CA3196518A1

CA3196518A1 - Analogues du 5 alpha-hydroxy-6 beta-[2-(1-h-imidazol-4-yl)ethylamino]-cholestan-3 beta-ol et compositions pharmaceutiques le comprenant pour utilisation dans le traitement du cancer

Info

Publication number: CA3196518A1
Application number: CA3196518A
Authority: CA
Inventors: Stephane Silvente; Quentin MARLIER; Arnaud RIVES; Nicolas Caron; Dario MOSCA; Helene Michaux
Original assignee: Individual
Current assignee: Dendrogenix
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-05-05
Also published as: JP2023551363A; AU2021372797A1; WO2022090427A1; KR20230097077A; AU2021372797A2; US20230391817A1; EP4236963A1

Abstract

L'invention concerne un nouveau composé de formule générale (I) et/ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, une composition pharmaceutique comprenant au moins ledit composé, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

Description

BETA42-(1-H-IMIDAZOL-4-YL)ETHYLAMIN0]-CHOLESTAN-3 BETA-OL ET
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LE COMPRENANT POUR
UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DU CANCER
Domaine technique [1] L'invention se rapporte au domaine des composés stérols et plus particulièrement à des analogues du composé 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-ol et compositions pharmaceutiques les comprenant pour leur utilisation dans le traitement du cancer.
Arrière-plan technologique

[2] Le terme cancer ou tumeur cancéreuse englobe un groupe de maladies se caractérisant par la multiplication et la propagation anarchiques de cellules anormales. Si les cellules cancéreuses ne sont pas éliminées, l'évolution de la maladie va mener plus ou moins rapidement au décès de la personne touchée.

[3] La prise en charge du cancer implique la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, qui peuvent être utilisées seules ou en association, simultanément ou séquentiellement.
La chimiothérapie utilise des agents antinéoplasiques qui sont des médicaments qui empêchent ou inhibent la maturation et la prolifération des néoplasmes. Les agents antinéoplasiques agissent en ciblant efficacement les cellules à division rapide. Comme les agents antinéoplasiques affectent la division cellulaire, les tumeurs avec un fort taux de croissance (telles que la leucémie myéloïde aiguë et les lymphomes agressifs, y compris la maladie de Hodgkin) sont plus sensibles à la chimiothérapie, car une plus grande proportion des cellules ciblées subit une division cellulaire à tout moment. Les tumeurs malignes avec des taux de croissance plus lents, comme les lymphomes indolents, ont tendance à répondre beaucoup plus modestement à la chimiothérapie.
Cependant, le développement de la chimiorésistance est un problème persistant pendant le traitement de chimiothérapie. Par exemple, le traitement conventionnel de la leucémie myéloïde aiguë (LMA) comprend l'administration combinée de cytarabine avec une anthracycline, telle que la daunorubicine. Le taux de survie globale à 5 ans est de 40 (3/0 chez les jeunes adultes et d'environ 10 % chez les patients âgés. Les taux de réponse varient considérablement avec le vieillissement, de 40 % à 55 % chez les patients de plus de 60 ans et de 24 % à 33 % chez les patients de plus de 70 ans. Ceci est encore pire pour les personnes âgées avec des profils cytogénétiques défavorables et le décès dans les 30 jours suivant le traitement varie de 10 % à 50 % avec l'âge et l'aggravation. Par ailleurs, la restriction de l'utilisation de ces molécules est due également à
des effets secondaires, et en particulier à l'émergence d'une toxicité cardiaque chronique (liée aux anthracyclines). Le taux de mortalité toxique liée à la chimiothérapie intensive est de 10 à
20 % chez les patients de plus de 60 ans.

[4] Avec ce profil bénéfice-risque du régime conventionnel, seulement 30 c'/0 des personnes âgées avec une LMA nouvellement diagnostiquée reçoivent une chimiothérapie antinéoplasique.

[5] Au cours des dernières décennies, il n'y a eu qu'une amélioration modeste des résultats pour les patients plus jeunes atteints de LMA, mais aucune pour les adultes de plus de 60 ans (la plupart des patients atteints de LMA).

[6] Il existe donc un réel besoin de développer des molécules utiles dans le traitement de ces tumeurs cancéreuses qui présentent des problèmes de chimiorésistance et de toxicité
intrinsèque des médicaments antinéoplasiques. Les données précitées soulignent la nécessité de trouver de nouvelles approches qui combinent à la fois une réduction des schémas posologiques d'agents antinéoplasiques pour le traitement des tumeurs chimiosensibles à une diminution de la résistance des tumeurs chimiorésistantes à l'agent antinéoplasique.

[7] On connaît du document EP3272350B1 le composé 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-ol, connu sous le nom de Dendrogénine A, et nommé ci-après DX101, utile pour le traitement des tumeurs chimiorésistantes. La Dendrogénine A est capable de restaurer la sensibilité des tumeurs chimiorésistantes à un agent antinéoplasique ou d'augmenter les effets des agents antinéoplasiques sur les tumeurs, ce qui permet à son tour de réduire la dose cytotoxique efficace d'agents antinéoplasiques contre les tumeurs chimiosensibles.

[8] Le document de De Medina et al. (Biochimie, 2021, 95(3), 482-488, XP028982107, Technical note: Hapten synthesis, antibody production and development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of the natural steroidal alkaloid Dendrogenin A) décrit des dérivés de Dendrogénine A pour lesquels l'alcool en position 3p est fonctionnalisé pour leur utilisation comme haptènes pour la production d'anticorps.

[9] Le document de De Medina et al. (J.Med. Chem., 2009, 52(23), 7765-77, XP9131948, Synthesis of new alkylaminooxysterols with potent cell differentiating activities:
identification of leads for the treatment of cancer and neurodegenerative diseases) décrit des dérivés de Dendrogénine A pour lesquels l'alcool en position 33 est éventuellement fonctionnalisé par un radical méthanoate ou propanoate, pour le traitement du cancer.

[10]
L'objet de la présente invention est de fournir de nouveaux composés et analogues au composé Dendrogénine A, utiles pour traiter les tumeurs cancéreuses, notamment les tumeurs chimiosensibles et/ou chimiorésistantes.

[11]
De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des analogues spécifiques du composé Dendrogénine A (nommé également DX101), présentent une activité
pharmacologique comparable à la Dendrogénine A.
Résumé
L'invention a pour premier objet un composé de formule (I) ;
R1 Hd H

ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, dans lequel :
Ri est choisi parmi F, N3, OCRI-12n+1, NR23, SR2, S02R2 , avec n 8, R2 et R3 sont indépendamment choisis parmi : H, un groupement alkyle en Cl à
08, saturé
ou insaturé, contenant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle, arène et hétérocyclique, pour son utilisation en tant que médicament, et plus particulièrement en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

[12]
L'invention a pour second objet une composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un composé de formule (I) pour son utilisation pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.
Définitions

[13]
Dans cette description, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, il est entendu que, lorsqu'un intervalle est donné, il inclut les bornes supérieures et inférieures dudit intervalle.

[14]
Dans la présente invention, tout au long de la présente description et des revendications annexées, les termes suivants, sauf indication contraire, doivent être compris comme ayant la signification suivante :

[15]
Le terme solvate est utilisé ici pour décrire un complexe moléculaire comprenant un composé de l'invention et contenant des quantités stoechiométriques ou sous-stoechiométriques d'une ou plusieurs molécules de solvant pharmaceutiquement acceptable telles que l'éthanol. Le terme hydrate fait référence lorsque ledit solvant est de l'eau.

[16] Le terme humain fait référence à un sujet des deux sexes et à tout stade de développement (c'est-à-dire un nouveau-né, nourrisson, juvénile, adolescent, adulte).

[17] Le terme patient fait référence à un animal à sang chaud, plus préférablement un humain, qui attend la réception ou qui reçoit des soins médicaux et/ou qui sera l'objet d'un acte médical.

[18] Par pharmaceutiquement acceptable il est entendu que les ingrédients d'un produit pharmaceutiquement acceptable sont compatibles les uns avec les autres et ne sont pas nuisibles pour le patient de ce produit.

[19] Le terme véhicule pharmaceutique tel qu'utilisé dans ce texte signifie un support ou un milieu inerte utilisé comme solvant ou diluant dans lequel l'agent pharmaceutiquement actif est formulé et / ou administré. Des exemples non limitatifs de véhicules pharmaceutique comprennent les crèmes, les gels, les lotions, les solutions et les liposomes.

[20] Le terme administration , signifie délivrer, l'agent actif ou l'ingrédient actif (par exemple le composé de formule (I), dans une composition pharmaceutiquement acceptable, au patient dans lequel une condition, un symptôme et/ou une maladie doit être traitée.

[21] Les termes traiter et traitement tels qu'utilisés ici incluent atténuer, apaiser, stopper, soigner une condition, un symptôme et/ou une maladie.

[22] Le terme analogue tels qu'utilisés ici signifie un composé ayant une structure chimique similaire à un autre composé de référence, mais différant de celui-ci par un certain composant. Il peut différer d'un ou de plusieurs atomes, groupes fonctionnels, sous-structures, qui sont remplacés par d'autres atomes, groupes fonctionnels ou sous-structures. Les analogues peuvent avoir des propriétés physiques, chimiques, biochimiques ou pharmacologiques différentes. Dans la présente invention, les composés analogues sont en référence au composé Dendrogénine A. Ces analogues présentent des propriétés pharmacologiques identiques ou similaire par rapport au composé de référence.

[23] Par "cancer chimiorésistant", on entend un cancer chez un patient où
la prolifération des cellules cancéreuses ne peut être empêchée ou inhibée au moyen d'un agent antinéoplasique ou d'une combinaison d'agents antinéoplasiques habituellement utilisés pour traiter ce cancer, à une dose acceptable pour le patient. Les tumeurs peuvent être intrinsèquement résistantes avant la chimiothérapie, ou une résistance peut être acquise pendant le traitement par des tumeurs initialement sensibles à la chimiothérapie.

[24] Par ''cancer chimiosensible", on entend un cancer chez un patient qui répond aux effets d'un agent antinéoplasique, c'est-à-dire que la prolifération des cellules cancéreuses peut être empêchée au moyen dudit agent antinéoplasique à une dose acceptable pour le patient.

[25] Le composé de formule (I) appartient au groupe des stéroïdes.
La numérotation des atomes de carbone du composé de formule (I) suit donc la nomenclature définie par l'IUPAC dans Pure & Appl. Chem., Vol.61, No.10, pp.1783-1822,1989. La numérotation des atomes de carbone d'un composé appartenant au groupe des stéroïdes selon l'IUPAC
est illustrée ci-dessous :
z

26 12 16 23, 24 25 19 D le I g 2 e 14 A

[26] Dans la présente invention, les abréviations suivantes signifient :
LMA : leucémie myéloïde aiguë;
15 Dendrogénine A : 50-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-ol ;
MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7;
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium ;
SVF : sérum de veau foetal ;
ChEH : Cholestérol Epoxyde Hydrolase 20 Neuro2a : neuroblastome murin ;
CTL : Contrôle ;
MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium ;
PBS : tampon phosphate salin ;
DMSO : diméthylsulfoxyde ;
DO : densité optique ou absorbance ;
CT : cholestane-313,5a,613-triol ;
OCDO : 6-oxo-cholestan-313,50-diol ;
5,6a-EC : 5,6a-epoxycholesterol ;

27 6 Tam : Tamoxifène ;
CCM : chromatographie sur couche mince.
P0.: per os LC/MS : chromatographie liquide/ spectrométrie de masse Description des modes de réalisation [27] L'invention concerne en premier objet un composé de formule (I) ;
HO
H

ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, dans lequel :
Ri est choisi parmi F, N3, OCnH2n+1 NR2R3, S R2, S02R2, avec n 8, R2 et R3 sont indépendamment choisis parmi : H, un groupement alkyle en Cl à
08, saturé
ou insaturé, contenant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle, arène et hétérocyclique, pour son utilisation en tant que médicament.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule (I) ;
HO
H
H
ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, dans lequel :
Ri est choisi parmi F, N3, OCnH2n+1 NR2R3, S R2, S02R2 , avec n 8, R2 et R3 sont indépendamment choisis parmi : H, un groupement alkyle en Cl à
08, saturé
ou insaturé, contenant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle, arène et hétérocyclique, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

[28] Dans la présente invention :
- le groupe carbonyle fait référence à tous les groupes fonctionnels contenant le groupe oxo (un atome d'oxygène doublement lié (=0) à un atonie de carbone) et peut être choisi parmi les aldéhydes, les cétones, l'acide carboxylique, les esters, les amides et/ou l'anhydride.
- le terme allyle fait référence à un groupe fonctionnel alcénique de formule semi-développée H2C=CH-C1-12-=
- le terme sulfonyle est un composé chimique où l'atome de soufre est combiné
à deux atomes d'oxygène doublement liés (=0) et à son radical.
- le terme arène fait référence à tous les hydrocarbures aromatiques monocycliques et polycycliques - le terme hétérocyclique fait référence à des composés aromatiques monocycliques et polycycliques comportant comme éléments cycliques un ou plusieurs hétéroatomes parmi 0, S et/ou N.
Dans la définition du composé de formule (1) selon l'invention, le radical du carbone 3 peut être en position a ou p. La position p étant un mode de réalisation préféré.

[29] Selon un mode de réalisation, le composé de formule (1) est un analogue 0-aminé
dans lequel le radical Ri = NR2R3 avec R2 étant H ou COCnI-12,1-0 et R3 = H.

[30] Dans ce mode de réalisation, le composé de formule (I) est plus particulièrement le 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-3p-acétamide (nommé DX127).

[31] Dans ce mode de réalisation, le composé de formule (I) est plus particulièrement le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-3p-amino (nommé DX125).

[32] Dans ce mode de réalisation, le composé de formule (I) est plus particulièrement le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-3p-azoture (nommé DX123).

[33] Selon encore un mode de réalisation, le composé de formule (1) est le 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro (nommé DX111).

[34] Selon encore un autre mode de réalisation, le composé de formule (1) est un analogue 0-alkylé et présente un radical Ri = OCRI-12n+i avec n 8, et est choisi parmi :
- 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthoxyle (nommé
DX103) 5a-hydroxy-6642-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-éthoxyle (nommé
DX105) - 5a-hydroxy-6642-(1H-1midazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-octanoxyle (nommé
DX115)

[35] De manière plus préférentielle encore, le composé de formule (1) est un analogue alkylé tel que 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-méthoxyle (DX103) et 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-

36-éthoxyle (DX105).
[36] Selon un mode de réalisation supplémentaire, le composé de formule (I) est un analogue soufré et présente un radical R1 = S02R2 avec R2 étant H ou OCnH2n_o, avec n < a

[37] Dans ce mode de réalisation, le composé de formule (1) est préférentiellement le 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-méthylsulfo nyle (nommé
DX129).

