KR20060093554A

KR20060093554A - 다약제내성 억제 효과를 갖는 퀴놀린 유도체 및 이의 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20060093554A
Application number: KR1020050014626A
Authority: KR
Inventors: 강종민; 최상운
Original assignee: 학교법인 대양학원; (주)바이오버드
Priority date: 2005-02-22
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2006-08-25
Also published as: KR100639163B1

Abstract

본 발명은 다약제내성 억제 효과를 갖는 퀴놀린 유도체 및 이의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물을 제공한다.

[화학식]

상기 화학식에서 R은 수소 또는 벤젠고리를 나타낸다.

본 발명의 신규한 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물은 다약제내성의 억제효과가 우수하여 항암제 치료시 약물 내성에 의한 약효 저감을 방지하여 효율적으로 암치료를 할 수 있는 유용한 효과가 있다.

퀴놀린, 유도체, 다약제내성, 억제, 암

Description

다약제내성 억제 효과를 갖는 퀴놀린 유도체 및 이의 약제학적 조성물{Quinoline derivatives having effect with Reversal of multidrug resistance and pharmaceutical composition containing the same}

도 1은 in vitro 에서 MES-SA 인간 암세포의 파클라탁셀(TAX) 독성에 대한 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)의 효과를 나타낸 그래프,

도 2는 in vitro 에서 MES-SA/DX5 인간 암세포의 파클라탁셀(TAX) 독성에 대한 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)의 효과를 나타낸 그래프,

도 3은 in vitro 에서 HCT15 인간 암세포의 파클라탁셀(TAX) 독성에 대한 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)의 효과를 나타낸 그래프,

도 4는 MES-SA, MES-SA/DX5 및 HCT15의 인간 암세포에서 로드아민 123의 축적율에 대한 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)의 효과를 나타낸 그래프,

도 5는 파클리탁셀 유도와 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)에 의한 MES-SA/DX5 암세포의 세포 주기의 정지 효과를 나타낸 그래프,

도 6는 파클리탁셀 유도와 본 발명의 퀴놀린 유도체(1B-1, 1B2-2)와 베라파민(VER)에 의한 HCT 암세포의 세포 주기의 정지 효과를 나타낸 그래프.

현재까지 암 질병에 대한 생화학적 연구와 화학치료제에 대한 연구가 계속되어 왔으나, 암의 완전 치료에는 이르지 못하고 있는 실정이다.

또한, 현재 시행중인 암의 치료 방법으로는 외과적 방법, 방사선 요법 및 약물과 같은 화학요법이 있으나, 이중 외과적 방법과 방사선 요법은 암 발생의 초기 단계에서 유용한 방법이기 때문에 초기에 감지하기가 힘든 암의 경우에 화학요법에 대한 의존도가 점차 증가되고 있다.

그러나, 항암 화학요법은 50년 이상의 역사를 가지고 있고, 현재까지 수백여 종의 항암제가 개발되어 임상에서 사용되어 왔으나, 임상적으로 만족할만한 효과를 얻는 경우는 아직 많지 않다.

이와같이, 암이 난치성 질환으로 남아 있는 주요한 이유 중의 하나가 암세포에서 흔히 관찰되는 약제내성의 발현이며, 특히 구조적으로나 기능적으로 서로 연관이 없는 여러 가지 종류의 항암제들에 대해 교차내성을 나타내는 다약제내성의 발현은 약물에 의한 항암치료를 더욱 어렵게 하고 있다.

지금까지 다약제내성의 발현과 관련된 여러 기작들이 밝혀지고 있는 데, 구체적인 예를 들어 임상에서 가장 일반적으로 발현되고 문제가 되는 기작 중의 하나 로 세포막 단백질인 P-당단백질(P-glycoprotein; PGD)의 과다발현에 의한 다약제내성이 알려져 있다.

즉, P-당단백질은 사람의 ABCB-1(MDR1) 유전자에 의해 170kDa이 암호화 되어 있는 세포막 단백질(membrane protein)로서, 6개의 막으로 구분되는 부분과 하나의 ATP-결합부위를 가지는 상동의 소수성 부위가 두개로 형성된 1,280개의 아미노산으로 구성된 ATP 결합 카세트(ATP binding cassette; ABC) 수송단백질(transporter proteins)의 상족(superfamily)에 속하는 데, P-당단백질에 의한 다약제내성의 발현은 P-당단백질이 약물과 직접 결합하여 ATP를 소모하는 에너지 의존적 기작에 의해 약물을 세포 밖으로 방출시킴으로써 세포내의 약물 농도를 낮추는 기작을 통해 다약제내성을 나타내는 것이다.

또한, 대부분의 결장이나 신장암과 같은 인간의 종양에는 P-당단백질이 발현되고 발현속도가 증가하여, 종양의 악화를 가중시킨다.

이중, P-당단백질에 의해서 영향을 받는 항암제로는 빈카 알카로이드(vinca alkaloids) 계열의 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 나벨빈(navelbine)과, 탁산스(taxanes) 계열의 파클리탁셀(paclitaxel;TAX), 탁소테르( taxotere)과, 안트라사이클린(anthracyclines) 계열의 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin)과, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins) 계열 약물인 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide) 등과 기타약물들로 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스 산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 및 미토마이신 C(mitomycin C) 등의 다양한 약물들이 알려져 있다.

따라서, 항암제의 사용에 있어서 이러한 다약제내성이 중요한 제한요소로 작용되고 있으며, 임상적으로도 P-당단백질을 발현하는 암을 갖는 환자의 치료율이 이를 발현하지 않는 암 환자에 비해 현저히 떨어지는 결과를 보이고 있다.

현재 이러한 다약제 내성을 극복하기 위한 연구들이 다양하게 진행되고 있으며, 다약제내성 억제제의 개발은 1980 년대 초에 Tsuruo 등에 의해 베라파밀(verapamil)의 다약제내성 억제효과가 처음으로 발표된 이후에 다양한 약물들이 다약제내성 억제효과가 있음이 밝혀지고 있다.

즉, 다약제내성 억제제로의 활성이 있는 물질들로는 베르파밀(VER)을 비롯하여, 세팔라틴(cephalanthine), 페노티아진(phenothiazine), 사이클로스포린 A (cyclosporine A), 디피리다몰(dipyridamol), 퀴니딘(quinidine), 프로게스테론(progesterone), 세포페라존(cefoperazone) 등 다수의 약물들이 지금까지 보고 되고 있으며, 최근에는 덱스베라파밀(dexverapamil), 덱스니굴디핀(dexniguldipine), Ro11-2933, PSC-833, S9788, LY335979, XR-9576, GF120918, VX-710, VX-853 등이 임상 실험을 진행하였거나 현재 진행 중에 있으나 아직까지 임상에서 만족할 만한 효과를 나타내는 약물은 보고 되고 있지 않다.

이에 본 발명자는 다수 합성한 신규한 퀴놀린 유도체 중에서 기존의 다약제내성 억제제보다 우수한 특성을 갖는 약물개발을 목적으로 다양한 구조의 약물들을 대상으로 다약제내성 억제효과를 갖는 화합물을 검색하고, 이중 우수한 다약제내성 억제 효과를 나타내는 퀴놀린 유도체를 선발하여, 본 발명을 완성하였다.

또한, 본 발명에서는 상기 선발된 퀴놀린 유도체와 P-당단백질의 기질로 알려진 기존의 TAX를 P-당단백질을 발현하는 암세포 및 발현하지 않는 암세포에 병용 처리하여 암세포에 대한 세포독성 변화를 비교 측정하여, 각 유도체들의 다약제내성 억제효과를 측정하고 구조와의 상관관계에 대하여 밝히고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 효과를 갖는 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식에서 R은 수소 또는 벤젠고리를 나타낸다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 유도체를 유효량으로, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물 을 제공한다.

아울러, 상기 다약제내성은 항암제에 대한 내성인 것을 특징으로 하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 상기 암은 결장암, 직장암, 방광암, 난소암, 유방암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 신규한 퀴놀린 유도체는 합성하여 제조하며, 약물에 대한 암세포의 다약제내성을 억제하는 용도로 사용하는 데, 기존 다약제내성 억제제와 비교하여 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라 종래 항암제에 대한 암세포 독성을 강화하여 항암효과를 증가시키는 화합물이다.

즉, 본 발명의 퀴놀린 유도체는 파클리탁셀(paclitaxel; TAX) 등과 같이 G2나 M기의 암세포 주기를 정지시켜서 항암작용을 하는 항암제와 같이 사용하면, P-당단백질의 발현 억제를 통해 암세포에 대한 항암 효과를 증가시킨다.

그리고, P-당단백질에 의해 항암효과에 영향을 받는 항암제와 같이 사용해도 항암 효과를 훨씬 향상 시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 퀴놀린 유도체는 항암제의 약물 내성을 억제해주는 용도로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 결장장, 직장암, 방광암, 난소암, 유방암, 폐암 등 암의 치료에 사용하는 항암제와 병용하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 합성된 상기 퀴놀린 유도체는 하기 화학식 2와 화학식 3으로 표시되며, 이를 각각 1B3-1와 1B3-2로 명명하였다.

[화학식 2]

[화학식 3]

그리고, 본 발명의 퀴놀린 유도체는 하기 반응식과 같은 공정을 거쳐 제조하 는 것이 바람직하다.

[반응식]

그러나, 본 발명의 퀴놀린 유도체는 상기 합성방법 이외에, 이미 공지된 방법 뿐만 아니라 미공지된 방법이라도 본 발명의 퀴놀린 유도체를 합성할 수 있는 방법이라면 어느 방법을 사용해도 무방하다.

그리고, 본 발명에 따라서 약학적 제제의 형태로 제조하는 경우, 본 발명의 퀴놀린 유도체, 즉 1B3-1 또는 1B3-2를 포함하는 조성물을 약학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제나 현탁제와 같은 경구 투여용 제제 또는 주사가능한 액제나 현탁제와 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화될 수 있다.

이때, 본 발명의 퀴놀린 유도체를 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현 탁제 등의 경구 투여용 제제로 제형화하는 경우에 있어서는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세 결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산 이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있으며, 투여 단위형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다.

또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사 가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 불휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류 등의 약학적으로 허용되는 액상 담체중에 유효량의 활성 화합물을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다.

그리고, 상기 약학적으로 허용되는 담체로는 약학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 활성 성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명의 퀴놀린 유도체 3μM은 종래 다약제내성 억제제로 잘 알려진 베르파밀(verpamil) 10 μM의 억제 효과와 유사하다.

따라서, 본 발명의 퀴놀린 유도체를 유효량으로 함유하는 약학적 제제는 경 구 투여의 경우 성인 1인 기준으로 30 내지 120㎎, 바람직하게는 40 내지 80㎎을 1일 1회 내지 수회, 바람직하게는 2회 내지 3회에 나누어 투여하며, 주사 투여의 경우에 있어서는 성인 1인 기준 40 내지 60㎎을 1일 1회 내지 수회에 걸쳐 나누어 투여할 수 있다.

하지만, 상기 퀴놀린 유도체의 유효량은 통상적으로 다약제내성의 억제 효과가 있는 것으로 알려진 베라파밀(verapamil)의 유효량 효과를 예상하여 결정하였으나, 환자가 앓고 있는 질환의 종류 및 질환의 중증도, 투여하고자 하는 환자의 성별, 연령, 체중 및 건강 상태, 투여 방식, 투여 횟수와 시간, 병용 약물의 사용 여부 및 기타 외부 환경요인에 따라 변경될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다.

하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예 1] 본 발명의 퀴놀린 유도체 제조

(a) 화합물 1B 제조

다이클로로메탄 4 ml에 상기 화학식 4의 화합물 100mg을 녹이고 1,1-카르보닐디이미다졸(1,1-carbonyldiimidazole) 85 mg을 넣어준 후 1시간 동안 교반하고 상기 화학식 5의 아민 B(amine B) 65 mg 를 넣어주고 1시간 동안 교반하였다. 그리고, 반응 솔벤트를 모두 감압 증류한 후 2% 메탄올-다이클로로 메탄을 이용하여 실리카젤 하에서 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 131 mg (84 %) 의 상기 화학식 6 으로 표시되는 화합물을 얻었으며, 이를 1B라 명명하였다.

¹H NMR(CDCl₃) 6.8 (d, 2H, J= 8.3) 6.7(m, 3H) 6.6(d, 2H, J=8.3) 5.3(br, 1H) 3.8(s, 6H) 3.6(br, 2H) 3.4(q, 2H, J=6.7) 2.9(t, 2H, J= 7.3) 2.6(t, 2H, J=6.7) 2.4(t, 2H, J=7.3)

HRMS C₁₉H₂₄N₂O₃계산값 328.1787 측정값 328.1793

(b) 화합물 1B3 제조

다이클로로메탄 4 ml에 상기 화학식 7의 화합물 100mg을 녹이고 1,1-카르보닐디이미다졸 103 mg을 넣어준 후 1시간 동안 교반한 후 상기 제조한 화학식 6의 1B 화합물 189 mg 을 넣어주고 2일 동안 교반하였다. 그리고, 솔벤트에 녹지 않는 생성물을 여과하여 상기 화학식 8로 표시되는 화합물 198 mg(70.9 %)을 얻었으며, 이를 1B3라 명명하였다.

¹H NMR(CDCl₃) 9.4(d, 1H, J=2.3) 8.7(d, 1H, J=2.3) 8.2(d, 1H, J=8.3) 8.1(s, 1H) 7.9(d,1H, J=8.3) 7.8(td, 1H, J=8.0, 1.5) 7.7(td, 1H, J= 8.0, 1.0) 7.6(d, 2H, J= 8.4) 7.1(d, 2H, J=8.4) 6.7(m, 3H) 5.3(br, 1H) 3.8(s,3H) 3.8(s,3H) 3.5(q, 2H, J = 6.5) 2.9(t, 2H, J=7.4) 2.7(t, 2H, J = 6.5) 2.4(t, 2H, J= 7.4)

HRMS C₂₉H₂₉N₃O₄계산값 483.2158 측정값 483.2160

(c) 화합물 1B3-1 과 화합물 1B3-2의 제조

상기 제조한 화학식 8의 화합물인 1B3 200mg을 6 ml DMF에 녹인뒤 30mg NaH를 넣고 351mg(5 eq.)의 벤질 브로마이드(Benzyl bromide)를 넣고 두시간 교반하였다. 그리고, 반응 혼합물을 물 40 ml에 붓고 생성되는 고체를 여과하였다. 얻어진 고체는 1 % 메탄올-다이클로로메탄을 이용하여 실리카젤 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 26 mg(11 %)의 화학식 2로 표시되는 화합물인1B3-1과 117mg(43 %)의 화학식 3으로 표시되는 화합물인 1B3-2를 각각 얻었다.

화합물 1B3-1: ¹H NMR(CDCl₃) 8.6(d, 1H, J=4) 8.29(d, 1H, J=2) 8.2(d, 1H, J=8.3) 8.1 - 6.4(m , 17H) 5.4(br, 1H) 3.8(s,3H) 3.8(s,3H) 3.3(q, 2H, J = 6.5) 2.8(t, 2H, J=7.4) 2.5(t, 2H, J = 6.5) 2.3(t, 2H, J= 7.4)

HRMS C₃₆H₃₅N₃O₄계산값 573.2628 측정값 573.2630

화합물 1B3-2: ¹H NMR(CDCl₃) 8.71(d, 1H, J=2) 8.28(d, 1H, J=2.) 8.2- 6.6(m, 21H) 5.16(br, 1H) 4.3(s,2H) 3.9(s, 2H) 3.8(s,3H) 3.8(s,3H) 3.5(q, 2H, J = 6.5) 2.9(t, 2H, J=7.4) 2.7(t, 2H, J = 6.5) 2.4(t, 2H, J= 7.4)

HRMS C₄₃H₄₁N₃O₄계산값 663.3097 측정값 663.3059

[실시예 2] 세포배양

인간의 결장-직장암세포주 HCT 15 및 방광암세포주 MES-SA와 독소루비신에 내성을 지닌 방광암세포주 MES-SA/DX5는 ATTCC(American Type Culture Collection ,Rockville, Maryland, U.S.A.)에서 분양받은 것을 사용하였다.

세포배양은 글루타민(glutamine), 중탄산나트륨(NaHCO₃, Giboco사, Grand Island, N.Y., USA), 젠타미이신(gentamycin, Sigma, St. Louis, MO, USA), 암포테리신(amphotericin, Sigma 사)과 5%의 FBS(fetal bovine serum, Giboco사)가 함유된 RPMI1640 배지(Giboco사)가 있는 팔콘관 25(Falcon T-25, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA)에서 수행하였다.

이때, 배양하기 전 상기 세포를 분주하기 위해, 세포를 0.25% 트립신과 3mM CDTA에서 처리하여 사용하였다.

세포배양은 약제를 첨가할 경우를 제외하고는 37℃, 5% 이산화탄소 공기 조건의 CO₂ 배양기에서 수행하였다.

[실시예 3] 다약제내성 억제 효과

본 실시예는 항암제 파클리탁셀(TAX)의 세포독성을 배가시켜주는 다약제내성 억제제의 효능을 MES-SA, MES-SA/DX5 및 HIT15 세포주에서 측정하고자 하였다.

세포들은 96-웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 세포가 플레이트 바닥 면에 부착되도록 24시간동안 전배양을 하였다.

부착된 세포는 TAX의 연속 희석 농도에 따라 대조군(다약제내성 억제제 무첨가)과 상기 실시예 1에서 제조된 1B3-1과 1B3-2(0.3, 1.0 및 3.0μM)과 베라파밀(1.0, 2.0 및 10.0 μM)를 농도별로 첨가하여 72시간동안 배양하였다.

배양이 완료된 다음, 각 웰에서 배지를 제거하고, 세포는 4℃를 유지한 찬 10%의 TCA(trichloroacetic acid, Sigma 사)에서 1시간동안 고정하였다.

그리고, 세포는 다시 증류수로 수세하고 1% acetic acid 용액에 녹인 0.4%의 SRB 염료로 염색한 다음, 상온에서 30분동안 반응을 시켰다. 다시 세포를 수세하고 수세한 세포는 10mM의 트리스 염 용액(pH 10.5)에 용해하여 측정용 샘플로 사용하였다.

흡광도는 분광도계(spectrophotpmeter)의 520nm와 690nm에서 마이크로타이터 플레이트 측정기(microtiter plate reader, Molecular Devices E-max, Sunnyvale, CA, USA) )로 측정하였다. 이때, 비특이적인 흡광도를 제거하기 위여, 690nm의 흡광도에서 520nm의 흡광도를 공제하였다.

그리고, 세포의 생존성(Cell survival fractions; 순수 세포 성장율을 의미함)은 하기 3가지의 기본 측량를 이용하여 하기 식 1과 식 2로 계산하여 다약제내성의 억제효과를 나타내었다.

즉, 약물(drug, 다약제내성 억제제) 배양 시작 전의 0 시간의 웰당 흡광도는 Tz(time zero)로 나타내고, 약물없이 배양한 마지막 시간의 웰당 흡광도(대조군)는 CC(Cell control)로 나타내며, 약물 배양기간의 마지막 시간의 웰당 흡광도는 DT(drug-treatment)로 나타내었다.

[식 1]

DT≥Tz 인 경우

순수 완전 암세포 성장 억제 값 = {(DT-Tz)/(CC-Tz)}×100

[식 2]

DT≤Tz 인 경우

순수 완전 암세포 사멸 활성 값 ={(DT-Tz)/Tz}×100

이때, 본 발명에서 각 실험의 수치는 세번 수행한 평균값을 나타내었다.

이의 결과는 도 1과 2에 도시하였다.

도 1, 2 및 3에서 다약제내성 억제제 무처리군은 (○), 다약제내성 억제제 처리 농도별로 0.3μM은 (▲), 1.0μM은 (■), 3.0μM은 (●) 및 10.0μM은 (□)을 나타낸 것이다.

또한, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 50%의 암세포가 성장이 억제되는 파클라탁셀의 유효한 농도(EC₅₀) 값을 측정하여 다약제내성 억제효과를 나타내었다.

이때, 상기 실험의 모든 값은 평균값과 표준오차로 계산하였으며, 유의성 검정은 시그마 통계 프로그램(Sigma Stat^®, jandel사., San Rafael, Ca, USA)의 멀티플 비교에 대한 듀네트 테스트(Dunnett's test)에 따른 ANOVA(one-way analysis of variance)를 이용하였다. 유의성 검정은 p값이 0.05이하인 경우에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

상기 실험 결과, 먼저 MES-SA, MES-SA/DX5 및 HCT15의 암세포주에 대한 파클리탁셀의 세포독성은 농도 의존적으로 증가하는 데, 대조군(다약제내성 억제제 무처리군)의 EC₅₀ 값은 각각 1.3 nM, 173.8 nM 및 70.0nM로 나타났으며, MES-SA/DX5 세포주는 MES-SA 세포주보다 약물에 대해 130배 정도 더 높은 저항성을 나타내는 것을 확인하였다.

그리고, 본 발명의 1B3-1과 1B3-2, 그리고 베르파밀도 MES-SA, MES-SA/DX5 및 HCT15의 암세포주에 대한 파클리탁셀의 세포독성을 농도 의존적으로 보다 강화시키는 것을 알 수 있었다.

즉, 1B3-1 처리군은 3.0μM과 1.0 μM의 농도에서 MES-SA/DX5 세포주의 대조군보다 각각 암세포독성을 57배와 5배로 증가시켰고(P<0.05), 1B3-2는 3.0μM, 1.0 μM 및 0.3μM의 농도에서 각각 290배, 20배 및 9배로 증가시켰다(p<0.05).

또한, HIT 15 세포주에 있어서, 1B3-1 처리군은 3.0μM과 1.0 μM의 농도에서 대조군보다 각각 암세포독성을 60배와 6배로 증가시켰고(P<0.05), 1B3-2는 3.0μM, 1.0 μM 및 0.3μM의 농도에서 각각 230배, 23배 및 3배로 증가시켰다(p<0.05).

반면, MES-SA 세포주에 대한 본 발명의 1B3-1과 1B3-2 처리군의 모든 농도에서는 파클리탁셀의 암세포독성 효과에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었고, 유의성도 없었다(p>0.05).

[실시예 4] 암세포의 로도아민 축적 실험(Rhodoamine accumulation assay)

본 실시예에서는 형광물질인 rhodamine-123(Rho-123)의 방출과 세포의 P-당단백질 발현이 밀접한 관련(Lee, J. S., Paull, K., Alvarez, M., Hose, C., Monks A., Grever, M., Fojo, A. T. and Bates, S. E. : Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates in the national Cancer Institute drug screen. Mol. Pharmacol. 46, 627, 1994).이 있는 것을 착안하여, 본 발명의 다약제내성 억제 효과를 암세포주에 대한 로도아민- 123(rhodamine-123)의 축적량으로 측정하고자 하였다.

먼저, 로도아민 축적 실험은 최 S-U 등의 변형된 방법(Choi S-U, Lee C-O, Kim K-H, Choi E-J, Park S-H, Shin H-S, Yoo S-E, Jung N-P and Lee B-H: Reversal of multidrug resistance by novel verapamil analogs in cancer cells. Anti-Cancer Drugs 9: 157-165, 1998)에 따라 형광물질 측정 시스템을 사용하여 24 웰에서 다음과 같이 수행하였다.

세포주는 1.5㎖의 성장배지가 있는 24개의 플랫 웰에 동량을 접종하고, 37℃, 5%의 CO₂의 조건에서 2∼3일동안 배양하였다.

그리고, 반융합의 세포 대수기(semiconfluent logarithmic growth phase)에서, 배지를 제거하고 4μM의 로도아민 123을 무약물, 1B3-1, 1B3-2 및 베르파밀을 처리한 세포에 첨가하고 37℃, 5%의 CO₂의 조건에서 40분동안 배양한 다음, 로드아민이 포함된 배지를 제거하고 세포는 차가운 PBS(potassium buffered saline)에 두번 수세하였다.

그리고 나서, 세포는 웰당 1.5㎖의 증류수를 넣고 파쇄하고, 이를 측정용 샘플로 사용하였다.

세포에 축적된 로도아민 123은 형광물질 마이크로플레이트 리더 시스템(fluorescence microplate reader system, Millipore Cytofluor 2300, MA, USA)을 이용하여 측정하였다(excitation: 485/20 nm , emission: 530/25nm).

그리고, 로도아민 축적의 비교 측정값은 하기 식 3으로 나타내었다.

[식 3]

로도아민 축적값 = (TC-BC)/(CC-BC)

이때, BC는 세포를 넣지 않는 블랭크의 대조구(blank control)이고, CC는 세포에 다약제내성 억제제를 넣고 배양하지 않은 대조군이고, TC는 세포에 다약제내성 억제제를 넣고 배양하지 않은 실험군이다.

이의 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 HIT 15 세포주에서는 3.0μM과 1.0 μM의 농도에서 처리한 1B3-1 실험군이 대조군에 비하여 각각 3.3배와 2.1배가 높게 나타났다(p<0.05).

MES-SA/DX5 세포주의 경우에는 3.0μM과 1.0 μM의 농도에서 처리한 1B3-1 실험군이 대조군에 비하여 각각 2.8배와 1.7배가 높게 나타났으며(p<0.05), 1B3-2는 각각 4.3배와 2.8배가 높게 나타났다(p<0.05).

그러나, MES/SA 세포주에서는 상기 실시예 3의 암세포독성 결과와 같이 로드아민 축적에 영향이 없는 것으로 분석되었다.

[실시예 5] 세포주기 분석(cell cycle assay)

본 실시예에서는 항암제와 본 발명의 1B3-1과 1B3-2를 동시에 사용하고, 이에 암세포주기에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

세포 주기는 Lee BH 등(2000)의 변형된 PI 염색방법으로 DNA의 함량을 측정하여 분석하였다(Lee BH, Shin HS, Lee CO, Park SH, Yoo SE, Yi KY, Jung N-P and Choi S-U: Effects of KR-30035, a novel multidrug-resistance modulator, on the cardiovascular system of rats in vivo and on the cell cycle of human cancer cells in vitro. Anti-Cancer Drugs 11: 55-61, 2000).

먼저, 세포는 6 웰 플레이트(팔콘) 바닥에 고정시키고, 1 내지 2일도안 배양을 하였다.

그리고, 세포가 융합되기 전에 파클리탁셀을 각각 무약물, 1B3-1, 1B3-2 및 베르파밀과 세포에 첨가하고 12시간, 24시간 및 48시간동안 배양을 한 다음, 찬 PBS와 트립신으로 수세를 하고, 다시 두번을 찬 PBS에서 500g/ 8분동안 원심분리하여 수세하였다.

최종 세포 펠렛은 1 ㎖ PI 용액(2차 증류수 1리터 기준으로 PI 50mg, 4mM 시트르산나트륨, RNAase A 450mg과 1%의 트리톤 X-100)에서 서서히 재현탁하고, 암소에서 적어도 30분동안 반응을 시켜 분석용 샘플을 준비하여 플로우 사이토메트리(flow cytometry, FACSort, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.

그리고, 세포 주기는 CellQuest^TM software (Becton-Dickinson)를 사용하여 G0/G1, S, G2/M기의 세포 집단들(cell populations)을 막대그래프로 나타내었다.

이의 결과는 도 5와 6에 나타내었다.

HCT 15 세포주의 세포주기를 나타낸 도 5에 의하면, 12시간 이후에는 대조군(파클리탈셀과 다약제내성 억제제를 둘 다 처리하지 않음)은 세포가 기하급수적으로 성장하면서 G0/G1(첫번째 피크), S(첫번째 피크와 두번째 피크 사이) 및 G2/M(상대적으로 작은 두번째 피크)기에 속하는 세포 집단 비율이 각각 53.0%, 18.2% 및 26.4%로 나타났으며, 24시간과 48시간 이후에는 상술한 12시간 결과와 유사하게 나타내었다.

그리고, 0.1μM의 파클리탁셀을 세포에 처리하면 12시간 후, G0/G1기가 G2/M기로 전이되면서 세포 집단 비율이 각각 16.1%, 13.2% 및 64.0%로 측정되었고, 24시간 후에도 상기 비율이 유지되었으나, 48시간 이후에는 HCT 15 세포주의 70%이상이 세포사멸(apoptosis)기로 유도되었다.

파클리탁셀 0.01 μM에서는 조금씩 G0/G1기가 G2/M기로 전이되면서 48시간 이후에는 HCT 15 세포주의 약 30%가 세포사멸(apoptosis)기로 유도되었다.

그러나, 3 μM의 1B3-2와 0.01μM의 파클리탁셀 처리군은 12시간 이후 G0/G1기가 G2/M기로 매우 신속히 전이되면서 세포 집단 비율이 각각 18.2%, 12.5% 및 52.0%로 측정되었고, 1B3-1과 베르파밀도 매우 유사한 결과를 나타내었다. 그리고 48시간 이후에는 1B3-1, 1B3-2 및 VER 처리군의 HCT 15 세포주 세포사멸기(apoptosis phase)가 각각 58.4%, 72.7% 및 37.1%로 유도되었다.

또한, MES-SA/DX5 세포주의 세포주기를 나타낸 도 6에 의하면, 대조군에서는 G0/G1기가 60∼70%, G2/M기가 13∼18% 였고, 세포사멸기는 모든 특정 시점에서 8%를 넘지 않았다.

그리고, 1μM의 파클리탁셀은 세포집단의 G0/G1기가 12시간, 24시간 및 48시간 이후에 각각 50.5%, 33.2% 및 34.7%로 감소되었으며, S, G2/M기 및 세포사멸기는 약간 증가한 것으로 나타났다.

반면, 0.1μM의 파클리탁셀에서는 세포집단에 거의 변화가 없었다.

그리고, 3μM의 1B3-2의 존재하에서 0.1μM의 파클리탁셀 처리군은 G0/G1기가 12시간, 24시간 및 48시간 이후에 각각 40.1%, 5.1% 및 3.1%로 감소되었으며, G2/M기는 48.7%, 71.2% 및 37.6%로 증가하였다.

그리고, 3μM의 1B3-1의 존재하에서 0.1μM의 파클리탁셀 처리군은 G0/G1기가 12시간, 24시간 및 48시간 이후에 각각 38.2%, 21.4% 및 23.7%로 감소되었으며, G2/M기는 36.0%, 24.8% 및 35.8%로 증가하였다.

이때, 베르파밀 10μM은 3μM의 1B3-1과 유사한 유효 효과를 나타내었다.

[실시예 6] 본 발명의 퀴놀린 화합물을 포함한 정제의 제조

성분 함량

1B3-1 또는 1B3-2 100㎎

옥수수 전분 68㎎

락토오즈 90㎎

미세결정질 셀룰로즈 40㎎

마그네슘 스테아레이트 2㎎

통상적인 정제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합하고, 교반한 후, 과립화하였다. 그런다음, 건조후 타정기를 사용하여 1정당 유효 성분 1B3-1 또는 1B3-2가 100㎎이 포함된 정제를 제조하였다.

[실시예 7] 본 발명의 퀴놀린 화합물을 포함한 캅셀제의 제조

성분 함량

1B3-1 또는 1B3-2 80㎎

옥수수 전분 68㎎

락토오즈 90㎎

미세결정질 셀룰로즈 60㎎

마그네슘 스테아레이트 2㎎

통상적인 캅셀제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합한 후, 1 캅셀당 80㎎의 본 발명의 퀴놀린 화합물이 포함되도록 적절한 크기의 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

[실시예 8] 본 발명의 퀴놀린 화합물을 포함한 주사제의 제조

성분 함량

1B3-1 또는 1B3-2 50㎎

소듐 메타비설파이트 1.5㎎

메틸 파라벤 1.0㎎

프로필 파라벤 0.1㎎

주사용 정제수 적당량

통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 비등수에 교반하면서 용해시킨 후, 냉각시켜 2㎖ 용량의 멸균 바이알에 충진하고, 적당량의 주사용 정제수를 2㎖가 되도록 보충하여 바이알 1개당 50㎎의 본 발명의 퀴놀린 화합물을 포함하는 주사제를 제조하였다.

[실시예 9] 본 발명의 퀴놀린 화합물을 포함한 액제의 제조

성분 함량

1B3-1 또는 1B3-2 200㎎

농축 과즙 2g

슈크로즈 5g

시트르산 나트륨 100㎎

향료 70㎎

물 적당량

통상적인 시럽의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 적당량의 물에 혼합하고, 가열하여 용해시킨 후, 냉각시키고 용기에 충전하여 200㎖ 용량의 음료 1병당 200㎎의 1B3-1 또는 1B3-2를 포함하는 액상제제를 제조하였다.

이상과 같이, 본 발명의 신규한 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물은 다약제내성의 억제효과가 우수하여 항암제 치료시 약물 내성에 의한 약효 저감을 방지하여 효율적으로 암치료를 할 수 있는 유용한 효과가 있다.

Claims

하기 화학식으로 표시되는 퀴놀린 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물.

[화학식]

상기 화학식에서 R은 수소 또는 벤젠고리를 나타낸다.
제 1 항 기재의 유도체를 유효량으로, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 다약제내성 억제용 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서,

상기 다약제내성은 항암제에 대한 내성인 것을 특징으로 하는 다약제내성 억제용 약제학적 조성물.
제 3 항에 있어서,

상기 암은 결장암, 직장암, 방광암, 난소암, 유방암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 다약제내성 억제용 약제학적 조성물.