0,3 <SEP> 1,2
<tb> 
<tb> 60 <SEP> 8,0 <SEP> .220 <SEP> 0,3 <SEP> 6,0
<tb> 
<tb> 72 <SEP> 8,2 <SEP> 210 <SEP> 0,25 <SEP> 12,0
<tb> 
 
 EMI14.5 
 EXBMPLE 4.- On introduit 200 1 de milieu contenant 2,0% d'amidon, 1,0% de farine de fèves de soya, 0,05% KCle 0,05% MgS0.7HO, 0,3% NaCl, 0,'2%,NaN03 dans le fermentateur de 400 litres, on règle le pH à 7,5 puis on stérilise le milieu (le pH après la stérilisation est de 7,0) et on le traite comme dans l'Exemple 3. On trouve 
 EMI14.6 
 qu'après 48 heures, la bouillie renferme 250 mcg/ml de kanasnycine. 



  Dans la suite, la concentration de la bouillie en kanamycine, ne varie pas de   façon   marquée. Après 65 heures de fermentation, on filtre la bouillie. On obtient ainsi 160 1 de bouillie filtrée.      
 EMI14.7 
 



  Elle contient 150 mcg/ml de kanmnycine, et le pH est de 8,2. On fait passer le filtrat à travers une colonne de résine d'échange de cations. La colonne a 15 cm de diamètre et contient 6 litres de IRC-50 sous la forme sodium, c'est-à-dire régénérée par de l'hy- 
 EMI14.8 
 droxyde de sodium, au pH 8,0. L'a,mberlite IRC-50 est une résine d'échange de cations du genre acide carboxylique existant dans le   commerce.   C'est un copolymère d'acide méthacrylique et de divinyl- benzène. On fait passer le filtrat à travers la colonne à raison de 16 1/heure. Le liquide sortant de la colonne n'accuse aucune 
 EMI14.9 
 activité antibactérienne contre le Mycobacterjum 607 à l'essai par le procédé cylindre-plaque.

   On lave alors 'la colonne avec environ 10 1. d'eau distillée qu'on fait passer à travers la 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 colonne à la même vitesse que le filtrat de la bouillie. On fait en'suite passer de l'acide chlorhydrique 1 N à travers la colonne 
 EMI15.1 
 ,à raison de 0,8 litre/heure. On recueille l'éluet 2r portions (fractions) de 21. Après la 7e fraction, les éluats deviennent acides, et on retrouve la kanamycine dôns les fractions 7 - 10 in- clus. On combine les fractions contenant la kan8ycine, on règle la solution combinée, d'un volume de 8 litres, au pH 6,0 par du NaOH à la$, et on la concentre à. 3000   ml   par distillation dans le vide à environ 50 C. On sèche la solution concentrée par congéla- tion. Les 500 g de poudre blanc brunâtre ainsi obtenus contien- nent 8 g de kanamycine.

   On les dissout dans 2 1 de méthanol, et après séparation de la partie insoluble;, on ajoute 20 1. d'acétons et on obtient 80 g. de poudre blanc brunâtre. Cette poudre ren- 
 EMI15.2 
 ferme 8 g. de k2naycine. On dissout vingt graines de cette poudre dans 40 ml   d'eau   distillée et on ajoute une solution saturée 
 EMI15.3 
 aqueuse de reineckate 2woni nue. On sépare le précipité rostre pâle apparaissant en premier lieu, et pesant 50 :"12 et on continue à ajouter de la solution de reineckate e=i=-ionique jusGU'â ce qu'îl ne se forme plus de précipité. On recueille ce précipité rosâtre, et on le fait recristalliser à partir d'eau distillée. On obtient 300 mg. de reineckate de   kanaycine   cristallisé rose. Il devient 
 EMI15.4 
 plus sonbre à 191-193 C et se décompose à 211-2i3 C.

   Le précipi- té légèrement rosâtre formé en premier lieu contient également de 
 EMI15.5 
 la kanamycine. rX.'PLH 5.- On inocule du k2Damyctîcus (sous-culture slection née de souche   K2-J)   dans 200 1. de milieu introduit dans un   fermer   tateur de 400 1. en acier inoxydable, et on le fait fermenter. Le 
 EMI15.6 
 milieu renferme 2% d'a:.idon 1,0fi d.e glucose, 1,2; de farine de fèves de soya, 0,3fi.Nacl, 0,05% KC'l, 005% IagS04.7H20, z K2HP04' 0,2% Ca.C03 et 0,3% de peptone. Le pH du milieu, après stérilisation, est de 7,0. On ajoute au milieu 0,15 d'huile de 
 EMI15.7 
 fèv- #b .soya- con.,ne antimousse. Après soixante cinq heures de 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 culture profonde aérée, la bouillie renferme 220 mcg de   kanamy-   cine par ml. Le pH est de 8.0.