[38] Selon un mode de réalisation, le composé de formule (I) est destiné à être utilisé
dans le traitement du cancer du sein, de la prostate, colorectal, du poumon, de la vessie, de la peau, de l'utérus, du col de l'utérus, de la bouche, du cerveau, de l'estomac, du foie, de la gorge, du larynx, de l'oesophage, de l'os, de l'ovaire, du pancréas, du rein, de la rétine, du sinus, des fosses nasales, du testicule, de la tyroïde, de la vulve, le traitement du lymphome, lymphomes non hodgkiniens, lymphomes hodgkiniens, de la leucémie, la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le myélome multiple, carcinome à cellules de Merkel ou mésothéliome.

[39]
Selon un mode de réalisation, le cancer est un adénocarcinome acineux, un carcinome acineux, un mélanome acro-lentigineux, une kératose actinique, un adénocarcinome, un carcinome adénoïde kystique, un carcinome adénosquameux, un carcinome annexiel, une tumeur du repos surrénal, carcinome adrénocortical, carcinome sécrétant de l'aldostérone, sarcome alvéolaire de la partie molle, carcinome améloblastique de la thyroïde, angiosarcome, carcinome apocrine, tumeur d'Askin, astrocytome, carcinome basocellulaire, carcinome basaloïde, carcinome basosquameux, cancer des voies biliaires, cancer de la moelle osseuse, sarcome botryoïde, carcinome bronchioalvéolaire, adénocarcinome bronchogène, carcinome bronchogène, carcinome ex adénome pléomorphe, chlorome, carcinome cholangiocellulaire, chondrosarcome, choriocarcinome, carcinome du plexus choroïde, adénocarcinome à cellules claires, cancer du côlon, comédocarcinome, carcinome producteur de cortisol, carcinome à cellules cylindriques, liposarcome différencié, adénocarcinome canalaire de la prostate, carcinome canalaire, carcinome canalaire in situ, cancer duodénal, carcinome eccrine, carcinome embryonnaire, carcinome de l'endomètre, carcinome stromal de l'endomètre, sarcome épithélioïde, sarcome d'Ewing, carcinome exophytique, sarcome fibroblastique, fibrocarcinome, carcinome fibrolamellaire, fibrosarcome, carcinome folliculaire de la thyroïde, cancer de la vésicule biliaire, adénocarcinome gastrique, carcinome à cellules géantes, sarcome à
cellules géantes, tumeur osseuse à cellules géantes, gliome, glioblastome multiforme, carcinome à cellules de granulosa, cancer de la tête et du cou, hémangiome, hémangiosarcome, hépatoblastome, carcinome hépatocellulaire, Carcinome à
cellules de Hürthle, cancer iléal, carcinome lobulaire infiltrant, carcinome inflammatoire du sein, carcinome intraductal, carcinome intra-épidermique, cancer du jéjunum, sarcome de Kaposi, tumeur de Krukenberg, carcinome à cellules de Kulchitsky, sarcome à
cellules de Kupffer, carcinome à grandes cellules, cancer du larynx, mélanome de lentigo maligna, liposarcome, carcinome lobulaire, carcinome lobulaire in situ, lymphoépithéliome, lymphosarcome, mélanome malin, carcinome médullaire, carcinome médullaire de la thyroïde, médulloblastome, carcinome méningé, carcinome micropapillaire, sarcome à
cellules mixtes, carcinome mucineux, carcinome muco-épidermoïde, mélanome mucosal, liposarcome myxoïde, myxosarcome, carcinome nasopharyngé, néphroblastome, neuroblastome, mélanome nodulaire, cancer du rein à cellules non claires, cancer du poumon à cellules non petites, carcinome à cellules d'avoine, mélanome oculaire, cancer buccal, carcinome ostéoïde, ostéosarcome, cancer des ovaires, carcinome de Paget, pancréatoblastome, adénocarcinome papillaire, carcinome papillaire, carcinome papillaire de la thyroïde, cancer pelvien, carcinome périampullaire, tumeur phyllode, cancer de l'hypophyse, liposarcome pléomorphe, blastome pleuropulmonaire, carcinome intra-osseux primaire, cancer du rectum, carcinome des cellules rénales, rétinoblastome, rhabdomyosarcome, liposarcome à cellules rondes, cancer cicatriciel, cancer de la vessie schistosomique, carcinome schneidérien, carcinome sébacé, carcinome à cellules en anneau, cancer de la peau, cancer du poumon à petites cellules, ostéosarcome à
petites cellules, sarcome des tissus mous, sarcome à cellules fusiformes, carcinome épidermoïde, cancer de l'estomac, mélanome à diffusion superficielle, sarcome synovial, sarcome télangiectasique, carcinome du canal terminal, cancer des testicules, cancer de la thyroïde, carcinome des cellules transitoires, carcinome tubulaire, mélanome tumorigène, carcinome indifférencié, adénocarcinome de l'urètre, cancer de la vessie, cancer de l'utérus, carcinome du corps utérin, mélanome de l'utérus, cancer du vagin, carcinome verruqueux, carcinome villeux, liposarcome bien différencié, tumeur de Wilms ou tumeurs des cellules germinales.

[40] Dans un mode de réalisation préféré, le composé de formule (I) est destiné à être utilisé dans le traitement du cancer du sein chez les mammifères.

[41] Selon un mode de réalisation, le composé est destiné à être utilisé
dans le traitement d'un cancer ch imiosensible.

[42] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le composé de formule (I) est destiné à être utilisé dans le traitement d'un cancer chimiorésistant.

[43] Selon un mode de réalisation, le cancer chimiorésistant est un cancer hématologique ou du sang, tel que la leucémie, en particulier la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le lymphome, en particulier le lymphome non-hodgkinien et le myélome multiple.

[44] Selon un mode de réalisation, le cancer est chimiorésistant à la daunorubicine, à la cytarabine, au fluorouracile, au cisplatine, à l'acide tout-trans-rétinoïque, au trioxyde d'arsenic, au bortézomib ou à l'une de leurs combinaisons.

[45] Toutes les références aux composés de formules (I) comprennent les références aux sels, aux complexes multi-composants et leurs cristaux liquides. Toutes les références aux composés de formules (I) comprennent également les références aux polymorphes et leurs cristaux habituels.

[46] Le composé selon l'invention peut être sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. Un sel pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) comprend l'addition d'acide de celui-ci.

[47] Des sels acides appropriés sont formés à partir d'acides qui forment des sels non toxiques. Par exemple choisi parmi : l'acétate, l'adipate, le benzoate, le bicarbonate, le carbonate, le bisulfate, le sulfate, borate, camsylate, citrate, cyclamate, édisylate, ésylate, formate, furamate, gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphate, hibenzate, chlorhydrate de chlorure, brom hydrate, bromure, hydroiodure, iodure, iséthionate, lactate, malate, maléate, malonate mésylate, méthylsulfate, naphtylate, 2-napsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate, hydrogène phosphate, phosphate dihydrogène, pyroglutamate, saccarate, stérate, succinate, tan nate, sels de tartrate, tosylate, trifluoroacétate et xinofoate. De manière préféré, le sel pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) est formé à partir du lactate.

[48] Les sels pharmaceutiquement acceptables des composés de formule (I) peuvent être préparés par une ou plusieurs des trois méthodes suivantes :
(i) en faisant réagir le composé de formule (I) avec l'acide désiré ;
(ii) en éliminant un groupe protecteur labile en milieu acide ou basique d'un précurseur approprié du composé de formule (I) ou en ouvrant le cycle d'un précurseur cyclique approprié, par exemple une lactone ou un lactame, en utilisant l'acide ou la base désiré ;
ou iii) par conversion d'un sel du composé de formule (I) en un autre par réaction avec un acide ou une base appropriés ou au moyen d'une colonne échangeuse d'ions appropriée.

[49]
Ces trois réactions sont généralement effectuées en solution. Le sel obtenu peut précipiter et être recueilli par filtration ou peut être récupéré par évaporation du solvant.
Le degré d'ionisation du sel obtenu peut varier de complètement ionisé à
presque non ionisé.

[50]
L'invention concerne en deuxième objet une composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable au moins un composé selon l'invention, comme décrit ci-dessus pour son utilisation pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.

[51] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un autre agent thérapeutique.

[52] Selon un monde de réalisation préféré, cet autre agent thérapeutique est un agent antinéoplasique.

[53] Selon un mode de réalisation, l'agent antinéoplasique est un agent endommageant l'ADN tel que la camptothécine, l'irinotécan, le topotécan, l'amsacrine, l'étoposide, le phosphate d'étoposide, le téniposide, le cisplatine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le cyclophosphamide, le chlorambucil, la chlorméthine, le busulfan, le tréosulfan ou le thiotépa, un antibiotique antitumoral tel que la daunorubicine, la doxorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, la mitoxantrone, la valrubicine, l'actinomycine D, la mitomycine, la bléomycine ou la plicamycine, un antimétabolite tel que le 5-fluorouracile, la cytarabine, la fludarabine ou le méthotrexate, un antimitotique tel que le paclitaxel, le docétaxel, la vinblastine, la vincristine, la vindésine ou la vinorelbine, ou divers agents antinéoplasiques tels que le bortézomib, l'acide tout- trans-rétinoïque, le trioxyde d'arsenic, ou l'un de leurs produits combinés.

[54] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est utilisée dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d'une tumeur qui est chimiorésistante audit agent antinéoplasique lorsqu'il n'est pas administré en combinaison avec un composé
selon l'invention.

[55] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est utilisée dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d'une tumeur qui est chimiosensible audit agent antinéoplasique, et la dose de l'agent antinéoplasique administré audit patient en combinaison avec un composé selon l'invention ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l'agent antinéoplasique lorsqu'il n'est pas administré en combinaison avec un composé selon l'invention. En particulier, la dose de l'agent antinéoplasique administré audit patient en combinaison avec un composé selon l'invention ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l'agent antinéoplasique administré seul, sans autre principe actif.

[56] La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comprendre en outre d'autres composés thérapeutiques actifs utilisés couramment dans le traitement de la pathologie énoncée ci-dessus.

[57] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée par toutes voies, notamment par voies : intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pulmonaire, transmuqueuse (orale, intranasale, intravaginale, rectale), inhalation par spray nasal, utilisant une formulation en comprimé, capsule, solution, poudre, gel, particule ; et contenu dans une seringue, un dispositif implanté, une pompe osmotique, une cartouche, une micropompe ; ou tout autre moyen apprécié par l'artisan qualifié, bien connu dans l'art. L'administration spécifique à
un site peut être réalisée, par exemple par voie intratumorale, infra-articulaire, intrabronchique, intra-abdominale, intracapsulaire, intra-cartilagineuse, intracavitaire, intracérébelleu se, intracérébroventriculaire, intracolique, intracervicale, intragastrique, intra-hépatique, intracardiaque, intraostéale, intra-pelvien, intrapéricardique, intrapéritonéal, intrapleural, intraprostatique, intrapulmonaire, intrarectal, intrarénal, intrarétinien, intraspinal, intrasynovial, intrathoracique, intra-utérin, intravasculaire, intravésical, intralésionnel, vaginal, rectal, buccal, sublingual, intranasal ou transdermique dans un dosage adapté comprenant les véhicules usuels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. De manière préférée, la composition pharmaceutique est sous forme appropriée pour être administrée par voie intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale. La voie orale étant particulièrement préférée.

[58] Outre les animaux à sang chaud tels que les souris, les rats, les chiens, les chats, les moutons, les chevaux, les vaches et les singes, le composé de l'invention est également efficace sur les humains.

[59] Selon un mode de réalisation, les compositions pharmaceutiques pour l'administration des composés de cette invention peuvent être présentées sous forme de doses unitaires et peuvent être préparées par l'une des méthodes bien connues dans l'état de l'art. Toutes les méthodes comprennent l'étape consistant à mettre le principe actif en association avec le support qui constitue un ou plusieurs ingrédients accessoires. En général, les compositions pharmaceutiques sont préparées en mettant l'ingrédient actif en association avec un support liquide ou un support solide finement divisé ou les deux, puis, si nécessaire, en façonnant le produit dans la formulation souhaitée. Dans la composition pharmaceutique, le composé de l'objet actif est inclus en quantité suffisante pour produire l'effet souhaité sur le processus ou l'état des maladies. Les compositions pharmaceutiques contenant le principe actif peuvent se présenter sous une forme adaptée à
l'usage oral, par exemple sous forme de comprimés, de pastilles, de suspensions aqueuses ou huileuses, de poudres ou de granulés dispersibles, d'émulsions, de capsules, de sirops, d'élixirs, de solutions, de timbres buccaux, de gel oral, de chewing-gum, de comprimés à
mâcher, de poudre effervescente et de comprimés effervescents. Les compositions pharmaceutiques contenant le principe actif peuvent se présenter sous une forme de suspension aqueuse ou huileuse.

[60] Selon un mode de réalisation, les suspensions aqueuses contiennent les matières actives en mélange avec des excipients adaptés à la fabrication de suspensions aqueuses.
Ces excipients sont des agents de suspension, par exemple la carboxyméthylcellulose sodique, la méthylcellulose, l'hydroxy-propylméthylcellulose, l'alginate de sodium, la polyvinyl-pyrrolidone, la gomme adragante et la gomme d'acacia ; les agents dispersants ou mouillants peuvent être un phosphatide naturel, par exemple la lécithine, ou des produits de condensation d'un oxyde d'alkylène avec des acides gras, par exemple le stéarate de polyoxyéthylène, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des alcools aliphatiques à longue chaîne, par exemple l'heptadécaéthylène-oxycétanol, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des esters partiels dérivés d'acides gras et d'un hexitol, comme le monooléate de polyoxyéthylène sorbitol, ou des produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des esters partiels dérivés d'acides gras et d'anhydrides d'hexitol, par exemple le monooléate de polyéthylène sorbitol. Les suspensions aqueuses peuvent également contenir un ou plusieurs conservateurs, par exemple de l'éthyle, ou du n-propyle, du p-hydroxybenzoate, un ou plusieurs colorants, un ou plusieurs aromatisants, et un ou plusieurs édulcorants, comme le saccharose ou la saccharine.

[61] Selon un mode de réalisation, les suspensions huileuses peuvent être formulées en mettant en suspension le principe actif dans une huile végétale, par exemple l'huile d'arachide, d'olive, de sésame ou de coco, ou dans une huile minérale telle que la paraffine liquide. Les suspensions huileuses peuvent contenir un agent épaississant, par exemple de la cire d'abeille, de la paraffine dure ou de l'alcool cétylique. Des agents édulcorants tels que ceux mentionnés ci-dessus et des agents aromatisants peuvent être ajoutés pour obtenir une préparation orale agréable au goût. Ces compositions peuvent être conservées par l'ajout d'un antioxydant tel que l'acide ascorbique. Les poudres et granules dispersables qui conviennent à la préparation d'une suspension aqueuse par addition d'eau fournissent l'ingrédient actif en mélange avec un agent dispersant ou mouillant, un agent de suspension et un ou plusieurs conservateurs.

