BE1028852A1

BE1028852A1 - PRODROGUE DU 5α-hydroxy-6β-[2-(1H-imidazol-4-yl) éthylamino]cholestan-3β-ol ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LE COMPRENANT POUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DU CANCER

Info

Publication number: BE1028852A1
Application number: BE20205878A
Authority: BE
Inventors: Stéphane Silvente; Hélène Michaux; Dario Mosca; Arnaud Rives; Quentin Marlier; Nicolas Caron
Original assignee: Dendrogenix
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-06-28
Also published as: US20240002429A1; BE1028852B1; JP2024503572A; AU2021391628A9; KR20230114274A; AU2021391628A1; CN116615202A; EP4255441A1; CA3200327A1; WO2022117824A1; CN116546988A

Abstract

L’invention concerne un nouveau composé de formule générale (I) : et/ou un sel pharmaceutiquement acceptable d’un tel composé, une composition pharmaceutique comprenant au moins ledit composé, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

Description

PRODROGUE DU 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4- yl)éthylamino]cholestan-3B-oi ET COMPOSITIONS

PHARMACEUTIQUES LE COMPRENANT POUR UTILISATION DANS

LE TRAITEMENT DU CANCER Domaine technique

[1] L'invention se rapporte au domaine des composés stérols et plus particulièrement à des prodrogues du composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol et compositions pharmaceutiques le comprenant pour utilisation notamment dans le traitement du cancer. Arrière-plan technologique

[2] Le terme « cancer » ou «tumeur cancéreuse » englobe un groupe de maladies se caractérisant par la multiplication et la propagation anarchiques de cellules anormales. Si les cellules cancéreuses ne sont pas éliminées, l’évolution de la maladie va mener plus ou moins rapidement au décès de la personne touchée.

[3] La prise en charge du cancer implique la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, qui peuvent être utilisées seules ou en association, simultanément ou séquentiellement. La chimiothérapie utilise des agents antinéoplasiques qui sont des médicaments qui empêchent ou inhibent la maturation et la prolifération des néoplasmes. Les agents antinéoplasiques agissent en ciblant efficacement les cellules à division rapide. Comme les agents antinéoplasiques affectent la division cellulaire, les tumeurs avec un fort taux de croissance (telles que la leucémie myéloïde aiguë et les l\ymphomes agressifs, y compris la maladie de Hodgkin) sont plus sensibles à la chimiothérapie, car une plus grande proportion des cellules ciblées subit une division cellulaire à tout moment. Les tumeurs malignes avec des taux de croissance plus lents, comme les lymphomes indolents, ont tendance à répondre beaucoup plus modestement à la chimiothérapie. Cependant, le développement de la chimiorésistance est un problème persistant pendant le traitement de chimiothérapie. Par exemple, le traitement conventionnel de la leucémie myéloïde aiguë (LMA) comprend l'administration combinée de cytarabine avec une anthracycline, telle que la daunorubicine. Le taux de survie globale à 5 ans est de 40% chez les jeunes adultes et d'environ 10 % chez les patients âgés. Les taux de réponse varient considérablement avec le vieillissement, de 40 % à 55 % chez les patients de plus de 60 ans et de 24 % à 33 % chez les patients de plus de 70 ans. Ceci est encore pire pour les personnes âgées avec des profils cytogénétiques défavorables et le décès dans les 30 jours suivant le traitement varie de 10% à 50% avec l'âge et l'aggravation. Par ailleurs, la restriction de l'utilisation de ces molécules est due également à des effets secondaires, et en particulier à l'émergence d'une toxicité cardiaque chronique (liée aux anthracyclines). Le taux de mortalité toxique liée à la chimiothérapie intensive est de 10 % à 20 % chez les patients de plus de 60 ans.

[4] Avec ce profil risque-bénéfice du régime conventionnel, seulement 30% des personnes âgées avec une LMA nouvellement diagnostiquée reçoivent une chimiothérapie antinéoplasique.

[5] Au cours des dernières décennies, il n'y a eu qu'une amélioration modeste des résultats pour les patients plus jeunes atteints de LMA, mais aucune pour les adultes de plus de 60 ans (la plupart des patients atteints de LMA).

[6] Il existe donc un réel besoin de développer des molécules utiles dans le traitement de ces tumeurs cancéreuses qui présentent des problèmes de chimiorésistance et de toxicité intrinsèque des médicaments antinéoplasiques. Les données précitées soulignent la nécessité de trouver de nouvelles approches qui combinent à la fois de réduire les schémas posologiques d'agents antinéoplasiques pour traiter les tumeurs chimiosensibles et de contourner la résistance des tumeurs chimiorésistantes à l'agent antinéoplasique.

[7] On connaît du document EP3272350B1 le composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol, connu sous le nom de Dendrogénine A, utile pour le traitement des tumeurs chimiorésistantes. La Dendrogénine A est capable de restaurer la sensibilité des tumeurs chimiorésistantes à un agent antinéoplasique ou d'augmenter les effets des agents antinéoplasiques sur les tumeurs, ce qui permet à son tour de réduire la dose cytotoxique efficace d'agents antinéoplasiques contre les tumeurs chimiosensibles.

[8] Un objet de la présente invention est de fournir de nouveaux composés et prodrogues du composé Dendrogénine A, utiles pour notamment traiter les tumeurs cancéreuses, les tumeurs chimiosensibles et/ou chimiorésistantes.

[9] De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des prodrogues spécifiques en C3 du composé Dendrogénine A, présentent une activité pharmacologique comparable ou supérieure à la Dendrogénine A, notamment avec une bonne biodisponibilité ainsi qu’un effet thérapeutique prolongé dans l’organisme du patient.

Résumé

[10] L'invention a pour premier objet un composé de formule (I) ; ‚ OSE

HN N 7 =

H ou un sel pharmaceutiquement acceptable d’un tel composé, dans lequel R1 est choisi parmi : - une chaîne carbonée en C1 à C20 , - un groupement - P(O)(OR2)(OR:3), - un groupement - C(O)NRa4R:s, où Ra, R3, R4 et Rs sont équivalents ou différents et sont H ou une chaîne carbonée en C1 à C20 : - un groupement - C(O)Rs , - un groupement - C(O)OR7, où Rs et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20 ; - un groupement - C(O)CHNH:Rs où Rs est la chaîne latérale des acides aminés essentiels et est choisi parmi H, CHs3, CH2CH(CH:s)2, -CH(CH3)CH2CH3, -(CH2)s, - CH(CHz)a, -CH2CsHs, -CH2-C3N2Hs, -CH2CsNHes, -(CHz)sNHC(NH)NHz, -(CHz2)4NHz, -CH2C(O)NHz, -(CH2)2C(O)NH2, -CH2C(O)OH, -(CH2)2C(O)OH, -CH2CsOHs, - CH2OH ; -CH(OH)CH: ; -CH2SH ; -(CH2)2SCH, et lorsque R+, Ra, Rs, Ra, Rs, Re et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20, elle peut être indépendamment saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée et contient éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle et aryle, ledit groupe aryle contenant éventuellement des hétéroatomes choisis parmi N, O, et S, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

N | BE2020/5878

[11] L'invention a pour second objet une composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un composé de formule (I) pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère. Définitions

[12] Dans cette description, à moins qu’il n’en soit spécifié autrement, il est entendu que, lorsqu'un intervalle est donné, il inclut les bornes supérieures et inférieures dudit intervalle.

[13] Dans le présent texte, les termes suivants, sauf indication contraire, doivent être compris comme ayant la signification suivante :

[14] Leterme « solvate » est utilisé ici pour décrire un complexe moléculaire comprenant un composé de l'invention et contenant des quantités stoechiométriques ou sous- stœchiométriques d’une ou plusieurs molécules de solvant pharmaceutiquement acceptable telles que l’éthanol. Le terme « hydrate » fait référence lorsque ledit solvant est de l’eau.

[15] Le terme «humain » fait référence à un sujet des deux sexes et à tout stade de développement (c'est-à-dire un nouveau-né, nourrisson, juvénile, adolescent, adulte).

[16] Le terme « patient » fait référence à un animal à sang chaud, plus préférablement un humain, qui attend la réception ou qui reçoit des soins médicaux et/ou qui sera l’objet d’un acte médical.

[17] Par « pharmaceutiquement acceptable » il est entendu que les ingrédients d’un produit pharmaceutiquement acceptable sont compatibles les uns avec les autres et ne sont pas nuisibles pour le patient de ce produit.

[18] Le terme « véhicule pharmaceutique » tel qu’utilisé dans ce texte signifie un support ou un milieu inerte utilisé comme solvant ou diluant dans lequel l’agent pharmaceutiquement actif est formulé et / ou administré. Des exemples non limitatifs de véhicules pharmaceutique comprennent les crèmes, les gels, les lotions, les solutions et les liposomes.

[19] Le terme « administration », signifie délivrer, l’agent actif ou l’ingrédient actif (par exemple le composé de formule (I)), dans une composition pharmaceutiquement acceptable, au patient dans lequel une condition, un symptôme et/ou une maladie doit être traitée.

[20] Les termes «traiter » et « traitement » tels qu’utilisés ici incluent atténuer, apaiser, stopper, soigner une condition, un symptôme et/ou une maladie.

[21] Le terme « prodrogue » ou « promédicament » tels qu’utilisés dans la présente description désigne les dérivés pharmacologiquement acceptables des composés de formule (|), qui peuvent être administré à un patient sans toxicité excessive, irritation, réaction allergique, etc., qui sont convertibles in vivo par des moyens métaboliques (par 5 exemple par hydrolyse) et dont le produit de biotransformation in vivo génère le médicament biologiquement actif. Les promédicaments décrits dans la présente description sont caractérisés par une biodisponibilité accrue et sont facilement métabolisés en composés biologiquement actifs in vivo. Le promédicament est administré sous une forme inactive ou beaucoup moins active que son métabolite. Dans la présente description, les prodrogues présentent des propriétés pharmacologiques identiques, similaire ou supérieure au composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-ol.