   On filtre et on obtient 170 1. de   filtrat',   (210   mcg/ml).   On le fait passer à travers la tour de résine d'échange de cations. La tour de résine contient 6 1. de. résine IRC-50 sur,cycle sodium au pH 8,0 et a 15 cm de diamètre. 



  La vitesse de passage est de 30 1./heure,   c'est-à.-dire   1/12 litre de volume de résine par minute. On fait ensuite passer 30 1.   d'eaù   à travers la tour de résine à raison de 30 l./heure. On élutrie ensuite.la kanamycine adsorbée par la résine, par du HCl 1 N, à un débit de 3,0 1/heure. Le premier éluat (6,5 1) ne possède au- cune activité; l'éluat suivant contient la kanamycine. Nônante pour cent de la kanamycine adsorbée apparaissent dans l'éluat, dont le   pH   dépasse 2,0 On règle les 16 1. d'éluat actif, obtenu au pH 7,5 par du NaOH à 10% On le dilue ensuite à 80 1.

   Le rendement à partir du filtrat de la bouillie, est à ce moment de   83%.   On fait de nouveau passer la. solution diluée à travers une colonne de résine, contenant 2 1. de résine IRC 50 sur le cycle sodium, au   pH' 7,5.   Le   diamètre   de la colonne est de 5 cm. La vitesse d'écou- lement est de 10 l./heure. On lave la colonne au moyen de 20 1. d'eau à une vitesse d'écoulement de 10 l./heure. On élutrie en- suite la kanamycine adsorbée par du HCl 1 N. La vitesse d'écoule- ment est de 3,0 l./heure. Comme dans l'élutria.tion précédente, la kanamycine apparaît dans l'éluat, dont le pH est supérieur à 2,0.

   On règle les 4,5l, d'éluat actif au pH 6,0 par addition de résine d'échange d'anions   IR-4B,   sous sa forme hydroxyle.   L'a.m-   berliteIR-4B est une résine d'échange d'anions légèrement basique, existant dans le commerce, du type décrit dans le brevet américain n  2.591.573, On l'évapore sous vide à environ 40 C jusque 500 ml. 



  On ajoute à cette solution concentrée 5 litres de méthanol, et on sépare la portion insoluble. On évapore le filtrat sous vide à en- viron 40 c JUSQU'à 250 +11.,¯et on ajoute à la solution concentrée   2,5 'litres,   d'acétone. On obtient 65 g. de kanamycine   sous rme   de poud- brun clair. La puissance de la poudre est de 350 mcg/mg. 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 



  EXEMPLE 6.- 
 EMI17.1 
 On dissout 5 g de kanamycine blanc brunâtre obtenue dans 1' exen.ple 5 dans 50 ml. de méthanol aqueux à 60;, on sépare les matières insolubles, on ajoute au filtra.t 40, ml. de méthanol aqueux à 60% contenant 2000' mgr de sulfate ar2ronir.ue; on recueil- le le sulfate de kanamycine précipité, on le lave avec 50   ml   de méthanol aqueux à 80%, et on le sèche. On obtient ainsi   4,5  g de 
 EMI17.2 
 sulfate de kanamycine, sous forme de poudre légèrement brunâtre. 



  La puissance est de 370   mcg/mg.   



  EXEMPLE 7. - 
On dissout dix grammes de chlorhydrate de kanamycine 
 EMI17.3 
 solide, -ayant une puissance dé 535 :rlcg/mg., dans 100 ml de métha- nol aqueux à 90% et on fait passer la solution 8 travers une co- lonne   d'alumine.   La colonne contient 140 g d'alumine traitée ppr l'acide sulfurique, et a 1,5 cm de diamètre. On la développe par du méthanol. Le premier éluat de 200 ml ne contient pas de kana- 
 EMI17.4 
 mycine. Le second éluat (128ml) possède une activité antibactté-   rtenne;   on l'évapore sous vide pour obtenir   4,681   g de chlorhy- drate de kanamycine sous forme de poudre blanche.

   La puissance de la poudre est de 560   mcg/mg.   En appliquant le même   procéder   on obtient 2,205 g de chlorhydrate de   kanàriycine   blanc solide à par- tir des 115 ml du troisième éluat. La puissance est de 615 mcg/mg Par ce procédé, le pigment jaune est adsorbé par la colonne et on 
 EMI17.5 
 obtient le chlorhydrate de kanamycine sous forme de poudre in- colore. On élutrie le pigment jaune adsorbé par la colonne par une nouvelle élutriation par du méthanol aqueux à 505 et de l'eau distillée. 
 EMI17.6 
 



  EXE:'1PLE 8. - On dissout quatre ?:rê:.l"'leS de chlorhzrdrrte de kani-iyci-n,2 solide, ayant une puissance de 500 ::cg/:.g., dans 200 1a1 de métha- nol et, après évaporation 80 nl., On la fit passer 2 travers une ce" '"1.e contenant 5 g. de carbone actif et 25 g de poudre de 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 
 EMI18.1 
 cellulose. On développe la. colonne au moyen due ''10thano#,.. Le pre- mier élua.t de 50 n?1 ne contient pas- de kanamycine. On évapore le second éluat. (60 mil) pour obtenir 364 mag. de chlorhydrate de kana- mycine- La puissance de cette pondre est de 720 J11cg/mg.. Le troi- sième ëluat z6 ml) donne 381 mg de poudre de chlorhydrate de kana.-   mycine.   La puissance de cette poudre -est de 616 mcg/mg.

   A partir du quatrième éluat (55 ml), on obtient 1,873   mg.   de chlorhydrate de kanamycine blanc, ayant une puissance de   483     mcg/mg.   Le pre- 
 EMI18.2 
 mier éluat (55 ml) donne 956,6 mag sous fon-iie de poudre blanche ayant une puissance de   410   mcg/mg. Toutes les matières solides ainsi obtenues sont incolores. 
 EMI18.3 
 



  !L2.:.:¯¯- On soumet à une culture à secousses du S.kanffi1ycetiys . dans un milieu qui contient 10% d'a:nidor, 1,5,""J de farine de fè- ves de soya et 03% de NaCl, ayant un pH initial de 7,0, à 2$ C, pendant quatre 'jours. On combine les   bouillies   de culture dans 25 flacons, et on filtre. Le filtrat a un pH de 8,2 et contient 
 EMI18.4 
 400 ?n.cô/¯!1 d e kanamycine. On fait passer le filtrat de 3,100 ml â travers une colonne de résine   IRC-50.   La colonne renferme 100 ml de la résine sur cycle de sodium, au pH   8,0.   Après absorption, on lave la colonne par   500 .ml   d'eau, on élutrie -la kanamycine ad-   sorbée   par HCl 1N, et on fractionne le liquide sortant en frac- tions de 20 ml.  L'activité   est comprise dans les fractions quatre à neuf.

   On combine ces fractions et on règle ls pH à 6,0. On con- centre la solution à 12 ml par évaporation dans le vide, et on sépare les impuretés insolubles. On ajoute à la solution, une so- 
 EMI18.5 
 lution saturée de reineckate a9nQue- Le précipité apparaissant en premier lieu, est coloré en rose ; c1^ir, pèse 50 mag, contient de la kanamycine et est séparé. On ajoute de nouveau une solution ne reineckate ammonique à la solution surnageante,' jusqu'à ce OU ne se forme plus de   précipité.   On sépare le précipité rose, et on le sèche'pour obtenir 544 mg de reineckate de kanamycine. Envi- 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 ron 305 de l'activité restent dans le liquide qui surnage. On ajou- te ce précipité à 12   #il     d'eau   distilla on   chauffe :   60 C et on filtre.

   On refroidit le filtrat, et on sépare des cristaux de rein- eckate de kanamycine. On ajoute à la liqueur-mère le reineckate de 
 EMI19.1 
 kanamycine qui n'a pas été rec.i ssotzs, et après svoir chauffé de nouveau à 60 Cj et âpres refroidisse":er.t, on sépare une seconde portion de reineckate de kanamycine cristallin. On répète cette opération encore- trois fois. On sépare ainsi 300 mg de reineckate de kanamycine   cri stallin.     On   ajoute 140 mgn de ce   reineckate   cris- 
 EMI19.2 
 tallin à 105 m1. d'eau distillée, et on ajoute goutte-à-qoutte de l'acide chlorhydrique 2,5 N dans la pyridine   jusqu'à   ce qu'il ne se forme plus de précipité.

   On sépare ce   précipité   par   centrifu-   gation, on le sèche par congélation et on le   lave   à l'acétone. On 
 EMI19.3 
 obtient ainsi 60 mg de chlorhydrate de kanamycine sous forme oë solide blanc hydroscopique. 
 EMI19.4 
 



  EXE?:IPLE 10.- On dissout 10 g de chlorhydrate de kanamycine à .50 mcg/mg; obtenu par un procédé analogue à celui de l'exeoeple 5, dans un litre d'eau distillée, et on règle le pTi à 6,.... On l'2jout à. une colonne de 75 Bil de résine IRC-50 sous la for.,le sodium su pH 6,4 sous un débit de 10 1/su.n. Apres lavage de la colonne par 50 ml, d'eau, on élutri e la kanamycine adsorbée par du NH40H R 5 . 



  Le premier éluat (80   ml)   ne possède aucune activité, et l'é;uat 
 EMI19.5 
 suivant -(130 ni) contient la kanamycine. Le rh de cet éluat dé- passe 10,0. On l'évapore sous vide jusque. 22 yil 8 environ /-0C. 



  Le rendement dans cette solution conceiitrée, est de 978"'. On fait passer cette solution concentrée à travers une colonne de carbone contenant 20 g de carbone actif passant au   tais   de 100-250 mail- les. Le diamètre de la colonne est de 2 cu. On lave ensuite la co- lonne par 160 m1 d'eau distilla et on la développe par chroma- tographie par de l'acide sulfurique 0,5 N. On fractionne le li- 
 EMI19.6 
 quide obtenu en portions d'environ 20 rol. Le sulfate de kanamycine 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 apparaît à partir de la cinquième fraction. Les fractions 1 - 4 ont un pH de 6,2 - 6,4 et ne contiennent pas de kanamycine.

   On re trouve comme suit la plus grande partie de la kanamycine dans les fractions   5-8:   5 e fraction : pH   8,2,   22,0 ml., 16,9   mg/ml.;   6e fraction: pH 8.6, 23,0 ml, 65,3   mg/ml;   7e fraction: pH 8,6, 20,0 ml, 55,0 mg/ml; 8e fraction pH   4,6,   22,0 ml;   47,5     mg/ml;   9e frac- tion : pH 1,0,   22,0   ml, 4, 2 mg/mi. On   ajoute à   la 6e fraction 23,0 ml de méthanol, on précipite le sulfate de kanamycine cristallin, on le recueille et on le sèche. On obtient ainsi 1,39 g de sul- fate de kanamycine cristallin. On dissous 1,2 g de ce sulfate cris- tallin dans 8 ml   d'eau,   on le chauffe à 45 C et on ajoute 6,5 ml de méthanol en remuant 'et refroidissant.

   On précipite alors 1,07g de kanamycine sous forme cristalline. Au microscope, on observe des cristaux en paillettes incolores. Il ne fond pas en dessous de 250 C. 



  Résultats d'analyse: C ; 35,97, 35,98; H, 6,51, 6,56; N, 9,13,   8,92;   S,   3,47;   D23 =---- 121 C. 



   Si on le désire, à des fins particulières et en les ren- dant compatibles au point de vue pharmaceutique, on peut mélanger aux composés de la,présente invention d'autres médicaments tels que des   antihistaminicrues,   drogues sulfa., stimulants, anesthési- ques locaux,analgésiques, laxatifs, sédatifs, sels de pénicilline et-autres agents antibiotiques tels que la streptomycine, ou un antibiotique du genre de la tétracycline, des vitamines, hormones et agents antifongals. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, la kanamycine, caractérisé en ce qu'on cultive une souche de Streptomyces kanamyceticusnov. sp. dont les propriétés sont dé- crites ci-avant dans des conditions aérobiques dans un milieu nu- triti" convenable, jusau'à ce qu'une activité antibiotioue subs- <Desc/Clms Page number 21> EMI21.1 tantielle soit conférée au milieu, et on sépare r-Itntibï a-ti:ou-e de la bouillie de fomentation.

2.- Procédé suivant la revendication 1x caractérisé en ce qu'on effectue la culture sous conditions', submergées,; à uns EMI21.2 température comprise dans la gan-,-e- de 27 à 32-C pendant 3 à 5 jours..

3.- Procédé suivant les revendic'a fions:! et 2, caac- téris-é en ce que le milieu nutritif renferme' la- combinaison G"am4- don et de farine de fèves d'e soya.

4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient respectivement 2,0% d'amidon et 1,2% de farine de fèves de soya.

5. - Procédé suivant les revendications 1 à 4 caractéri- EMI21.3 sé en ce au'on sépare antibiotique de la bouillie de fermenta- tion par' extraction par le butanol en présence'd'un support tel que l'acide laurique ou l'acide stéarique.

6. - Procédé suivant les revendications 1 à 4, caracté- EMI21.4 risé en ce qu'on sépare 1.1,qntibiotique de la bouillie de fomenta- tion par adsorption sur une résine d'échange de- cations.

7. - Procédé suivant les revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que la résine d'échange de cation est du type acide carboxylique. EMI21.5

8.- Procédé suivant les revendications 6 à 7 cqr-2ctc-'ri sé en ce que la résine déchange de cations est un copolymère d' acide méthacrylique et de divinyl benzène.

9.- Matière antibiotique efficace pour l'inhibition de EMI21.6 croissance de bactéries à Gram positif, bactéries.à Gran négatif et mycobactéries choisies dans le groupe consistant en un composé basique apte à former des sels avec des acides, soluble dans 1' EMI21.7 eau et pratiquement.insoluble dans le n-butanol, l'ac4tate'd'éthy. le, l'acétate de butyle, l'éther, le chloroòrme et le benzène, ne présentant aucune absorption" à la lumière ultraviolette de 220 mill- crons à 400 millimicrons, donnant une réaction posi- <Desc/Clms Page number 22> tive au réactif ninhydrine dissous dans la pyridine et des réac- tions de Tollens, de Sakaguchi, de Fehling et de Elson-Morgan négatives;

sous forme de son hémisulfate purifié, contenant 35,9% de carbone, 6,5% d'hydrogène, 9.1% d'azote et 3,5% de soufre par analyse et 45,0% d'oxygène par différence, possédant un D23 de -- 1210 en solution à 1% dans l'eau, et présentant quand on le granule dans du bromure de potassium des bandes d'absorption caractéristiques dans la région infra-rouge du spectre, aux lon- gueurs d?onde suivantes, exprimées en microns: 2,85, 3,03, 3;20, 3,30, 3,43, 3,63, 3,70, 3,83, 4,70 (large) 6,05; 6,17,6,27, 6,60, 6,90, 7,15, 7,35, 7,52, 7,60, 7,95, 8,18, 8,76, 8,95, 9,08, 9,40, 9,70, 10,20, 10,48, 10,75, 11,13, 11,50, 11,90, 12,35, 12,80 et 13,15 et ses sels d'addition d'acide.

10. - Composé basique efficace pour L'inhibition de crois . sance de bactéries à Gram positif, bactéries à Gram néga.tif et my- cobactéries capables de former des sels avec des acides, soluble dans l'eau et pratiquement insoluble dans le n-butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther, le chloroforme et le ben- zéne, ne présentant aucune absorption à la lumière ultraviolette de 200 microns à 400 microns, donnant une réaction positive au réactif de ninhydrine dissous dans la pyridine, et des réactions de Tollens, Sakaguchi, Fehling et Elson-Morgan négatives, et con- tenant sous forme de son hémi-sulfate purifié 35,9% de carbone, 6,5% d'hydrogène, 9.1% d'azote et 3,5 % de soufre par analyse, et 45,0% d'oxygène par différence, possédant un D23 de ----- 1210 en solution à 1% dans l'eau,

et présentant lorsqu'on. le granule dans du bromure de potassium, des bandes d'absorption caractéris- tiques dans la région infra-rouge du spectre, aux longueurs d' onde suivantes exprimées en microns: 2,85, 3,03, 3,20, 3,30, 3,43 3,63, 3,70, 3,83, 4,70 (large), 6,05,6,17, 6,27, 6,60, 6,90, 7,15, 7,35, 7,52, 7,60, 7,95, 8,18, 8,76, 8,95, 9,08, 9,40, 9,70, 10,20, la,48, 10,75, 11,13, Il,50, 11,90, 12,35, 12,80 et 13,15.

11.- Sel d'addition d'acide du composé basique suivant la revendication 10.. <Desc/Clms Page number 23>

12. - Chlorhydrate du composé basique suivant la reven- dication 10.

13. - Sulfate du composé basique suivant la revendica- tion 10.

14.- Reineckate du composé basique suivant la revendi- cation 10.