La présente invention a pour objet un procédé de préparation du monoacétate de l'hydroxy-25 cholestérol, caractérisé en ce qu'on extrait, à partir de végétaux choisis parmi les Phanérogames une huile, on saponifie ladite huile, on isole l'insaponifiable d'où l'on sépare un mélange de phytostérols qui est, directement ou après transformation en monoacétate par acétylation, soumis à une réaction d'oxymercuration-démercuration comprenant une réaction avec l'acétate mercurique dans le tétrahydrofuranne, suivie d'une réduction par du borohydrure de sodium conduisant à une hydratation sélective de la double liaison 24 et on sépare du mélange réactionnel le monoacétate de l'hydroxy-25 cholestérol.
Parmi les plantes de l'embranchement des Phanérogames, on peut citer la famille des Apocynacées, où l'on choisit, par exemple, les genres Funturnia, Hoierdiena et autres. Le présent procédé. peut être réalisé notamment à partir de graines de Funtumia elastica, quoique des résultats analogues aient été obtenus avec d'autres parties de la plante.
L'invention a également pour objet l'utilisation du monoacétate de l'hydroxy-25 cholestérol ainsi obtenu pour la préparation d'acétate de desmostérol. Cette utilisation est caractérisée en ce que l'on déshydrate le monoacétate de l'hydroxy-25 cholestérol pour obtenir l'acétate de desmostérol.
On sait que le desmostérol joue un rôle important dans la biosynthèse du cholestérol chez les animaux comme intermédiaire labile (W.M. Stokes, W.A. Fish & F.C. Hickel, J. Biol. Chem. , 1956, 220, 415; W.M. Stokes et coll., ibid., 1958, 232, 347; J.
Avigan et coll., J. Biol. Chem. , 1960, 235, 3123). Ces auteurs en ont isolé des quantités minimes de l'embryon de poussin, de la peau de rat, du sérum, du foie et d'autres tissus animaux.
Le desmostérol a été également isolé de certains mollusques marins (Fagerlund & Idler, J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 6473) et plus récemment d'algues rouges (Gibbons, Goad & BR<
Goodwin, Phytochemistry , 1967, 6, 677; D.R. Idler, A. Saito & BR< P. Wiseman, Steroids , 1968, II, 465).
On sait que la synthèse partielle du desmostérol a été réalisée (Fagerlund & Idler, loc. cit.; Bergmann & Dusza, J. Org.
Chem. , 1958, 23, 459), ce produit présentant l'inconvénient d'être d'un prix très élevé, faute de matière première abondante et relativement bon marché.
Outre l'intérêt intrinsèque du desmostérol, ce produit peut également être envisagé comme matière première intéressante pour la synthèse partielle de certains stéroïdes physiologiquement actifs dont certains ont acquis une grande importance ces dernières années (hormones du type ecdysone; hydroxy-25 vitamine D3 ou 25 H.C.C., etc.).
En effet, contrairement au cholestérol, matière première habituelle pour la synthèse de certains stéroïdes, par exemple celle de la vitamine D3, le desmostérol possède une chaîne latérale déjà fonctionnalisée (A24).
Si l'on prend l'exemple de la synthèse de l'hydroxy-25, vitamine D3 ou 25 H.C.C., forme biologiquement active de la vitamine D3 et substance dont l'activité antirachitique est la plus puissante actuellement (J.A. Campbell, D.M. Squires & J.C.
Babcock, Steroids , 1969, 13, 567), il est difficile d'envisager cette synthèse à partir du cholestérol. Par contre, le desmostérol paraît être une matière première de choix. En effet, la synthèse du A7 desmostérol est connue (T.J. Scallen, Research Communications , 1965, 21, 89) et les réactions ultérieures sont également connues dans la série du A7 cholestérol et de l'ergostérol.
La stabilité de l'hydroxy-25 cholestérol est une propriété particulièrement intéressante. On sait en effet, d'une part, que le desmostérol, même conservé dans l'obscurité, se détériore au bout de quelques mois (M.J. Thompson, J.N. Kaplanis & H.E. Vroma, Steroids , 1965, 551). D'autre part, l'hydroxy-25 cholestérol et ses dérivés constituent une matière première utilisée dans la synthèse du 25 H.C.C. (J.W. Blunt & H.F. De Luca, Biochemistry , 1969, 8, 671-675), mais il y a lieu de remarquer que
I'hydroxy-25 cholestérol est d'un prix très élevé ( Steraloids ,
Inc., New York).