[62]
Les sirops et élixirs peuvent être formulés avec des agents édulcorants, par exemple le glycérol, le propylène glycol, le sorbitol ou le saccharose. Ces formulations peuvent également contenir un émollient, un agent de conservation, des agents aromatisants et colorants.

[63] Les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous la forme d'une suspension aqueuse ou oléagineuse injectable de manière stérile. Cette suspension peut être formulée selon l'art connu en utilisant les agents dispersants ou mouillants et les agents de suspension appropriés qui ont été mentionnés ci-dessus. La préparation stérile injectable peut également être une solution ou une suspension stérile injectable dans un diluant ou un solvant non toxique acceptable par voie parentérale, par exemple une solution dans du 1,3-butane diol. Les véhicules et solvants acceptables pouvant être utilisés comprennent ; l'eau, le liquide de Ringer et la solution isotonique de chlorure de sodium. En outre, des huiles fixes stériles sont traditionnellement utilisées comme solvant ou milieu de suspension. A cette fin, toute huile fixe peut être utilisée, y compris les mono-ou diglycérides synthétiques. En outre, les acides gras tels que l'acide oléique sont utilisés dans la préparation des produits injectables.

[64] Les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent également être administrés sous forme de suppositoires pour l'administration rectale du médicament. Ces compositions peuvent être préparées en mélangeant le médicament avec un excipient approprié non irritant qui est solide à la température ordinaire mais liquide à la température rectale et qui fondra donc dans le rectum pour libérer le médicament. Ces matières comprennent le beurre de cacao et les polyéthylèneglycols.

[65] En outre, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrés par voie oculaire au moyen de solutions ou de pommades. De plus, l'administration transdermique des composés en question peut être réalisée au moyen de patchs iontophorétiques et autres. Pour l'utilisation topique, on utilise des crèmes, des pommades, des gelées, des solutions ou des suspensions.

[66] Dans le traitement d'un mammifère ou patient souffrant ou risquant de développer un cancer, un dosage approprié de la composition pharmaceutique de cette invention peut généralement être d'environ 0,1 à 50 000 microgrammes (pg) par kg de poids corporel du patient par jour, qui peut être administré en doses uniques ou multiples. Le niveau de dosage sera de préférence d'environ 1000 à environ 40 000 pg/kg par jour, en fonction de nombreux facteurs tels que la gravité du cancer à traiter, l'âge et l'état de santé relatif du sujet, la voie et la forme d'administration. Pour l'administration orale, cette composition peut être fournie sous forme de comprimés contenant 1000 à 10 0000 microgrammes de chacun des principes actifs, en particulier 1000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 25 000, 50 000, 75 000, 10 0000 microgrammes de chaque principe actif. Cette composition peut être administrée selon un schéma de 1 à 4 fois par jour, par exemple une ou deux fois par jour.
Le régime posologique peut être ajusté pour fournir une réponse thérapeutique optimale.
L'invention divulgue également un procédé de fabrication du composé de formule (1).

[67] Selon un mode de réalisation, le procédé de fluoration en C3 comprend une étape de fluoration de la Dendrogénine A, réalisée à partir d'un réactif de fluoration, par exemple le Diéthylaminosulfur trifluoride (DAST) ou le tétrafluoroborate. La réaction de fluoration avec le DAST est décrite dans la littérature e Tetrahedron letters 1979, 20, 1823-1826, A new method for fluorination of sterols (https://doi.org/10.1016/S0040-4039(01)86228-6). La réaction de fluoration avec le tétrafluoroborate est décrite dans la littérature Org. Lett., Vol. 11, No. 21, 2009, 5050-5053, Aminodifluorosulfinium Tetrafluoroborate Salts as Stable and Crystalline Deoxofluorinating Reagents

[68] Selon un mode de réalisation, le procédé de synthèse du 5a-hydroxy-6[342-(1 I-1-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-fluoro dilactate comprend les étapes suivantes :
- dissolution du composé 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro dans de l'éthanol anhydre puis y ajouter de l'acide lactique ;
- agitation du mélange à température ambiante durant 3 h;
- évaporation du solvant organique.
La poudre blanche obtenue est le composé 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro dilactate.

[69]
Selon un mode de réalisation du procédé, la température ambiante est comprise entre 15 et 40 C, par exemple 25 ou 37, préférentiellement 20 C.
Brève description des figures

[70]
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description suivante de plusieurs modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés.

[71] [fig.1] La figure 1 représente les résultats d'une étude de cytotoxicité du 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro (DX111) sur les cellules Neuro2a via un test de bleu de trypan.

[72] [fig.2] La figure 2 illustre les résultats d'un test de viabilité
cellulaires MTT réalisé sur des cellules tumorales mammaires MCF-7 en présence du composé 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro.

[73] [fig. 3] La figure 3 illustre les résultats de l'activité de la Cholestérol Epoxyde Hydrolase (ChEH) dans des cellules MCF-7 en présente du composé 5a-hydroxy-6[312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro.
lo [74]
[fig. 4] La figure 4 illustre le profil pharmacocinétique du composé 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthoxyle (DX103) en comparaison avec le composé Dendrogénine A (DX101).
[75] [fig. 5] La figure 5 illustre le profil pharmacocinétique du composé
5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-éthoxyle (DX105) en comparaison avec le composé Dendrogénine A (DX101).
[76] [fig. 6] La figure 6 illustre le profil pharmacocinétique du composé
5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-fluoro (DX111) en comparaison avec le composé Dendrogénine A (DX101).
[77] [fig. 7A] et [fig. 7B] Les figures 7A et 7B illustrent l'évolution de la croissance tumorale et le taux de survie chez la souris en comparant le traitement avec le DX111 et le DX101.
[78] [fig. 8] La figure 8 illustre le profil pharmacocinétique du composé
5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-azoture (DX123) en comparaison avec le composé Dendrogénine A (DX101).
EXEMPLES
[79]
Différentes expériences ont été réalisées afin d'évaluer les caractéristiques des composés de formule (1).
[80]
Les composés préférés selon l'invention correspondant à la formule 1 générale dont il est décrit ci-après la synthèse et l'activité sont les suivants :

-----..
--Et,c) Fe, HO H HO H HO H

N Hd fede H2N Fi,. Me-ILII Hd 'H
Me-S Hv H

Les autres composés rentrant dans la portée de la formule générale, non décrits, font partie intégrante des composés selon l'invention.
[81] Exemple 1 : Synthèse du composé analogue 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-fluoro (nommé DX111) La première étape est une synthèse du composé 3p-fluorocholestane comprenant les étapes suivantes :
õ .
¨
-\---).--r.
_________________________________________________ , r ,......_,... F'-' =-j-s".-j-fio y -"-L'' TICM
to ri. 6h [82] 5.00 g de trifluorure de diéthylaminosulfure (d=1.22 g/ml, 31.0 mmol) ont été dissous on 200 ml de DCM anhydre. 6.66 grammes (g) de cholestérol (17.2 mmol) ont été
mis en solution dans 100 millilitres (m1) de dichlorométhane anhydre et ajouté goutte par goutte au réactif fluoré à la température de 000. Le mélange ainsi obtenu a été
laissé sur agitation magnétique pour 5 heures en la laissant chauffer jusqu'au la température ambiante. A
l'issus de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 100 ml d'une solution de NaHCO3 sat. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase organique a été lavée par 2 fois avec NaHCO3 sat, 2 autres fois par une solution saturée de NaCI et une seule fois par l'eau. La phase organique a été séchée sur du MgSO4, filtrée et puis évaporée permettant l'obtention d'une poudre blanche. 6.61 g correspondant au 3p-fluorocholestane a été obtenu. Le rendement final de la réaction est de 99 %.

[83] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.40 ¨ 5.39 (d, 1H), 4.47 ¨ 4.30 (m, 1H), 2.45 ¨
2.42 (t, 2H), 2.03 ¨ 1.95 (m, 3H), 1.90 ¨ 0.95 (m, 26H), 0.92 ¨ 0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.68 (s, 3H).
[84] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du 313-fluoro-cholestane le composé
313-fluoro-5,6a-Epoxy-cholestane de la manière suivante :
f. J.
n) t1 Fe [85] 4.96 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque au 77 % de pureté (22.1 mmol) ont été
dissous dans 100 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 6.61 g de 313-fluorocholestane (17.0 mmol) dissous dans 50 ml de dichlorométhane. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé deux fois avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 % en poids, deux fois une solution saturée de NaHCO3 et une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4. anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention de 6.90 g d'une poudre blanche comprenant : 3j3-fluoro-5,6a-Epoxy-cholestane (85 (3/0 de la poudre blanche) et 3j3-fluoro-5,613-Epoxy-cholestane (15 % de la poudre blanche). Le 3j3-fluoro-5,6a-epoxycholestane a été utilisé sans purification supplémentaire.
[86] 1H-NMR (500 MHz, CD0I3): O (ppm) 4.82 ¨ 4.64 (m, 1H), 2.91 ¨ 2.90 (d, 1H), 2.28 ¨
2.21 (m, 1H), 2.10 ¨ 2.06 (m, 1H), 1.97 ¨ 1.70 (m, 6H), 1.59 ¨ 0.92 (m, 23H), 0.89 ¨ 0.88 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.61 (s, 3H).
[87] La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminoLcholestan-3E3-fluoro (DX111 sous forme basique) de la manière suivante :
NH, r Bu( =
Fe" ¨ 130 C, 2d Fe¨ -O
Ft%
.µ

[88] 0.80 g d'histamine sous sa forme basique (7.2 mmol) a été ajouté à
une solution butanolique de 10 ml comprenant 1.45 g du composé 3p-fluoro-5,6a-epoxycholestane (3.6 mmol) sous agitation à 130 C. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 C durant 48 heures.
[89]
L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 3f3-fluoro-5,6-epoxycholestane.
[90] Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 15 ml de méthyl tert-butyl éther. La phase organique a été lavée par 3 fois 15 ml d'eau.
[91] La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre, filtré et puis évaporée permettant l'obtention d'une huile brune. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification comprenant une colonne prépacké de 20 g éluant Acétate d'éthyle 100 %. Une poudre blanche de 0.86 g de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-fluoro a été
obtenue. Le rendement final de la réaction est de 41 (3/0 avec une pureté supérieure à 97 % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).
[92] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): ô (ppm) 7.54 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 5.05 ¨ 4.88 (m, 1H), 3.03 ¨ 2.96 (m, 1H), 2.77 ¨ 2.73 (m, 3H), 2.46 (s, 1H), 2.27 ¨ 2.20 (q, 1H), 2.00 ¨ 1.98 (d, 2H), 1.86 ¨ 0.94 (m, 31H), 0.91 ¨ 0.89 (d, 3H), 0.87 ¨ 0.85 (d, 6H), 0.67 (s, 3H).
[93]
Exemple 2: Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6512-(11-1-imidazol-4-v1)-éthylaminol-cholestan-313-fluoro (DX111 sous forme dilactate) :

[94] Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6P-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-fluoro a été préparé de la manière suivante :
r\----)-- 0 , .., t i.... i C=H /
Xy-t=-r\---)----I '''' = - ' - -"" F : . -=
110 f t ' HOt.J. 0 1..õ N ri 311 ' =-= = .
Q,..,õ 0- 1 he -0)Lre N
IN
il -- ..."`c [ =
Nil [95] 267.2 mg d'acide lactique (2.97 mmol) a été ajouté à une solution de 0.76 g de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro dans 15 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 1.03 g de 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro dilactate.
[96] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.58 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.73 -4.57 (m, 1 H), 3.86 - 3.82 (dd, 2H), 3.35 - 3.31 (dd, 2H), 3.18 - 3.13 (m, 1H), 3.03 ¨ 2.98 (m, 1H), 2.77 -2.75(t, 2H), 2.70 (s, 1H), 2.12 - 2.05 (dd, 1H), 1.78- 1.76(d, 1H), 1.70 ¨
1.68 (d, 1H), 1.63 - 0.85 (m, 30H), 0.78 - 0.73 (d, 2H), 0.68 ¨ 0.66 (d, 3H), 0.61-0.60 (dd, 6H), 0.49 (s, 3H).
[97] Exemple 3 : préparation des dérivés ou analogues 3a amino et 3a sulfure de formule (I) :
[98] Les étapes sont les suivantes :
1) NaH, p TsCI
2) NuH
THF
H 70nC, 24h Nu = R2S ou Ft2R3N
DOM ni-CPBA
ri, 4h n Du0H
130 C, 48h H H
H
Nu = R2R3KI et dans le R2S la réaction Nu = R2R3N et R202S
donne le produit d'oxydation R202S
Mettre en agitation du cholestérol en tetrahydrofurane (THF) en présence de NaH durant cinq minutes à 70 C, additionner du paratoluènesulfonique chlorure (p-TsCI) et agiter le mélange durant 4 heures à 70 C. Additionner de l'eau, filtrer la réaction et évaporer les solvants organiques. Extraire le produit de la réaction avec dichlorométhane/eau (DCM/H20) puis sécher sur MgSO4. Éliminer les solvants organiques par évaporation sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel pour l'étape suivante.
Solubiliser le produit obtenu en THF sous agitation durant 12 h avec 1.1 équivalent de NuH
(Nucléophile-hydrogène). NuH correspond à R2SH ou NHR2R3 à 70 C. La réaction est arrêtée par addition d'eau et les produits ont été extraits par un système AcOEt/H20. La phase organique a été séchée sur MgSO4 et les solvants organiques évaporés sous vide. Les produits cholestan-3-sulfure et cholestan-3-amino dérivés sont purifiés soit par chromatographie sur colonne soit par recristallisation. Le chemin réactionnel pour obtenir les analogues de la Dendrogénine A sont les mêmes étapes développées pour la synthèse de la Dendrogénine A.
[99] Le produit R202S sera obtenu par oxydation de R2S avec des agents d'oxydation tels que le m-CPBA ou H202.
[100] Exemple 4 : Préparation de dérivés ou analogues 313 amino et 313 sulfure de formule LU
Les étapes sont présentées ci-dessous :
MsCI TMS-SD2 BF3.Et.,0 Et3N
DCM
DCM
H rt, 12h Ms r1, 3h R2S
DCM TMSN, 3h BF,Et20 Et20 (R2)2N d 2elf N =
H H
Dissoudre du cholestérol, ajouter du NEt3 dans du DCM et ajouter du chlorure de mésyle (MsCI) goutte à goutte en solution de DCM à température ambiante durant 1 h.
Agiter la réaction durant 12 h, puis évaporer le solvant organique et cristalliser le produit avec du Me0H. Le produit obtenu est un solide de couleur blanche. Le produit obtenu est utilisé
pour obtenir le 3- sulfure et 38-azoture dérivés. Le produit obtenu est dissout en DCM
puis du TMS-SR2 pour le 38- sulfure dérivé ou du TMS-N3 pour le 313-azoture dérivé est ajouté à la solution. Une addition de BF3*Et20 est réalisée à température ambiante.
Ensuite, on agite durant 3 h.
[101] Le 38-azoture est réduit en 38-amino par action de LiAIH4 en Et20 et transformé dans les produits de formule (I) avec réaction de R2X (X = Br, Cl ou I) en Et20 (ou pyridine) comme solvant. Le chemin réactionnel pour obtenir les analogues de la Dendrogénine A
sont les mêmes étapes développées pour la synthèse de la Dendrogénine A. Le dérivé
sulfonyle R202S sera obtenu par oxydation de R2S par des agents oxydants usuels. Cette méthode est détaillée dans la littérature ORGANIC LETTERS; 2009, 11, 3, 567-570, Practical Synthesis of 3p-Amino-5-cholestene and Related 3p-Halides Involving i-Steroid and Retro-i-Steroid Rearrangements (https://doi.org/10.1021/o1802343z).

[102] Exemple 5 : Étude de la cytotoxicité du 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminecholestan-313-fluoro (nommé DX111) [103] Pour cette expérience, un milieu de culture cellulaire a été préparé. Le milieu de culture est constitué d'un milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, commercialisé par VVestburg sous la référence LO BE12-604F), comprenant 4.5 g/L glucose avec de la L-Glutamine, auquel y est ajouté 10 % de sérum de veau foetal (SVF). Des cellules Neuro2a (neuroblastome murin) sont introduites dans ce milieu de culture.
[104] II a été ensemencé des boites de 24 puits avec 10 000 cellules Neuro2a par puits.
Après 72 heures (h) de culture en condition normale, c'est-à-dire dans un incubateur à
une température de 37 C à 5 % de CO2, nous traitons pendant 48h les cellules Neuro2a avec le 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-38-fluoro et le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-ol à 100 nM, 1 M
et 10 M.
Un contrôle (CTL) est également réalisé en utilisant le protocole décrit précédemment sans le traitement avec le 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3a-fluoro et le 5a-hydroxy-6812-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminoLcholestan-38-ol. La survie cellulaire est quantifiée par un test de bleu de trypan avec comptage automatique par l'appareil Biorad TC20 (TC20Tm Automated Cell Counter). Le test via le bleu de trypan est basé sur l'intégrité des membranes cellulaire, laquelle est rompue chez les cellules mortes.
Le bleu de trypan colore les cellules mortes en bleu. L'appareil de comptage cellulaire Biorad TC20 compte la proportion de cellules bleues et non-bleues, et rapporte au pourcentage de cellules. Les résultats sont représentés figure 1. La figure 1 illustre en ordonnée le pourcentage de survie cellulaires par rapport au groupe contrôle.
[105] II est illustré figure 1 que pour 100 nM de traitement au 5a-hydroxy-6312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-38-fluoro le pourcentage de cellule vivante reste inchangé en comparaison au groupe contrôle (CTL). En outre, pour des concentrations de 1 M et 10 M, le pourcentage de survie cellulaire est de 75 % et 30 /0. Il est également observé une activité similaire entre les deux composés testés.
En conclusion, on observe une activité cytotoxique du composé 5u-hydroxy-6312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3j3-fluoro de formule (1) envers les cellules tumorales Neuro2a pour des concentrations en 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3a-fluoro de 1 M et 10 M.
[106] Exemple 6: Effet du 5a-hydroxy-6312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-38-fluoro sur la viabilité des cellules MCF-7 [107] Un test de viabilité cellulaires a été réalisé sur des cellules tumorales mammaires MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) surexprimant HER2 (cellules ER(-0).
Les cellules MCF-7 sont dans un milieu de culture cellulaire identique à
l'exemple 5 et sont ensemencées dans des plaques 12 puits à 50 000 cellules par puits. 24 heures après ensemencement, les cellules sont traitées par le solvate véhicule comprenant de l'eau et de l'éthanol avec un rapport 1% d'éthanol, le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro et le 5a-hydroxy-63-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-ol à 1, 2.5 ou 5 M. Les cellules sont observées au microscope inversé et photographiées via la caméra du microscope à 24 h et 48 h. Les modifications morphologiques des cellules à 1 M sont très faibles. On observe uniquement quelques vésicules blanches, traduisant le début du phénomène d'autophagie, engendrant la mort cellulaires après 24 heures de traitement avec le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro et le 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-ol. Les effets sont davantage marqués à 2.5 M et 5 M avec une augmentation du nombre de cellules mortes. En effet, il est observé après 24 h de traitement au 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-33-fluoro à 2,5 M de nombreuses vésicules blanches et des cellules qui se décrochent. Après 24 h de traitement au 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro à 5 M, 99 % des cellules observées sont surnageantes, traduisant une mort cellulaire et 1 % des cellules sont adhérentes et présentent des vésicules blanches. On observe après 48 h de traitement au 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-33-fluoro à 2,5 M un effet cytostatique plus important qu'à 24 h et davantage de cellules qui s'arrondissent, traduisant la mort cellulaires. L'effet cytostatique est illustré par une inhibition de la prolifération cellulaire. Après 48 h de traitement au 5a-hydroxy-6[312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-fluoro à 5 M, toutes les cellules sont surnageantes. En comparaison avec le traitement avec le 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-ol, le traitement avec le 50-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-33-fluoro présente un effet supérieur ou égale après 24 h d'observation et similaire après 48 h d'observation.
[108] La viabilité cellulaire est mesurée par marquage MTT à 48 heures. Ce test est basé
sur l'utilisation du sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tétrazolium). Le tétrazolium est réduit par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan, précipité de couleur violette. La quantité de précipité formé est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes mais également à l'activité métabolique de chaque cellule. Ainsi, un simple dosage de la densité
optique à 540 nm par spectroscopie permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Après 48 heures, le milieu est aspiré, les cellules lavées au tampon phosphate salin (PBS) puis incubées avec du MTT (0.5 mg/mi dans du PBS) pendant environ 2 heures. La solution de MTT est aspirée puis les cristaux violets sont solubilisés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). La DO (densité optique) est mesurée à 540 nm.
[109] Les résultats de ce test sont présentés figure 2. La figure 2 illustre en ordonnée le pourcentage de viabilité cellulaires par rapport au groupe contrôle. Le groupe contrôle est réalisé de manière similaire aux groupes étudiés sans l'ajout des molécules étudiées dans le présent texte. En comparaison au contrôle, il est mesuré une diminution dose dépendante de la viabilité cellulaire en MTT pour le 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-fluoro et le 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-ol. Pour une concentration de 5 M, la viabilité est proche de 0 %. Cela traduit une capacité de destruction de cellules tumorales mammaires par le composé de formule (I). Ces résultats sont concordant avec les observations réalisées à
24 h et 48 h précitées.
[110] Exemple 7: Effet du 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-fluor sur l'activité de la Cholestérol Epoxyde Hydrolase (ChEH) dans des cellules MCF-[111] Les composés 5,6a-epoxycholesterol (5,6a-EC) et 5,66-epoxycholesterol (5,66-EC) sont des oxystérols impliqués dans la pharmacologie anticancéreuse du tamoxifène, un médicament antitumoral largement utilisé. Ils sont tous deux métabolisés en cholestane-36,50,66-triol (CT) par l'enzyme cholestérol-5,6-époxyde hydrolase (ChEH), et le CT est métabolisé par l'enzyme HSD11B2 (116-Hydroxystéroïde déshydrogénase 2) en 6-oxo-cholestan-36,5a-diol (0CDO), un oncostérone promoteur de tumeur.
[112] L'expérience suivante a pour but de démontrer la capacité du 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3-fluoro à bloquer la ChEH et donc à
limiter la métabolisation d'oncostérone, un métabolite promoteur de tumeur.
[113] Des cellules MCF-7 sont dans un milieu de culture cellulaire identique à
l'exemple 5 et sont ensemencées dans des plaques 6 puits à 150 000 cellules par puits avec 3 puits par condition de traitement. 24 h après ensemencement, les cellules MCF-7 sont traitées par du [14C]5,6a-EC (solution mère 1000X : 0.6 mM ; 20 j.ICi/j.trnol ;
concentration finale 0.6 M) seul ou en association avec du Tamoxifène (tam). Le Tamoxifène est utilisé
en tant que témoin positif du 5a-hydroxy-6642-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3a-fluoro et du 5a-hydroxy-6[342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-ol (1 M pour toutes les molécules).
[114] Après 24 heures de traitement, les milieux sont collectés et des extraits lipidiques sont préparés à partir des culots cellulaires par extraction avec 100 I_ de chloroforme, 400 pl_ de méthanol et 300 1_ d'eau. Les extraits lipidiques sont analysés par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant l'acétate d'éthyle (Et0Ac) en tant qu'éluant. L'analyse est réalisée à l'aide d'un lecteur de plaque puis par autoradiographie. Les résultats sont présentés figure 3. Il est observé la métabolisation quasi-totale de l'époxyde en CT et OCDO (puits 2 et 4) et une inhibition totale de l'activité ChEH par le Tamoxifène et presque totale (trace de CT) par le 5a-hydroxy-6p-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3a-fluor . Des résultats similaires sont observés avec le 5a-hydroxy-63-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-ol.
[115] En conclusion, le 5a-hydroxy-63-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3a-fluor possède une activité inhibitrice de la ChEH similaire au 5a-hydroxy-6[342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-ol.
[116] Exemple 8 : Synthèse du COMPOSé de formule (I) 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-33-méthoxyle (nommé DX103) Na' ',lel f 60 c n.
HO
[117] Une première étape consiste à mettre en solution 4.0 grammes (g) de cholestérol (10.3 mmol) dans 20 millilitres (m1) de tétrahydrofurane (THF). 0.80 g de NaH (60 %
dans l'huile, 20.0 mmol) a été additionné et laissé réagir pour 30 minutes à 60 C, puis 1.8 ml de iodométhane (28.9 mmol) ont été ajoutés. Le mélange ainsi obtenu a été laissé
à 60 C
pendant la nuit, à savoir environ 10 h. Après refroidissement de la solution, la réaction a été neutralisée par addition de 20 ml d'eau. Le mélange a été filtré et le THF
évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été
extraite trois fois avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques ainsi obtenues ont été
combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l'obtention d'une huile.
L'huile obtenue a été dissoute dans 2 ml de Et20 et du Me0H a été ajouté
jusqu'à la formation d'un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du Me0H
froid et séchée.
Une poudre blanche de 3.40 g (correspondent à 82 `Vo de rendement) de cholestan-313-méthoxyle a été ainsi obtenue.

[118] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.36 (s, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.09 - 3.02 (q, 1H), 2.40 - 2.36 (d, 1H), 2.18 - 2.13 (t, 1H), 2.03 - 1.81 (m, 5H), 1.60 - 1.00 (m, 24H), 0.92 -0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.68 (s, 3H).
[119] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-33-méthoxyle le composé 5,6a-epoxy-cholestan-38-méthoxyle de la manière suivante :
õ,..
õ....
-...0 ed-[120] 1.80 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque (8.90 mmol) ont été dissous dans 70 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 2.50 g de cholestan-313-méthoxyle (6.24 nnmol) dissous dans 20 ml de dichlorométhane. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant trois heures.
Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 /c, en poids, une solution saturée de NaHCO3 et une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été
réalisée et permet l'obtention d'une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et20 ont été
ajouté pour dissoudre l'huile, puis 25 ml d'Et0H ont été additionné et le mélange a été
chauffé jusqu'à ébullition pour 3 fois et enfin mis à 0 C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du Me0H froid et séché ; 1.73 g, correspondant à 67 % (avec un excès énantiomérique 90 %) de rendement de 5,6a-epoxy-cholestan-38-méthoxyle a été ainsi obtenue.
[121] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): ô (ppm) 3.45 - 3.39 (m, 1H), 3.33 (s, 3H), 2.90 - 2.89 (d, 1H), 2.00 - 0.94 (m, 31H), 0.89 - 0.88 (d, 3H), 0.86 - 0.85 (dd, 6H), 0.60 (s, 3H).
[122] La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6812-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3.-méthoxyle (DX103 forme basique) de la manière suivante :
i-J i õ,..

/-Ni-I2 $ ' _ -P-in 1741.1 Fritf 0 H N.

.
'2 ri' 0.81 g d'histamine (7.30 mmol) sous sa forme basique a été ajoutée à une solution butanolique de 10 ml comprenant 1.50 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-3[3-méthoxyle (3.62 mmol) sous agitation. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 oc durant 48 heures.
L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3[3-méthoxyle.
Après refroidissement, le mélangea été dilué dans 10 ml de méthyl tert-butyle éther. La phase organique a été lavée par 2 fois avec 10 ml d'eau puis une fois avec 10 ml d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Le mélange a été purifié
par colonne chromatographique sur un automate de purification. L'éluant utilisé
est un mélange Acétate d'éthyle-Méthanol en rapport 90-10 %. Une poudre blanche de 1.32 g de 5a-hydroxy-6[312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminoLcholestan-3[3-méthoxy a été
obtenue.
Le rendement final de la réaction est de 69 % avec une pureté supérieure à 95 "Yo mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).
[123] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.62 (s, 1H), 6.88(s, 1H), 3.71 ¨3.65 (m, 1H), 3.34 (s, 3H), 2.98 ¨ 2.97 (d, 1H), 2.78 ¨ 2.77 (m, 3H), 2.45 (s, 1H), 2.03 ¨
2.00 (m, 1H), 1.94 ¨ 1.83 (m, 3H), 1.65 ¨ 1.01 (m, 27H), 0.95 ¨ 0.94 (d, 3H), 0.91 - 0.89 (d, 6H), 0.71 (s, 3H).
[124] Exemple 9 : Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminol-cholestan-35-méthoxyle (DX103 forme dilactate) [125] Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthoxyle a été préparé de la manière suivante :
H OH

3i1 '0 I N INe = OH
`--NH
[126] 21.0 mg d'acide lactique (1.89 mmol) a été ajouté à une solution de 0.50 g de 5a-hydroxy-6[342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthoxyle (0.95 mmol) dans 15 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à
température ambiante 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 0.52 g de 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthoxyle dilactate.
[127] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.61 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 3.93 -3.89 (q, 2H), 3.62 - 3.57 (m, 1H), 3.39 - 3.09 (m, 8H), 3.21 - 3.16 (m, 1H), 2.84 - 2.74 (m, 3H), 1.91 -1.81 (m, 2H), 1.70 - 0.79 (m, 31H), 0.73 - 0.72 (d, 3H), 0.68 - 0.66 (d, 6H), 0.56 (s, 3H).
[128] Exemple 10 : Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-v1)-éthvlaminol-cholestan-3(3-éthoxyle (nommé DX105) La première étape est une synthèse du composé cholestan-313-éthoxy comprenant les lo étapes suivantes :
Kiil Et, , III
4.00 g de cholestérol (10.3 mmol) a été mis en solution dans 20 ml de THF.
0.82 g de NaH (60 (3/0 dans l'huile, 20.0 mmol) a été additionné et laissé réagir pour 30 minutes à
60 C, puis 1.9 ml de iodoéthane (28.9 mmol) a été ajouté. Le mélange ainsi obtenu a été
laissé à 60 C pendant la nuit. Après refroidissement de la solution, la réaction a été
neutralisée par addition de 20 ml d'eau. Le mélange a été filtré et le THF
évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été
extraite trois fois avec d'acétate d'éthyle. Les phases organiques ainsi obtenues ont été
combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l'obtention d'une huile.
L'huile obtenue a été dissoute dans 2 ml de Et20 et du Me0H a été ajouté
jusqu'à la formation d'un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du Me0H
froid et séché.
Une poudre blanche de 2.12 g (correspondent à 49 43/0 de rendement) de cholestan-313-éthoxyle a été ainsi obtenue.
[129] 11-1-NMR (500 MHz, CD0I3): O (ppm) 5.35 (s, 1H), 3.53-3.51 (q, 2H), 3.17 - 3.14 (m, 1H), 2.38 -2.35 (d, 1H), 2.22 -2.17 (t, 3H), 2.02 - 1.79 (m, 5H), 1.60- 0.94 (m, 27H), 0.92 - 0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.67 (s, 3H).

[130] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3[3-éthoxyle le composé 5,6a-epoxy-cholestan-313-éthoxyle de la manière suivante :
-1"---n. I \,- rn (21'13/Ç
...... _ _....... . fr--\ ----\\/--E.f::.,1 R -ih ....,,...-.....0 u.
[131] 1.44 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque (correspondant à 6.43 mmol) ont été
dissous dans 50 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 2.0 g de cholestan-3[3-éthoxyle (4.82 mmol) dissous dans 10 ml de dichlorométhane.
Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de Na2S203 à
10 %
en poids, une solution saturée de NaHCO3 et une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention d'une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et20 ont été ajouté pour dissoudre l'huile, puis 25 ml d'Et0H ont été
additionné et le mélange a été chauffé jusqu'à ébullition pour 3 fois et puis mis à 0 C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du Me0H froid et séchée : 0.72 g, correspondant à 35 (3/0 (avec un excès énantiomérique k90 %) de rendement de 5,6a-epoxy-cholestan-313-éthoxy a été ainsi obtenu.
[132] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): (5 (ppm) 3.55 ¨ 3.46 (m, 3H), 2.89 ¨ 2.88 (d, 1H), 2.04 ¨
0.93 (m, 34H), 0.89 ¨ 0.88 (d, 3H), 0.86 - 0.85 (dd, 6H), 0.60 (s, 3H).
[133] La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6f3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-éthoxy (DX105 sous forme basique) de la manière suivante :
. H
¨NFI2 ='-ç I
.. ,.......e, .. , ,_, i r=iii 13`'.'C, . -:.Ei h L1.1 1 [134] 0.31 g d'histamine sous sa forme basique (correspondent à 2.74 mmol) a été ajouté à
une solution butanolique de 5 ml comprenant 0.51 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-313-éthoxyle à 1.18 mmol sous agitation. Le mélangea été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 C durant 48 heures.

L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3f3-éthoxyle.
Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 5 ml de méthyl tert-butyle éther. La phase organique a été lavée par 2 fois avec 5 ml d'eau puis une fois avec 5 ml d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Le mélange a été purifié
par colonne chromatographique sur un automate de purification. L'éluant utilisé
est un mélange Acétate d'éthyle-Méthanol en rapport 90-10. Une poudre blanche de 0.28 g de 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-éthoxyle a été
obtenue. Le rendement final de la réaction est de 44 % avec une pureté supérieure à 97 %
mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).
[135] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.62 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 3.82 ¨3.76 (m, 1H), 3.57 ¨ 3.52 (q, 2H), 3.05 ¨ 3.00 (m, 1H), 2.85 ¨ 2.80 (m, 3H), 2.50 (s, 1H), 2.03 ¨ 1.83 (m, 5H), 1.65 ¨ 1.51 (m, 7H), 1.42 ¨ 1.01 (m, 22H), 0.96 ¨ 0.94 (d, 3H), 0.91 -0.89 (d, 6H), 0.72 (s, 3H).
[136] Exemple 11 : Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6542-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3f3-éthoxyle (DX105 sous forme dilactate) [137] Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-éthoxyle a été préparé de la manière suivante :

OH
1 ..õ.====-=..r, HiTS Hl"
1;1,1 -F1,N1 OH
0 =i NH '2-- Nil C H
[138] 166.2 mg d'acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.50 g de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3f3-éthoxyle (0.92 mmol) dans 5 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante pour 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 0.20 g de 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminoLcholestan-3[3-éthoxyle dilactate.

WO 2022/090427 31_ [139] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.61 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 3.92 ¨3.89 (q, 2H), 3.60 - 3.57 (m, 1H), 3.39 - 3.09 (m, 7H), 2.84 ¨ 2.74 (m, 3H), 1.91 ¨ 1.81 (m, 2H), 1.70 -0.79 (m, 34H), 0.73 ¨ 0.72 (d, 3H), 0.67 - 0.65 (d, 6H), 0.54 (s, 3H).
[140] Exemple 12: Synthèse du composé de formule (I) 5a-hydroxy-6(342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylaminoi-cholestan-313-octanoxyle (nommé DX115) La première étape est une synthèse du composé cholestan-313-octanoxyle comprenant les étapes suivantes4xf :
f Nal' 0:0 - =
1,F
ti0er 4.00 g de cholestérol a été mis en solution dans 20 ml de tétrahydrofurane.
0.84 g de NaH
10 a été additionné et laissé réagir pour 30 minutes à 60 C, puis 3.0 g d'isooctane ont été
ajoutés. Le mélange ainsi obtenu a été laissé à 60 C pendant la nuit Après refroidissement de la solution, la réaction a été neutralisée par addition de 20 ml d'eau. Le mélange a été
filtré et le THF évaporé sous vide. Le mélange a été transféré dans une ampoule à
décanter et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec de l'acétate d'éthyle. Les phases 15 organiques ainsi obtenues ont été combinées et séchées sur du MgSO4 puis évaporées permettant l'obtention d'une huile.
L'huile obtenue a été dissoute dans 2 ml de Et20 et du Me0H a été ajouté
jusqu'à
formation d'un précipité blanc. La poudre a été filtrée, lavée avec du Me0H
froid et séchée.
Une poudre blanche de 2.5 g (correspondent à 48 %) de cholestan-33-octanoxyle a été
20 ainsi obtenue.
[141] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.35 (s, 1H), 3.45 - 3.43 (q, 2H), 3.15 ¨ 3.10 (q, 1H), 2.37 ¨ 2.35 (d, 1H), 2.21 ¨ 2.16 (t, 1H), 2.02 ¨ 1.95 (m, 2H), 1.90 ¨
1.84 (m, 3H), 1.58 ¨ 0.97 (m, 39H), 0.92 ¨ 0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.86 (dd, 6H), 0.67 (s, 3H).
[142] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3p-octanoxyle le 25 composé 5,6a-époxycholestan-33-octanoxyle de la manière suivante :
_ .
Lf,f3A
=
C411 . .
81-117,0 CH
0.90 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque (correspondent à 4.0 mmol) ont été
dissous dans 40 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 1.50 g de cholestan-33-octanoxyle à 3.0 mmol dissous dans 10 ml de dichlorométhane. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures.
Le mélange obtenu a été lavé avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 % en poids, une solution saturée de NaHCO3 et une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été
réalisée et permet l'obtention une huile transparente et visqueuse. 5 ml de Et20 ont été
ajouté pour dissoudre l'huile, puis 25 ml de Me0H ont été additionné et le mélange a été
chauffé jusqu'à ébullition pour 3 fois et enfin mis à 0 C pendant la nuit pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été filtrée, lavée avec du Me0H froid et séchée : 1.19 g, correspondent à 77 % de rendement (avec un excès énantiomérique 90 %) de 5,6a-epoxy-cholestan-3p-octanoxyle a été ainsi obtenue.
[143] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): ô (ppm) 3.51 ¨ 3.37 (m, 3H), 2.88 ¨ 2.87 (d, 1H), 2.02 ¨
1.87 (m, 4H), 1.84 ¨ 1.76 (m, 1H), 1.69 ¨ 1.67(m, 1H), 1.58¨ 1.45(m, 7H), 0.89 ¨ 0.88 (m, 42H), 0.60 (s, 3H).
[144] La troisième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle (DX115 sous forme basique) de la manière suivante :
Il-- il H
= F. Fi1-1 C7E-1e---'13 d Fi I- No N
en,111510 11-1µd [145] 0.48 g d'histamine sous sa forme basique (correspondant à 4.31 mmol) a été ajoutée à une solution butanolique de 10 ml comprenant 1.1 g du composé 5,6a-epoxy-cholestan-3p-octanoxyle à 2.14 mmol sous agitation. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 C durant 48 heures.
L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3p-octanoxyle.
Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 10 ml de méthyl tert-butyl éther. La phase organique a été lavée par 2 fois avec 10 ml d'eau puis une fois avec 10 ml d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Le mélange a été purifié
par colonne chromatographique sur un automate de purification. L'éluant utilisé
est un mélange Acétate d'éthyle/Méthanol en rapport 95/5. Une poudre blanche de 0.74 g de 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle a été
obtenue. Le rendement final de la réaction est de 55 % avec une pureté supérieure à 95 %
mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC (Chromatographie sur couche mince).
[146] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.59 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 3.79 -3.74 (q, 1H), 3.49 - 3.47 (q, 2H), 2.95 - 2.90 (m, 1H), 2.78 - 2.70 (m, 3H), 2.40 (s, 1H), 2.01 - 1.84 (m, 5H), 1.62 - 1.54 (m, 9H), 1.39 - 1.02 (m, 30H), 0.95 - 0.89 (d, 12H), 0.70 (s, 3H).
[147] Exemple 13 : Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-6842-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313- octanoxyle (DX115 sous forme dilactate) [148] Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-68-[2-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle a été préparé de la manière suivante :
Pic C,11, C,11 FiC: F crlye F,1 1-tOhl rt ' I N
OH
iH.0-OH
[149] 166.2 mg d'acide lactique (1.85 mmol) a été ajouté à une solution de 0.57 g de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle (0.92 mmol) dans 5 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à
température ambiante pendant trois heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 0.59 g de 5a-hydroxy-6842-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle dilactate.
[150] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.71 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 4.02 -3.98 (q, 2H), 3.72 - 3.65 (q, 1H), 3.41 - 3.31 (m, 3H), 3.21 - 3.16 (m, 1H), 2.95 - 2.92 (t, 2H), 2.86 - 2.85 (d, 1H), 2.04 - 1.99 (t, 1H), 1.96 - 1.93 (d, 1H), 1.83 - 1.59 (m, 7H), 1.49 -1.04 (m, 38H), 0.98 - 0.89 (m, 2H), 0.85 - 0.84 (d, 3H), 0.81 - 0.77 (m, 9H), 0.66 (s, 3H).
[151] Exemple 14: Synthèse du composé 5a-hydroxy-6842-(1H-imidazol-4-y1)-éthylam ino]-cholestan-3f3-azoture (nommé DX123) [152] La première étape est la synthèse du composé 3-mesylcholestane comprenant les étapes suivantes :

_ j12-'s--\\--')'-HO' .."'-''''' 09C rt on. ..._,S.Ø,, _...,...-,....:1,....õ,./
[153] Dans un ballon de 1L à 0 C ont été solubilisés 40 g de cholestérol (0.1 mol) et 22 ml de NEt3 (d=0.88 g/ml, 0.19 mol) en 340 ml de dichlorométhane anhydre. 10 ml de méthanesulfonyl chloride (1.48 g/ml, 0.13 mol) ont été solubilisé dans 40 ml de dichlorométhane anhydre et ajouté goutte par goutte à la solution contenant le cholestérol.
Le mélange ainsi obtenu a été laissé sur agitation magnétique pour toute la nuit en la laissant chauffer jusqu'à température ambiante.
A l'issus de cette durée, la réaction a été monitorée par TLC et concentré sur vide jusqu'au 2/3 du volume initiale. L'ajout de 500 ml de Me0H nous permet d'obtenir 46.4 g d'un précipité blanc correspondant au produit souhaité (97 % de rendement).
[154] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.42 - 5.41 (d, 1H), 4.55 - 4.49 (q, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.56 - 2.45 (m, 2H), 2.05 - 1.96 (m, 3H), 1.92 - 1.75 (m, 3H), 1.60 -0.93 (m, 23H), 0.92 - 0.90 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.67 (s, 3H).
[155] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du 313-mesyl cholestérol le composé
3p-azoture-cholestane de la manière suivante :
Ir I
0 r., fr - -' -#1_,./e----\
--t :: [-, Nee0 :.,r , [156] Dans un ballon de 500 ml nous avons ajouté en séquence à température ambiante :
23.27 g de 3p-mésylcholesterol (50.1 mmol), 100 ml de dichlorométhane anhydre, 7.5 ml d'azoture de triméthylsilyle (d=0.868 g/ml, 56.5 mmol) et enfin 12.5 ml de diéthyléthérate de trifluorure de bore (d=1.15 g/ml, 101.3 mmol). Le mélange ainsi obtenu a été laissé sur agitation magnétique pendant 3 heures.
A l'issus de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 100 ml d'une solution de NaOH 2M. Les produits organiques ont été extrait deux fois avec dichlorométhane. Les phases organiques ont été combinées et rincées deux fois avec une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4, filtrée et puis évaporée permettant l'obtention d'une solide. Le brut de la réaction a été purifié par colonne chromatograph igue éluant hexane 100 %. Une poudre blanche-jaunâtre de 13.33 g correspondant au azoture-cholestane a été ainsi obtenue. Le rendement final de la réaction est de 65%.
[157] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.39 - 5.38 (d, 1H), 3.23 - 3.17 (q, 1H), 2.30 -2.28 (d, 2H), 2.03 - 1.97 (m, 2H), 1.91 - 1.81 (m, 3H), 1.60 - 0.94 (m, 24H), 0.92 - 0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.86 (dd, 6H), 0.68 (s, 3H).
[158] La troisième étape de synthèse consiste à synthétiser à partir du 313-azoturecholestane le composé 313-azoture-5,6a-epoxycholestane de la manière suivante :
I--- --\1----I 117 1 l'HA
-I - -p. 111_ 7 N3 '" -'' rt 't=
[159] 950 mg d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque au 77% de pureté (4.24 mmol) ont été
dissous dans 15 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un solution de 1.3 g de 3f3-azoturecholestane (3.16 mmol) dissous dans 15 ml de dichlorométhane.
Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé deux fois avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 % en poids, deux fois avec une solution saturée de NaHCO3 et une fois avec une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4anhydre.
Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention de 1.35 g d'une poudre blanche correspondant au mélange de : 3-azoture-5,6-epoxycholestane (83 (3/0 du total) et 33-azoture-5,63-epoxycholestane (17 (3/0 de la poudre blanche). Le produit final a été utilisé sans purification supplémentaire.
[160] 11-1-NMR (500 MHz, CD0I3): O (ppm) 3.63 - 3.56 (q, 1H), 2.94 - 2.93 (d, 1H), 2.13 -2.08 (t, 1H), 1.97 - 0.94 (m, 30H), 0.89 - 0.88 (d, 3H), 0.86 - 0.85 (dd, 6H), 0.61 (s, 3H).
[161] La quatrième étape est la synthétise du 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-azoture (DX123 sous forme neutre) de la manière suivante :
H2N.õ...., ..., ,.. N..
---) --\---\\_._ ,. .
1-- Nil - -FIN,,.......,...yr N
N.:-.)- , ---eej .1 ._, i:r C h [162] 864 mg d'histamine sous sa forme basique (7.77 mmol) a été ajouté à une solution butanolique de 20 ml comprenant 2.02 g du composé 313-azoture-5,6-epoxycholestane à 83 % (3.9 mmol) sous agitation à 130 C. Le mélangea été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 C durant 48 heures.
L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 33-azoture-5,6a-epoxycholestane.
Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 15 ml de méthyl tert-butyl éther. La phase organique a été lavée par 3 fois avec 15 ml d'eau.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4anhydre, filtré et puis évaporée permettant 1.0 l'obtention d'une huile brune. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur gel de Silice sur un automate de purification comprenant une colonne prépacké
de 40 g éluant dichlorom éthane-acétate d'éthyle 75-25 % jusqu'au 0-100 /0. Une poudre blanche de 890 mg de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3p-azoture a été obtenue. Le rendement final de la réaction est de 42 % avec une pureté
supérieure à
97 % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC
(Chromatographie sur couche mince).
[163] 11-1-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.55 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 3.73 -3.67 (q, 1H), 2.90 - 2.85 (m, 1H), 2.72 - 2.62 (m, 3H), 2.33 (s, 1H), 2.05 - 2.00 (t, 1H), 1.96 - 1.94 (m, 1H), 1.84 - 1.77 (m, 1H), 1.74 - 1.72 (m, 1H), 1.62 - 0.97 (m, 27H), 0.89 -0.88 (d, 3H), 0.85 - 0.84 (d, 6H), 0.64 (s, 3H).
[164] Exemple 15: Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3(3-azoture (DX123 forme dilactate) .,;---, - )= - HIC; -11.I'e' N3 ç c "rf otetd-' H Nerfr-) I
-9 Fie; .: i `1,-,N,_,,,...,_ e, --0- FIN N EiCy-- - ,.., ri. :i h .."(..)-NH

[165] 63.5 mg d'acide lactique (0.77 mmol) a été ajouté à une solution de 210 mg de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3f3-azoture dans 4 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante pour 3 heures.
Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 263.5 mg de 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-azoture dilactate.
[166] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.67 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 4.01 -3.97 (m, 2H), 3.73 - 3.67 (q, 1H), 3.34 - 3.29 (m, 1H), 3.19 - 3.13 (m, 1H), 2.91 - 2.88 (t, 2H), 2.81 (s, 1H), 2.20 - 2.15 (t, 1H), 1.94 - 1.92 (d, 1H), 1.77 - 1.75 (m, 3H), 1.66 -1.58 (m, 4H), 1.47 - 0.98 (m, 26H), 0.95 - 0.87 (m, 2H), 0.83 - 0.82 (d, 3H), 0.77 - 0.76 (dd, 6H), 0.65 (s, 3H).
[167] Exemple 16: Synthèse d'un sel trichlorure du composé 5a-hydroxy-6642-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-amino (nommé DX125, sous forme trichloride) [168] La réaction qui va permettre de synthétiser un sel trichlorure du 5a-hydroxy-6[342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-amino à partir du 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-azoture est la suivante :
- .....,'"..,.,___ ' ''"ji)F12 eeS )= .>
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1 "ICI
MN .., Ati 717) - C . 2h .i.,1=::N
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ILlIA1-1 [169] 730 mg de triphénylphosphine (2.8 mmol) a été ajouté à une solution de 8.0 ml THF
de 300 mg de 5a-hydroxy-6p12-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-azoture (0.56 mmol) sous agitation à 70 C. Le mélange a été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 70 C durant 2 heures. Puis, 0.5 ml d'eau (correspondent à 27.8 mmol) a été additionné et maintenu l'agitation pour deux autres heures à 70 C. L'avancée de la réaction est contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM), puis le mélange des solvants a été évaporé. La poudre blanche obtenue a été dissoute avec 20 ml de dichlorométhane et transféré dans une ampoule à
décanter contenant 20 ml d'une solution aqueuse de HCI (1 ml de HCI 37% dans 19 ml d'eau), la phase aqueuse a été lavée trois fois avec du dichlorométhane. La phase aqueuse a été
séchée sous vide permettant l'obtention d'une poudre blanche. La poudre a été
reprise avec du dichlorométhane et filtré une dernière fois pour éliminer les dernières traces de triphénylphosphine. La procédure nous permet d'obtenir 350 mg d'un sel trichlorure de 5a-hydroxy-613-[2-(1H-imidazo1-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-amino avec un rendement quantitatif et une pureté supérieure à 95 %.

[170] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): $5 (ppm) 8.90 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 3.67 -3.60 (q, 1 H), 3.56 - 3.41 (m, 4H), 3.28 - 3.27 (d, 1H), 2.61 - 2.56 (t, 1H), 2.08 - 2.05 (d, 1H), 1.99 - 1.11 (m, 28H), 1.06 - 1.00 (dd, 1H) 0.96 - 0.94 (d, 3H), 0.89 - 0.88 (dd, 6H), 0.78 (s, 3H).
[171] Exemple 17: Synthèse du composé 5a-hydroxy-6(3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-acétamide (nommé DX127) [172] La première étape de synthèse est la réduction du groupement azoture en amine en position 3 du dérivé cholestan-313-azoture.
I ieM
_______________________________________________ -3>
>
N3 OCnr h H2N
[173] 5.21 g de cholestan-313-azoture (12.7 mmol) ont été dissous dans 60 ml de tétrahydrofurane (THF) puis 5 portions d'environ 480 mg de LiALH4 ont été
additionnés toutes les 15 minutes pour un total de 2.32 g (61.1 mmol). Le mélange ainsi obtenu est laissé sur agitation magnétique pendant 3 heures. A l'issus de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de quelques gouttes de Na2CO3 5 % aq (ajouté
délicatement).
La phase organique a été extrait trois fois avec de l'AcOEt et les phases organiques ont été combinés. La solution résultante a été séchée sur du MgSO4, filtrée et puis évaporée permettant l'obtention d'un solide. Une poudre blanche suffisamment propre de 3.78 g correspondant au 313-amino-cholestane a été ainsi obtenue. Le rendement final de la réaction est de 77 %.
[174] 1H-NMR (500 MHz, 0DCI3): O (ppm) 5.32 - 5.31 (d, 1H), 2.63 - 2.57 (q, 1H), 2.17 -2.13 (m, 1H), 2.08 - 1.93 (m, 4H), 1.85 - 1.81 (m, 2H), 1.72 - 1.68 (m, 1H), 1.43 - 0.84 (m, 33H), 0.68 (s, 3H).
[175] La deuxième étape consiste à synthétiser à partir du cholestan-3-amine le composé
cholestan-313-acétamide de la manière suivante :
A r pyricline r 0:
DC
rté c rmµ
H
[176] 3.78 g de cholestan-313-amine (9.8 mmol) ont été dissous dans 20 ml de dichlorométhane anhydre, puis 16 mi de pyridine anhydre (198 mmol) et 5.0 g d'anhydride acétique (49.0 mmol) ont été ajoutés à la réaction. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenu à température ambiante pour toute la nuit. Le mélange obtenu a été
lavé trois fois avec une solution aqueuse de HCI 0.1 M et la phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre, filtrée et séchée sous vide. L'huile obtenu a été
dissous avec 30 ml de chloroforme, 90 ml de Me0H a été additionné et le mélange a été chauffé
jusqu'à
ébullition pour 3 fois et jusqu'à la réduction du volume des solvants de 2/3 et enfin mis à
0 C pour favoriser la précipitation. Une poudre blanche a été obtenue, filtrée, lavée avec du Me0H froid et séchée : 2.41 g, correspondent à 58 % de rendement de cholestan-36-acétamide a été ainsi obtenue.
lo [177] 11-1-NMR (500 MHz, 0D013): O (ppm) 5.36 - 5.35 (d, 1H), 5.32 - 5.30 (d, 1H), 3.73 -3.65 (q, 1H), 2.32 - 2.29 (d, 1H), 2.09 - 1.79 (m, 9H), 1.60 - 0.95 (m, 22H), 0.92 - 0.90 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.67 (s, 3H).
[178] La troisième étape consiste à synthétiser le 5,6-epoxy-cholestan-3[3-acétamide de la manière suivante :
cr PA

N - M
)4.1 H
[179] 1.19 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque au 77% de pureté (5.3 mmol) ont été
dissous dans 10 ml de dichlorométhane et ajouté goutte à goutte dans un mélange de 1.61 g de cholest-3[3-acétamide (3.8 mmol) dissous dans 25 ml de dichlorométhane. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenue à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé deux fois avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 % en poids, deux fois une solution saturée de NaHCO3 et une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention de 1.65 g d'une poudre blanche comprenant : 5,6a-Epoxy-cholest-313-acétamide (60 % de la poudre blanche) et 5,60-Epoxy-cholest-33-acétamide (40 % de la poudre blanche). Le 5,6a-Epoxy-cholest-3[3-acétamide a été utilisé sans purification supplémentaire.
[180] 11-1-NMR (500 MHz, CD0I3): O (ppm) 5.29 - 5.28 (d, 1H), 4.05 - 3.99 (q, 1H), 2.89 -2.88 (d, 1H), 2.08 - 0.84 (m, 43H), 0.60 (s, 3H).
[181] La quatrième étape consiste à synthétiser le 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-acetamide (DX127 sous forme neutre) de la manière suivante :

1-12N r47 p,( I
13c2deL, 1 H H
H N
[182] 0.47 g d'histamine sous sa forme basique (correspondent à 4.26 mmol) a été ajouté à
une solution butanolique de 20 ml comprenant 1.65 g du composé 5,6u-epoxy-cholestan-3p-acétamide à 60 A correspondent à 0.99 mmol sous agitation. Le mélange a été
maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 C
durant 48 heures. L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 5,6a-epoxy-cholestan-3p-acétamide.
Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 20 ml de méthyl tert-butyle éther. La phase organique a été lavée par 2 fois avec 20 ml d'eau et trois fois avec 20 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre. Le mélange a été purifié par colonne chromatographique sur un automate de purification.
L'éluant utilisé
est un mélange dichlorométhane-méthanol-ammoniac en rapport 75-20-5 %. Une poudre blanche de 0.37 g de 5a-hydroxy-6[312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-acetamide a été obtenue. Le rendement final de la réaction est de 30 % avec une pureté
supérieure à 97 % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC
(Chromatographie sur couche mince).
[183] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.56 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 4.15 ¨
4.08 (q, 1H), 2.91 ¨ 2.88 (m, 1H), 2.74 ¨ 2.68 (m, 3H), 2.35 (s, 1H), 1.99 ¨ 1.94 (m, 2H), 1.87 ¨ 1.77 (m, 5H), 1.66 ¨ 0.97 (m, 28H), 0.90 ¨ 0.88 (d, 3H), 0.85 - 0.84 (d, 6H), 0.65 (s, 3H).
[184] Exemple 18 : Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3P-acétamide (DX127 sous forme dilactate) [185] Un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-acétamide a été préparé de la manière suivante:

WO 2022/090427 41_ PCT/EP2021/080054 fe 0 el. HO)jï1-1 0 -)( /11', N elolle H 1-1_91 H
N r\
+ -H HO Et0H
H rt, 3h N

---=01-1 [186] 120.6 mg d'acide lactique (1.34 mmol) ont été ajoutés à une solution de 370 mg de 5a-hydroxy-6[3-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-acetamide dans 5 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante pour 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 490 mg de 5a-hydroxy-61342-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-acétamide dilactate.
[187] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.69 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.08 -4.03 (m, 1H), 3.37 - 3.27 (m, 1H), 3.18 - 3.12 (m, 2H), 2.91 - 2.88 (t, 2H), 2.77 (s, 1H), 2.07 - 2.02 (t, 1H), 1.93 - 1.90 (d, 1H), 1.79 (s, 3H), 1.76 - 0.88 (m, 36H), 0.82 - 0.81 (d, 3H), 0.75 - 074 (dd, 6H), 0.63 (s, 3H).
[188] Exemple 19 : Synthèse du composé 5a-hydroxy-65-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthylsulfonyle (nommé DX129) [189] La première étape consiste à synthétiser à partir du 313-mésylcholestérol le composé
3[3-méthylthio-cholestane de la manière suivante :
_ --- . f.,="'S t':::'...lp 1.),,,..:2 j eicfj .-.
[190] Dans un ballon de 500 ml, nous avons ajouté en séquence à température ambiante :
10.62 g de 3-mésylcholestérol (22.9 mmol), 50 ml de dichlorométhane, 5.0 g de triméthyl(méthylthio)silane (41.6 mmol) et 8.0 ml de diéthyléthérate de trifluorure de bore (d=1.15 g/ml, 64.8 mmol). Le mélange ainsi obtenu a été laissé sur agitation magnétique pour 3 heures.
A l'issus de cette durée, la réaction a été neutralisée par addition de 100 ml d'une solution de NaOH 2M. La phase organique a été extraite deux fois avec du dichlométhane.
Les phases organiques ont été combinées et rincées deux fois avec une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4, filtrée et puis évaporée permettant l'obtention d'un solide. Le brut réactionnel a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice éluant hexane 100 /.3. Une poudre blanche de 6.04 g correspondant au 313-méthylthio-cholestane a été ainsi obtenue. Le rendement final de la réaction est de 63%.
[191] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 5.33 (s, 1H), 2.71 - 2.65 (m, 1H), 2.30 - 2.26 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.02 - 0.94 (m, 29H), 0.92 - 0.91 (d, 3H), 0.87 - 0.85 (dd, 6H), 0.67 (s, 3H).
[192] La deuxième étape de synthèse consiste à synthétiser à partir du 313-méthylthio-cholestane le composé 3[3-méthylsulfony1-5,6-epoxy-cholestane de la manière suivante :
- . ).--- \--y-41.
Ci L.1 [193] 6.30 g d'acide méta-chloro-peroxybenzoïque au 77 % de pureté (28.1 mmol) a été
dissout dans 40 ml de dichlorométhane et une solution de 2.9 g de 3-méthylthio-cholestane (6.8 mmol) s dans 20 ml de dichlorométhane a été ajoutée goutte à
goutte. Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation et maintenue à température ambiante durant 3 heures. Le mélange obtenu a été lavé deux fois avec une solution aqueuse de Na2S203 à 10 % en poids, trois fois avec une solution saturée de NaHCO3 et une fois avec une solution saturée de NaCI. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre.
Une évaporation sous vide du solvant organique a été réalisée et permet l'obtention de 2.10 g d'une poudre blanche. Le brut de la réaction a été purifié par colonne chromatographique éluant initial hexane 100% et puis des mélanges d'hexane et AcOEt.
Le produit souhaité a été purifié par colonne chromatographique sur gel de silice avec l'éluent hexanes-AcOEt 55-45%v. Une poudre blanche de 380 mg correspondant au méthylthio-5,6epoxy-cholestane a été ainsi obtenue. Le rendement final de la réaction est de 12%.
[194] 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): O (ppm) 3.25 - 3.20 (m, 1H), 3.02-3.01 (d, 1H), 2.83 (s, 3H), 2.11 - 2.09 (m, 1H), 1.98 - 1.93 (m, 3H), 1.87 - 1.79 (m, 3H), 1.57 -0.93 (m, 24H), 0.89 - 0.88 (d, 3H), 0.86 - 0.85 (dd, 6H), 0.61 (s, 3H).
[195] La troisième étape est la synthèse du 5a-hydroxy-6[312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-méthylsulfonyl (DX129 sous forme basique) de la manière suivante :
V.' 1:30-c 111 d' 'u H i [196] 338 mg d'histamine sous sa forme basique (3.04 mmol) a été ajoutée à une solution butanolique de 5 ml comprenant 350 mg du composé 3-méthylsulfony1-5,6-epoxy-cholestane (0.75 mmol) sous agitation à 130 C. Le mélangea été maintenu sous agitation dans un chauffage à reflux à une température de 130 OC durant 48 heures.
L'avancée de la réaction peut être contrôlée par chromatographie sur couche mince (CCM) pour suivre la conversion du 3-méthylsulfony1-5,6-epoxy-cholestane.
Après refroidissement, le mélange a été dilué dans 5 ml de méthyl tert-butyl éther. La phase organique a été lavée par 3 fois avec 15 ml de chlorure de sodium saturée.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre, filtrée et puis évaporée permettant l'obtention d'une huile brune. Le brut de la réaction a été purifié
par colonne chromatographique éluant initiale AcOEt 100 %, puis des mélanges AcOEt-Me0H.
Le produit souhaité était purifié avec le mélange AcOEt-Me0H 75-25 %. Une poudre jaune de 190 mg correspondant au 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3-méthylsulfonyl est obtenue. Le produit est purifié une deuxième fois par colonne chromatographique pour avoir une pureté supérieure à 97 [197] % mesurée par analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) et TLC
(Chromatographie sur couche mince). Une poudre blanche de 167.4 mg a été
obtenue.
Le rendement final de la réaction est de 39 %.
[198] 11-1-NMR (500 MHz, Me0D-4d): ô (ppm) 7.63 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 3.49 -3.40 (m, 1H), 3.04 - 3.02 (m, 1H), 2.89 (s, 3H), 2.81 - 2.78 (m, 3H), 2.50 (s, 1H), 2.44 -2.40 (t, 1H), 2.02 - 2.01 (m, 1H), 1.94 - 1.92 (m, 1H), 1.88 - 1.83 (m, 1H), 1.76 - 1.00 (m, 30H), 0.90 - 0.89 (d, 3H), 0.85 - 0.84 (d, 6H), 0.66 (s, 3H).
[199] Exemple 20: Préparation d'un sel dilactate du composé 5a-hydroxy-61312-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-313-méthylsulfonyl (DX129 sous forme dilactate) 1.111 N Se HO)L-i:
N

d's\b H Et0H H
rt, 3h +
1-1(5F12_ H

H
[200] 51.6 mg d'acide lactique (1.34 mmol) a été ajouté à une solution de 165.0 mg de 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-36-méthylsulfo nyl dans 5 ml d'éthanol anhydre sous agitation. L'agitation a été maintenue à température ambiante pour 3 heures. Une évaporation sous vide du solvant organique permet l'obtention d'une poudre blanche de 216.6 mg de 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-y1)-éthylamino]-cholestan-3[3-méthylsulfonyl dilactate.
[201] 1H-NMR (500 MHz, Me0D-4d): O (ppm) 7.77 (s, 1H), 6.98(s, 1H), 3.52 -3.47 (m, 1H), 3.45 - 3.41 (m, 1H), 3.18 - 3.14 (m, 1H), 2.96 - 2.94 (t, 2H), 2.89 - 2.87 (m, 4H), 2.59 -2.55 (t, 1H), 2.02 - 2.00 (m, 1H), 1.97 - 1.95 (m, 1H), 1.86 - 1.80 (m, 2H), 1.75 - 1.65 (m, 5H) 1.57 - 0.95 (m, 29H), 0.90 - 0.89 (d, 3H), 0.84 - 0.82 (dd, 6H), 0.72 (s, 3H).
[202] Exemple 21 : Étude pharmacocinétique du DX103 [203] L'étude suivante est un dosage par LC/MS dans le plasma des différentes molécules sur 3 jours (11 points de mesures au final). Les graphiques sont toujours présentés en comparaison avec le DX101 qui est la référence.
[204] Protocole Groupe 1 Groupe 2 Administration du DX101 DX103 composé
Dose 50 mg/kg 50 mg/kg Voie d'application orale orale Animaux rat rat Taille du groupe 3 3 Échantillons plasma plasma Dosage DX101 DX103 et DX101 Échantillonnage plasmatique à 0 (sans injection), 5, 10, 15, 30 min, 1h 4h 8h 24h 48h 72h (11 points) [205] Le profil pharmacocinétique du DX103 en comparaison avec le DX101 est donné à la figure 4. Les résultats sont les suivants :

Aire sous la courbe 143297 105351 Concentration max (nM) 140 135 Temps pour Cmax (min) 480 240 [206] Conclusion : Le profil du DX103 montre une absorption plus rapide dans l'organisme et une biodisponibilité légèrement inférieure au DX101.
[207] Exemple 22 : Étude pharmacocinétique du DX105 [208] L'étude suivante est un dosage par LC/MS dans le plasma des différentes molécules sur 3 jours (11 points de mesures au final). Les graphiques sont toujours présentés en comparaison avec le DX101 qui est la référence.
Protocole Groupe 1 Groupe 2 Administration du DX101 DX105 composé
Dose 50 mg/kg 50 mg/kg Voie d'application orale orale Animaux rat rat Taille du groupe 3 3 Échantillons plasma plasma Dosage DX101 DX105 et DX101 Échantillonnage plasmatique à 0 (sans injection), 5, 10, 15, 30 min, 1h 4h 8h 24h 48h 72h (11 points) [209] Le profil pharmacocinétique du DX105 en comparaison avec le DX101 est donné à la figure 5. Les résultats sont les suivants :

Aire sous la courbe 143297 145590 Concentration max (nM) 140 197 Temps pour Cmax (min) 480 240 [210] Le DX105 montre une biodisponibilité équivalente (voir très légèrement supérieure) au DX101. En revanche, il présente une absorption beaucoup plus rapide et une concentration maximale beaucoup plus importante, ce qui permet de prétendre à
de bonne perspective in vivo.
[211] Exemple 23 : Étude pharmacocinétique du DX111 [212] L'étude suivante est un dosage par LC/MS dans le plasma des différentes molécules sur 3 jours (11 points de mesures au final). Les graphiques sont toujours présentés en comparaison avec le DX101 qui est la référence.
Groupe 1 Groupe 2 Administration du DX101 DX111 composé
Dose 50 mg/kg 50 mg/kg Voie d'application orale orale Animaux rat rat Taille du groupe 3 3 Échantillons plasma plasma Dosage DX101 DX111 et DX101 Échantillonnage plasmatique à 0 (sans injection), 5, 10, 15, 30 min, 1h 4h 8h 24h 48h 72h (11 points) [213] Le profil pharmacocinétique du DX111 en comparaison avec le DX101 est donné à la figure 6. Les résultats sont les suivants :

Aire sous la courbe 143297 368921 Concentration max (nM) 140 515 Temps pour Cmax (min) 480 240 Cette étude de pharmacocinétique par voie orale montre que le 0X1 11 démontre une absorption de 3 fois supérieure au DX101. De plus, le DX111 possède une concentration maximale plus importante ainsi qu'une absorption plus rapide.
[214] Exemple 24 : Étude pharmacocinétique du DX123 [215] L'étude suivante est un dosage par LC/MS dans le plasma des différentes molécules sur 3 jours (11 points de mesures au final). Les graphiques sont toujours présentés en comparaison avec le DX101 qui est la référence.
Protocole Groupe 1 Groupe 2 Administration du DX101 DX123 composé
Dose 50 mg/kg 50 mg/kg Voie d'application orale orale Animaux rat rat Taille du groupe 3 3 Échantillons plasma plasma Dosage DX101 DX123 et DX101 Echantillonnage plasmatique à 0 (sans injection), 5, 10, 15, 30min, 1h 4h 8h 24h 48h 72h (11 points) [216] Le profil pharmacocinétique du DX123 en comparaison avec le DX101 est donné à la figure 8. Les résultats sont les suivants :

Aire sous la courbe 3019 6711 Concentration max (nM) 150 721 Temps pour Cmax (min) 4 4 [217] Cette première analyse de pharmacocinétique par voie orale montre que le présente une biodisponibilité deux fois plus élevée en comparaison au DX101.
Ces résultats permettent de prétendre à de bonne perspective in vivo du DX123.
[218] Exemple 25: Étude de la cytotoxicité des analogues du DX101 selon l'invention sur les cellules 4T1 [219] Les tests de viabilité cellulaires ont été réalisés sur des cellules tumorales mammaires murine 4T1 caractérisées comme triples négatives (HER2-, ER-, PR-).
[220] Pour cette expérience, un milieu de culture cellulaire a été préparé. Le milieu de culture est constitué d'un milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, commercialisé par Westburg sous la référence LO BE12-604F), comprenant 4.5 g/L glucose avec de la L-Glutamine, auquel y est ajouté 10 % de sérum de veau foetal (SVF) et 50 U/ml de pénicilline /streptomycine. Les cellules 4T1 sont introduites dans ce milieu de culture.
[221] II a été ensemencé des boites de 96 puits avec 2000 cellules 4T1 par puits. Après 72 heures (h) de culture en condition normale, c'est-à-dire dans un incubateur à
une température de 37 C à 5 % d'02, nous traitons pendant 48h les cellules 4T1 avec le DX101, DX103, DX111, DX123, DX125, DX127 et DX129 à 100 nM, 1 M, 2.5 M et 10 M. Une condition contrôle (CTL) est également réalisée en parallèle en utilisant le protocole décrit précédemment sans traitement avec les molécules DX101, DX103, DX111, DX123, DX125, DX127 ou DX129.
[222] La viabilité cellulaire est mesurée par trois différentes méthodes. Pour la première méthode, un marquage MTT est réalisé à 48 heures. Ce test est basé sur l'utilisation du sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium).
Le tétrazolium est réduit par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan, précipité de couleur violette. La quantité de précipité
formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes mais également à
l'activité
métabolique de chaque cellule. Ainsi, un simple dosage de la densité optique à
550 nm par spectroscopie permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Après 48 heures, le milieu est aspiré, et les cellules sont incubées avec du MTT (0.5 mg/mi dans du milieu de culture) pendant environ 3 heures. La solution de MTT est aspirée et les cristaux violets sont solubilisés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
La DO (densité optique) est mesurée à 550 nm. Le pourcentage de viabilité est alors déterminé dans chaque puits par rapport au CTL et l'IC50 (concentration pour laquelle il reste 50 % de cellules vivantes) est déterminée pour chaque molécule avec le logiciel Prism à l'aide d'une droite de régression non linéaire (log(inhibitor) vs.
Response).
[223] Pour la deuxième méthode, le pourcentage de viabilité est déterminé à
l'aide du dosage de l'activité de l'enzyme LDH (lactate déshydrogénase) dans les surnageants cellulaires à l'aide du kit non radioactive cytotoxicity assay kit (Promega).
La LDH est une enzyme libérée dans le surnageant des cellules mortes. Plus l'activité LDH
dans le surnageant est élevée, plus la mort cellulaire est importante. Dans cet essai enzymatique, la LDH libérée convertit un sel de ttrazolium violet en formazan de couleur rouge, absorbant à 490 nm. L'intensité de la couleur rouge est proportionnelle au nombre de cellules morte. Après 48h de traitement, les surnageants sont transférés dans une nouvelle plaque 96 puits et sont incubés pendant 30 minutes en présence du substrate mix à température ambiante. La réaction est arrêtée à l'aide du réactif stop stolution et l'absorbance est déterminée à 490 nM. Le pourcentage de mort cellulaire est déterminé
ici à l'aide d'un contrôle 100 % d'activité maximale de la LDH (réalisé à
partir de cellules non traitées incubées en présence du lysis solution 45 minutes à 37 C juste avant l'ajout du substrate mix), et la viabilité cellulaire dans chaque puits est alors déduite de ce pourcentage. L'IC50 est alors déterminée comme expliqué dans le paragraphe précédent.
[224] Pour la troisième méthode, le pourcentage de viabilité est déterminé à
l'aide du kit CellTox Green Cytotoxicity Assay (Promega). Ce test mesure la mort cellulaire via un changement de l'intégrité membranaire. Ce test utilise une sonde de type cyanine qui ne pénètre pas dans les cellules quand elles sont vivantes, mais, qui se lie à
l'ADN des cellules mortes, elles perméables à la sonde, la rendant alors fluorescente.
En conséquence, plus la fluorescence dans les puits est élevée, plus la mort cellulaire est importante. Après 48h de traitement, les cellules sont incubées pendant 15 minutes minimum en présence du Celltox green reagent à température ambiante et la fluorescence est lue ¨emission 485 nm/A
¨excitation 590 nm. Le pourcentage de mort cellulaire est déterminé
à l'aide du contrôle 100 % de mort cellulaire (réalisé à partir de cellules non traitées incubées en présence du lysis solution 30 minutes à 37 C avant l'ajout du Celltox green reagent), et la viabilité cellulaire dans chaque puits est alors déduite de ce pourcentage.
L'IC50 est alors déterminée comme expliqué précédemment.
[225] Les résultats des IC50 de ces tests sont présentés dans les Tableaux la, lb et 1 c.
Dans ces tableaux :
- a Le seuil de significativité a été calculé par comparaison du LogIC50 du composé au LogIC50 du DX101 avec min n=3 et un test de One-way ANOVA suivi d'un post-test de Dunn's _ nb représente le nombre de test indépendant avec 4 à 10 réplicats pour chaque condition.
[226] Tableau la:
IC50 (IIM) MIT

Composé nb Moyenne IC50 p valuea LogIC50 (IIM) (iSEM) DX101 10 0.64 0.05 4.40 DX103 2 0.50 0.02 3.16 DX111 5 0.23 0.03 1.69 <0.05 DX115 3 1.57 0.12 >10 <0.001 DX123 6 0.77 0.04 5.94 >0.05 DX125 4 2.16 0.23 >10 <0.0001 DX127 2 1.07 0.04 11.67 DX129 1 1.18 0.17 15.10 [227] Tableau lb:
Icso (p M LDH
Composé nb Moyenne IC50 p valuea Log1C50 (11M) ( SEM) DX101 10 0.51 0.07 3.24 DX103 2 0.64 0.09 4.40 >0.05 DX111 5 0.27 0.13 1.88 >0.05 DX115 3 1.24 0.07 >10 >0.05 DX123 5 0.16 0.19 1.45 >0.05 DX125 3 1.56 0.63 >10 <0.01 DX127 2 0.85 0.44 7.09 DX129 1 0.59 0.18 3.87 [228] Tableau lc :
IC50 (n) Green Cytotoxicity Assy WO 2022/090427 51_ Composé nb Moyenne IC50 p valuea Log1C50 (11M) ( SEM) DX101 8 0.43 0.08 2.68 DX103 1 0.42 0.13 2.63 >0.05 DX111 9 0.34 0.11 2.18 >0.05 DX115 3 1.40 0.05 > 10 <0.001 DX123 6 0.32 0.13 > 10 >0.05 DX125 4 1.35 0.25 >10 <0.001 DX127 2 1.04 0.13 10.89 DX129 1 1.21 0.10 16.18 [229] II est illustré dans les Tableaux la, lb et 1 c que pour le DX111, 11050 est significativement inférieure (jusqu'à un facteur de 2,5) à celle du DX101, indiquant une activité cytotoxique supérieure à celle du DX101. En outre, l'activité du DX123 a une tendance à être supérieure à celle du DX101, et les activités du DX125, DX127 et du DX129 sont inférieures à celle du DX101.
[230] Exemple 26 : Étude de la cytotoxicité des analogues du DX101 selon l'invention sur les cellules BT-474 [231] Les tests de viabilité cellulaires ont été réalisés également sur des cellules tumorales mammaires humaines BT-474 (caractérisée comme étant triples positives HER2+, ER+, PR+). Les cellules BT-474 sont dans un milieu de culture cellulaire identique à l'exemple précédent et sont ensemencées dans des plaques 24 puits à 70 000 cellules par puits, pour la détermination de la viabilité cellulaire à l'aide du bleu Trypan, ou dans des plaques 96 puits à 13 000 cellules par puits pour la détermination de la viabilité
cellulaire à l'aide du test MTT ou LDH. Après 96 heures (h) de culture en condition normale, c'est-à-dire dans un incubateur à une température de 37 C à 5 0/0 d02, nous traitons pendant 48h les cellules BT-474 avec le DX101, DX103, DX105, DX111, DX123 et DX127 à 100 nM, 1 M, 2.5 M et 10 M. Un contrôle est également réalisé en utilisant le protocole décrit précédemment sans traitement avec les molécules DX101, DX103, DX105, DX111, DX123 et DX127.

[232] Après une digestion à la trypsine de 10 minutes à 37 C, la survie cellulaire a été
quantifiée également par un test de bleu de trypan avec comptage automatique par l'appareil Biorad TC20 (TC20Tm Automated Cell Counter). Le test via le bleu de trypan est basé sur l'intégrité des membranes cellulaire, laquelle est rompue chez les cellules mortes.
Le bleu de trypan colore les cellules mortes en bleu. L'appareil de comptage cellulaire Biorad TC20 compte la proportion de cellules bleues et non-bleues, et rapporte au pourcentage de cellules. Le pourcentage de viabilité est alors déterminé dans chaque puits par rapport au cellules non traitées et l'IC50 est déterminée comme expliqué dans l'exemple précédent. Les résultats sont représentés sur le Tableau 2.
Également, le pourcentage de viabilité des cellules BT-474 a été déterminé à l'aide du test MIT et LDH, réalisé comme décrit dans l'exemple précédent.
[233] Les résultats sont représentés dans les Tableaux 2a, 2b et 2c. Dans ces tableaux :
- a Le seuil de significativité a été calculé par comparaison du LogIC50 du composé au LogIC50 du DX101 avec min n=3 et un test de One-way ANOVA suivi d'un post-test de Dunn's (excepté pour le test LDH où la p-value a été calculée par un t-test) _ nb représente le nombre de test indépendant avec 3 à 10 réplicas pour chaque condition.
[234] Tableau 2a:
IC50 (p.M) MTT
Composé nb Moyenne IC50 p yaluea LogIC50 (IIM) ( SEM) DX101 0.88 0.03 7.53 DX103 0.85+0.05 7.08 >0.05 DX105 0.86 0.04 4.08 >0.05 DX111 0.95+0.10 8.94 >0.05 [235] Tableau 2b:
IC50 (IIM) LDH
Composé nb Moyenne IC50 p values LogIC50 (IIM) ( SEM) DX101 1.03 0.06 10.64 DX111 0.89 0.04 7.82 >0.05 [236] Tableau 2c:
IC50 (IIM) Trypan Blue Composé nb Moyenne ICso p valuea LogIC50 (IIM) ( 5E M) 0X101 0.61 0.20 4.03 DX103 0.42 0.25 2.62 >0.05 DX105 0.55 0.14 3.57 >0.05 DX111 60.78 0.15 5.96 >0.05 [237] II est illustré dans les Tableaux 2a, 2b et 2c que l'activité des molécules DX103, DX105, DX111 et DX127 est similaire à celle du DX101, et que celle du DX123 a la tendance à
être supérieure à celle du DX101 dans cette lignée. Toutes ces molécules sont donc pressenties comme de bons candidats pour un développement industriel car elles ont des données de biologique similaires ou supérieures au DX101.
[238] Exemple 27 : Effet du composé analogue DX111 sur la croissance tumorale in vivo [239] Toutes les procédures sur les animaux ont été conduites selon les directives de notre institution après avoir été approuvée par le comité d'éthique. Les cellules 4T1 ont, été
cultivées comme précédemment, été dissociées dans la trypsine, lavées deux fois dans du PBS froid et re-suspendues dans du PBS à 1.5 million/ml. Les tumeurs 4T1 ont été
obtenues par transplantation sous-cutanée de 0.150 million de cellules dans 100 [IL dans le flanc de souris Balb/c femelle (9 semaines, Janvier). Quand les tumeurs ont atteint un volume de 50-100 mm3, les souris ont été gavées de 40 mg/kg de DX101 ou de 40 mg/kg de DX111 ou du véhicule contrôle (eau). Le traitement a été réalisé tous les jours jusqu'à
la fin de l'expérience (volume tumoral> 1000 mm3). Le volume tumoral a été
déterminé
tous les jours à l'aide d'un pied à coulisse et calculé à l'aide de la formule :1/2 X (Longueur Largeur2). Le pourcentage d'inhibition de la croissance tumorale a été
déterminé selon la formule suivante : 100 X (1- (Volume tumoral, jour 7/ volume tumoral jour 0) mol 1) / (1-(volume tumoral, jour 7/ volume tumoral jour 0) véhicule).
[240] La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour comparer la survie des animaux.
[241] II est illustré sur la Figure 7A que le DX111 présente un effet supérieur au DX101 sur la réduction de la croissance tumorale ("p<0.01, test one-way ANOVA et post-test de Tukey). L'inhibition de la croissance tumorale à 7 jours a en outre été
déterminée à 67 %
pour les animaux traités au DX111 et à 48 % pour les animaux traités au DX101.
[242] En outre, l'analyse de la survie des animaux, illustrée également sur la Figure 7B, indique une meilleure médiane de survie des animaux traités au DX111 (Log-rank Mantel-Cox test, *p<0.05 et ns, non significatif ; Logrank test for trend, **p<0.01).
Également, on y observe que après 15 jours de traitements, la survie est de 25 % pour les animaux traités au DX111 alors qu'elle est de 0 % pour les animaux traités au DX101. La médiane de survie après traitement du DX101 (40 mg/kg) se situe à 9 jours alors que celle du DX111 (40 mg/kg) se situe à 10 jours.
[243] En conclusion, l'effet du DX111 est beaucoup plus important in vivo sur l'inhibition de la croissance tumorale et influe fortement sur la survie des animaux.
[244] Exemple 28 : Étude pour déterminer la pharmacocinétique et la biodisponibilité du DX111 par voie orale chez le rat.
[245] Protocole : L'étude a été réalisée sur quatre groupes décrits ci-après.
Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4 Administration du DX101 DX101 DX111 DX111 composé
Dose 50 mg/kg 5 mg/kg 50 mg/kg 5 mg/kg Voie d'application orale I.V. orale I.V.
Animaux rat rat rat rat Taille du groupe 3 3 3 3 Échantillons plasma plasma plasma plasma Dosage DX101 DX101 DX111 DX111 [246] Prélèvement plasmatique à 0 (sans injection), 15, 30min, lh, 4h, 8h, 24h, 48h, 72h [247] Les résultats sont donnés dans le Tableau 3 [248] Tableau 3 Composé DX101 DX111 Dose po (mg/kg) 50 50 Dose iv (mg/kg) 5 Cmax [ng/ml] 77 309 Cmax [ng/ml] 3308 Tmax [h] 4 4 ASC(t0-tlast) 1546 3228 ASC(t0-tlast) Vd [L/kg] 29 Vss [L/kg] 19 T1/2 2nd phase [h] 39 24 T1/2 2nd phase [h] 28 Clairance[ml/min/kg] 412 240 Clairance[ml/min/kg] 11 F 3 0/0 10 `)/0 [249] De façon surprenante, les résultats montrent que le composé analogue présente une biodisponibilité 3 fois supérieure au composé de référence DX101 en diminuant le temps de demi-vie d'élimination. La concentration maximale plasmatique obtenue avec le DX111 est 4 fois supérieure à celle du DX101 et la clairance est divisée par 2.
[250] Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.
L'usage du verbe comporter , comprendre ou inclure et de ses formes conjuguées n'exclut pas la présence d'autres éléments ou d'autres étapes que ceux énoncés dans une revendication.

Claims

Revendications ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un tel composé, dans lequel :
R1 est choisi parmi : F, N3, OaH2n+1, NR2R3, SR2, 502R2, avec n 8, R2 et R3 sont indépendamment choisis parmi : H, un groupement alkyle en C1 à
C8, saturé
ou insaturé, contenant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi des groupes allyle, carbonyle, arène et hétérocyclique, pour son utilisation en tant que médicament pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.
[Revendication 2] Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé de formule (I) est un analogue 0-aminé dans lequel le radical R1 = NR2R3 avec R2 étant H ou COC,-,1-12n+1 et R3 = H.
[Revendication 3] Composé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le composé de formule (l) est le 5a-hydroxy-66-[2-(1H-imidazol-4-yl)-éthylarnino]-3p-acétam ide.
[Revendication 4] Composé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le composé de formule (l) est le 5a-hydroxy-66-[2-(1 H-irnidazol-4-yl)-éthylamino]-3p-am i no.
[Revendication 5] Composé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le composé de formule (l) est le 5a-hydroxy-6[312-(1 H-irnidazol-4-yl)-éthylamino]-3p-azoture.
[Revendication 6] Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel le composé de formule (l) est le 5a-hydroxy-6612-(1 H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-ch olestan-313-fluoro.
[Revendication 7] Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel le composé de formule (l) est un analogue 0-alkylé et est choisi parmi :
- le 5a-hydroxy-66-[2-(1 H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-36-méthoxyle - le 5a-hydroxy-66-[2-(1 H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-36-éthoxyle - le 5a-hydroxy-6642-(1H-im idazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-313-octanoxyle.
[Revendication 8] Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel le composé de formule (I) est le 5a-hydroxy-6612-(1H-imidazol-4-yl)-éthylamino]-cholestan-3f3-méthylsulfonyle.
[Revendication 9] Composé pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la tumeur cancéreuse est un cancer chimiosensible.
[Revendication 101 Composé pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à
8, dans lequel la tumeur cancéreuse est un cancer chimiorésistant.
[Revendication 11] Composé pour son utilisation selon la revendication 10 dans lequel le cancer chimiorésistant est un cancer hématologique ou du sang, tel que la leucémie, en particulier la leucémie myéloïde aiguë ou la leucémie lymphocytaire aiguë, le lymphome, en particulier le lymphome non-hodgkinien et le myélome multiple.
[Revendication 12] Composé pour son utilisation selon l'une des revendications 10 et 11 dans lequel ledit cancer est chimiorésistant à la daunorubicine, à la cytarabine, au fluorouracile, au cisplatine, à l'acide tout-trans-rétinoïque, au trioxyde d'arsenic, au bortézomib ou à l'une de leurs combinaisons.
[Revendication 13] Composition pharmaceutique comprenant dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un cornposé selon l'une des revendications 1 à 8 pour son utilisation pour faire régresser une tumeur cancéreuse de mammifère.
[Revendication 14] Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 13, comprenant en outre au moins un autre agent thérapeutique.
[Revendication 15] Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 14, dans laquelle l'autre agent thérapeutique est un agent antinéoplasique.
[Revendication 16] Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d'une tumeur qui est chimiorésistante audit agent antinéoplasique lorsqu'il n'est pas administré en combinaison avec un composé selon l'une des revendications

1 à 8.
[Revendication 17] Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient souffrant d'une tumeur qui est chimiosensible audit agent antinéoplasique, dans laquelle la dose de l'agent antinéoplasique administré audit patient en combinaison avec un composé selon l'une des revendications 1 à 8 ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables est inférieure à la dose de l'agent antinéoplasique lorsqu'il n'est pas administré en combinaison avec un composé selon l'une des revendications 1 à 8.
[Revendication 18]
Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisée par le fait qu'elle est sous forme appropriée pour être administrée par toutes voies, de préférence par voie intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale.