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" Procédé pour la séparation de l'hormone folliculeuse de l'urine des individus en état de gestation".
On a constaté que l'on peut séparer à l'état d'esters et relativement pure l'hormone folliculeuse en partait comme matière première de l'urine d'@@ individus en état de gestation ou des préparations ou extraits que l'on en obtient par extrac- tion ou d'autrespréparations ou extraits, par exemple, qui proviennent du placenta ou d'autres organes, de matières végétales et analogues.
A cette fin, on soumet la matière première à un traite- ment préalable qui a pour but d'en éliminer les phénols vo- latils et les matières neutres qu'elle renferme. Ce traite- ment préalable consiste opportunément à soumettre l'urine ou
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les extraits renfermant l'hormone tout d'abord à une distilla- tion par la vapeur d'eau qui a pour effet d'éliminer les phénols ;ce et autres constituants volatils. Le reliquat de la distillation à la vapeur d'eau est ensuite soumis à ébullition avec une so- lution aqueuse d'alcalis ou est dissous dans un solvant organi- que non miscible avec l'eau. Puis la solution ainsi obtenue est extraite par une solution alcaline.
Par ces deux procédés, on réalise la séparation des constituants neutres de la matière première , tandis que l'hormone reste dans la solution, alcaline.
Après séparation des constituants non dissous, on transforme la solution alcaline par des agents axylants. Le produit de l'acy- lation est isolé et daine par saponification une hormone de valeur.
On peut remplacer la solution. alcaline par d'autres matiè- res à réaction alcaline, telles que par exemple des bases orga- niques, de la pyridine et analogues. Comme solvant non miscible à l'eau, on se sert d'éther, de benzol ou analogue. Quand on emploie l'urine comme matière première, on fait tout d'abord bouillir opportunément l'urine pendant un temps suffisant pour en expulser l'ammoniaque complètement ou pour la plus grande partie. Les constituants neutres séparés par traitement à l'al- cali peuvent être séparés de la solution alcaline par centrifu- gation, filtration, éventuellement En présence de kieselguhr ou de matières analogues ou de toute autre manière appropriée.
EXEMPLE I. On soumet à distillation par la vapeur 20 litres d'urine; le traitement se poursuit jusqa'à cessation de déga- gement de combinaisons volatiles. On rend le résidg alcalin et on le fait bouillir pendant quelques heures jusqu'à ce que l'ammoniaque soit éliminée pour la plus grande partie. ;Par cette opération, une partie de l'eau s'évapore. Après séparation par
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filtration des constituants insolubles, on ajoute du p-toluol- sulfochlorure de préférence dissous dans un peu d'acétone, en agi- tant énergiquement, à la solution concentrée et fortement alca- line et on continue à agiter pendant plusieurs heures à une tem- pérature d'environ 30 à 40 .
Au refroidissement, le produit dtacylation formé se sépare à l'état de masses graisseuses que l'en sépare par filtration. En saponifiant on obtient une hor- mone folliculeuse très active.
EXEMPLE 2.
On débarrasse par distillation par la vapeur 500 grammes d'un extrait obtenu de la façon usuelle à partir du placenta et ayant environ 50. 000 unités souris par gramme, de ses con- stitumts volatils. On fait bouillir le résidu en présence d'al- cali pendant quelques heures et ensuite on le filtre. A cette solution alcaline, on ajoute 250 grs de chlorure de benzoyle en agitant énergiquement. Le benzoate de l'hormone folliculeuse se sépare à l'état de graisse dans le liquide et peut être sé- paré par filtration éventuellement avec addition d'un peu de
Kieselguhr. On peut toutefois aussi traiter le mélange de la réaction par l'éther et le benzoate passe alors dans ce der- nier. Après évaporation de l'éther il reste un résidu rempli de cristaux.
EXEMPLE 3.
On soumet pendant une journée entière à la distillation par la vapeur 100 grs. d'extrait d'hormone folliculeuse à
35000 unités souris environ par gramme provenant de l'urine de jument en état de gestation. Le résidu de la distillation par la vapeur (envirm 80 grs.) est dissous dans 1,5 litre de solution de potasse à 5%,et ''si c'est nécessaire ,débarrassé de ses constituants neutres non dissous. A la solution alcaline obtenue , en ajoute environ 80 grs. de p-tuluolsulfochlorure dans
160 cm3 de benzol et l'on agite éner giquement le mélange pen-
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dant 6 à 8 heures. On extrait le mélange par l'éther,on traite la solution étherée par l'eau ,on sèche et on évapore l'éther.
Le résidu ainsi obtenu est porté à ébullition pendant 3 à 4 @ heures avec 1,5 litre de solution méthanolique de potasse à
5%. Ensuite dilué par une grande quantité d'eau ; en y ajoute du sel de cuisine, puis on l'extrait à nouveau par l'éther. L'ex- trait éthéré est lavé successivement par l'eau, l'acide chlorhy- drique dilué et à nouveau par l'eau et extrait plusieurs fois par une solution aqueuse de potasse à 5% jusque ce @ qu'il ne se produise plus de précipitations quand on acidifie le pro- duit du dernier extrait alcalin.On réunit les extraits alcalins ou on les travaille séparément.