[22] Le terme « médicament » dans la présente description désigne tout composé ou composition présenté(e) comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Par extension, un médicament comprend tout composé ou composition pouvant être utilisé chez l'être humain ou l'animal ou pouvant leur être administrée, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique. Le médicament est composé de deux sortes de substances, un principe actif et un ou plusieurs excipients.

Le terme « principe actif » désigne un composé ayant un effet pharmacologique et un effet thérapeutique.

Le terme « excipient » désigne toute substance autre que le principe actif dans un médicament.

[23] Par "cancer chimiorésistant", on entend un cancer chez un patient où la prolifération des cellules cancéreuses ne peut être empêchée ou inhibée au moyen d'un agent antinéoplasique ou d'une combinaison d'agents antinéoplasiques habituellement utilisés pour traiter ce cancer, à une dose acceptable pour le patient. Les tumeurs peuvent être intrnsèquement résistantes avant la chimiothérapie, ou une résistance peut être acquise pendant le traitement par des tumeurs initialement sensibles à la chimiothérapie.

[24] Par "cancer chimiosensible", on entend un cancer chez un patient qui répond aux effets d'un agent antinéoplasique, c'est-à-dire où la prolifération des cellules cancéreuses peut être empêchée au moyen dudit agent antinéoplasique à une dose acceptable pour le patient.

[25] Le composé de formule (|) appartient au groupe des stéroïdes. La numérotation des atomes de carbone du composé de formule (I) suit donc la nomenclature définie par PIUPAC dans Pure & Appl. Chem., Vol.61, No.10, pp.1783-1822,1989. La numérotation des atomes de carbone d’un composé appartenant au groupe des stéroïdes selon "IUPAC est illustrée ci-dessous : za: za} 2 99 22 26 a 8 za 24 Tas H (= 7 2?

SE 2 6 4 8

GI + 8

[26] Dans la présente description, les abréviations suivantes signifient : LMA : leucémie myéloïde aiguë ; Dendrogenine A : 5a-hydroxy-68-[2-(1 H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol ; MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7 ; DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium ; SVF : sérum de veau fcetal ; ChEH : Cholestérol Epoxyde Hydrolase ; Neuro2a : glioblastome murin ; CTL : Contrôle ; MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium ; PBS : tampon phosphate salin ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; DO : densité optique ou absorbance ; CT : cholestane-3B,5a,6B-triol ; OCDO : 6-oxo-cholestan-3B,5a-diol ; 5,60-EC : 5,60-epoxycholesterol ; Tam : Tamoxifène ; CCM : chromatographie sur couche mince ; tert-butyle : ter-butyle ou t-butyle de formule (CHa)zC-—.

Description des modes de réalisation

[27] L'invention a pour premier objet un composé de formule (I) ; ‚ OSE

HN N 7 =

H ou un sel pharmaceutiquement acceptable d’un tel composé, dans lequel R1 est choisi parmi : - une chaîne carbonée en C1 à C20 , - un groupement - P(O)(OR2)(OR:3), - un groupement - C(O)NRa4R:s, où Ra, R3, R4 et Rs sont équivalents ou différents et sont H ou une chaîne carbonée en C1 à C20 : - un groupement - C(O)Rs , - un groupement - C(O)OR7, où Rs et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20 ; - un groupement - C(O)CHNH:Rs où Rs est la chaîne latérale des acides aminés essentiels et est choisi parmi H, CHs3, CH2CH(CH:s)2, -CH(CH3)CH2CH3, -(CH2)s, - CH(CHz)a, -CH2CsHs, -CH2-C3N2Hs, -CH2CsNHes, -(CHz)sNHC(NH)NHz, -(CHz2)4NHz, -CH2C(O)NHz, -(CH2)2C(O)NH2, -CH2C(O)OH, -(CH2)2C(O)OH, -CH2CsOHs, - CH2OH ; -CH(OH)CH: ; -CH2SH ; -(CH2)2SCH, et lorsque R+, Ra, Rs, Ra, Rs, Re et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20, elle peut être indépendamment saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée et contient éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle et aryle, ledit groupe aryle contenant éventuellement des hétéroatomes choisis parmi N, O, et S, pour son utilisation en tant que médicament.

[28] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule (I) ; PE20E0 SITE _ 4957

HN N Ly

H ou un sel pharmaceutiquement acceptable d’un tel composé, dans lequel R, est choisi parmi : - une chaîne carbonée en C1 à C20, - un groupement - P(O)(OR2)(OR:3) , - un groupement - C(O)NRa4R:s, où Ra, R3, R4 et Rs sont équivalents ou différents et sont H ou une chaîne carbonée en C1 à C20 : - un groupement - C(O)Rs , - un groupement - C(O)OR7, où Rs et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20 ; - un groupement - C(O)CHNH:Rs où Rs est la chaîne latérale des acides aminés essentiels et est choisi parmi H, CHs3, CH2CH(CH:s)2, -CH(CH3)CH2CH3, -(CH2)s, - CH(CHs)2, -CH2CsHs, -CH2-C3N2Hs, -CH2CsNHs, -(CH2)sNHC(NH)NHaz, -(CH2)4NH2, -CH2C(O)NHz, -(CH2)2C(O)NH2, -CH2C(O)OH, -(CH2)2C(O)OH, -CH2CsOHs, - CH2OH ; -CH(OH)CH: ; -CH2SH ; -(CH2)2SCH, et lorsque R+, Ra, Rs, Ra, Rs, Re et R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20, elle peut être indépendamment saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée et contient éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle et aryle, ledit groupe aryle contenant éventuellement des hétéroatomes choisis parmi N, O, et S, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

[29] Dans le composé de formule (I), les groupements chimiques Ra et Rs ou R4 et Rs présentent indépendamment les définitions indiquées.

[30] Dans un mode de réalisation préféré du composé de formule (1), le radical R est une chaîne carbonée en C1 à C8.

[31] Dans un mode de réalisation très préféré du composé de formule (1), le radical Ry est un groupement alkyle en C1 ou C2 ou C8.

[32] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Ry est un groupement alkyle en C1, il s’agit du composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle.

[33] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Ry est un groupement alkyle en C2, il s’agit du composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-éthoxyle.

[34] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Ry est un groupement alkyle en C8, il s’agit du composé 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-octanoxyle.

[35] Dans un autre mode de réalisation préféré du composé de formule (|), le radical R est un groupement -C(O)Rs avec Rs est une chaîne carbonée en Ca à Cs.

[36] Dans un mode de réalisation très préféré du composé de formule (1), le radical Rs est une chaîne carbonée en C3, C6 et C8.

[37] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Rs est une chaîne carbonée en C3, il s’agit du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate.

[38] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Rs est une chaîne carbonée en C6, il s’agit du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl hexanoate.

[39] Dans ce mode de réalisation très préféré du composé de formule (I), lorsque le radical Rs est une chaîne carbonée en C8, il s’agit du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl octanoate.

[40] Dans un mode de réalisation encore plus préféré du composé de formule (|), le composé est : -5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle, -5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-36-éthoxyle, -5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate, -5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl hexanoate.

— ; BE2020/5878

[41] Dans un autre mode de réalisation du composé de formule (I), le radical R: est le groupement C(O)OR7 où R7 est une chaîne carbonée en C1 à C20. II s’agit du composé de formule : gr, LA PR 2 ee Re, 9 A, 8 ee, — + À | . N Sc

[42] Dans encore un autre mode de réalisation du composé de formule (I), le radical R4 est le groupement C(O)NR4Rs où R4 et Rs sont équivalents ou différents et sont H ou une chaîne carbonée en C1 à C20; Il s’agit du composé de formule: HT CE Ni ge à "46 | UE nt Le Ÿ "> 5 ë.

NE

[43] Dans un mode de réalisation du composé de formule (I), Rı est un groupement P(O)(ORz)(ORs), Il s’agit du composé de formule : 5 “m Ne, ; 7 SE N Sm R 3 in, 9 N el oe Nr Se Ne, SEM Ka x x X

[44] Dans un mode de réalisation du composé de formule (I), Ra est un groupement - C(O)CHNH:Rs où Rs est la chaîne latérale des acides aminés essentiels.

[45] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical R4 est un groupement C(O)CHNH:CH3, il s’agit du composé L-Alanine 50-hydroxy-8B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[46] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH:2(CH2)3NHC(NH)NH2, il s’agit du composé L-Arginine 5a- hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[47] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical R+ı est le groupement -C(O)CHNH:CH:C(O)NHz, il s’agit du composé L-Aspargine 5a-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[48] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O0)CHNH:CH:C(O)OH, il s'agit du composé L-Aspartate 5a-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[49] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Rı est le groupement -C(O)CHNH:CHzSH, il s’agit du composé L-Cystéine 5a-hydroxy-68-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[50] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHzNHz, il s’agit du composé L-Glycine 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[51] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le radical -C(O)CHNH:(CHz2)2C(O)OH, il s’agit du composé L-Glutammate 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[52] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNHz(CHz)2C(O)NHz, il s’agit du composé L-Glutamine 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[53] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH:CH2C:N2Ha, il s’agit du composé L-Histidine 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[54] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical R est le groupement -C(O)CHNH:CH(CH3)CH2CH;, il s’agit du composé L-Isoleucine 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[55] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH2CH2CH(CHs3)2, il s'agit du composé L-Leucine 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[56] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNHz(CH2)4NHz, il s’agit du composé L-lysine 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[57] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH:2(CH2)2SCH;, il s’agit du composé L-Methionine 50-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[58] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical R+ı est le groupement -C(O)CHNH2CH2CsHs, il s’agit du composé L-Phénylalanine 5a-hydroxy-68- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[59] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH(CHaz)s, il s’agit du composé L-Proline 5a-hydroxy-68-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[60] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical R est le groupement -C(O)CHNH:CH:OH, il s’agit du composé L-Sérine 5a-hydroxy-68-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[81] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH:CH(OH)CH;, il s’agit du composé L-Thréonine 5a-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[62] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH2CH2CsNHe, il s'agit du composé L-Tryptophane 5a-hydroxy-68- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[63] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH2CH2CsH4OH, il s’agit du composé L-Tyrosine 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[64] Dans ce mode de réalisation du composé de formule (I), quand le radical Ry est le groupement -C(O)CHNH:CH(CHs)2, il s’agit du composé L-Valine 5a-hydroxy-68-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl ester.