Les graines de Funtumia elastica sont cueillies, de préférence, à parfaite maturité. Elles sont séchées, broyées et traitées dans un milieu neutre pour en extraire par un solvant une substance huileuse, laquelle est saponifiée par la soude ou la potasse.
Ensuite, le mélange saponifié est dilué sous agitation avec de l'eau distillée. Puis on acidifie jusqu'à pH = 8 environ par de l'acide chlorhydrique à 20% et l'on verse la solution obtenue dans une ampoule à décanter contenant de l'éther éthylique. Puis on procède à une agitation suivie d'une période de repos pour la décantation. On sépare la couche organique et l'on extrait la couche aqueuse à l'éther éthylique par trois nouvelles opérations semblables à la précédente. Les différents extraits éthérés rassemblés sont lavés à l'eau distillée puis séchés sur du sulfate de sodium anhydre. On filtre la solution éthérée puis on l'évapore dans un évaporateur rotatif. Le résidu constitue l'insaponîfiable total qui est composé de cycloarténol, de nor-31 lanostérol, de déhydro-24 lophénol et d'autres phystostérols.
Le mélange saponifié peut également être extrait en continu, après acidification, dans un appareil à extraction liquide-liquide à flux ascendant, par l'éther éthylique, l'éther de pétrole ou l'hexane.
L'insaponifiable total est ensuite chromatographié sur alumine. On sépare successivement le cycloarténol, le mélange de déhydro-24 lophénol et de nor-31 lanostérol, puis le mélange de phytostérols contenant principalement le desmostérol.
Le procédé décrit peut être mis en oeuvre par l'application de l'une des variantes suivantes, données à titre d'exemple:
Variante A. - Le mélange de phytostérols est acétylé et les acétates obtenus sont chromatographiés sur une colonne de silice imprégnée de nitrate ou sont soumis à un procédé de séparation usuel. Cette opération est cependant longue et coûteuse. Elle peut être remplacée par la variante B décrite ci-après.
On réalise ainsi un dégrossissement du mélange par séparation des composants en deux catégories, à savoir: les composés à une double liaison, qui sont élués les premiers et les composés à deux doubles liaisons, dont le desmostérol sous forme d'acétate, qui sont élués ensuite. Cette dernière catégorie de composés contient déjà une très forte proportion de desmostérol sous forme d'acétate.
Ce mélange d'acétates en solution dans le tétrahydrofuranne est traité par l'acétate mercurique et le mélange réactionnel est ensuite réduit par le borohydrure de sodium suivant la réaction d'oxymercuration-démercuration.
Le traitement à l'acétate mercurique dans le tétrahydrofuranne aqueux constitue une méthode d'oxymercuration des doubles liaisons carbone-carbone, tandis que la réduction du mélange réactionnel par le borohydrure de sodium dans la soude est une réaction de démercuration.
Ces deux réactions - oxymercuration puis démercuration constituent une méthode d'hydratation selon la règle de Markovnirov des doubles liaisons carbone-carbone, méthode développée par H.C. Brown et Ph. Georghean Jr. ( J. Amer. Chem. Soc. ,
1967, 89, p. 1522 et J. Org. Chem. , 1970, 35, p. 1844).
Dans le cas du desmostérol (ou de son acétate), qui possède deux doubles liaisons (A5,24), cette méthode est très sélective: seule la double liaison A24 est hydratée.
Ces réactions peuvent être interprétées de la manière suivante:
1) Oxymercuration: L'action de l'acétate mercurique sur le
desmostérol (ou son acétate) dans le tétrahydrofuranne aqueux conduit à un composé oxymercurique:
EMI1.1
<tb> <SEP> M <SEP> 7 <SEP> Hg(OAc)2
<tb> OAc <SEP> T.H.F./eau
<tb>
EMI2.1
desmostérol (acétate)
2) Démercuration: La réduction par le borohydrure de sodium dans la soude du mélange réactionnel aboutit à la démercuration du composé oxymercurique:
EMI2.2
Après extraction des produits organiques, on obtient un mélange de produits qui est soumis à une chromatographie sur colonne d'adsorbant, par exemple de la silice ou autre produit semblable.
Cette opération peut être remplacée par la variante C décrite ciaprès.
Les produits qui n'ont pas réagi sont d'abord élués, ce qui permet d'obtenir l'hydroxy-25 cholestérol sous forme de monoacétate.
La saponification de ce dernier conduit à l'hydroxy-25 cholestérol. Le desmostérol est obtenu sous forme d'acétate par déshydratation du monoacétate de 1'hydroxy-25 cholestérol. On le purifie par cristallisation dans l'acétone.
La saponification de l'acétate de desmostéryle conduit au desmostérol.
Variante B. On soumet directement le mélange de phytosté rols provenant de la première chromatographie aux opérations suivantes qui ont pour but d'obtenir l'hydroxy-25 cholestérol: le mélange de phytostérols est mis en solution dans le tétrahydrofuranne. La solution obtenue est agitée en y ajoutant un léger excès d'acétate mercurique tel qu'expliqué précédemment.
L'avancement de la réaction est contrôlé par des chromatographies périodiques sur une couche mince de silice. Quand la réaction est terminée, on réduit le mélange réactionnel par le borohydrure de sodium tel qu'expliqué précédemment. La couche organique est ensuite séparée, séchée et évaporée. Le résidu est repris par le benzène et chromatographié sur une colonne d'adsorbant, par exemple de la silice ou un autre corps semblable.
La chromatographie peut être remplacée, comme mentionné antérieurement, par la variante C décrite ci-après. On élue la colonne par des mélanges de benzène et d'acétate d'éthyle. L'hydroxy-25 cholestérol est élué en dernier lieu. Sa déshydratation conduit au desmostérol.
Variante C. La chromatographie sur colonne de silice est supprimée et remplacée par les opérations suivantes: le mélange réactionnel provenant du traitement des phytostérols par l'acétate mercurique dans le tétrahydrofuranne suivi d'une réduction par le borohydrure de sodium, après extraction et évaporation du solvant, est repris, à chaud, par le benzène jusqu'à dissolution complète puis on laisse refroidir la solution à la température ambiante. L'hydroxy-25 cholestérol cristallise. On le filtre. Les eaux mères benzéniques sont évaporées sous pression réduite et le résidu est dissous à chaud dans le méthanol. Au refroidissement,
les phytostérols qui n'ont pas réagi ainsi que d'autres produits
cristallisent. On le filtre. Les eaux mères méthanoliques sont
évaporées sous pression réduite et le résidu est dissous à chaud
dans le benzène.
Au refroidissement, une nouvelle quantité d'hy
droxy-25 cholestérol cristallise.
Ces opérations suffisent, en général, à séparer la presque
totalité de l'hydroxy-25 cholestérol du mélange réactionnel. Il est
à remarquer qu'on peut faire appel à la chromatographie des
variantes A ou B pour récupérer le reste de l'hydroxy-25 cholesté
rol des eaux mères.
La déshydratation de l'hydroxy-25 cholestérol conduit au
desmostérol.
The present invention relates to a process for preparing the monoacetate of hydroxy-cholesterol, characterized in that an oil is extracted from plants chosen from phanerogams, said oil is saponified, the unsaponifiable is isolated from 'where a mixture of phytosterols is separated which is, directly or after transformation into monoacetate by acetylation, subjected to an oxymercuration-demercuration reaction comprising a reaction with mercuric acetate in tetrahydrofuran, followed by reduction with sodium borohydride leading to selective hydration of double bond 24 and the hydroxy-cholesterol monoacetate is separated from the reaction mixture.
Among the plants of the branch of Phanerogams, mention may be made of the family of Apocynaceae, where the genera Funturnia, Hoierdiena and others are chosen, for example. The present process. can be achieved in particular from seeds of Funtumia elastica, although similar results have been obtained with other parts of the plant.
A subject of the invention is also the use of the hydroxy-cholesterol monoacetate thus obtained for the preparation of desmosterol acetate. This use is characterized in that the hydroxy-cholesterol monoacetate is dehydrated to obtain desmosterol acetate.
Desmosterol is known to play an important role in the biosynthesis of cholesterol in animals as a labile intermediate (WM Stokes, WA Fish & FC Hickel, J. Biol. Chem., 1956, 220, 415; WM Stokes et al., Ibid. ., 1958, 232, 347; J.
Avigan et al., J. Biol. Chem. , 1960, 235, 3123). These authors isolated minimal amounts from chick embryos, rat skin, serum, liver and other animal tissues.
Desmosterol has also been isolated from certain marine molluscs (Fagerlund & Idler, J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 6473) and more recently from red algae (Gibbons, Goad & BR <
Goodwin, Phytochemistry, 1967, 6, 677; D.R. Idler, A. Saito & BR <P. Wiseman, Steroids, 1968, II, 465).
It is known that the partial synthesis of desmosterol has been carried out (Fagerlund & Idler, loc. Cit .; Bergmann & Dusza, J. Org.
Chem. , 1958, 23, 459), this product having the disadvantage of being of a very high price, for lack of abundant and relatively cheap raw material.
In addition to the intrinsic interest of desmosterol, this product can also be considered as an interesting raw material for the partial synthesis of certain physiologically active steroids, some of which have acquired great importance in recent years (hormones of the ecdysone type; hydroxy-25 vitamin D3 or 25 HCC, etc.).
Indeed, unlike cholesterol, the usual raw material for the synthesis of certain steroids, for example that of vitamin D3, desmosterol has an already functionalized side chain (A24).
If we take the example of the synthesis of hydroxy-25, vitamin D3 or 25 HCC, a biologically active form of vitamin D3 and a substance whose antirachitic activity is currently the most potent (JA Campbell, DM Squires & JC
Babcock, Steroids, 1969, 13, 567), it is difficult to envisage this synthesis from cholesterol. On the other hand, desmosterol appears to be a raw material of choice. Indeed, the synthesis of A7 desmosterol is known (T.J. Scallen, Research Communications, 1965, 21, 89) and the subsequent reactions are also known in the series of A7 cholesterol and ergosterol.
Of particular interest is the stability of hydroxy cholesterol. It is in fact known, on the one hand, that desmosterol, even stored in the dark, deteriorates after a few months (M.J. Thompson, J.N. Kaplanis & H.E. Vroma, Steroids, 1965, 551). On the other hand, 25-hydroxycholesterol and its derivatives constitute a raw material used in the synthesis of 25 H.C.C. (J.W. Blunt & H.F. De Luca, Biochemistry, 1969, 8, 671-675), but it should be noted that
25-hydroxy cholesterol is very expensive (Steraloids,
Inc., New York).
The seeds of Funtumia elastica are preferably picked at perfect maturity. They are dried, crushed and treated in a neutral medium to extract an oily substance with a solvent, which is saponified by soda or potash.
Then, the saponified mixture is diluted with stirring with distilled water. Then acidified to pH = 8 approximately with 20% hydrochloric acid and the solution obtained is poured into a separating funnel containing ethyl ether. Then stirring is carried out followed by a period of rest for decantation. The organic layer is separated and the aqueous layer is extracted with ethyl ether by three new operations similar to the previous one. The various combined ethereal extracts are washed with distilled water and then dried over anhydrous sodium sulfate. The ethereal solution is filtered and then evaporated in a rotary evaporator. The residue constitutes the total unsaponifiable which is composed of cycloartenol, nor-31 lanosterol, dehydro-24 lophenol and other phystosterols.
The saponified mixture can also be extracted continuously, after acidification, in an apparatus for liquid-liquid extraction with ascending flow, with ethyl ether, petroleum ether or hexane.
The total unsaponifiable matter is then chromatographed on alumina. The cycloartenol, the mixture of dehydro-24 lophenol and nor-31 lanosterol, then the mixture of phytosterols mainly containing desmosterol are separated successively.
The method described can be implemented by applying one of the following variants, given by way of example:
Variant A. - The mixture of phytosterols is acetylated and the acetates obtained are chromatographed on a silica column impregnated with nitrate or are subjected to a usual separation process. This operation is however long and expensive. It can be replaced by variant B described below.
A roughening of the mixture is thus carried out by separating the components into two categories, namely: compounds with a double bond, which are eluted first and compounds with two double bonds, including desmosterol in the form of acetate, which are eluted. then. This last category of compounds already contains a very high proportion of desmosterol in the form of acetate.
This mixture of acetates in solution in tetrahydrofuran is treated with mercuric acetate and the reaction mixture is then reduced with sodium borohydride following the oxymercuration-demercuration reaction.
Treatment with mercuric acetate in aqueous tetrahydrofuran constitutes a method of oxymercuration of carbon-carbon double bonds, while reduction of the reaction mixture with sodium borohydride in sodium hydroxide is a demercuration reaction.
These two reactions - oxymercuration then demercuration constitute a hydration method according to the Markovnirov rule of carbon-carbon double bonds, a method developed by H.C. Brown and Ph. Georghean Jr. (J. Amer. Chem. Soc.,
1967, 89, p. 1522 and J. Org. Chem. , 1970, 35, p. 1844).
In the case of desmosterol (or its acetate), which has two double bonds (A5,24), this method is very selective: only the A24 double bond is hydrated.
These reactions can be interpreted as follows:
1) Oxymercuration: The action of mercuric acetate on the
desmosterol (or its acetate) in aqueous tetrahydrofuran leads to an oxymercuric compound:
EMI1.1
<tb> <SEP> M <SEP> 7 <SEP> Hg (OAc) 2
<tb> OAc <SEP> T.H.F./water
<tb>
EMI2.1
desmosterol (acetate)
2) Demercuration: The reduction with sodium borohydride in sodium hydroxide of the reaction mixture leads to the demercuration of the oxymercuric compound:
EMI2.2
After extraction of the organic products, a mixture of products is obtained which is subjected to column chromatography on an adsorbent, for example silica or other similar product.
This operation can be replaced by variant C described below.
The unreacted products are first eluted, which makes it possible to obtain the hydroxy-cholesterol in the form of monoacetate.
Saponification of the latter leads to hydroxy-25 cholesterol. Desmosterol is obtained as acetate by dehydration of hydroxycholesterol monoacetate. It is purified by crystallization from acetone.
The saponification of desmosteryl acetate leads to desmosterol.
Variant B. The mixture of phytosterols originating from the first chromatography is directly subjected to the following operations, the aim of which is to obtain hydroxy-cholesterol: the mixture of phytosterols is dissolved in tetrahydrofuran. The solution obtained is stirred by adding thereto a slight excess of mercuric acetate as explained above.
The progress of the reaction is monitored by periodic chromatography on a thin layer of silica. When the reaction is complete, the reaction mixture is reduced with sodium borohydride as explained previously. The organic layer is then separated, dried and evaporated. The residue is taken up in benzene and chromatographed on an adsorbent column, for example silica or another similar substance.
Chromatography can be replaced, as mentioned previously, by variant C described below. The column is eluted with mixtures of benzene and ethyl acetate. The 25-hydroxy cholesterol elutes last. Its dehydration leads to desmosterol.
Variant C. Chromatography on a silica column is deleted and replaced by the following operations: the reaction mixture resulting from the treatment of phytosterols with mercuric acetate in tetrahydrofuran followed by reduction with sodium borohydride, after extraction and evaporation of the solvent, is taken up, hot, in benzene until complete dissolution and then the solution is allowed to cool to room temperature. The 25-hydroxy cholesterol crystallizes. We filter it. The benzene mother liquors are evaporated off under reduced pressure and the residue is dissolved hot in methanol. On cooling,
phytosterols that have not reacted as well as other products
crystallize. We filter it. Methanolic mother liquors are
evaporated under reduced pressure and the residue is dissolved hot
in benzene.
On cooling, a further quantity of hy
droxy-25 cholesterol crystallizes.
These operations are generally sufficient to separate the almost
all of the hydroxy cholesterol in the reaction mixture. It is
note that one can use the chromatography of
variants A or B to recover the rest of the 25-hydroxy cholesterol
rol of mother liquors.
Dehydration of 25-hydroxy cholesterol leads to
desmosterol.