Par acidification de ceux-ci, on obtient les cristaux plus ou moins bruns de l'hormone folli- culeuse qui quand la distillation par la vapeur de l'extrait aqueux n'a pas duré suffisamment, contient encore des constituants huileux. Le rendement en produit cristallisé atteint environ 70 à 80% rapportés aux unités souris de la matière de départ.
L'hormone cristallisée obtenue renfermer à 4 millions d'unités sourispar gramm e.
REVELIDICATIONS.
1. Procédé pour la séparation de l'hormone folliculeuse de l'urine des individus en état de gestation ou d'extraits qui en proviennent ou qui dérivent d'autres matières premières telles que placenta et autres organes, matières végétales ou analogues, caractérisé par le fait que l'on transforme le liquide hormo- nique après une préparation appropriée en solutions alcalines, qu'on le traite par des agents acylants et que l'on sépare les produits d'acylation obtenus que l'on saponifie ensuite le cas échéant.
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"Method for the separation of follicle hormone from the urine of pregnant individuals".
It has been found that the follicle hormone can be separated as esters and relatively pure from it as raw material from the urine of pregnant individuals or from preparations or extracts which are obtained. obtained by extraction or other preparations or extracts, for example, which are obtained from the placenta or other organs, from plant materials and the like.
To this end, the raw material is subjected to a preliminary treatment with the aim of eliminating therefrom the volatile phenols and the neutral materials which it contains. This pre-treatment conveniently consists of submitting the urine or
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the extracts containing the hormone first of all to a distillation by the water vapor which has the effect of eliminating the phenols, this and other volatile constituents. The remainder of the steam distillation is then boiled with an aqueous alkali solution or is dissolved in an organic solvent immiscible with water. Then the solution thus obtained is extracted with an alkaline solution.
By these two processes, the separation of the neutral constituents of the raw material is achieved, while the hormone remains in the solution, alkaline.
After separation of the undissolved constituents, the alkaline solution is converted with axylating agents. The acylation product is isolated and made by saponification a valuable hormone.
We can replace the solution. alkaline by other alkaline reacting materials, such as, for example, organic bases, pyridine and the like. As the water-immiscible solvent, ether, benzol or the like is used. When urine is used as a raw material, the urine is first conveniently boiled for a time sufficient to expel the ammonia completely or for the most part. The neutral constituents separated by treatment with alkali can be separated from the alkaline solution by centrifugation, filtration, optionally in the presence of kieselguhr or the like or in any other suitable manner.
EXAMPLE I. 20 liters of urine are subjected to steam distillation; the treatment is continued until the evolution of volatile combinations ceases. The residue is made alkaline and boiled for a few hours until most of the ammonia is removed. By this operation, part of the water evaporates. After separation by
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filtration of the insoluble constituents, p-toluol-sulfochloride, preferably dissolved in a little acetone, is added, with vigorous stirring, to the concentrated and strongly alkaline solution and stirring is continued for several hours at a temperature. temperature about 30 to 40.
On cooling, the dtacylation product formed separates out in the form of fatty masses which are separated therefrom by filtration. By saponifying we obtain a very active follicle hormone.
EXAMPLE 2.
500 grams of an extract obtained in the usual manner from the placenta and having about 50,000 mouse units per gram are freed by steam distillation of its volatile constituents. The residue is boiled in the presence of alkali for a few hours and then filtered. To this alkaline solution, 250 g of benzoyl chloride are added with vigorous stirring. The follicle hormone benzoate separates as fat in the liquid and can be separated by filtration if necessary with the addition of a little
Kieselguhr. However, it is also possible to treat the reaction mixture with ether and the benzoate then passes into the latter. After evaporation of the ether, a residue filled with crystals remains.
EXAMPLE 3.
100 grams are subjected to steam distillation for a whole day. follicle hormone extract
Approximately 35,000 mouse units per gram from the urine of a pregnant mare. The residue from the steam distillation (approx. 80 grs.) Is dissolved in 1.5 liters of 5% potassium hydroxide solution, and '' if necessary, freed of its undissolved neutral constituents. To the alkaline solution obtained, add about 80 grs. p-tuluolsulfochloride in
160 cm3 of benzol and the mixture is stirred vigorously.
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for 6 to 8 hours. The mixture is extracted with ether, the ethereal solution is treated with water, dried and the ether evaporated.
The residue thus obtained is brought to the boil for 3 to 4 hours with 1.5 liters of methanolic solution of potassium hydroxide at
5%. Then diluted with a large quantity of water; add cooking salt to it, then extract it again with ether. The ethereal extract is washed successively with water, dilute hydrochloric acid and again with water and extracted several times with a 5% aqueous solution of potassium hydroxide until this occurs. more precipitation when the product of the last alkaline extract is acidified. The alkaline extracts are combined or worked separately.
By acidification of these, more or less brown crystals of the follicle hormone are obtained which, when the steam distillation of the aqueous extract has not lasted sufficiently, still contains oily constituents. The yield of crystalline product is about 70-80% based on mouse units of the starting material.
The crystallized hormone obtained contains 4 million mouse units per gram.
REVELIDICATIONS.
1. Process for the separation of follicle hormone from the urine of pregnant individuals or extracts derived therefrom or derived from other raw materials such as placenta and other organs, plant materials or the like, characterized by the fact that the hormonal liquid is converted after suitable preparation into alkaline solutions, that it is treated with acylating agents and that the acylation products obtained are separated and then saponified if necessary .