[65] Selon un mode de réalisation, le composé de formule (I) est destiné à être utilisé en tant que médicament dans le traitement du cancer du sein, de la prostate, colorectal, du poumon, de la vessie, de la peau, de l’utérus, du col de l’utérus, de la bouche, du cerveau, de l'estomac, du foie, de la gorge, du larynx, de l'œsophage, de l'os, de l'ovaire, du pancréas, du rein, de la rétine, du sinus, de la fosses nasales, du testicule, de la tyroïde, de la vulve, dans le traitement du lymphome, lymphome non hodgkinien, lymphome hodgkinien, de la leucémie, la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le myélome multiple, le carcinome à cellules de Merkel ou mésothéliome.

[66] Selon un mode de réalisation, le cancer est un adénocarcinome acineux, un carcinome acineux, un mélanome acro-lentigineux, une kératose actinique, un adénocarcinome, un carcinome adénoïde kystique, un carcinome adénosquameux, un carcinome annexiel,

une tumeur du repos surrénal, un carcinome adrénocortical, un carcinome sécrétant de l'aldostérone, un sarcome alvéolaire de la partie molle, un carcinome améloblastique de la thyroïde, un angiosarcome, un carcinome apocrine, une tumeur d'Askin, astrocytome,

un carcinome basocellulaire, un carcinome basaloïde, un carcinome basosquameux, un cancer des voies biliaires, un cancer de la moelle osseuse, un sarcome botryoïde, un carcinome bronchioalvéolaire, un adénocarcinome bronchogène, un carcinome bronchogène, un carcinome ex adénome pléomorphe, un chlorome, un carcinome cholangiocellulaire, un chondrosarcome, un choriocarcinome, un carcinome du plexus choroïde, un adénocarcinome à cellules claires, un cancer du côlon, un comédocarcinome,

un carcinome producteur de cortisol, un carcinome à cellules cylindriques, un liposarcome différencié, un adénocarcinome canalaire de la prostate, un carcinome canalaire, un carcinome canalaire in situ, un cancer duodénal, un carcinome eccrine, un carcinome embryonnaire, un carcinome de l'endomètre, un carcinome stromal de l'endomètre, un sarcome épithélioïde, un sarcome d'Ewing, un carcinome exophytique, sarcome fibroblastique, un fibrocarcinome, un carcinome fibrolamellaire, un fibrosarcome, carcinome folliculaire de la thyroïde, un cancer de la vésicule biliaire, un adénocarcinome gastrique, un carcinome à cellules géantes, un sarcome à cellules géantes, une tumeur osseuse à cellules géantes, un gliome, un glioblastome multiforme, un carcinome à cellules de granulosa, un cancer de la tête et du cou, un hémangiome, un hémangiosarcome, un hépatoblastome, un carcinome hépatocellulaire, un carcinome à cellules de Hürthle, un cancer iléal, un carcinome lobulaire infiltrant, un carcinome inflammatoire du sein, un carcinome intraductal, un carcinome intra-épidermique, un cancer du jéjunum, un sarcome de Kaposi, une tumeur de Krukenberg, un carcinome à cellules de Kulchitsky, un sarcome à cellules de Kupffer, un carcinome à grandes cellules,

un cancer du larynx, un mélanome de lentigo maligna, un liposarcome, un carcinome lobulaire, un carcinome lobulaire in situ, un Iymphoépithéliome, un lymphosarcome, un mélanome malin, un carcinome médullaire, un carcinome médullaire de la thyroïde, un médulloblastome, un carcinome méningé, un carcinome micropapillaire, un sarcome à cellules mixtes, un carcinome mucineux, un carcinome muco-épidermoïde, un mélanome mucosal, un liposarcome myxoïde, un myxosarcome, un carcinome nasopharyngé, néphroblastome, un neuroblastome, un mélanome nodulaire, un cancer du rein à cellules non claires, un cancer du poumon à cellules non petites, un carcinome à cellules d'avoine, un mélanome oculaire, un cancer buccal, un carcinome ostéoïde, un ostéosarcome, un cancer des ovaires, un carcinome de Paget, un pancréatoblastome, un adénocarcinome papillaire, un carcinome papillaire, un carcinome papillaire de la thyroïde, un cancer pelvien, un carcinome périampullaire, une tumeur phyllode, un cancer de l'hypophyse, liposarcome pléomorphe, un blastome pleuropulmonaire, un carcinome intra-osseux primaire, un cancer du rectum, un carcinome des cellules rénales, un rétinoblastome, un rhabdomyosarcome, un liposarcome à cellules rondes, un cancer cicatriciel, un cancer de la vessie schistosomique, un carcinome schneidérien, un carcinome sébacé, un carcinome à cellules en anneau, un cancer de la peau, un cancer du poumon à petites cellules, un ostéosarcome à petites cellules, un sarcome des tissus mous, un sarcome à cellules fusiformes, un carcinome épidermoïde, un cancer de l'estomac, un mélanome à diffusion superficielle, un sarcome synovial, un sarcome télangiectasique, un carcinome du canal terminal, un cancer des testicules, un cancer de la thyroïde, un carcinome des cellules transitoires, un carcinome tubulaire, un mélanome tumorigène, un carcinome indifférencié, un adénocarcinome de l'urètre, un cancer de la vessie, un cancer de l'utérus, un carcinome du corps utérin, un mélanome de l'utérus, un cancer du vagin, un carcinome verruqueux, un carcinome villeux, un liposarcome bien différencié, une tumeur de Wilms ou une tumeurs des cellules germinales.

[87] Dans un mode de réalisation préféré, le composé de formule (Il) est destiné à être utilisé en tant que médicament dans le traitement du cancer du sein chez les mammifères.

[68] Selon un mode de réalisation, le composé est destiné à être utilisé en tant que médicament dans le traitement d’un cancer chimiosensible.

[69] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le composé de formule (I) est destiné à être utilisé en tant que médicament dans le traitement d’un cancer chimiorésistant.

[70] Selon un mode de réalisation, le cancer chimiorésistant est un cancer hématologique ou du sang, tel que la leucémie, en particulier la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le lymphome, en particulier le lymphome non-hodgkinien et le myélome multiple.

[71] Selon un mode de réalisation, le cancer est chimiorésistant à la daunorubicine,à la cytarabine, au fluorouracile, au cisplatine, à l’acide tout-trans-rétinoïque, au trioxyde d’arsenic, au bortézomib ou à l’une de leurs combinaisons.

[72] Les prodrogues spécifiques en C3 du composé Dendrogénine A décrits dans la présente description présentent une activité pharmacologique comparable ou supérieure à la Dendrogénine A. La Dendrogénine A est éliminée rapidement in vivo par l’organisme.

Les prodrogues spécifiques en C3 présentent une biodisponibilité supérieure à | 20/9679 Dendrogénine A et sont facilement métabolisés en composés biologiquement actifs in vivo. Par conséquent, l’effet thérapeutique de la Dendrogénine A est prolongé dans l’organisme du patient lorsqu'une prodrogue spécifique en C3 décrit dans la présente description est utilisée in vivo.

[73] Toutes les références aux composés de formules (I) comprennent les références aux sels, aux complexes multi-composants et leurs cristaux liquides. Toutes les références aux composés de formules (l) comprennent également les références aux polymorphes et leurs cristaux habituels.

[74] Le composé selon l'invention peut être sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. Un sel pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) comprend l’addition d’acide de celui-ci.

[75] Des sels acides appropriés sont formés à partir d’acides qui forment des sels non toxiques. Par exemple les sels sont choisis parmi : acétate, adipate, benzoate, bicarbonate, carbonate, bisulfate, sulfate, camphosulfonate, borate, camsylate, citrate, cyclamate, édisylate, ésylate, formate, furamate, gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphate, hibenzate, chlorhydrate de chlorure, bromhydrate, bromure, hydroiodure, iodure, iséthionate, lactate, malate, maléate, malonate mésylate, méthylsulfate, naphtylate, 2-napsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate, hydrogène phosphate, phosphate dihydrogène, pyroglutamate, saccarate, stérate, succinate, tannate, sels de tartrate, tosylate, trifluoroacétate et xinofoate. De manière préféré, le sel pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) est formé à partir du lactate.

[76] Les sels pharmaceutiquement acceptables des composés de formule (I) peuvent être préparés par une ou plusieurs des trois méthodes suivantes : (i) en faisant réagir le composé de formule (I) avec l'acide désirée ; (ii) en éliminant un groupe protecteur labile en milieu acide ou basique d'un précurseur approprié du composé de formule (l) ou en ouvrant le cycle d'un précurseur cyclique approprié, par exemple une lactone ou un lactame, en utilisant l'acide désiré ; ou ill) par conversion d'un sel du composé de formule (I) en un autre par réaction avec un acide ou au moyen d'une colonne échangeuse d'ions appropriée.

[77] Ces trois réactions sont généralement effectuées en solution. Le sel obtenu peut précipiter et être recueilli par filtration ou peut être récupéré par évaporation du solvant. Le degré d'ionisation du sel obtenu peut varier de complètement ionisé à presque non ionisé.

[78] L'invention concerne en deuxième objet une composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable au moins un composé selon l’invention, comme décrit ci-dessus pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

[79] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un autre agent thérapeutique.

[80] Selon un monde de réalisation préféré, cet autre agent thérapeutique est un agent antinéoplasique.

[81] Selon un mode de réalisation, l'agent antinéoplasique est un agent endommageant l'ADN tel que la camptothécine, l'iinotécan, le topotécan, l'amsacrine, l'étoposide, le phosphate d'étoposide, le téniposide, le cisplatine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le cyclophosphamide, le chlorambucil, la chlorméthine, le busulfan, le tréosulfan ou le thiotépa, un antibiotique antitumoral tel que la daunorubicine, la doxorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, la mitoxantrone, la valrubicine, l'actinomycine D, la mitomycine, la bléomycine ou la plicamycine, un antimétabolite tel que le 5-fluorouracile, la cytarabine, la fludarabine ou le méthotrexate, un antimitotique tel que le paclitaxel, le docétaxel, la vinblastine, la vincristine, la vindésine ou la vinorelbine, ou divers agents antinéoplasiques tels que le bortézomib, l'acide tout- trans-rétinoïque, le trioxyde d'arsenic, ou l'un de leurs produits combinés.

[82] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est utilisée dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d’une tumeur qui est chimiorésistante audit agent antinéoplasique lorsqu'il n’est pas administré en combinaison avec un composé selon l’invention.

[83] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est utilisée dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d’une tumeur qui est chimiosensible audit agent antinéoplasique, et la dose de l’agent antinéoplasique administrée audit patient en combinaison avec un composé selon l'invention ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l’agent antinéoplasique lorsqu'il n’est pas administré en combinaison avec un composé selon l'invention. En particulier, la dose de l'agent antinéoplasique administré audit patient en combinaison avec un composé selon l'invention ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l’agent antinéoplasique administré seul, sans autre principe actif.

[84] La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comprendre en outre d’autres composés thérapeutiques actifs utilisés couramment dans le traitement de la pathologie énoncée ci-dessus.

[85] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend le composé selon l'invention comme unique agent thérapeutique.

[86] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend le composé de formule (|) administré au patient en tant qu’agent thérapeutique actif.

[87] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend le composé de formule (I) administré au patient en combinaison avec au moins un autre agent thérapeutique actif.

[88] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée par toutes voies, notamment par voies : intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pulmonaire, transmuqueuse (orale, intranasale, intravaginale, rectale), inhalation par spray nasal, utilisant une formulation en comprimé, capsule, solution, poudre, gel, particule ; et contenu dans une seringue, un dispositif implanté, une pompe osmotique, une cartouche, une micropompe ; ou tout autre moyen apprécié par l'artisan qualifié, bien connu dans l'art. L'administration spécifique à un site peut être réalisée, par exemple par voie intratumorale, intra-articulaire, intrabronchique, intra-abdominale, intracapsulaire, intra-cartilagineuse, intracavitaire, intracérébelleuse, intracérébroventriculaire, intracolique, intracervicale, intragastrique, intra-hépatique, intracardiaque, intraostéale, intra-pelvien, intrapéricardique, intrapéritonéal, intrapleural, intraprostatique, intrapulmonaire, intrarectal, intrarénal, intrarétinien, intraspinal, intrasynovial, intrathoracigue, intra-utérin, intravasculaire, intravésical, intralésionnel, vaginal, rectal, buccal, sublingual, intranasal ou transdermique dans un dosage adapté comprenant les véhicules usuels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. De manière préférée, la composition pharmaceutique est sous forme appropriée pour être administrée par voie intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale. La voie orale étant particulièrement préférée.

[89] Outre les animaux à sang chaud tels que les souris, les rats, les chiens, les chats, les moutons, les chevaux, les vaches et les singes, le composé de l'invention est également efficace sur les humains.

[90] Selon un mode de réalisation, les compositions pharmaceutiques pour l'administration des composés de cette invention peuvent être présentées sous forme de doses unitaires et peuvent être préparées par l'une des méthodes bien connues dans l’état de l'art. Toutes les méthodes comprennent l'étape consistant à mettre le principe actif en association avec 299878 le support qui constitue un ou plusieurs ingrédients accessoires. En général, les compositions pharmaceutiques sont préparées en mettant l'ingrédient actif en association avec un support liquide ou un support solide finement divisé ou les deux, puis, si nécessaire, en façonnant le produit dans la formulation souhaitée. Dans la composition pharmaceutique, le composé de l'objet actif est inclus en quantité suffisante pour produire l'effet souhaité sur le processus ou l'état des maladies. Les compositions pharmaceutiques contenant le principe actif peuvent se présenter sous une forme adaptée à l'usage oral, par exemple sous forme de comprimés, de pastilles, de suspensions aqueuses ou huileuses, de poudres ou de granulés dispersibles, d'émulsions, de capsules, de sirops, d'élixirs, de solutions, de timbres buccaux, de gel oral, de chewing-gum, de comprimés à mâcher, de poudre effervescente et de comprimés effervescents. Les compositions pharmaceutiques contenant le principe actif peuvent se présenter sous une forme de suspension aqueuse ou huileuse.

[91] Selon un mode de réalisation, les suspensions aqueuses contiennent les matières actives en mélange avec des excipients adaptés à la fabrication de suspensions aqueuses. Ces excipients sont des agents de suspension, par exemple la carboxyméthylcellulose sodique, la méthylcellulose, l'hydroxy-propylméthylcellulose, l'alginate de sodium, la polyvinyl-pyrrolidone, la gomme adragante et la gomme d'acacia ; les agents dispersants ou mouillants peuvent être un phosphatide naturel, par exemple la lécithine, ou des produits de condensation d'un oxyde d'alkylène avec des acides gras, par exemple le stéarate de polyoxyéthylène, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des alcools aliphatiques à longue chaîne, par exemple l'heptadécaéthylène-oxycétanol, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des esters partiels dérivés d'acides gras et d'un hexitol, comme le monooléate de polyoxyéthylène sorbitol, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des esters partiels dérivés d'acides gras et d'anhydrides d'hexitol, par exemple le monooléate de polyéthylène sorbitol. Les suspensions aqueuses peuvent également contenir un ou plusieurs conservateurs, par exemple de l'éthyle, ou du n-propyle, du p-hydroxybenzoate, un ou plusieurs colorants, un ou plusieurs aromatisants, et un ou plusieurs édulcorants, comme le saccharose ou la saccharine.

[92] Selon un mode de réalisation, les suspensions huileuses peuvent être formulées en mettant en suspension le principe actif dans une huile végétale, par exemple l'huile d'arachide, d'olive, de sésame ou de coco, ou dans une huile minérale telle que la paraffine liquide. Les suspensions huileuses peuvent contenir un agent épaississant, par exemple de la cire d'abeille, de la paraffine dure ou de l'alcool cétylique. Des agents édulcorants tels que ceux mentionnés ci-dessus et des agents aromatisants peuvent être ajoutés pour obtenir une préparation orale agréable au goût. Ces compositions peuvent être conservées par l'ajout d'un antioxydant tel que l'acide ascorbique. Les poudres et granules dispersables qui conviennent à la préparation d'une suspension aqueuse par addition d'eau fournissent l'ingrédient actif en mélange avec un agent dispersant ou mouillant, un agent de suspension et un ou plusieurs conservateurs.

[93] Les sirops et élixirs peuvent être formulés avec des agents édulcorants, par exemple le glycérol, le propylène glycol, le sorbitol ou le saccharose. Ces formulations peuvent également contenir un émollient, un agent de conservation, des agents aromatisants et colorants.

[94] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent se présenter sous la forme d'une suspension aqueuse ou oléagineuse injectable de manière stérile. Cette suspension peut être formulée selon l'art connu en utilisant les agents dispersants ou mouillants et les agents de suspension appropriés qui ont été mentionnés ci-dessus. La préparation stérile injectable peut également être une solution ou une suspension stérile injectable dans un diluant ou un solvant non toxique acceptable par voie parentérale, par exemple une solution dans du 1,3-butane diol. Les véhicules et solvants acceptables pouvant être utilisés comprennent ; l'eau, le liquide de Ringer et la solution isotonique de chlorure de sodium. En outre, des huiles fixes stériles sont traditionnellement utilisées comme solvant ou milieu de suspension. À cette fin, toute huile fixe peut être utilisée, y compris les mono- ou diglycérides synthétiques. En outre, les acides gras tels que l'acide oléique sont utilisés dans la préparation des produits injectables.

[95] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être administrées sous forme de suppositoires pour l'administration rectale du médicament.

Ces compositions peuvent être préparées en mélangeant le médicament avec un excipient approprié non irritant qui est solide à la température ordinaire mais liquide à la température rectale et qui fondra donc dans le rectum pour libérer le médicament. Ces matières comprennent le beurre de cacao et les polyéthylèneglycols.

[96] En outre, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par voie oculaire au moyen de solutions ou de pommades. De plus, l'administration transdermique des composés en question peut être réalisée au moyen de patchs iontophorétiques et autres. Pour l'utilisation topique, on utilise des crèmes, des pommades, des gelées, des solutions ou des suspensions.

[97] Dans le traitement d'un mammifère souffrant ou risquant de développer un cancer, un dosage approprié de la composition pharmaceutique selon l’invention peut généralement être d'environ 0,1 à 50 000 microgrammes (kg) par kg de poids corporel du patient Oet 9205878 jour, qui peut être administré en doses uniques ou multiples. Le niveau de dosage sera de préférence d'environ 1000 à environ 40 000 g/kg par jour, en fonction de nombreux facteurs tels que la gravité du cancer à traiter, l'âge et l'état de santé relatif du sujet, la voie et la forme d'administration. Pour l'administration orale, cette composition peut être fournie sous forme de comprimés contenant 1000 à 100000 microgrammes de chacun des principes actifs, en particulier 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 50000, 75000, 100000 microgrammes de chaque principe actif. Cette composition peut être administrée selon un schéma de 1 à 4 fois par jour, par exemple une ou deux fois par jour. Le régime posologique peut être ajusté pour fournir une réponse thérapeutique optimale.

[98] L'invention divulgue également ci-après des procédés de fabrication des composés de formule (1). Brève description des figures

[99] L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description suivante de plusieurs modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés.

[100] [fig.1] La figure 1 représente les résultats d’une étude de cytotoxicité des composés 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, | 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B8-ethoxyle et 5a-hydroxy-66-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate sur les cellules Neuro2a via un test de bleu de trypan.

[101] [fig.2] La figure 2 illustre les résultats d’un test de viabilité cellulaires MTT réalisé sur des cellules tumorales mammaires MCF-7 en présence des composés 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle et 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate.

[102] [fig. 3] La figure 3 illustre les résultats de l’activité de la Cholestérol Epoxyde Hydrolase (ChEH) dans des cellules MCF-7 en présence des composés 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle et 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate.

EXEMPLES

Différentes expériences ont été réalisées afin d’évaluer les caractéristiques des composés de formule (1). Le terme « température ambiante » employé dans les exemples suivants doit s’interpréter comme étant une température comprise entre 10 et 40 degrés Celsius (°C), par exemple entre 15 °C et 30 °C et préférentiellement environ 20 °C.

[103] Exemple 1 : Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle : AS sa Nat. Mei IA ee H pe sort an Bes Une première étape consiste à mettre en solution 4.0 grammes (g) de cholestérol (10.3 mmol) dans 20 millilitres (mL) de tétrahydrofurane (THF). 0.80 g d’hydrure de sodium (60% dans l'huile, 20.0 mmol) a été additionné et laissé réagir pour 30 minutes à 60°C, puis 1.8 mL de iodométhane (28.9 mmol) a été ajouté. Le mélange ainsi obtenu a été laissé à 60°C pendant la nuit, à savoir environ 10 h. À l'issue de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 20 mL d’eau. Le mélange a été filtré et le THF évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec de l’acétate d’éthyle. Les phases organiques ainsi obtenues ont été combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l’obtention d’une huile. L'huile obtenue a été dissoute dans 2 mL de Et:O et du MeOH a été ajouté jusqu’à la formation d’un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séchée.

Une poudre blanche de 3.40 g (correspondent à 82 % de rendement) de cholestan-3B- méthoxyle a été ainsi obtenue.

La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3B-méthoxyle le composé 5,6a-epoxy-cholestan-3B-méthoxyle de la manière suivante :

1.80 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque (8.90 mmol) a été dissous dans 70 mL de chlorure de méthylène et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 2.50 g de cholestan- 3B-méthoxyle (6.24 mmol) dissous dans 20 mL de chlorure de méthylène. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant trois heures. Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de sulfite de sodium à

| ; _ BE2020/5878 10 % en poids, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention d’une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et:O ont été ajouté pour dissoudre l'huile, puis 25 mL d’EtOH ont été additionné et le mélange a été chauffé jusqu’à ébullition pour 3 fois et puis mis à 0°C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séché ; 1.73 g, correspondant à 67 % (avec un excès énantiomérique = 90 %) de rendement de 5,6a-epoxy-cholestan- 3B-méthoxyle a été ainsi obtenue. La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle de la manière suivante : ni AL de mp n-ButOH gs” + Ÿ “ J © 130°C, 48h ts A Doe 55 Ÿ | x 008 {>

N

0.81 g d’histamine (7.30 mmol) sous sa forme basique a été ajoutée à une solution butanolique de 10 mL comprenant 1.50 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-3B- méthoxyle (3.62 mmol) sous agitation. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 °C durant 48 heures. L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3B-méthoxyle. Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 10 mL de méthyl tert-butyle éther. La phase organique a été lavée par 2 fois avec 10 ML d’eau puis une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification. L’éluant utilisé est un mélange Acétate d’éthyle/Méthanol en rapport 9/1. Une poudre blanche de 1.32 g de 5da-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- méthoxy a été obtenue. Le rendement final de la réaction est de 69 % avec une pureté supérieure à 95 % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).

[104] Exemple 2 : Préparation d’un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle :

| == ; BE2020/5878 Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-méthoxyle a été préparé de la manière suivante : [ 5 ; y DH | % ; de si ÔH de en 7 ge BOR ge ee À THÉ 3 OE | ee e HN LN "HA AN Am ae % > in a fi * it Lp me “Nh YT Sr

OH

[105] 21.0 mg d’acide lactique (1.89 mmol) a été ajouté à une solution de 0.50 g de 5a- hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle (0.95 mmol) dans 15 mL d’éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l’obtention d’une poudre blanche de 0.52 g de 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-méthoxyle dilactate.

[106] Exemple 3 : Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-éthoxyle : La première étape est une synthèse du composé cholestan-3B-éthoxy comprenant les étapes suivantes : En mn Fe en, pH Tes NaM, EH | CK cu LS Te et ‘ ie 7 nde ef | HT a Ae” EI ie

4.00 g de cholestérol (10.3 mmol) a été mis en solution dans 20 mL de tétrahydrofurane.

0.82 g d’hydrure de sodium (60% dans l'huile, 20.0 mmol) a été additionné et laissé réagir pour 30 minutes à 60°C, puis 1.9 mL de iodoéthane (28.9 mmol) a été ajouté. Le mélange ainsi obtenu a été laissé à 60°C pendant la nuit. A l’issus de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 20 mL d’eau. Le mélange a été filtré et le THF évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec d’acétate d’éthyle. Les phases organiques ainsi obtenues ont été combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l’obtention d’une huile. L’huile obtenue a été dissoute dans 2 ml de Et:O et du MeOH a été ajouté jusqu’à la formation d’un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séché. Une poudre blanche de 2.12 g (correspondent à 49 % de rendement) de cholestan-3B-

éthoxyle a été ainsi obtenue. La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3B-éthoxyle le composé 5,6a-epoxy-cholestan-3B-éthoxyle de la manière suivante : pn Put” HE, dh "gr it

1.44 g d’acide méta-chloro-peroxybenzoïque à 6.43 mmol a été dissous dans 50 mL de chlorure de méthylène et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 2.0 g de cholestan- 3B-éthoxyle à 4.82 mmol dissous dans 10 mL de chlorure de méthylène. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de sulfite de sodium à 10 % en poids, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention d’une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et:O ont été ajouté pour dissoudre l’huile, puis 25 ml d’EtOH ont été additionné et le mélange a été chauffé jusqu’à ébullition pour 3 fois et puis mis à 0°C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séchée : 0.72 g, correspondant à 35 % (avec un excès énantiomérique = 90%) de rendement de 5,6a-epoxy-cholestan- 3B-éthoxy a été ainsi obtenu. La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-éthoxy de la manière suivante :

0.31 g d’histamine sous sa forme basique à 2.74 mmol a été ajouté à une solution butanolique de 5 mL comprenant 0.51 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-3B-éthoxyle à

1.18 mmol sous agitation. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 °C durant 48 heures. L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3B-éthoxyle.

| a | 20 | ; BE2020/5878 Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 5 mL de méthyl tert-butyle éther. La phase organique a été lavée par 2 fois 2 ML d’eau puis une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification. L’éluant utilisé est un mélange Acétate d’éthyle/Méthanol en rapport 9/1. Une poudre blanche de 0.28 g de 5da-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- éthoxyle a été obtenue. Le rendement final de la réaction est de 44 % avec une pureté supérieure à 97 % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).

[107] Exemple 4 : Préparation d’un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-éthoxyle : Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-éthoxyle a été préparé de la manière suivante : Kee Aen FT © OF ie A SS 4 ouf / ne Ii | Ï $ / y “OH | ; “VA À LE 6 HET pe HN, SN a PN Ng 45 eN 7

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166.2 mg d'acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.50 g de 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-éthoxyle (0.92 mmol) dans 5 mL d’éthanol anhydre sous agitation. L’agitation a été maintenue à température ambiante 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l’obtention d’une poudre blanche de 0.20 g de 5da-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- éthoxyle dilactate.

[108] Exemple 5 : Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-octanoxyle : La première étape est une synthèse du composé cholestan-3B-octanoxyle comprenant les étapes suivantes :

‚ ; BE2020/5878 as ; ne NaH, Cet AA La porte À FC. 00 GH, ds

4.00 g de cholestérol a été mis en solution dans 20 mL de tétrahydrofurane. 0.84 g d’hydrure de sodium a été additionné et laissé à réagir pour 30 minutes à 60°C, puis 3.0 g d’isooctane a été ajouté. Le mélange ainsi obtenu a été laissé à 60°C pendant la nuit. A l'issue de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 20 mL d’eau. Le mélange a été filtré et le THF évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec de l’acétate d’éthyle. Les phases organiques ainsi obtenues ont été combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l’obtention d’une huile. L’huile obtenue a été dissoute dans 2 mL de Et:O et du MeOH a été ajouté jusqu’à formation d’un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séchée. Une poudre blanche de 2.5 g (correspondent à 48 %) de cholestan-3B-octanoxyle a été ainsi obtenue. La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3B-octanoxyle le composé 5,6a-époxycholestan-3B-octanoxyle de la manière suivante : CHR mers CH GM RT, dh orge hs

0.90 g d’acide méta-chloro-peroxybenzoïque à 4.0 mmol a été dissous dans 40 mL de chlorure de méthylène et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 1.50 g de cholestan- 3B-octanoxyle à 3.0 mmol dissous dans 10 mL de chlorure de méthylène. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de sulfite de sodium à 10 % en poids, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et20 ont été ajouté pour dissoudre l'huile, puis 25 ml de MeOH ont été additionné et le mélange a été chauffé jusqu’à ébullition pour 3 fois et puis mis à 0°C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du MeOH froid et séchée : 1.19 g, correspondent à 77 % de rendement (avec un excès énantiomérique = 90%) de 5,6a-epoxy-cholestan-3B- octanoxyle a été ainsi obtenue.

La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6B-[2-(1 H-imidazol-4-yl). 79/5576 éthylamino]-cholestan-3B- octanoxyle de la manière suivante : HN M X— Pa ue VIN rn, Nl, werf, CH ‘ SN Lun es | ee EO ee Se CD 300 48h CH" 048 on ö >

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0.48 g d’histamine sous sa forme basique correspondant à 4.31 mmol a été ajouté à une solution butanolique de 10 ML comprenant 1.1 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-3B- octanoxyle à 2.14 mmol sous agitation. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 °C durant 48 heures. L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3B- octanoxyle.

Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 10 mL de méthyl tert-butyl éther. La phase organique a été lavée par 2 fois 10 ML d’eau puis une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium.

La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification.

L’éluant utilisé est un mélange Acétate d'éthyle/Méthanol en rapport 95/5. Une poudre blanche de 0.74 g de 5da-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- octanoxyle a été obtenue. Le rendement final de la réaction est de 55 % avec une pureté supérieure à 95% mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).

[109] Exemple 6 : Préparation d’un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38- octanoxyle : Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B- octanoxyle a été préparé de la manière suivante : LT ‘ en L a. ANA ' HG À J ú U ; CaHer nets dj A ss Cabas Lg A À ï ee

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166.2 mg d'acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.57 g de 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-octanoxyle (0.92 mmol) dans 5 mL d’éthanol anhydre sous agitation. L’agitation a été maintenue à température ambiante durant trois heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l’obtention d’une poudre blanche de 0.59 g de 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3fB- octanoxyle dilactate.

[110] Exemple 7 : Synthèse du composé de formule (|) 5a-Hydroxy-68-[2-(1H-imidazole-4- yl)éthylamino]cholestane-3B-yl propanoate : La première étape est une synthèse du composé 3B-propanoate-cholestane comprenant les étapes suivantes : A Te CHOHCOOH CK yr A11] Bee tin OLA ged Dans un ballon rodé de 250mL, 25.0 mL de pyridine est ajouté à 25 mL d’acide propionique.

5.00 g (1.0 eq) de cholestérol est ajouté en plusieurs portions et le tout est mélangé à température ambiante pendant 22 heures. Au bout de 22 heures, un précipité blanc apparait dans le mélange. La réaction est arrêtée par addition de 250 mL d’H2O et une grande quantité de précipité blanc est obtenue. Le brut réactionnel est filtré et le précipité est lavé avec de l’eau. Le précipité est alors dissous dans de l’hexane (100 mL) et lavé deux fois avec H2O (50 mL) et une fois avec du chlorure de sodium saturé. La phase organique est séchée sur MgSO,, filtrée et évaporée pour obtenir une masse de

5.5g de brut réactionnel. Le brut réactionnel est recristallisé dans de l’éthanol et une masse de 4.66g (81% de rendement) de 38-propanoate-cholestane est obtenue. La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du 3B-propanoate-cholestane le composé 5,6a-Epoxycholestan-3B-propanoate de la manière suivante :

O O AS en AL L’acide méta-chloro-peroxybenzoïque (2.47 g, 11.0 mmol) est dissous dans du chlorure de méthylène (18 mL) et ajouté goutte à goutte à un mélange de 3fB-propanoate- cholestane (4.065 g, 9.18 mmol) dissous dans du chlorure de méthylène (15 mL). L’agitation est maintenue à température ambiante durant trois heures. Le milieu a | | ; | | BE2020/5878 reactionnel est lavé avec une solution aqueuse de sulfite de sodium (10 % en poids), une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. L'évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention de 3.70 g d’une poudre blanche (rendement quantitatif). Le 5,6a-Epoxycholestan-3B-propanoate est utilisé tel quel sans purification supplémentaire. La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-Hydroxy-6B-[2-(1H-imidazole-4- yl)éthylamino]cholestane-3B-propanoate de la manière suivante : HoN N 2 AGEN a ST DL zw

O O n-BuOH A 130°C, 48 h Se £ HO_A H

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N L’histamine sous sa forme basique (1.47 g, 13.1 mmol) est ajoutée à une solution butanolique (24 mL) d'un 5,6a-Epoxycholestan-3B-propanoate (3.00 g, 6.54 mmol). Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation et à reflux, pendant 48 heures. L'avancée de la réaction est contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-Epoxycholestan-3B-propanoate. Après refroidissement, le milieu réactionnel est dilué dans 24 mL de méthyl tert-butyl éther, la phase organique est lavée par 4 fois 24 ML d’eau puis une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification. L’éluant utilisé est un mélange Acétate d'éthyle/Méthanol 9/1. Une poudre blanche de 0.86 g (23 %) de 5a-Hydroxy-68-[2-(1H-imidazole-4-ylhéthylamino]cholestane-3B-yl propanoate est obtenue.

[112] Exemple 8 : Préparation d’un sel dilactate du _5a-Hydroxy-68-[2-(1H-imidazole-4- yl)éthylamino]cholestane-3B-yl propanoate : Un sel dilactate du composé 5a-Hydroxy-6B-[2-(1H-imidazole-4-yl)éthylamino]cholestane- 3B-yl propanoate a été préparé de la manière suivante : [> / 5 J [ ? / a NS Ho AT dE 5 Ti SEE mere DT SE ce H et ee | BO NSS Nas EtOH [ eN LS db — in an OUR A ï |

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166.2 mg d’acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.52 g de 5a- Hydroxy-88-[2-(1H-imidazole-4-yljéthylamino]cholestane-38-yl propanoate (0.92 mmol) dans 5 mL d’éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante durant trois heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d’une poudre blanche de 0.54 g de 5a-Hydroxy-66-[2-(1H-imidazole-4- yl)éthylamino]cholestane-3B-yl propanoate dilactate.

[113] Exemple 9 : Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl hexanoate : La première étape est une synthèse du composé 3fB-hexanoate-cholestane comprenant les étapes suivantes : Dans un ballon rodé de 250 mL, 4.00 g (10.35 mmol) de cholestérol est dissous dans du dichlorométhane 80 mL. 632.0 mg de DMAP (5.17 mmol) est additionné en une portion et

4.8 mL d’anhydride hexanoïque (20.07 mmol) est addition goutte à goutte, le tout est mélangé à température ambiante pendant 22 heures. Le dichlorométhane est évaporé à l’évaporateur rotatif. Le brut réactionnel est repris dans de l’hexane 100 mL, lavé à l’eau deux fois 100 ML et une fois au NaCl saturé. La phase organique est séchée sur MgSO4 et évaporée sous pression réduite pour obtenir une masse de 7.5 g de brut réactionnel. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification. L’éluant utilisé est un mélange Hexane/Acétate d’éthyle 99/1. Une poudre blanche de 3.77 g, rendement final de 75 %, est obtenue. La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du 38-hexanoate-cholestane le composé 5,6a-Epoxycholestan-3B-hexanoate de la manière suivante : mCPBA O RT, 3h > L’acide méta-chloro-peroxybenzoïque (2.75 g, 11.0 mmol) est dissous dans du chlorure de méthylène (30 mL) et ajouté goutte à goutte à un mélange de 3B-hexanoate-cholestane (3.77 g, 7.78 mmol) dissous dans du chlorure de méthyléne (60 mL). L'agitation est maintenue à température ambiante 3 heures. Le milieu réactionnel est lavé avec une solution aqueuse de sulfite de sodium (10 % en poids), une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. L'évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention de 3.50 g d’une poudre blanche (rendement quantitatif). Le 5,6a-Epoxycholestan-3B-hexanoate est utilisé tel quel sans purification supplémentaire. La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-Hydroxy-6B-[2-(1H-imidazole-4- yl)éthylamino]cholestane-3B-hexanoate de la manière suivante :

FN N A SA BuOH Ls O 130 °C, 48 h AA L’histamine sous sa forme basique (2.04 g, 18.4 mmol) est ajoutée à une solution butanolique (36 mL) d'un 5,6a-Epoxycholestan-3B-hexanoate (4.60 g, 9.20 mmol). Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation et à reflux, pendant 48 heures. L'avancée de la réaction est contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-Epoxycholestan-3B-propanoate. Après refroidissement, le milieu réactionnel est dilué dans 36 mL de méthyl tert-butyl éther, la phase organique est lavée par 4 fois 36 ML d’eau puis une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification. L’éluant utilisé est un mélange Acétate d’éthyle/Méthanol 99/1. Une poudre blanche de

1.48 g de 5a-Hydroxy-68-[2-(1H-imidazole-4-yl)éthylamino]cholestane-3B-hexanoate (31 % de rendement) est obtenue.

[114] Exemple 10 : Préparation d’un sel dilactate du composé 5a-Hydroxy-68-[2-(1H- imidazole-4-yl)éthylamino]cholestane-3B-yl hexanoate : Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B- octanoxyle a été préparé de la manière suivante :

; BE2020/5878 a es Te, x, Ra q{ me An, Il an | ; } 3 | [> / Tite VX is ie REX H © À, m7 © MA, a, ÉtOH Rs, en de LH A 38 STAM Pa be

166.2 mg d'acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.52 g de 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-octanoxyle (0.92 mmol) dans 5 mL d’éthanol anhydre sous agitation. L’agitation a été maintenue à température ambiante 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l’obtention d’une poudre blanche de 0.54 g de 5da-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- octanoxyle dilactate

[115] Exemple 11: Synthèse du composé de formule (I) pour des dérivés de 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-carbamate, _comprend les étapes suivantes : y N Ba UNS Sta tT es EN ‘ Vorige 2 $ PE a Sesam ” eggen et ur SPL ZEN Pepper” fon & Vod 5 inw EN ENST, 5% vn, : ss - Le cholestérol est dissous dans de la pyridine et mis à réagir avec un dérivé de chlorure carbamate pour 24 h à 60°C, - Les chemins réactionnels successifs sont les mêmes étapes développées pour la synthèse de la Dendrogénine A, notamment divulgué dans le brevet EP2782923B1, « Procédé de préparation de dérivés de stérol », dont le contenu est inclus par référence dans la présente invention.

[116] Exemple 12 : Synthèse du composé de formule (|) pour des dérivés 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-phosphate, comprend les étapes suivantes : , 2 EX th CPBA Te TS Ra PRE Pas ee nom A No | A Ne vas N 1 UH 7 xd 5 N J A J 2 f EN ie B TE 8 (TT Ba BDO, 246 Re gie at Or Be ve eo Lu Rz DRE fes HN eN . Lak - Le cholestérol est dissous dans de la pyridine et mis à réagir avec un dérivé de chlorure phosphonate pour 24 h à 60°C, PEZ020/5679 - Les chemins reactionnels successifs sont les mêmes étapes développées pour la synthèse de la Dendrogénine A (voir ci-dessus).

[117] Exemple 13 : Synthèse des composés L-Alanine 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylam_ino]-cholestan-3B-yl ester, L- Arginine_5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, _L-Aspargine _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, _L-Aspartate _5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, L-Cystéine _5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl __ester, __ Glycine __5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, _L-Glutammate _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, L-Glutamine _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl _ ester, _L-Histidine _5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl __ester,L-Isoleucine __5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl _ ester, _L-Leucine _ 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl __ ester, L-lysine____5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, _L-Methionine _5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, L-Phenylalanine 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl __ester, __L-Proline __5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl __ ester, __L-Sérine __5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, _L-Thréonine _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, L-Tryptophane_5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl _ ester, L-Tyrosine ___5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, L-Valine __5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl ester, comprennent les étapes suivantes : — dissolution des différents acides aminés en CH3CN et ajout des réactifs DMAP et (BOC)zO pour protéger leurs groupes aminés, — chloruration du groupe carbonyle avec SOCL, — estérification du cholestérol avec les chlorures dérivés en pyridine, - Les chemins réactionnels successifs sont les mêmes étapes développées pour la synthèse de la Dendrogénine A (voir ci-dessus).

[118] Exemple 14 : Etude de la cytotoxicité des composés 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle, 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-éthoxyle et 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate :

Pour cette expérience, un milieu de culture cellulaire a été préparé. Le milieu de culture est constitué d’un milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) commercialisé par Westburg sous la référence LO BE12-604F), comprenant 4.5 g/L Glucose avec de la L- Glutamine, auquel y est ajouté 10% de sérum de veau fœtal (SVF). Des cellules Neuro2a (neuroblastome murin) sont introduites dans ce milieu de culture. Il a été ensemencé des boites de 24 puits avec 10000 cellules Neuro2a par puits. Après 72 heures (h) de culture en condition normale, c’est-à-dire dans un incubateur à une température de 37 °C à 5% d’O2, les cellules Neuro2a ont été traitées pendant 48h avec le 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl-propanoate et le 5da-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol à 100 nM, 1 UM et 10 uM. Un contrôle (CTL) est également réalisé en utilisant le protocole décrit précédemment sans le traitement avec les composés précités. La survie cellulaire est quantifiée par un test de bleu de trypan avec comptage automatique par l’appareil Biorad TC20 (TC20TM Automated Cell Counter). Le test via le bleu de trypan est basé sur l'intégrité des membranes cellulaire, laquelle est rompue chez les cellules mortes. Le bleu de trypan colore les cellules mortes en bleu. L'appareil de comptage cellulaire Biorad TC20 compte la proportion de cellules bleues et non-bleues, et rapporte au pourcentage de cellules. Les résultats sont représentés figure

1. La figure 1 illustre en ordonnée le pourcentage de survie cellulaire par rapport au groupe contrôle. Il est illustré figure 1 que pour 100 nM de traitement avec les composés 5a-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate et le 5da-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol, le pourcentage de cellule vivante reste inchangé en comparaison au groupe contrôle (CTL). En outre, pour une concentration de 1 um de 5a- hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-ol, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate, le pourcentage de survie cellulaire est respectivement de 85,42 % avec un standard de déviation (SD) autrement appelé écart type égale à 4,729, 87.76% avec un SD de 13,01 ; 54,91 avec un SD 4,12 et 84,08 avec un SD de 4,09. Pour une concentration de 10 um de 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-0l, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-36-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate, le pourcentage de survie cellulaire est respectivement de 43,25 % SD 2,44 , 21,67 % sp 9205878 7,18, 26,83 % SD 2,64 et 30,46 % SD 5,22. En conclusion, on observe une activité cytotoxique des composés de formule (I) envers les cellules tumorales Neuro2a pour des concentrations de 1 um pour 5a-hydroxy-6B8-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate et 10 um pour 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-©B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, Sa-hydroxy-86-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate.

[119] Exemple 15: Effet des composés 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-méthoxyle,_50-hydroxy-88-[2-(1H-imidazol-4-y[)-éthylamino]-cholestan-38- ethoxyle et_5a-hydroxy-88-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-36-yl propanoate sur la viabilité des cellules MCF-7 : Un test de viabilité cellulaires a été réalisé sur des cellules tumorales mammaires MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) surexprimant HER2 (cellules ER(+)) contenant des récepteurs pour l'hormone d'osstrogène.

Les cellules MCF-7 sont dans un milieu de culture cellulaire identique à l'exemple 14 et sont ensemencées dans des plaques 12 puits à 50000 cellules par puits durant 24 h. 24 heures après ensemencement, les cellules sont traitées par le solvate véhicule comprenant de l’eau et de l’éthanol avec un rapport 1%o d’éthanol et comprenant le 5a- hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2- (1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-3B8-yl propanoate ou le 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol à 1, 2.5 ou 5 HM. Les cellules sont observées au microscope inversé et photographiées via la caméra du microscope à 24 h et 48 h. Les modifications morphologiques des cellules à 1 UM sont très faibles. On observe quelques vésicules blanches après 24 heures de traitement avec le 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol.

Dans ce test : - Les vésicules blanches traduisent la mort cellulaire par autophagie cytotoxique ; - Les cellules qui s’arrondissent traduisent la mort cellulaire ; - Les cellules qui se décrochent traduisent un effet cytotoxique ; - Les cellules adhérentes traduisent une survie cellulaire ; - Les cellules surnageantes traduisent une mort cellulaires ; et - Les cellules réfringentes traduisent la mort cellulaire.

[120] [Tableau 1] Morphologie des cellules MCF7 après 24 heures et 48 heures de traitement par le 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol et ses dérivés : 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Effet cytostatique. L'effet cytostatique est imidazol-4-yl)-éthylamino]- De nombreuses vésicules davantage marqué. Il y a cholestan-3B-ol à 2.5 HM blanches. davantage de cellules qui Quelques cellules arrondies | s'arrondissent en comparaison à l’observation a24h.. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Quasi-totalité des cellules Toutes les cellules sont imidazol-4-yl)-éthylamino]- surnageantes (assez surnageantes. cholestan-3B-ol à 5 HM réfringentes). Rares cellules adhérentes avec vésicules. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Présence de vésicules Davantage de vésicules imidazol-4-yl)-éthylamino]- blanches mais légèrement blanches, de cellules qui cholestan-3B-méthoxyle à inférieure au 5a-hydroxy-6f- | s’arrondissent et de cellules

2.5 uM [2-(1H-imidazol-4-yl)- qui se décrochent. éthylamino]-cholestan-3B-ol | L'effet cytotoxique semble à 2.5 pM. supérieur à celui observé Présence de cellules pour le 5a-hydroxy-6B-[2- arrondies. (1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol à 2.5 uM. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Effet similaire au 5a- Effet similaire au 5a- imidazol-4-yl)-éthylamino]- hydroxy-68-[2-(1H-imidazol- | hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- cholestan-3B-méthoxyle à 5 | 4-yl)-éthylamino]-cholestan- | 4-yl)-éthylamino]-cholestan- UM 3ß-ol à 5 UM. 3ß-ol à 5 UM. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Présence de vésicules Effet similaire au 5a- imidazol-4-yl)-éthylamino]- blanches en quantité hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol- cholestan-3B-ethoxyle à 2.5 | légèrement inférieures que | 4-yl)-éthylamino]-cholestan- UM le 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H- 3B-ol à 2,5 UM mais imidazol-4-yl)-éthylamino]- comporte moins de cholestan-3B-ol à 2,5 HM. vésicules blanches. Présence de cellules arrondies en quantité légèrement inférieure ou similaire en comparaison au traitement au 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B- méthoxyle à 2,5 UM. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Effet similaire au 5a- Effet similaire au 5a- imidazol-4-yl)-éthylamino]- hydroxy-68-[2-(1H-imidazol- | hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- cholestan-3B-ethoxyle à 5 4-yl)-éthylamino]-cholestan- | 4-yl)-éthylamino]-cholestan- UM 3ß-ol à 5 UM. 3ß-ol à 5 UM.

BF2020/5878 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Effet cytotoxique inférieur Présence de quelques imidazol-4-yl)-éthylamino]- aux 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- vésicules blanches.et cholestan-3B-yl propanoate | imidazol-4-yl)-éthylamino]- cellules arrondies. à 2.5 uM cholestan-3B-ol, 5a- hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-méthoxyle et 5a- hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol- 4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-ethoxyle à 2,5 HM. Cependant, présence de quelques vésicules blanches. 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- Cellules adhérentes avec Presque toutes les cellules imidazol-4-yl)-éthylamino]- vésicules blanches. sont surnageantes. cholestan-3B-yl propanoate | L'effet est similaire au 5a- Quelques rares cellules à 5 uM hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol- | adhérentes. 4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3ß-ol à 2.5 uM. Les observations décrites ci-dessus illustrent que les composés de formule (I) présentent une activité cytotoxique sur les cellules MCF-7. Au vu des observations au microscope, il peut être classé les composés au regard de leurs activités, entrainant des cellules qui s’arrondissent et des vésicules blanches : - A 24 heures : Dendrogénine A > 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-méthoxyle > 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B- ethoxyle > 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate ; - À 48 heures : 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle > Dendrogénine A > 5da-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f- ethoxyle > 5a-hydroxy-66-[2-(1 H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate.

[121] A la suite de cette observation, un test de viabilité cellulaire est mesuré par marquage MTT à 48 heures. Ce test est basé sur l’utilisation du sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium). Le tétrazolium est réduit par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan, précipité de couleur violette. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes mais également à l'activité métabolique de chaque cellule. Ainsi, un simple dosage de la densité optique à 540 nm par spectroscopie permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Après 48 heures, le milieu est aspiré, les cellules lavées au tampon phosphate salin (PBS) puis incubées avec du MTT (0.5 mg/ml dans du PBS) pendant environ 2 heures. La solution de MTT est aspirée puis les cristaux violets sont solubilisés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). La DO (densité optique) est mesurée à 540 nm.

[122] Les résultats de ce test sont présentés figure 2. La figure 2 illustre en ordonnée le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au groupe contrôle. Le groupe contrôle est réalisé de manière similaire aux groupes étudiés sans l’ajout des molécules étudiées dans le présent texte. En comparaison au contrôle, il est mesuré une diminution dose dépendante 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle de la viabilité cellulaire en MTT pour 50-hydroxy-88-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B- ethoxyle, 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate et le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol.

Pour une concentration de 2,5 uM, il est observé une diminution de la viabilité cellulaire sur les cellules MCF-7 au regard du groupe contrôle. Le traitement avec le composé 5a- hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol entraine une viabilité cellulaire proche de 60 % au regard du groupe contrôle. Pour le composé 5a-hydroxy-6B- [2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle ; la viabilité cellulaire est d’environ 31 %. Concernant 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan- 3B-ethoxyle, la viabilité cellulaire est d’environ 55 %. Enfin pour 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate, la viabilité cellulaire est d’environ 95 %. En conclusion, pour un traitement avec une concentration de 2,5 uM, on obtient un ordre d’efficacité suivant : 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B- méthoxyle > 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle > Dendrogénine A > 5da-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate.

Pour un traitement à une concentration de 5 uM, il est observé une diminution de la viabilité cellulaire sur les cellules MCF-7 au regard du groupe contrôle. Les traitements avec les composés 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol, 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle et 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, il est observé une viabilité cellulaire proche de 0 % au regard du groupe contrôle. Concernant le traitement avec 5a-hydroxy- 6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f-yl propanoate, la viabilité cellulaire est d’environ 18 %. En conclusion, pour un traitement avec une concentration de 5 HM, on obtient un ordre d’efficacité suivant : Dendrogénine A > 5a-hydroxy-6f-[2-(1 H-imidazol-4- yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle > 5a-hydroxy-©B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle > 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate.

Cette expérience démontre une capacité de destruction de cellules tumorales mammaires par les composés de formule (I). Ces résultats sont concordant avec les observations 9978 réalisées à 24 h et 48 h précitées.

[123] Exemple 16 : Effet des composés 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-38-méthoxyle, _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38- ethoxyle, _5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl _propanoate sur l’activité de la Cholestérol Epoxyde Hydrolase (ChEH) dans des cellules MCF-7 :

[124] Les composés 5,6a-epoxycholesterol (5,6a-EC) et 5,6B-epoxycholesterol (5,6B-EC) sont des oxystérols impliqués dans la pharmacologie anticancéreuse du tamoxifène, un médicament antitumoral largement utilisé. Ils sont tous deux métabolisés en cholestane- 3B,5a,6B-triol (CT) par l'enzyme cholestérol-5,6-époxyde hydrolase (ChEH), et le CT est métabolisé par l’enzyme HSD11B2 (11B-Hydroxystéroïde déshydrogénase 2) en 6-oxo- cholestan-3B,5a-diol (OCDO), un oncostérone promoteur de tumeur. L'expérience suivante a pour but de démontrer la capacitée des composés 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle, 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, Sa-hydroxy-86-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate à bloquer la ChEH et donc à limiter la métabolisation d’oncostérone, un métabolite promoteur de tumeur.

[125] Des cellules MCF-7 sont dans un milieu de culture cellulaire identique à exemple 14 et sont ensemencées dans des plaques 6 puits à 150000 cellules par puits avec 3 puits par condition de traitement. 24 h après ensemencement, les cellules MCF-7 sont traitées par du [**C]5,60-EC (solution mère 1000X : 0.6mM ; 20pCi/umol ; concentration finale 0.6 HM) seul ou en association avec du Tamoxifène (tam). Le Tamoxifène est utilisé en tant que témoin positif des composés étudiés. Le traitement avec les composés selon l'invention est réalisé à une concentration de 1 HM.

[126] Après 24 heures de traitement, les milieux sont collectés et des extraits lipidiques sont préparés à partir des culots cellulaires par extraction avec 100 uL de chloroforme, 400 HL de méthanol et 300 uL d’eau. Les extraits lipidiques sont analysés par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant l’acétate d'éthyle (EtOAc) en tant qu’éluant. L'analyse est réalisée à l’aide d’un lecteur de plaque puis par autoradiographie.

[127] Les résultats sont présentés figure 3. Il est observé la métabolisation quasi-totale de l’époxyde en CT et OCDO (puits 2 et 4) et une inhibition totale de l’activité ChEH par le Tamoxifène et presque totale (trace de CT) par le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ol. Une inhibition presque totale de la ChEH est observée avec le traitement au 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-38-méthoxyle, elle est légèrement inférieure à l’inhibition engendré par le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-

| | BE2020/5878 4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol. Concernant 50-hydroxy-88-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle, Sa-hydroxy-86-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-yl propanoate, une inhibition de la ChEH est observée au regard du témoin (1), elle est cependant moins importante que le témoin positif (2), le 5a-hydroxy-6B-[2-(1H- imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-ol et le 5a-hydroxy-6B8-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-méthoxyle. Ces résultats permettent de déduire l’ordre d'efficacité suivant : Dendrogénine A > 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]- cholestan-3B-méthoxyle > 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B- ethoxyle > 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate. En conclusion, les composés étudiés possèdent une activité inhibitrice de la ChEH. Il est observé que l’ordre d’efficacité est identique de l’ordre établi pour les modifications morphologiques observées après 24 heures de traitement pour les cellules MCF-7 de l'exemple 15.

[128] [Tableau 1] Tableau des composés préférés selon l’invention : SS en Miis NS 2 SET | SE HO $S 5e H © H N et ed | HM N +, eN = EN CON ; À NN” HN 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- est vee 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-y1)- éthylamino]-cholestan-3B-ethoxyle ° es, > Hil ee rn T° MC pe 7 H S | À â PT © >= y N SM HN 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- 5a-hydroxy-6B-[2-(1H-imidazol-4-yl)- éthylamino]-cholestan-3B-yl hexanoate éthylamino]-cholestan-3B-yl propanoate

[129] Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.

[130] L'usage du verbe « comporter », « comprendre » ou « inclure » et de ses formes conjuguées n’exclut pas la présence d’autres éléments ou d’autres étapes que ceux énoncés dans une revendication.

[131] Dans les revendications, tout signe de référence entre parenthèses ne saurait être interprété comme une limitation de la revendication.

Claims

Revendications BE2020/5878

1. Composé de formule (1) ;

TY HO à

HN N OT =

H ou un sel pharmaceutiquement acceptable d’un tel composé, dans lequel R; est choisi parmi : - une chaîne carbonée en Ci à CZ0, - un groupement - P(OYOR2)(ORs3), - un groupement - C(O)NR2Rs, où Ra, Ra, Ra et Rs sont équivalents ou différents et sont H ou une chaîne carbonée en Ci à C20 ; - un groupement - C(O)Re, - un groupement - C(OJORz, où Re et R7 est une chaîne carbonee en C1 à 020; - Un groupement - C(O)CHNHaRs où Rs est la chaîne latérale des acides aminés essentiels et est choisi parmi H, CH, CHICH(CHa)>, -CH(CHs)CH2CHz, -(CHa}s, - CH(CHs)a, CH>CeHs, -CH>-CaNoHs, -CH2CaNHe, (CH2)NHC(NFINH>, -(CH2)aNH2, -CH2C{(O)NHz, (CH2)2C(O)NH2, -CH2C(OIOH, (CH2)2C(O)OH, -CH2CeOHs, - CH2OH ; -CH(OH)CHz ; -CH2SH ; (CH2)2SCHa, et lorsque R+, Ra, Ra, Ra, Rs, Re et R; est une chaîne carbonée en C1 à C20, elle peut être indépendamment saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée et contient éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle et aryle, ledit groupe aryle contenant éventuellement des hétéroatomes choisis parmi N, O, et 5, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifere.

2. Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel Rı est une chaîne carbonée en C1 à C8. BE2020/5878

3. Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel R, est un groupement -C(O)Rs avec Rs est une chaîne carbonée en C2 à CB.

4. Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel le composé de formule (1) est choisi parmi : - 5a-hydroxy-55-[2-(1 H-imidazoi-d-yD-éthylamino|-cholestan-38-méthoxyle : - 5a-hydroxy-65-12-(1H-imidazol-4-v}-éthylaminol-cholestan-35-éthoxyle ; - 5a-hydroxy-65-[2-(1H-imidazol-4-vh-éthylamino]-cholestan-35-yl propanoate ; - 5a-hydroxy-65-[2-(1H-imidazol-4-v)-éthylamino)-cholestan-36-yl hexanoate.

5. Composé pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la tumeur cancéreuse est un cancer chimiosensible.

6. Composé pour son utilisation selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel la tumeur cancéreuse est un cancer chimiorésistant.

7. Composé pour son utilisation selon la revendication 6 dans lequel le cancer chimiorésistant est un cancer hématologique ou du sang, tel que la leucémie, en particulier la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le lymphome, en particulier le Iymphome non-hodgkinien et le myélome multiple.

8. Composé pour son utilisation selon l’une des revendications 5 et 6 dans lequel ledit cancer est chimiorésistant à la daunorubicine, à la cytarabine, au fluorouracile, au cisplatine, à l'acide tout-trans-rétinoïque, au trioxyde d'arsenic, au bortézomib ou à Pune de leurs combinaisons.

9. Composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un composé selon l’une des revendications 1 à 8 pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, comprenant au moins un autre agent thérapeutique.

11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, dans laquelle l’autre agent thérapeutique est un agent antinéoplasique.

12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d’une tumeur qui est chimiorésistante audit agent antinéoplasique lorsqu'il n’est pas administré en combinaison avec un composé selon l’une des revendications 1 à 8,

13. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d’une tumeur qui est chimiosensible audit agent antinéoplasique, et la dose de l'agent antinéoplasique administrée audit patient en combinaison avec un composé selon l’une des revendications 1 à 8 ou PunBE2020/5878 de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l’agent antinéoplasique lorsqu'il n’est pas administré en combinaison avec un composé selon Pune des revendications 1 à 8.

14. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 9 à 13, caractérisée par le fait qu'elle est sous forme appropriée pour être administrée par voie intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale.