CA2706812A1 - Procede de preparation de nanoparticules a base de molecules ou macromolecules amphiphiles fonctionnelles et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de préparation de nanoparticules à base de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles, éventuellement en présence d'au moins un colipide, permettant Pencapsulation d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux, et leur utilisation pour le transport et la vectorisation d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
Description
Procédé de préparation de nanoparticules à base de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles et leur utilisation L'invention concerne un procédé de préparation de nanoparticules à base de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles et leur utilisation pour le transport ou la vectorisation d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
Parmi les agents anti-tumoraux, le cis-platine est un agent anti-tumoral largement utilisé, notamment pour le traitement de tumeurs solides.
Cependant, son utilisation se trouve limitée par sa toxicité ainsi que l'apparition d'une résistance acquise.
Pour pallier ces inconvénients, différentes formulations ont été
proposées dans l'art antérieur: par exemple, le brevet US 5 178 876 décrit des dérivés de platine sous forme de complexe hydrophobe destinés à une encapsulation dans des liposomes.
Le brevet US 6 001 817 décrit des compostions contenant du cis-platine et un vecteur comprenant au moins un nucléoside ou déoxynucléoside.
Le brevet US 7 908 160 concerne des dérivés de cis-platine liés à des ligands, dont l'activité est réversible en fonction de la liaison au ligand.
La demande WO01/32139 décrit des compositions de cis-platine encapsulé dans des nanoparticules lipophiles obtenues par cycles répétés de chauffage et congélation, à base de lipides naturels chargés négativement, en particulier la dioléylphosphatidylsérine. Il est indiqué dans cette demande que le cis-platine forme, dans l'eau, des agrégats chargés positivement présentant une solubilité dans plus élevée que les espèces non chargées, ce qui permet leur interaction avec les membranes lipidiques chargées négativement et la réorganisation des membranes lipidiques autour des agrégats de cis-platine.
Cependant, il existe encore un besoin pour résoudre les problèmes liés à la vectorisation des agents thérapeutiques, en particulier les agents anti-tumoraux.
Parmi les agents anti-tumoraux, le cis-platine est un agent anti-tumoral largement utilisé, notamment pour le traitement de tumeurs solides.
Cependant, son utilisation se trouve limitée par sa toxicité ainsi que l'apparition d'une résistance acquise.
Pour pallier ces inconvénients, différentes formulations ont été
proposées dans l'art antérieur: par exemple, le brevet US 5 178 876 décrit des dérivés de platine sous forme de complexe hydrophobe destinés à une encapsulation dans des liposomes.
Le brevet US 6 001 817 décrit des compostions contenant du cis-platine et un vecteur comprenant au moins un nucléoside ou déoxynucléoside.
Le brevet US 7 908 160 concerne des dérivés de cis-platine liés à des ligands, dont l'activité est réversible en fonction de la liaison au ligand.
La demande WO01/32139 décrit des compositions de cis-platine encapsulé dans des nanoparticules lipophiles obtenues par cycles répétés de chauffage et congélation, à base de lipides naturels chargés négativement, en particulier la dioléylphosphatidylsérine. Il est indiqué dans cette demande que le cis-platine forme, dans l'eau, des agrégats chargés positivement présentant une solubilité dans plus élevée que les espèces non chargées, ce qui permet leur interaction avec les membranes lipidiques chargées négativement et la réorganisation des membranes lipidiques autour des agrégats de cis-platine.
Cependant, il existe encore un besoin pour résoudre les problèmes liés à la vectorisation des agents thérapeutiques, en particulier les agents anti-tumoraux.
2 Notamment, il est recherché un moyen de permettre un transport des agents thérapeutiques (notamment le cis-platine et/ou ses dérivés) rapidement à l'intérieur des cellules tumorales avec une activité
pharmacologique élevée, tout en préservant les cellules saines, c'est-à-dire en diminuant la toxicité neurologique, rénale, auditive, digestive, etc., en limitant simultanément les phénomènes d'apparition de résistance à cet agent thérapeutique.
Il est également recherché de fournir un vecteur présentant une stabilité dans le temps suffisante pour éviter la libération précoce de l'agent thérapeutique et les inconvénients liés à la présence de l'agent thérapeutique libre dans le milieu biologique, notamment en termes de perte d'activité et de toxicité.
On a maintenant trouvé que l'utilisation de nanoparticules formées à partir de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles permettait la délivrance intracellulaire efficace et rapide d'agents thérapeutiques et présentaient des propriétés de stabilité améliorées, en particulier à 37 C, permettant une vectorisation prolongée dans le temps desdits agents thérapeutiques.
Par agents thérapeutiques , on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées, à l'exception des acides nucléiques ou de leurs fragments.
Une telle molécule peut être choisie, par exemple, parmi les principes actifs de médicaments, en particulier parmi les agents anti-tumoraux tels que, par exemple :
- les complexes de platine, parmi lesquels on peut notamment citer le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le lobaplatine, etc.,ou - le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore
pharmacologique élevée, tout en préservant les cellules saines, c'est-à-dire en diminuant la toxicité neurologique, rénale, auditive, digestive, etc., en limitant simultanément les phénomènes d'apparition de résistance à cet agent thérapeutique.
Il est également recherché de fournir un vecteur présentant une stabilité dans le temps suffisante pour éviter la libération précoce de l'agent thérapeutique et les inconvénients liés à la présence de l'agent thérapeutique libre dans le milieu biologique, notamment en termes de perte d'activité et de toxicité.
On a maintenant trouvé que l'utilisation de nanoparticules formées à partir de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles permettait la délivrance intracellulaire efficace et rapide d'agents thérapeutiques et présentaient des propriétés de stabilité améliorées, en particulier à 37 C, permettant une vectorisation prolongée dans le temps desdits agents thérapeutiques.
Par agents thérapeutiques , on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées, à l'exception des acides nucléiques ou de leurs fragments.
Une telle molécule peut être choisie, par exemple, parmi les principes actifs de médicaments, en particulier parmi les agents anti-tumoraux tels que, par exemple :
- les complexes de platine, parmi lesquels on peut notamment citer le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le lobaplatine, etc.,ou - le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore
3 - les complexes inorganiques sans platine à base de ruthénium Il et/ou III, de titane, par exemple le dichlorure de titanocène, ou de gallium, par exemple les sels de gallium tels que le nitrate de gallium, le chlorure de gallium, le KP46, ou - les dérivés du fer, tels que, par exemple, les sels de ferrocenium, les analogues nucléosidiques contenant du fer, les complexes de fer (II) contenant des ligands pyridyl-pentadéntate, ou - les dérivés du cobalt, tels que, par exemple, les complexes d'hexacarbonyl-dicobalt, les complexes d'alkyne-cobalt, le complexe de Co(lll) contenant un ligand azote motarde, ou - les dérivés de l'or tels que, par exemple, l'Auranofin, les complexes d'or (I), (III) et (III), l'aurothioglucose, etc.
Avantageusement, l'utilisation de nanoparticules formées à partir de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles de formule (I) pour encapsuler ces composés et assurer leur délivrance intracellulaire permet de limiter les phénomènes de résistance à ces composés.
Les complexes de platine, en particulier le cis-platine, sont des agents thérapeutiques préférés aux fins de l'invention.
Des complexes inorganiques à base de ruthénium Il et/ou III, peuvent être, par exemple, les complexes dénommés NAMI-A, RAPTA-C, KP1019. De tels complexes non platinés sont décrits dans Ott I. et Gust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sei. 2007, 340, 117-126 ; Reedijk J., Curr Opin Chem Biol., 1999, 3, 236-40 ; Haimei Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 173-186.
Des analogues nucléosidiques contenant du fer sont décrits dans Schlawe D. et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 1731-1734.
L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un procédé
d'encapsulation d'un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, comprenant les étapes consistant à :
a) préparer un mélange d'au moins un composé amphiphile fonctionnel de formule (I)
Avantageusement, l'utilisation de nanoparticules formées à partir de molécules ou macromolécules amphiphiles fonctionnelles de formule (I) pour encapsuler ces composés et assurer leur délivrance intracellulaire permet de limiter les phénomènes de résistance à ces composés.
Les complexes de platine, en particulier le cis-platine, sont des agents thérapeutiques préférés aux fins de l'invention.
Des complexes inorganiques à base de ruthénium Il et/ou III, peuvent être, par exemple, les complexes dénommés NAMI-A, RAPTA-C, KP1019. De tels complexes non platinés sont décrits dans Ott I. et Gust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sei. 2007, 340, 117-126 ; Reedijk J., Curr Opin Chem Biol., 1999, 3, 236-40 ; Haimei Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 173-186.
Des analogues nucléosidiques contenant du fer sont décrits dans Schlawe D. et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 1731-1734.
L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un procédé
d'encapsulation d'un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, comprenant les étapes consistant à :
a) préparer un mélange d'au moins un composé amphiphile fonctionnel de formule (I)
4 PCT/FR2008/001661 X B
(I) !1 dans laquelle - X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène, - B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule O O
ou encore L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
- RI et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente - un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5 ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifié en Ci-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy , ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste H -(-CH2-C-)n-H
CO-V-dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou un groupe -(CH2)r,-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n = 1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol, ou encore - R3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, et - un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, b) soumettre ledit mélange à des cycles répétés de chauffage et congélation, de manière à obtenir des nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique, et c) récupérer les nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique ainsi obtenues.
De manière avantageuse, on a trouvé que les structures moléculaires et/ou macromoléculaires qui constituent les composés de formule (I), comprenant au moins un ligand de l'agent thérapeutique (nucléobase, nucléoside, nucléoside modifié, nucléotides, oligonucléotide, hétérocycle, etc) repésenté par le substituant B, et présentant un caractère amphiphile du fait de la présence d'au moins une partie hydrophile (phosphate, carboxylate, etc), et d'au moins une partie hydrophobe (segments hydrophobes monocaténaires, bicaténaires et parties polaires dérivées de synthons d'origine biologique, etc), permettaient de former avec l'agent thérapeutique des nanoparticules stables.
Par la combinaison des propriétés amphiphiles des composés de formule (1), de la présence de ligands de l'agent thérapeutique (principe actif) dans ces composés et des éventuelles interactions électrostatiques entre les agents thérapeutiques et ces composés, les nanoparticules ainsi obtenues présentent une structure permettant une délivrance intra-cellulaire efficace et rapide des principes actifs encapsulés, en particulier des agents anti-tumoraux.
Sans vouloir lier l'invention à une théorie, on peut émettre l'hypothèse selon laquelle les interactions intermoléculaires des composés de formule (I) induisent une augmentation des forces de cohésion à la surface des nanoparticules, ce qui se traduit par une plus grande stabilité dans le temps, dans les conditions d'utilisation.
Avantageusement, lesdites nanoparticules présentent également une durée de vie compatible avec leur utilisation comme vecteur d'agent thérapeutique.
Dans la formule (I) ci-dessus, n est avantageusement compris entre 1 et 500, de préférence compris entre 1 et 100, notamment compris entre 1 et 50 , tout particulièrement compris entre 1 et 10.
Par alkyle linéaire ou ramifié en CI-C5 , on entend par exemple un radical méthyle, éthyle, propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle, tert-butyle, de préférence méthyle ou éthyle.
Egalement, dans la formule (I) ci-dessus, la base purique ou pyrimidique, ou la base hétérocyclique non naturelle peut être substituée par au moins un substituant choisi, par exemple, parmi un halogène, un groupe amino, un groupe carboxy , un groupe carbonyl, un groupe carbonylamino, un groupe hydroxy, azido, cyano, alkyle, cycloalkyl, perfluoroalkyl, alkyloxy (par exemple, méthoxy), oxycarbonyl, vinyl, ethynyl, propynyl, acyl etc.
On entend par base hétérocyclique non naturelle une base autre que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine ou hypoxanthine, qui n'existe pas dans la nature.
Par groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote , on entend un groupement carbocyclique monocyclique ou bycyclique, aromatique ou partiellement insaturé, renfermant 5 à 12 atomes, interrompu par 1 à 4 atomes d'azote, en particulier les groupes pyrazole, triazole, tétrazole ou imidazole.
Pour la préparation des composés de formule (I), on peut se référer à la demande WO 2005/116043, qui décrit différentes voies d'accès à ce type de composés (voir notamment p. 8-17 et exemples).
Le procédé selon l'invention peut comprendre les étapes mises en oeuvre dans les conditions générales suivantes :
- le composé de formule (I), est mis en solution dans un solvant organique pour former un mélange lipidique, puis, après prélèvement, on évapore pour former un film ;
- parallèlement, la quantité voulue d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, est mise en solution dans de l'eau distillée ;
- le film lipidique est réhydraté dans la solution d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral. Une solution limpide est obtenue par sonification et chauffage ;
- la solution est refroidie rapidement, par exemple par immersion dans l'azote liquide. Ce cycle chauffage / refroidissement est effectué de préférence de 1 à 10 fois, en particulier de 5 à 10 fois, notamment 10 fois.
La solution obtenue est centrifugée. Le surnageant est écarté.
Après plusieurs centrifugations, le culot est séché.
Le solvant organique peut être choisi, par exemple, parmi les solvants organiques usuels dans le domaine, tels que, par exemple, le chloroforme, un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, etc.
Le chauffage est effectué, de préférence, à une température de l'ordre de 20 C à 80 C, et le refroidissement à une température de l'ordre de -190 C (azote liquide) à 0 C (glace). Un cycle chauffage/refroidissement approprié peut, par exemple, être de 45 C pour le chauffage et de -78 C pour le refroidissement.
De préférence, l'agent thérapeutique est choisi parmi les complexes de platine (cis-platine, carboplatine, ... ), le cis-platine étant particulièrement préféré, ou bien le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore les complexes inorganiques sans platine à
base de ruthénium II ou III, de titane de gallium, de cobalt, de fer ou d'or mentionnés plus haut.
Le rapport molaire R du composé de formule (I) / agent thérapeutique peut être compris, par exemple, entre 0,01 à 50, en particulier R = 0,2.
Les nanoparticules obtenues peuvent être éventuellement extrudées sur filtre polycarbonate ayant, par exemple, un diamètre de pores de l'ordre de 100 ou 200 nm.
On obtient ainsi des nanoparticules solides qui sont constituées d'un coeur riche en agent thérapeutique (principe actif) entouré par une ou plusieurs couches lipidiques constituées de composé amphiphile fonctionnel de formule (1) telle que définie plus haut, avec ou sans co-lipide.
Lesdites nanoparticules, solides, constituées d'un coeur riche en agent thérapeutique, de préférence un agent antitumoral, en particulier un complexe de platine, entouré par une ou plusieurs couches lipidiques constituées de composé amphiphile fonctionnel de formule (I) telle que définie plus haut, avec ou sans co-lipide, représentent un objet ultérieur de l'invention.
Dans le cas d'un entourage multi-couches, toutes les couches lipidiques sont constituées des mêmes lipides (composé de formule (I) avec ou sans co-lipide).
Selon un aspect de l'invention, on utilisera dans le mélange lipidique, en complément du composé de formule (I), au moins un un colipide.
Par colipide , on entend un composé utilisé en association avec le composé de formule (I), qui participe à l'élaboration de la structure de là
ou des couche(s) lipidique(s) de la nanoparticule.
On utilisera, de préférence, un colipide zwitterionique.
Ledit colipide peut être, par exemple, choisi parmi la dioléylphosphatidylcholine (DOPC) ou la dioléylphosphatidyluridine phosphatidylcholine (DOUPC), en combinaison avec le composé de formule (I) pour former la ou les couche(s) lipidiques de la nanoparticule.
Ces composés peuvent jouer le rôle de colipide lorsqu'ils sont utilisés en mélange avec un composé de formule (I). Alternativement, ils peuvent être compris dans la formule (I), comme, par exemple, la dioléylphosphatidyluridinephosphatidylcholine (DOUPC). Dans ce cas, ils joueront, soit le rôle de composé de formule (I), soit, en combinaison avec un autre composé de formule (I), le rôle de colipide.
Selon un aspect préféré du procédé, ledit mélange lipidique contient uniquement au moins un composé de formule (I) et ne contient pas de colipide.
On utilisera de préférence l'agent thérapeutique à une concentration de l'ordre de 0,1 ng/mL à 10 mg/mL dans la phase aqueuse, de manière à ce que la délivrance intracellulaire du principe actif soit importante.
Des composés préférés de formule (I) sont ceux dans lesquels X
représente l'oxygène.
Les composés de formule (I) dans lesquels B représente la thymine ou l'adénine sont également des composés préférés.
Parmi les composés de formule (I) particulièrement avantageux aux fins de l'invention, on peut citer les composés de formule (I) dans lesquels :
(I) !1 dans laquelle - X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène, - B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule O O
ou encore L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
- RI et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L, ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente - un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5 ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifié en Ci-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy , ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste H -(-CH2-C-)n-H
CO-V-dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou un groupe -(CH2)r,-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n = 1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol, ou encore - R3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, et - un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, b) soumettre ledit mélange à des cycles répétés de chauffage et congélation, de manière à obtenir des nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique, et c) récupérer les nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique ainsi obtenues.
De manière avantageuse, on a trouvé que les structures moléculaires et/ou macromoléculaires qui constituent les composés de formule (I), comprenant au moins un ligand de l'agent thérapeutique (nucléobase, nucléoside, nucléoside modifié, nucléotides, oligonucléotide, hétérocycle, etc) repésenté par le substituant B, et présentant un caractère amphiphile du fait de la présence d'au moins une partie hydrophile (phosphate, carboxylate, etc), et d'au moins une partie hydrophobe (segments hydrophobes monocaténaires, bicaténaires et parties polaires dérivées de synthons d'origine biologique, etc), permettaient de former avec l'agent thérapeutique des nanoparticules stables.
Par la combinaison des propriétés amphiphiles des composés de formule (1), de la présence de ligands de l'agent thérapeutique (principe actif) dans ces composés et des éventuelles interactions électrostatiques entre les agents thérapeutiques et ces composés, les nanoparticules ainsi obtenues présentent une structure permettant une délivrance intra-cellulaire efficace et rapide des principes actifs encapsulés, en particulier des agents anti-tumoraux.
Sans vouloir lier l'invention à une théorie, on peut émettre l'hypothèse selon laquelle les interactions intermoléculaires des composés de formule (I) induisent une augmentation des forces de cohésion à la surface des nanoparticules, ce qui se traduit par une plus grande stabilité dans le temps, dans les conditions d'utilisation.
Avantageusement, lesdites nanoparticules présentent également une durée de vie compatible avec leur utilisation comme vecteur d'agent thérapeutique.
Dans la formule (I) ci-dessus, n est avantageusement compris entre 1 et 500, de préférence compris entre 1 et 100, notamment compris entre 1 et 50 , tout particulièrement compris entre 1 et 10.
Par alkyle linéaire ou ramifié en CI-C5 , on entend par exemple un radical méthyle, éthyle, propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle, tert-butyle, de préférence méthyle ou éthyle.
Egalement, dans la formule (I) ci-dessus, la base purique ou pyrimidique, ou la base hétérocyclique non naturelle peut être substituée par au moins un substituant choisi, par exemple, parmi un halogène, un groupe amino, un groupe carboxy , un groupe carbonyl, un groupe carbonylamino, un groupe hydroxy, azido, cyano, alkyle, cycloalkyl, perfluoroalkyl, alkyloxy (par exemple, méthoxy), oxycarbonyl, vinyl, ethynyl, propynyl, acyl etc.
On entend par base hétérocyclique non naturelle une base autre que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine ou hypoxanthine, qui n'existe pas dans la nature.
Par groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote , on entend un groupement carbocyclique monocyclique ou bycyclique, aromatique ou partiellement insaturé, renfermant 5 à 12 atomes, interrompu par 1 à 4 atomes d'azote, en particulier les groupes pyrazole, triazole, tétrazole ou imidazole.
Pour la préparation des composés de formule (I), on peut se référer à la demande WO 2005/116043, qui décrit différentes voies d'accès à ce type de composés (voir notamment p. 8-17 et exemples).
Le procédé selon l'invention peut comprendre les étapes mises en oeuvre dans les conditions générales suivantes :
- le composé de formule (I), est mis en solution dans un solvant organique pour former un mélange lipidique, puis, après prélèvement, on évapore pour former un film ;
- parallèlement, la quantité voulue d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, est mise en solution dans de l'eau distillée ;
- le film lipidique est réhydraté dans la solution d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral. Une solution limpide est obtenue par sonification et chauffage ;
- la solution est refroidie rapidement, par exemple par immersion dans l'azote liquide. Ce cycle chauffage / refroidissement est effectué de préférence de 1 à 10 fois, en particulier de 5 à 10 fois, notamment 10 fois.
La solution obtenue est centrifugée. Le surnageant est écarté.
Après plusieurs centrifugations, le culot est séché.
Le solvant organique peut être choisi, par exemple, parmi les solvants organiques usuels dans le domaine, tels que, par exemple, le chloroforme, un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, etc.
Le chauffage est effectué, de préférence, à une température de l'ordre de 20 C à 80 C, et le refroidissement à une température de l'ordre de -190 C (azote liquide) à 0 C (glace). Un cycle chauffage/refroidissement approprié peut, par exemple, être de 45 C pour le chauffage et de -78 C pour le refroidissement.
De préférence, l'agent thérapeutique est choisi parmi les complexes de platine (cis-platine, carboplatine, ... ), le cis-platine étant particulièrement préféré, ou bien le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore les complexes inorganiques sans platine à
base de ruthénium II ou III, de titane de gallium, de cobalt, de fer ou d'or mentionnés plus haut.
Le rapport molaire R du composé de formule (I) / agent thérapeutique peut être compris, par exemple, entre 0,01 à 50, en particulier R = 0,2.
Les nanoparticules obtenues peuvent être éventuellement extrudées sur filtre polycarbonate ayant, par exemple, un diamètre de pores de l'ordre de 100 ou 200 nm.
On obtient ainsi des nanoparticules solides qui sont constituées d'un coeur riche en agent thérapeutique (principe actif) entouré par une ou plusieurs couches lipidiques constituées de composé amphiphile fonctionnel de formule (1) telle que définie plus haut, avec ou sans co-lipide.
Lesdites nanoparticules, solides, constituées d'un coeur riche en agent thérapeutique, de préférence un agent antitumoral, en particulier un complexe de platine, entouré par une ou plusieurs couches lipidiques constituées de composé amphiphile fonctionnel de formule (I) telle que définie plus haut, avec ou sans co-lipide, représentent un objet ultérieur de l'invention.
Dans le cas d'un entourage multi-couches, toutes les couches lipidiques sont constituées des mêmes lipides (composé de formule (I) avec ou sans co-lipide).
Selon un aspect de l'invention, on utilisera dans le mélange lipidique, en complément du composé de formule (I), au moins un un colipide.
Par colipide , on entend un composé utilisé en association avec le composé de formule (I), qui participe à l'élaboration de la structure de là
ou des couche(s) lipidique(s) de la nanoparticule.
On utilisera, de préférence, un colipide zwitterionique.
Ledit colipide peut être, par exemple, choisi parmi la dioléylphosphatidylcholine (DOPC) ou la dioléylphosphatidyluridine phosphatidylcholine (DOUPC), en combinaison avec le composé de formule (I) pour former la ou les couche(s) lipidiques de la nanoparticule.
Ces composés peuvent jouer le rôle de colipide lorsqu'ils sont utilisés en mélange avec un composé de formule (I). Alternativement, ils peuvent être compris dans la formule (I), comme, par exemple, la dioléylphosphatidyluridinephosphatidylcholine (DOUPC). Dans ce cas, ils joueront, soit le rôle de composé de formule (I), soit, en combinaison avec un autre composé de formule (I), le rôle de colipide.
Selon un aspect préféré du procédé, ledit mélange lipidique contient uniquement au moins un composé de formule (I) et ne contient pas de colipide.
On utilisera de préférence l'agent thérapeutique à une concentration de l'ordre de 0,1 ng/mL à 10 mg/mL dans la phase aqueuse, de manière à ce que la délivrance intracellulaire du principe actif soit importante.
Des composés préférés de formule (I) sont ceux dans lesquels X
représente l'oxygène.
Les composés de formule (I) dans lesquels B représente la thymine ou l'adénine sont également des composés préférés.
Parmi les composés de formule (I) particulièrement avantageux aux fins de l'invention, on peut citer les composés de formule (I) dans lesquels :
5 - X et B sont tels que définis ci-dessus ;
- Li représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène, RI
représente un groupe alkyle en C2-C30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy ; ou - LI et L2 représentent un atome d'oxygène, RI et R2 représentent l'hydrogène 10 et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C2-C30, ou - Li représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L2 représente l'hydrogène, RI représente un groupe alkyle en C2-C30 et R3 est un groupe hydroxy , ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C2-C30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R3 est un groupe ou un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R8 représente un alkyle en C2-C30, ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol , ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère , ou - LI représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène RI représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C2-C30 , et R3 est un groupement hydroxy, qui sont des composés nouveaux.
Les composés de formule (I) dans lesquels le substituant Li ou le substituant R3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué
ou substitué, sont également des composés nouveaux préférés aux fins du procédé selon l'invention.
Les composés ci-dessus sont des composés nouveaux qui représentent un objet de l'invention, ainsi que les nanoparticules comprenant ces composés et un agent thérapeutique, en particulier un agent anti-tumoral, en particulier les complexes de platine (tels que, par exemple le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le lobaplatine,), ou le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore des complexes inorganiques sans platine à base de ruthénium, de titane, de gallium, de cobalt, de fer ou d'or mentionnés plus haut . Le cis-platine est un agent anti-tumoral préféré aux fins de l'invention.
Les composés de formule (I) peuvent comporter des dérivés de base purique ou pyrimidique ayant une activité antinéoplasique, tels que, par exemple, l'aracytosine (AraC), le 5-fluorouracile (5-FU), l'lododéoxyuridine (IdU), la 2'-déoxy-2'-méthylidènecytidine (DMDC) ou la 5-chloro-6-azido-5,6-dihydro-2'-déoxyuridine.
L'invention a également pour objet l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour le transport ou la vectorisation d'agent thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
En particulier, l'invention concerne l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour la délivrance intracellulaire d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
L'invention concerne également l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour la préparation de médicaments anti-tumoraux.
L'invention concerne également les nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour le traitement de maladies tumorales, en particulier de cancers, tels que, par exemple, les cancers de l'ovaire, du testicule, du colon, du col de l'utérus, du poumon, ou l'adénosarcome etc.
L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous.
L'ensemble des produits de départ proviennent de fournisseurs de produits chimiques (Aldrich, Alfa Aesar et Avanti Polar Lipid) et sont utilisés sans purification ultérieure. Les solvants ont été utilisés sans distillation supplémentaire. Les composés synthétisés ont été caractérisés à l'aide de méthodes analytiques spectroscopiques standard telles que les RMN 1H à
300,13 MHz, 13C à 75,46 MHz et 3'P à 121,49 MHz) et la spectroscopie de masse (Caractéristiques). Les déplacements chimiques (8) en RMN sont exprimés en ppm et relativement au TMS. Les constantes de couplage J en RMN du 1H sont exprimées en Hz. Des plaques Merck RP-18 F254s ont été
utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM). De la silice SEPHADEX LH-20 (25-100 pm) a été utilisée pour les purifications par chromatographies quantitatives.
Les exemples ci-dessous, intitulés Préparation décrivent la préparation d'intermédiaires de synthèse utilisés pour préparer les composés de formule (I). La préparation des composés de formule (1) est décrite ensuite dans les exemples de synthèse intitulés Exemple .
Préparation 1 5'- paratoluènesulfonylthymidine o CINZ
O=S=O O
O
OH
Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de thymidine (8,26 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,935 g de chlorure d'acide paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20,6 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante, puis on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL
de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5% de NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCl et 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 75%
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : S 1,77 (s, 3H, CH3), $ 2,11 (m, 2H, CH2), S 2,42 (s, 3H, CH3), b 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), b 4,18 (m, 1 H, CH), ô 4,25 (m, 3H, CH, CH2), 6 5,42 (s, 1H, OH), b 6,15 (t, j = 6 Hz, H, CH), 8 7,38 (s, 1 H, CH), b 7,46 (s, 1 H, CH), â 7,49 (s, 1 H, CH), 8 7,78 (s, 1 H, CH), ô
7,81 (s, 1H, CH), 3 11,28 (s, 1H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 5 12,5 (CH3),6 21,6 (CH3), b 38,9 (CH2), ô 70,4 (CH2), b 70,6 (CH),S 83,7 (CH), â 84,5 (CH), ô 110,3 (C), ô
128,1 (CH ar), 3 130,6 (2 CH ar), â 132,6 (C ar), ô 136,4 (C ar), â 145,6 (C), ô
150,8 (C=O), 6 164,1 (C=O).
SM Haute [M+H]+ : 397,1 Préparation 2 2'-déoxy-5'-toluènesulfonyladénosine N
N
</
0=S=O N (N%
OH
Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 2'-déoxyadénosine (8 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,793 g de chlorure d'acide paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante, puis on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCI et 20 mL d'une solution à
5% de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé
attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol. 2,1 g d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF: 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 63%
Préparation 3 5'azido-5'-déoxythymidine o N O
OH
Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 5'-paratoluènesulfonylthymidine (5 mmol) telle que décrite dans la préparation 1 en solution 0,1 M dans le DMF. 1,3 g d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution est alors 5 agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse saturée de NaCI.
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le solvant est éliminé
sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation 10 dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide blanc.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 60%
SM [M+H]+ : 268.1 15 Préparation 4 5'-azido-5',2'-didéoxyadénosine <x5 O
OH
Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 2'-déoxy-5'-paratoluènesulfonyladénosine telle que décrite dans la préparation 2 (5 mmol) en solution 0,1 M dans le DMF.
1,3 g d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution est alors agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide blanc.
RF : 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 60%
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 277,1161 , masse mesurée : 277,1157 Préparation 5 1-propargyloxyoctadécane Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, sont introduits 673 mg d'alcool propargylique (12 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF. La solution est alors refroidie à 0 C et 180 mg d'hydrure de sodium (0,625 équivalent, 7,5 mmol) sont additionnés par petites fractions. Le milieu réactionnel est laissé revenir à température ambiante. 2 g de 1-bromo-octadecane (0,5 équivalent, 6 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol et l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCi. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur après séparation sur colonne chromatographique (hexane). 1,2 g d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,82 (Hexane) Rendement : 65 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : S 0,90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), S
1,28 (s, 30H, CH2), S 1,61 (m, 2H, CH2),S 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), ô 3,53 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : RMN '3C (75,47 MHz, CDCI3) : 8 14,2 (CH2), 8 22,7 (CH2),8 26,1 (CH2),8 29,4 (CH2),8 29,5 (CH2), 8 29,6 (CH2 ), 8 32,0 (CH2), 8 58,0 (CH2), ô 70,4 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
Préparation 6 1,12-propargyloxydodécane 12-propargyloxydodécan-1-ol Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 1 g de dodécan-1,12-diol (5 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 360 mg d'hydrure d'hydrogène (3 équivalents, 15 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante. 1,49 g de bromure de propargyle (2,5 équivalents, 12,5 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé
sous pression réduite. Les produits obtenus sont alors séparés sur colonne chromatographique (Hex/ActEth 9/1). Deux produits sont isolés, à savoir 370 mg d'une huile brune correspondant au 1,12-Propargyloxydodécane et 430 mg d'un solide brun correspondant au 12-propargyloxydodécan-1-ol.
1, 1 2-propargyloxydodécane RF : 0,53 (Hexane/AcOtEt 9/1) Rendement : 27 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 1,31 (m, 16H, CH2), 8 1,61 (m, 4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), 8 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,15 (d, j =
3 Hz, 4H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : 8 26,1 (CH2), 6 29,4 (CH2), 8 29,5 (CH2), 8 29,6 (CH2), 3 58,0 (CH2), 8 70,3 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
12-propargyloxydodécan-1-ol OH
RF : 0,10 (Hexane/AcOtEt 9/1) Rendement : 36 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 6 1,32 (m, 16H, CH2), 6 1,59 (m, 4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH), ô 3,52 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 6 3,65 (t, j =
- Li représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène, RI
représente un groupe alkyle en C2-C30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy ; ou - LI et L2 représentent un atome d'oxygène, RI et R2 représentent l'hydrogène 10 et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C2-C30, ou - Li représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L2 représente l'hydrogène, RI représente un groupe alkyle en C2-C30 et R3 est un groupe hydroxy , ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C2-C30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R3 est un groupe ou un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R8 représente un alkyle en C2-C30, ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol , ou - LI représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère , ou - LI représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène RI représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C2-C30 , et R3 est un groupement hydroxy, qui sont des composés nouveaux.
Les composés de formule (I) dans lesquels le substituant Li ou le substituant R3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué
ou substitué, sont également des composés nouveaux préférés aux fins du procédé selon l'invention.
Les composés ci-dessus sont des composés nouveaux qui représentent un objet de l'invention, ainsi que les nanoparticules comprenant ces composés et un agent thérapeutique, en particulier un agent anti-tumoral, en particulier les complexes de platine (tels que, par exemple le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine, le lobaplatine,), ou le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore des complexes inorganiques sans platine à base de ruthénium, de titane, de gallium, de cobalt, de fer ou d'or mentionnés plus haut . Le cis-platine est un agent anti-tumoral préféré aux fins de l'invention.
Les composés de formule (I) peuvent comporter des dérivés de base purique ou pyrimidique ayant une activité antinéoplasique, tels que, par exemple, l'aracytosine (AraC), le 5-fluorouracile (5-FU), l'lododéoxyuridine (IdU), la 2'-déoxy-2'-méthylidènecytidine (DMDC) ou la 5-chloro-6-azido-5,6-dihydro-2'-déoxyuridine.
L'invention a également pour objet l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour le transport ou la vectorisation d'agent thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
En particulier, l'invention concerne l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus, pour la délivrance intracellulaire d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
L'invention concerne également l'utilisation des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour la préparation de médicaments anti-tumoraux.
L'invention concerne également les nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus, pour le traitement de maladies tumorales, en particulier de cancers, tels que, par exemple, les cancers de l'ovaire, du testicule, du colon, du col de l'utérus, du poumon, ou l'adénosarcome etc.
L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous.
L'ensemble des produits de départ proviennent de fournisseurs de produits chimiques (Aldrich, Alfa Aesar et Avanti Polar Lipid) et sont utilisés sans purification ultérieure. Les solvants ont été utilisés sans distillation supplémentaire. Les composés synthétisés ont été caractérisés à l'aide de méthodes analytiques spectroscopiques standard telles que les RMN 1H à
300,13 MHz, 13C à 75,46 MHz et 3'P à 121,49 MHz) et la spectroscopie de masse (Caractéristiques). Les déplacements chimiques (8) en RMN sont exprimés en ppm et relativement au TMS. Les constantes de couplage J en RMN du 1H sont exprimées en Hz. Des plaques Merck RP-18 F254s ont été
utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM). De la silice SEPHADEX LH-20 (25-100 pm) a été utilisée pour les purifications par chromatographies quantitatives.
Les exemples ci-dessous, intitulés Préparation décrivent la préparation d'intermédiaires de synthèse utilisés pour préparer les composés de formule (I). La préparation des composés de formule (1) est décrite ensuite dans les exemples de synthèse intitulés Exemple .
Préparation 1 5'- paratoluènesulfonylthymidine o CINZ
O=S=O O
O
OH
Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de thymidine (8,26 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,935 g de chlorure d'acide paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20,6 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante, puis on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL
de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5% de NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCl et 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 75%
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : S 1,77 (s, 3H, CH3), $ 2,11 (m, 2H, CH2), S 2,42 (s, 3H, CH3), b 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), b 4,18 (m, 1 H, CH), ô 4,25 (m, 3H, CH, CH2), 6 5,42 (s, 1H, OH), b 6,15 (t, j = 6 Hz, H, CH), 8 7,38 (s, 1 H, CH), b 7,46 (s, 1 H, CH), â 7,49 (s, 1 H, CH), 8 7,78 (s, 1 H, CH), ô
7,81 (s, 1H, CH), 3 11,28 (s, 1H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 5 12,5 (CH3),6 21,6 (CH3), b 38,9 (CH2), ô 70,4 (CH2), b 70,6 (CH),S 83,7 (CH), â 84,5 (CH), ô 110,3 (C), ô
128,1 (CH ar), 3 130,6 (2 CH ar), â 132,6 (C ar), ô 136,4 (C ar), â 145,6 (C), ô
150,8 (C=O), 6 164,1 (C=O).
SM Haute [M+H]+ : 397,1 Préparation 2 2'-déoxy-5'-toluènesulfonyladénosine N
N
</
0=S=O N (N%
OH
Dans un ballon bi-col sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 2'-déoxyadénosine (8 mmol) en solution 0,1 M dans la pyridine anhydre. La solution est alors refroidie à 0 C et 3,793 g de chlorure d'acide paratoluène sulfonique (2,5 équivalents, 20 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante, puis on agite pendant 10 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 20 mL d'une solution à 5%
de NaHCO3, 20 mL d'une solution saturée de NaCI et 20 mL d'une solution à
5% de NaHCO3. Le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé
attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol. 2,1 g d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF: 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 63%
Préparation 3 5'azido-5'-déoxythymidine o N O
OH
Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 5'-paratoluènesulfonylthymidine (5 mmol) telle que décrite dans la préparation 1 en solution 0,1 M dans le DMF. 1,3 g d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution est alors 5 agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse saturée de NaCI.
La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le solvant est éliminé
sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation 10 dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide blanc.
RF : 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 60%
SM [M+H]+ : 268.1 15 Préparation 4 5'-azido-5',2'-didéoxyadénosine <x5 O
OH
Dans un ballon bi-col muni d'un réfrigérant et sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 2 g de 2'-déoxy-5'-paratoluènesulfonyladénosine telle que décrite dans la préparation 2 (5 mmol) en solution 0,1 M dans le DMF.
1,3 g d'azidure de sodium (4 équivalents, 20 mmol) sont ajoutés. La solution est alors agitée et chauffée à 110 C pendant 10 h. Le mélange est refroidi à
température ambiante. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 15 mL d'eau puis par 15 mL d'une solution aqueuse saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur par recristallisation dans le méthanol. On obtient ainsi 0,8 g d'un solide blanc.
RF : 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 60%
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 277,1161 , masse mesurée : 277,1157 Préparation 5 1-propargyloxyoctadécane Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, sont introduits 673 mg d'alcool propargylique (12 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF. La solution est alors refroidie à 0 C et 180 mg d'hydrure de sodium (0,625 équivalent, 7,5 mmol) sont additionnés par petites fractions. Le milieu réactionnel est laissé revenir à température ambiante. 2 g de 1-bromo-octadecane (0,5 équivalent, 6 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol et l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCi. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu pur après séparation sur colonne chromatographique (hexane). 1,2 g d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,82 (Hexane) Rendement : 65 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : S 0,90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), S
1,28 (s, 30H, CH2), S 1,61 (m, 2H, CH2),S 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), ô 3,53 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : RMN '3C (75,47 MHz, CDCI3) : 8 14,2 (CH2), 8 22,7 (CH2),8 26,1 (CH2),8 29,4 (CH2),8 29,5 (CH2), 8 29,6 (CH2 ), 8 32,0 (CH2), 8 58,0 (CH2), ô 70,4 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
Préparation 6 1,12-propargyloxydodécane 12-propargyloxydodécan-1-ol Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 1 g de dodécan-1,12-diol (5 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 360 mg d'hydrure d'hydrogène (3 équivalents, 15 mmol) sont additionnés par petites fractions. On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante. 1,49 g de bromure de propargyle (2,5 équivalents, 12,5 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol, l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCI.
La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé
sous pression réduite. Les produits obtenus sont alors séparés sur colonne chromatographique (Hex/ActEth 9/1). Deux produits sont isolés, à savoir 370 mg d'une huile brune correspondant au 1,12-Propargyloxydodécane et 430 mg d'un solide brun correspondant au 12-propargyloxydodécan-1-ol.
1, 1 2-propargyloxydodécane RF : 0,53 (Hexane/AcOtEt 9/1) Rendement : 27 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 1,31 (m, 16H, CH2), 8 1,61 (m, 4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 1 H, CH), 8 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,15 (d, j =
3 Hz, 4H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : 8 26,1 (CH2), 6 29,4 (CH2), 8 29,5 (CH2), 8 29,6 (CH2), 3 58,0 (CH2), 8 70,3 (CH2), 8 74,1 (CH), 6 80,1 (C).
12-propargyloxydodécan-1-ol OH
RF : 0,10 (Hexane/AcOtEt 9/1) Rendement : 36 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 6 1,32 (m, 16H, CH2), 6 1,59 (m, 4H, CH2), 8 2,43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH), ô 3,52 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 6 3,65 (t, j =
6 Hz, 2H, CH2), 6 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) :ô 25,8 (CH2), 8 26,0 (CH2), 8 29,4 (2 CH2), 8 29,5 (2 CH2), 8 29,6 (CH2), 8 32,7 (CH2), 8 57,9 (CH2), 6 62,7 (CH2), 6 70,2 (CH2), 8 74,2 (CH), 8 79,9 (C).
Préparation 7 o-propargylcholestérol Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 500 mg de cholestérol (1,3 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 47 mg d'hydrure de sodium (1,5 équivalents, 2 mmol) sont additionnés par petites fractions.
On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante 238 mg de bromure de propargyle (1,5 équivalents, 2 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol et l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu après purification sur colonne chromatographique (Hexane/AcOEt 8/2).
215 mg d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,83 (Hexane/AcOEt 8/2) Rendement : 39 Exemple 1 Thymidine 3'-(1,2-d imyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl4dT) o NH
O
"O
O-P=0 O O O O
( ) 11 ( ) 11 De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-dimyristoyl-sn-glycérol (0,447 g, 1,3 éq, 0,87 mmol) et une solution de tétrazole 0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq, 0,87 mmol) sont dissous dans 4 mL
d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu réactionnel est mis sous agitation magnétique pendant 24h00 à température ambiante. Le mélange est ensuite oxydé par ajout de 43 mL d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20.
Après 12 h à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est dissous dans 8 mL de dichlorométhane. Ensuite, 0,2 mL de 1,5-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq, 0,87 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu réactionnel est lavé avec une solution de HCI 0,IN puis avec une solution saturée de Na2S2O7. La phase organique est concentrée sous vide. Le composé est obtenu après purification par 5 chromatographie flash (381 mg) en utilisant un gradient d'élution (MeOH/DCM
9:1 jusqu'à 1:1).
Rendement : 69%
Rf : 0,34 (DCM/MeOH 9 :1) 10 RMN 1H (300 MHz, CDC13) : b en ppm 0,84 (t, 6H, J=6,92 Hz, 2*CH3), 1,21 (m, 40H, 20*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,45 Hz, J2=15,68 Hz, 2*CH2), 1,89 (s, 3H, Me), 2,30 (dd, 4H, J1=7,43 Hz, J2=15,92 Hz, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,84, H2'), 3,84 (m, I H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1 H, CHglycérol), 6,22 (t, 1 H, J=6,81 Hz, H1'), 7,61 (s,1 H, Hbase).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 8 en ppm 19,29 (CH3), 23,71 (CH2), 26,57 (CH2), 28,73 (CH2), 32,76 (CH2), 37,85 (CH2), 48,90 (CH2), 166,15 (C=O).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 0,61.
Masse Haute Résolution FAB- théorique m/z = 815,4823 observé
m/z = 815,4794.
Exemple 2 Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyi-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl6dT) NH
NZ
HO
O-P=0 De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol (0,496 g, 1,3 éq, 0,87 mmol / solubilisé dans 3 mL de THF) et une solution de tétrazole 0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq, 0,87 mmol) sont dissous dans 3 mL d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu réactionnel est mis sous agitation magnétique pendant 24h00 à température ambiante et sous azote. Le mélange est ensuite oxydé par ajout de 43 mL
d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20. Après 12 h à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide et séché à la pompe sous P205 pendant une nuit. Le résidu est dissous dans 8 mL de dichlorométhane.
Ensuite, 0,2 mL de 1,5-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq, 0,87 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu réactionnel est lavé avec une solution de HCI 0,1N puis avec une solution saturée de Na2S2O3. La phase organique est concentrée sous vide. Le composé est obtenu après purification par chromatographie flash (180 mg) en utilisant un gradient d'élution (MeOH/DCM 98:2 jusqu'à 1:1).
Rendement : 24%
Rf : 0,3 (DCM/MeOH 8:2) RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 en ppm 0,88 (t, 6H, J=6,9 Hz, 2*CH3), 1,25 (m, 48H, 24*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,4 Hz, J2=15,6 Hz, 2*CH2), 1,90 (s, 3H, Me), 2,33 (m, 4H, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,6 Hz, H2'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1 H, CH
glycérol), 6,21 (t, 1 H, J=6,7 Hz, H1'), 7,54 (s,1 H, H base).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : S en ppm 12,4 (CH3 base), 14,1 (CH3 chaîne), 19,6 (CH2), 19,7 (CH2), 22,6 (CH2), 24,8 (CH2), 29,1-29,6 (CH2), 31,9 (CH2), 33,9 (CH2), 34,1 (CH2), 61,5 (CH2), 61,7 (CH2), 62,5 (CH2), 62,6 (CH2), 66,1 (CH2), 66,2 (CH2), 69,1 (CH), 78,8 (CH), 85,5 (CH), 86,1 (CH), 111,3 (C
base), 136,8 (CH base), 150,5 (C=O base), 164,1 (C=O base), 173,0 (C=O
chaîne), 173,5 (C=O chaîne).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 2,1.
Masse ESI- : théorique m/z = 872,5 observé m/z = 871,3.
Exemple 3 5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
CINH
N~O
NN
N'N k-O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 231 mg de 1-propargyloxyoctadécane telle que décrit dans la préparation 5 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalents, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 180 mg d'un solide blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne de silice (AcOEt/MeOH
8/2).
RF : 0,72 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 42 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 4 5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'-didéoxyadénosine i N N
NNN N N
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5',2'-didéoxyadénosine telle que décrite dans la préparation 4 (0,72 mmol) et 223 mg de 1-propargyloxyoctadécane telle que décrite dans la préparation 5 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalents, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate. de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h, puis le mélange est refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 150 mg d'un solide blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2).
RF : 0,65 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 35 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 0,89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6 1,26 (m, 30H, CH2), 8 1,55 (m, 2H, CH2), 6 2,54 (m, 1 H, CH2), 6 3,06 (m, 1 H, CH2), 6 3,45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,50 (m, 4H, CH2, CH), 6 4,89 (m, ???), 6 5,88 (s, 2H, NH2), 8 6,40 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,42 (s, 1 H, CH), 6 7,81 (s, 1 H, CH), 6 8,35 (s, 1 H, CH).
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 585,4241 , masse mesurée : 585,4254 Exemple 5 5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine O
\OHNH
N O
N-N
OH
Dans un ballon sont introduits 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101 mg du mélange racémique de oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à
60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 78 %
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : 6 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6 1,24 (m, 6H, CH2)0 6 1,68 (m, 2H, CH2), 6 1,81 (s, 3H, CH3)0 6 4,06 (m, 1H, CH), 6 4,27 (m, 1 H, CH), 6 4,62 (m, 3H, CH2, CH), 6 5,2 (d, j = 6 Hz, 1 H, OH), 5 5,5 (s, 1 H, OH), 6 6,17 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,37 (s, 1 H, CH), 8 7,89 (s, 1 H, 5 CH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : b 12,5 (CH3), 6 014,4 (CH3), 6 22,6 (CH2), 6 25,1, 6 31,7 (CH2), b 38,4 (CH2), 6 51,6 (CH2-N), 6 66,0 (CH-O), 71,3 (C), 6 84,4, 6 84,5, 6 110,3 (=C-N), 6 122,8, 6 136,4, 6 150,9, 6 152,4, b 164,1.
10 SM Haute résolution [M+Na]+ : masse calculée : 416,1910, masse mesurée : 416,1897 Exemple 6 5'-(4-(hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
\NM N O
N_N O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 82,65 mg de non-1-yne (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 130 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,62 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 46 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 7 5'-(4-(heptyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
N O
N%% , N
iço-J
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 93 mg de non-1-yne (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 120 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 41 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDC13) : 5 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 8 1,25 (m, 8H, CH2), 5 1,55 (m, 2H, CH2), 8 1,79 (s, 3H, CH3), 5 2,10 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 5 2,61 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), ô 4,06 (s, I H, CH),. 5 4,27 (s, I H, CH), 4,59 (m, 2H, CH2), 5 5,5 (s, 1 H, OH), 5 6,16 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH),, 5 7,29 5 (s, 1H, CH), 5 7,82 (s, 1H, CH), 8 11,31 (s, I H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 8 12,6 (CH3), ô 14,4 (CH3), 5 22,5 (CH2), 6 25,4 (CH2), 5 28,9 (CH2), 5 29,0 (CH2), 5 29,4 (CH2),. 8 31,7 (CH2), 5 38,4 (CH2), 5 51,5 (CH2), 5 71,1 (CH), 5 84,4 (CH), 5 110 (C), 5 123,1 (CH), 5 136,5 (CH)6 5 147,4 (C), 8 150,9 (C=O), 5 164,1 (C=O).
Exemple 8 5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylméthoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine 0/~I C13H27 O
O
O NH
NO
N
%N, N
O
OH
Dans un ballon, on introduit 264 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (1 mmol) et 500 mg de 4-Prop-2-ynyloxyméthyl-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans un mélange THF eau (111). On ajoute, successivement : 39,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,2 mmol) et 16 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,1 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé
par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 8/2). 550 mg d'un solide blanc sont obtenus.
Rendement : 72 SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 774,5745 , masse mesurée : 774,5739 Exemple 9 5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylbutoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
O
O NH
'4.0 N%% , N
JO
OH
Dans un ballon, on introduit 195 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,73 mmol) et 400 mg de 4-(4-Prop-2-ynyloxy-butyl)-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,073 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et ' le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 9/1). 180 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,43 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 30 Exemple 10 5'-(4-((O-cholestéryl)-méthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine s O
O %,-e NH
N )O
NNN.N
J
OH
Dans un ballon, on introduit 170 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,63 mmol) et 270 mg de o-propargylcholestérol telle que décrit dans la préparation 7 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement :
mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,13 mmol) et 10 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,063 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est refroidi à température ambiante.
15 Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé
par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 260 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,57 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 59 %
SM [M+H]+ : 692,3 Exemple 11 1,1 2-bis-[5'-(4-(méthyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'd idéoxythymidine]-5 oxydodécane OH O
NH
O N~O O I
N N O
O NON Np N
HN N' I~ J
O OH
10 Dans un ballon, on introduit 100 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,375 mmol) et 52 mg de 1,12-dipropargyloxydodécane préparé à partir du composé décrit dans la préparation 6 (0,5 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 15 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,075 mmol) 15 et 6 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,0375 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 90 mg d'un solide 20 blanc sont obtenus.
Rendement : 59 RMN 1H (300,13 MHz, MeOH d4) : 8 1,28 (m, 16H, CH2), 8 0,83 (m, 4H, CH2), 8 1,89 (s, 6H, CH3), 8 2,17 (s, 2H, CH2), ô 2,25 (m, 4H, CH2), 8 25 3,51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,18 (m, 2H, CH) 8 4,42 (m, 2H, OH) 8 4,58 (s, 4H, CH2), 8 4,76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 6,21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), 8 7,23 (s, 2H, CH), 8 7,99 (s, 2H, CH).
Exemple 12 5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
OH NH
N N
N
O
I~--J
(R) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (R) oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1).
On ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 9/1). 240 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcEt/MeOH 9/1) Rendement : 76 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 13 5'-(4-(1 (S)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine OH NH
NON N
(S) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (S) oct-1-yn-3-01 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 78 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 14 5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxyadenosine OH
N
O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 95 mg du mélange racémique d'oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2).
240 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 80 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 15 : préparation des nanoparticules On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2 et comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks - a) Préparation de la solution de cis-platine :
15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h.
- b) Préparation des solutions de lipides :
Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de chloroforme (10 mg/mL). Cet échantillon est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le chloroforme, stockée à -20 C.
2) Préparation des formulations lipidiques Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont mélangés à 23,6 pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport de 1/1 en mole.
Le chloroforme est évaporé sous l'azote de manière à obtenir un film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules 1,2 mL de la solution de cis-platine pré-incubée à 37 C sont utilisés pour réhydrater le film lipidique préalablement préparé. Le mélange est incubé à 37 C pendant 30 min. Une série de 10 cycles de chauffage (bain marie à 45 C) et de congélation (carboglace/méthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules Une fois la série de 10 cycles terminée, le tube est centrifugé à
2100 rpm à 4 C pendant 5 min. Après élimination du surnageant le culot est re-suspendu dans 1 mL d'eau milliQ. Une deuxième centrifugation est réalisée (2100 rpm à 4 C pendant 5 min), puis le surnageant est retiré et le culot est séché.
La concentration (ICP/Optique) du culot re-suspendu dans 1 mL
d'eau milliQ est de 2,844 mM équivalent en cis-platine (852,2 mg/L). Cette concentration correspond à 47,4 % du cis-platine initialement utilisé.
Exemple 16 : préparation des nanocapsules On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2 et comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks - a) Préparation de la solution de cis-platine :
15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h, avec une agitation de temps en temps.
- b) Préparation des solutions de lipides :
5 Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de dichlorométhane (10 mg/mL). La solution est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le dichlorométhane, stockée à -20 C.
10 2) Préparation des formulations lipidiques Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont mélangés à 47,2pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport de 1/1 en mole.
Le dichlorométhane est évaporé avec de l'azote comprimé de 15 manière à obtenir un film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules 1,2 mL de la solution de cis-platine (5mM) sont incubés une nuit à
température ambiante avec le film lipidique préalablement préparé, sans 20 agitation. Une série de 10 cycles de chauffage (bain marie à 45 C) et de congélation (carboglace/éthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules Une fois la série de 10 cycles terminée, la suspension est agitée 25 et mise dans un tube à hémolyse en verre, puis soumise à une sonication pendant 5 min. Après la sonication, la suspension est centrifugée à
1000 rpm/2,5 min/20 C pour retirer les grosses capsules qui se retrouvent dans le culot qui sera éliminé. Le surnageant est à nouveau centrifugé à
10000 rpm/5min/20 C. Les nanoparticules se retrouvent dans le culot. Ce 30 dernier est remis en suspension dans 1 mL d'eau milliQ et une deuxième centrifugation est réalisée. Le culot est suspendu dans 1 mL et dosé en Inductively Coupled Plasma (ICP)-Optique .
Exemple 17 : test de stabilité
Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16 sont dosées en ICP-optique (la valeur mesurée correspond à la concentration totale). La suspension des nanoparticules est aliquotée dans 5 tubes eppendorf (150 pL). Ces derniers sont incubés à 37 C sous agitation (300 rpm) pendant différents temps (0, 2.5, 5, 10 et 24 heures).
A un temps donné (x), le tube est centrifugé à 14 000 rpm/lOmin/20 C et 50 pL de surnageant (récupéré doucement pour ne pas remettre le culot en suspension) sont dosés.
Des nanoparticules à base del,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-[phospho-L-sérinej (DOPS) avec de la 1,2-dioléoyl-sn-glyéro-3-phosphocholine (DOPC) comme colipide sont préparées selon le même protocole à titre de comparaison.
Le pourcentage de libération de cis-platine est calculé selon l'équation suivante :
% de cis-platine libéré = Cx-C0/Ct-CO
Cx : concentration trouvée à un temps donné (x).
CO : concentration trouvée dans le surnageant avant incubation.
Ct : concentration totale trouvé sans incubation et sans centrifugation.
La courbe de libération du cis-platine en fonction du temps d'incubation représentés sur la figure 1 . Les nanoparticules de l'exemple 16 sont représentées par le symbole -O- et les nanoparticules à base de DOPC/DOPS par le symbole - - -Les résultats montrent que le temps de demi-vie (temps d'incubation nécessaire pour libérer 50% du cis-platine) est supérieur à 24 h pour les nanoparticules selon l'invention, alors qu'il est de l'ordre de 6,5 h pour les nanoparticules à base de DOPC/DOPS.
Exemple 18 : mesure de la taille des nanoparticules Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16 ont été analysées avec un zétasizer MALVERN.
Les nanoparticules sont mises en suspension dans 2 mL d'eau milliQ (volume nécessaire pour la mesure de la taille). La concentration est d'environ 0,5 mM (la suspension doit être turbide pour diffuser la lumière).
Des cuves (1 cm/1 cm) à usage unique sont utilisées pour la mesure.
Les résultats montrent que plus de 95 % des nanoparticules ont une taille entre 100 et 250 nm avec une polydispersité de 0,228.
Exemple 19 : dosage du cis-platine intracellulaire Protocole Des cellules IGROVI (lignée d'adénocarcinome ovarien) à 80 %
de confluence (boîte de 10 cm de diamètre) sont traitées avec 100 pM de cis-platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de l'exemple 16 pendant 2, 4 ou 6 h. Au terme de ce traitement deux lavages au PBS sont effectués. Les cellules sont traitées avec de la trypsine et remises en suspension dans du PBS. Deux lavages au PBS des suspensions cellulaires sont effectués (centrifugation 1000 rpm/lmin). Les cellules sont mises en suspension dans 1 mL de PBS et comptées.
Dosage en ICP-optique 106 cellules sont lysées avec 500 pL de la solution de lyse cellulaire (lysis buffer de chez SIGMA). Le volume est complété avec de l'eau milliQ à 1% d'acide HNO3 pour atteindre 5 mL.
Résultats Les résultats sont représentés sur la figure 2, qui montre la concentration en cis-platine libéré après lyse cellulaire en fonction du temps, correspondant à la concentration en cis-platine internalisé dans les cellules traitées .
Pour chaque temps, la colonne hachurée (à gauche) correspond au cis-platine libre et la colonne en pointillés (à droite) aux nanoparticules contenant du cis-platine.
Les résultats montrent que l'internalisation de cis-platine est nettement plus efficace en présence des nanoparticules. Par exemple, dans des conditions identiques (106 cellules, 100 pM, 2 h) 0,5 nanomole de cis-platine est internalisé dans le cas du cis-platine libre alors que l'internalisation est 4,5 fois plus importante dans le cas des nanoparticules (2,3 nanomoles).
Exemple 20 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules préparées selon l'invention Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 15. On a utilisé comme composé de formule (I) le composé C20dT de formule o NH
N
HO
O
HO-P=O
() n dans laquelle n=18, décrit dans Nathalie Campins et al., New J. Chem., 2007, 31, 1928-1934).
Protocole Le test mis en oeuvre utilise la lignée de cellules cancéreuses humaines HCT8 (adénocarcinome colorectal), connue pour sa résistance intrinsèque aux dérivés du platine.
Le protocole est le suivant :
- A J-3, les cellules sont implantées en plaques 96 puits à la densité de 50 000 cellules par puits.
- A JO, les cellules sont traitées par la formulation test, soit pour une courte durée d'exposition (30 min) dans du sérum physiologique, soit pour une longue durée d'exposition (72 h) dans du milieu de culture. La gamme de concentrations réalisée comporte les points 0 - 0,4 - 0,8 - 1,5 - 3 - 6,25 -12,5 - 25 - 50 et 100 mg/L. Des contrôles négatifs (cellules non traitées) et des contrôles positifs (cispiatine) ont été réalisés simultanément.
-A J3, le milieu de culture est changé, et le traitement de 72 h arrêté.
- A J6, le protocole est terminé, et les cellules restantes au fond des puits sont colorées au cristal violet.
Expression des résultats La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de formulation test a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de courbes effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-dire la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
Résultats préliminaires (CI50) à 30 minutes Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 Composé (I) Colipide Rapport molaire du CI 50(mg/L) mélange Aucun - Non déterminée (Cis-platine seul) 0150 > 100 mg/L
C20dT DOPC DOPC/ C20dT 33 mg/L
1 :1 Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention, contenant le composé de formule (I) C20dT présente, dans ce test, une cytotoxicité à 30 min exprimée par la C150 à une dose significativement inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 21 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules 5 préparées selon l'invention On a utilisé comme composé de formule (1) :
- le diCl6dT (Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) de l'exemple 2 et un colipide (DOPC), ou - le 5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2, 3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxy-10 thymidine de l'exemple 12, mais sans ajouter de colipide.
Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 15, mais avec un seul cycle de chauffage/refroidissement pour le composé de l'exemple 12.
15 Protocole 1000 à 5000 cellules IGROV1 sont incubées dans 100 ML de milieu avec sérum par puits (plaque 96 puits). Après 24 h le milieu est retiré
et les cellules sont traitées pendant 1 à 3 jours avec les formulations selon l'invention et/ou le cis-Pt libre (aux concentrations voulues). Les cellules sont 20 incubées à 37 C dans 200 pL du milieu avec sérum. La viabilité cellulaire est révélée en colorimétrie par un test MTS à la fin du traitement.
Expression des résultats La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort 25 globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de formulations testées a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de courbes effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-dire la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
30 Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous, dans lequel la CI50 est exprimée soit en pM, soit en en mg/L de cis-platine (temps d'incubation : 24h).
Tableau 2 Composé (I) Colipide CI 50 C150 Exprimée en mg/L Exprimée en pM
Aucun - 9,48 31,6 Cis-latine seul) Exemple 2 DOPC 0,48 1,6 Exemple 12 - 0,95 3,16 Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention, contenant les composés de formule (1), préparées en présence ou en absence de colipide, présentent dans ce test une cytotoxicité à 24 h exprimée par la C15o à une dose significativement inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 22 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules préparées selon l'invention Protocole al Préparation et traitement des cellules :
Dans une plaque 96 puits, 2500 cellules (IGROVI, SKOV3, lignées d'adénocarcinomes ovariens) par puits sont incubées dans 100 pL du milieu avec sérum. Après 24 heures le milieu est aspiré et les cellules sont traitées avec du cis-platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de l'exemple 16 dans 100 pL du milieu sans sérum à différentes concentrations (500, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 pM). Après 24 heures de traitement, le milieu est retiré et les cellules sont lavées 2 fois avec 100 pL de PBS puis incubées avec 100 pL du milieu avec sérum.
b/ Révélation de la toxicité :
48h après les deux lavages, la viabilité cellulaire est révélée en ajoutant 20 pL de MTS. L'absorbance à 490 nm est mesurée après 2 à 4 heures d'incubation à 37 C. L'absorbance est proportionnelle à la viabilité
cellulaire.
et résultats Les résultats sont représentés sur la figure 3, qui montre la concentration nécessaire pour obtenir 50 % de mort cellulaire (IC50) avec du cis-platine libre (colonne A) ou les nanoparticules contenant du cis-platine (colonne B).
La figure 3A concerne la lignée cellulaire IGROVI et la figure 3B
concerne la lignée cellulaire SKOV3.
Les résultats montrent les nanoparticules de l'exemple 16 contenant du cis-platine sont plus efficaces que le cis-platine libre dans les deux lignées cellulaires, IGROVI (sensible au cis-platine) et SKOV3 (résistante au cis-platine).
Sur la lignée IGROVI, on obtient 50 % de mort cellulaire avec 0,27 pM de nanoparticules contenant du cis-platine alors qu'il faut utiliser 2,41 pM de cis-platine libre pour obtenir ce résultat. Sur la lignée SKOV3, on obtient 50 % de mort cellulaire avec 0,54 pM de nanoparticules contenant du cis-platine contre 4,3 pM de cis-platine libre.
Les nanoparticules contenant du cis-platine sont respectivement 9 et 8 fois plus* efficaces que le cis-platine libre sur les lignées IGROVI et SKOV3.
RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) :ô 25,8 (CH2), 8 26,0 (CH2), 8 29,4 (2 CH2), 8 29,5 (2 CH2), 8 29,6 (CH2), 8 32,7 (CH2), 8 57,9 (CH2), 6 62,7 (CH2), 6 70,2 (CH2), 8 74,2 (CH), 8 79,9 (C).
Préparation 7 o-propargylcholestérol Dans un ballon propre et sec, sous atmosphère d'azote anhydre, on introduit 500 mg de cholestérol (1,3 mmol) en solution 0,5 M dans le DMF.
La solution est alors refroidie à 0 C et 47 mg d'hydrure de sodium (1,5 équivalents, 2 mmol) sont additionnés par petites fractions.
On laisse revenir le milieu réactionnel à température ambiante 238 mg de bromure de propargyle (1,5 équivalents, 2 mmol) sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 5 h. La réaction est alors stoppée par ajout de 10 mL de méthanol et l'agitation est maintenue pendant 30 min. On ajoute au mélange 50 mL de CH2CI2 puis on lave successivement par 2 fois 20 mL et 20 mL d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est alors séchée sur Na2SO4 puis le solvant est éliminé sous pression réduite. Le composé attendu est obtenu après purification sur colonne chromatographique (Hexane/AcOEt 8/2).
215 mg d'un produit blanc sont ainsi isolés.
RF : 0,83 (Hexane/AcOEt 8/2) Rendement : 39 Exemple 1 Thymidine 3'-(1,2-d imyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl4dT) o NH
O
"O
O-P=0 O O O O
( ) 11 ( ) 11 De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-dimyristoyl-sn-glycérol (0,447 g, 1,3 éq, 0,87 mmol) et une solution de tétrazole 0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq, 0,87 mmol) sont dissous dans 4 mL
d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu réactionnel est mis sous agitation magnétique pendant 24h00 à température ambiante. Le mélange est ensuite oxydé par ajout de 43 mL d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20.
Après 12 h à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est dissous dans 8 mL de dichlorométhane. Ensuite, 0,2 mL de 1,5-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq, 0,87 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu réactionnel est lavé avec une solution de HCI 0,IN puis avec une solution saturée de Na2S2O7. La phase organique est concentrée sous vide. Le composé est obtenu après purification par 5 chromatographie flash (381 mg) en utilisant un gradient d'élution (MeOH/DCM
9:1 jusqu'à 1:1).
Rendement : 69%
Rf : 0,34 (DCM/MeOH 9 :1) 10 RMN 1H (300 MHz, CDC13) : b en ppm 0,84 (t, 6H, J=6,92 Hz, 2*CH3), 1,21 (m, 40H, 20*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,45 Hz, J2=15,68 Hz, 2*CH2), 1,89 (s, 3H, Me), 2,30 (dd, 4H, J1=7,43 Hz, J2=15,92 Hz, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,84, H2'), 3,84 (m, I H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1 H, CHglycérol), 6,22 (t, 1 H, J=6,81 Hz, H1'), 7,61 (s,1 H, Hbase).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 8 en ppm 19,29 (CH3), 23,71 (CH2), 26,57 (CH2), 28,73 (CH2), 32,76 (CH2), 37,85 (CH2), 48,90 (CH2), 166,15 (C=O).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 0,61.
Masse Haute Résolution FAB- théorique m/z = 815,4823 observé
m/z = 815,4794.
Exemple 2 Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyi-sn-glycéro-3-phosphate) (di cl6dT) NH
NZ
HO
O-P=0 De la 5'-0-(4,4'-diméthoxytrityl)-2'-déoxythymidine,3'-[(2-cyano-éthyl)-N,N-diisopropyl)] phosphoramidite (0,500 g, 1 éq, 0,67 mmol), du 1,2-dipalmitoyl-sn-glycérol (0,496 g, 1,3 éq, 0,87 mmol / solubilisé dans 3 mL de THF) et une solution de tétrazole 0,45 M dans l'acétonitrile (2 mL, 1,3 éq, 0,87 mmol) sont dissous dans 3 mL d'acétonitrile anhydre sous azote. Le milieu réactionnel est mis sous agitation magnétique pendant 24h00 à température ambiante et sous azote. Le mélange est ensuite oxydé par ajout de 43 mL
d'une solution de diiode 0,02M dans THF/Pyr/H20. Après 12 h à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide et séché à la pompe sous P205 pendant une nuit. Le résidu est dissous dans 8 mL de dichlorométhane.
Ensuite, 0,2 mL de 1,5-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (1,3 éq, 0,87 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel pendant 5 h. Le milieu réactionnel est lavé avec une solution de HCI 0,1N puis avec une solution saturée de Na2S2O3. La phase organique est concentrée sous vide. Le composé est obtenu après purification par chromatographie flash (180 mg) en utilisant un gradient d'élution (MeOH/DCM 98:2 jusqu'à 1:1).
Rendement : 24%
Rf : 0,3 (DCM/MeOH 8:2) RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 en ppm 0,88 (t, 6H, J=6,9 Hz, 2*CH3), 1,25 (m, 48H, 24*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,4 Hz, J2=15,6 Hz, 2*CH2), 1,90 (s, 3H, Me), 2,33 (m, 4H, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,6 Hz, H2'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glycerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1 H, CH
glycérol), 6,21 (t, 1 H, J=6,7 Hz, H1'), 7,54 (s,1 H, H base).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : S en ppm 12,4 (CH3 base), 14,1 (CH3 chaîne), 19,6 (CH2), 19,7 (CH2), 22,6 (CH2), 24,8 (CH2), 29,1-29,6 (CH2), 31,9 (CH2), 33,9 (CH2), 34,1 (CH2), 61,5 (CH2), 61,7 (CH2), 62,5 (CH2), 62,6 (CH2), 66,1 (CH2), 66,2 (CH2), 69,1 (CH), 78,8 (CH), 85,5 (CH), 86,1 (CH), 111,3 (C
base), 136,8 (CH base), 150,5 (C=O base), 164,1 (C=O base), 173,0 (C=O
chaîne), 173,5 (C=O chaîne).
RMN 31P (121 MHz, CDC13) : 8 en ppm 2,1.
Masse ESI- : théorique m/z = 872,5 observé m/z = 871,3.
Exemple 3 5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
CINH
N~O
NN
N'N k-O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 231 mg de 1-propargyloxyoctadécane telle que décrit dans la préparation 5 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalents, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 180 mg d'un solide blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne de silice (AcOEt/MeOH
8/2).
RF : 0,72 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 42 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 4 5'-(4-Hexadécyloxyméthyl-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'-didéoxyadénosine i N N
NNN N N
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5',2'-didéoxyadénosine telle que décrite dans la préparation 4 (0,72 mmol) et 223 mg de 1-propargyloxyoctadécane telle que décrite dans la préparation 5 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange de THF et d'eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalents, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate. de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h, puis le mélange est refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. 150 mg d'un solide blanc sont obtenus après chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2).
RF : 0,65 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 35 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 8 0,89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6 1,26 (m, 30H, CH2), 8 1,55 (m, 2H, CH2), 6 2,54 (m, 1 H, CH2), 6 3,06 (m, 1 H, CH2), 6 3,45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 8 4,50 (m, 4H, CH2, CH), 6 4,89 (m, ???), 6 5,88 (s, 2H, NH2), 8 6,40 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,42 (s, 1 H, CH), 6 7,81 (s, 1 H, CH), 6 8,35 (s, 1 H, CH).
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 585,4241 , masse mesurée : 585,4254 Exemple 5 5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine O
\OHNH
N O
N-N
OH
Dans un ballon sont introduits 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101 mg du mélange racémique de oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute alors, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à
60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 78 %
RMN 1H (300,13 MHz, DMSO d6) : 6 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 6 1,24 (m, 6H, CH2)0 6 1,68 (m, 2H, CH2), 6 1,81 (s, 3H, CH3)0 6 4,06 (m, 1H, CH), 6 4,27 (m, 1 H, CH), 6 4,62 (m, 3H, CH2, CH), 6 5,2 (d, j = 6 Hz, 1 H, OH), 5 5,5 (s, 1 H, OH), 6 6,17 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH), 6 7,37 (s, 1 H, CH), 8 7,89 (s, 1 H, 5 CH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : b 12,5 (CH3), 6 014,4 (CH3), 6 22,6 (CH2), 6 25,1, 6 31,7 (CH2), b 38,4 (CH2), 6 51,6 (CH2-N), 6 66,0 (CH-O), 71,3 (C), 6 84,4, 6 84,5, 6 110,3 (=C-N), 6 122,8, 6 136,4, 6 150,9, 6 152,4, b 164,1.
10 SM Haute résolution [M+Na]+ : masse calculée : 416,1910, masse mesurée : 416,1897 Exemple 6 5'-(4-(hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
\NM N O
N_N O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 82,65 mg de non-1-yne (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 130 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,62 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 46 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 7 5'-(4-(heptyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
N O
N%% , N
iço-J
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 93 mg de non-1-yne (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 120 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 41 %
RMN 1H (300,13 MHz, CDC13) : 5 0,83 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 8 1,25 (m, 8H, CH2), 5 1,55 (m, 2H, CH2), 8 1,79 (s, 3H, CH3), 5 2,10 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 5 2,61 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), ô 4,06 (s, I H, CH),. 5 4,27 (s, I H, CH), 4,59 (m, 2H, CH2), 5 5,5 (s, 1 H, OH), 5 6,16 (t, j = 6 Hz, 1 H, CH),, 5 7,29 5 (s, 1H, CH), 5 7,82 (s, 1H, CH), 8 11,31 (s, I H, NH).
RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6) : 8 12,6 (CH3), ô 14,4 (CH3), 5 22,5 (CH2), 6 25,4 (CH2), 5 28,9 (CH2), 5 29,0 (CH2), 5 29,4 (CH2),. 8 31,7 (CH2), 5 38,4 (CH2), 5 51,5 (CH2), 5 71,1 (CH), 5 84,4 (CH), 5 110 (C), 5 123,1 (CH), 5 136,5 (CH)6 5 147,4 (C), 8 150,9 (C=O), 5 164,1 (C=O).
Exemple 8 5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylméthoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine 0/~I C13H27 O
O
O NH
NO
N
%N, N
O
OH
Dans un ballon, on introduit 264 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (1 mmol) et 500 mg de 4-Prop-2-ynyloxyméthyl-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans un mélange THF eau (111). On ajoute, successivement : 39,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,2 mmol) et 16 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,1 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé
par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 8/2). 550 mg d'un solide blanc sont obtenus.
Rendement : 72 SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 774,5745 , masse mesurée : 774,5739 Exemple 9 5'-(4-(2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolan-4-ylbutoxyméthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
O
O NH
'4.0 N%% , N
JO
OH
Dans un ballon, on introduit 195 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,73 mmol) et 400 mg de 4-(4-Prop-2-ynyloxy-butyl)-2,2-ditridécyl-[1,3]dioxolane (1 équivalent) en solution 0,1 M
dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,073 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C
pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et ' le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 9/1). 180 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,43 (AcOEt/MeOH 9/1) Rendement : 30 Exemple 10 5'-(4-((O-cholestéryl)-méthyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine s O
O %,-e NH
N )O
NNN.N
J
OH
Dans un ballon, on introduit 170 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,63 mmol) et 270 mg de o-propargylcholestérol telle que décrit dans la préparation 7 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement :
mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,13 mmol) et 10 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,063 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est refroidi à température ambiante.
15 Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé
par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 260 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,57 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 59 %
SM [M+H]+ : 692,3 Exemple 11 1,1 2-bis-[5'-(4-(méthyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'd idéoxythymidine]-5 oxydodécane OH O
NH
O N~O O I
N N O
O NON Np N
HN N' I~ J
O OH
10 Dans un ballon, on introduit 100 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,375 mmol) et 52 mg de 1,12-dipropargyloxydodécane préparé à partir du composé décrit dans la préparation 6 (0,5 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 15 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,075 mmol) 15 et 6 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,0375 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2). 90 mg d'un solide 20 blanc sont obtenus.
Rendement : 59 RMN 1H (300,13 MHz, MeOH d4) : 8 1,28 (m, 16H, CH2), 8 0,83 (m, 4H, CH2), 8 1,89 (s, 6H, CH3), 8 2,17 (s, 2H, CH2), ô 2,25 (m, 4H, CH2), 8 25 3,51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 4,18 (m, 2H, CH) 8 4,42 (m, 2H, OH) 8 4,58 (s, 4H, CH2), 8 4,76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH2), 8 6,21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), 8 7,23 (s, 2H, CH), 8 7,99 (s, 2H, CH).
Exemple 12 5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxythymidine O
OH NH
N N
N
O
I~--J
(R) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (R) oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1).
On ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcEt/MeOH 9/1). 240 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcEt/MeOH 9/1) Rendement : 76 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 13 5'-(4-(1 (S)-hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxythymidine OH NH
NON N
(S) OH
Dans un ballon, on introduit 215 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,8 mmol) et 101,5 mg de (S) oct-1-yn-3-01 (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 31,5 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 13 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 85/15). 255 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF : 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15) Rendement : 78 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 14 5'-(4-(1 -hydroxy-hexyl)-[1,2,3]triazol-1 -yl)-5',2'didéoxyadenosine OH
N
O
OH
Dans un ballon, on introduit 200 mg de 5'-azido-5'-déoxythymidine telle que décrite dans la préparation 3 (0,75 mmol) et 95 mg du mélange racémique d'oct-1-yn-3-ol (1 équivalent) en solution 0,1 M dans un mélange THF eau (1/1). On ajoute, successivement : 30 mg de d'ascorbate de sodium (0,2 équivalent, 0,15 mmol) et 12 mg de sulfate de cuivre (0,1 équivalent, 0,075 mmol). Le milieu réactionnel est agité et chauffé à 60 C pendant 5 h. Le mélange est alors refroidi à température ambiante. Le milieu réactionnel est immédiatement adsorbé sur silice et le solvant éliminé par évaporation. Le composé est obtenu pur par chromatographie sur colonne (AcOEt/MeOH 8/2).
240 mg d'un solide blanc sont obtenus.
RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 8/2) Rendement : 80 %
SM Haute résolution [M+H]+ : masse calculée : 576,4125 , masse mesurée : 576,4120 Exemple 15 : préparation des nanoparticules On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2 et comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks - a) Préparation de la solution de cis-platine :
15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h.
- b) Préparation des solutions de lipides :
Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de chloroforme (10 mg/mL). Cet échantillon est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le chloroforme, stockée à -20 C.
2) Préparation des formulations lipidiques Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont mélangés à 23,6 pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport de 1/1 en mole.
Le chloroforme est évaporé sous l'azote de manière à obtenir un film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules 1,2 mL de la solution de cis-platine pré-incubée à 37 C sont utilisés pour réhydrater le film lipidique préalablement préparé. Le mélange est incubé à 37 C pendant 30 min. Une série de 10 cycles de chauffage (bain marie à 45 C) et de congélation (carboglace/méthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules Une fois la série de 10 cycles terminée, le tube est centrifugé à
2100 rpm à 4 C pendant 5 min. Après élimination du surnageant le culot est re-suspendu dans 1 mL d'eau milliQ. Une deuxième centrifugation est réalisée (2100 rpm à 4 C pendant 5 min), puis le surnageant est retiré et le culot est séché.
La concentration (ICP/Optique) du culot re-suspendu dans 1 mL
d'eau milliQ est de 2,844 mM équivalent en cis-platine (852,2 mg/L). Cette concentration correspond à 47,4 % du cis-platine initialement utilisé.
Exemple 16 : préparation des nanocapsules On utilise comme composé de formule (I) le composé thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) (di C16 dT) préparé à l'exemple 2 et comme co-lipide la dioléylphosphatidylcholine (DOPC).
1) Préparation des solutions stocks - a) Préparation de la solution de cis-platine :
15 mg de cis-platine sont solubilisés dans 10 mL d'eau milliQ
(5 mM). Cette suspension est agitée pendant 1 min (vortex), puis incubée à
37 C pendant 24 h, avec une agitation de temps en temps.
- b) Préparation des solutions de lipides :
5 Solution A : 20 mg du diCl6dT sont solubilisés dans 2 mL de dichlorométhane (10 mg/mL). La solution est stocké à -20 C.
Solution B : DOPC : solution à 20 mg/mL dans le dichlorométhane, stockée à -20 C.
10 2) Préparation des formulations lipidiques Dans un tube eppendorf de 2 mL, 52,3 pL de la solution A sont mélangés à 47,2pL de la solution B. Ces volumes correspondent à un rapport de 1/1 en mole.
Le dichlorométhane est évaporé avec de l'azote comprimé de 15 manière à obtenir un film lipidique homogène.
3) Préparation des nanoparticules 1,2 mL de la solution de cis-platine (5mM) sont incubés une nuit à
température ambiante avec le film lipidique préalablement préparé, sans 20 agitation. Une série de 10 cycles de chauffage (bain marie à 45 C) et de congélation (carboglace/éthanol -78 C) est réalisée.
4) Lavage et récupération des nanoparticules Une fois la série de 10 cycles terminée, la suspension est agitée 25 et mise dans un tube à hémolyse en verre, puis soumise à une sonication pendant 5 min. Après la sonication, la suspension est centrifugée à
1000 rpm/2,5 min/20 C pour retirer les grosses capsules qui se retrouvent dans le culot qui sera éliminé. Le surnageant est à nouveau centrifugé à
10000 rpm/5min/20 C. Les nanoparticules se retrouvent dans le culot. Ce 30 dernier est remis en suspension dans 1 mL d'eau milliQ et une deuxième centrifugation est réalisée. Le culot est suspendu dans 1 mL et dosé en Inductively Coupled Plasma (ICP)-Optique .
Exemple 17 : test de stabilité
Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16 sont dosées en ICP-optique (la valeur mesurée correspond à la concentration totale). La suspension des nanoparticules est aliquotée dans 5 tubes eppendorf (150 pL). Ces derniers sont incubés à 37 C sous agitation (300 rpm) pendant différents temps (0, 2.5, 5, 10 et 24 heures).
A un temps donné (x), le tube est centrifugé à 14 000 rpm/lOmin/20 C et 50 pL de surnageant (récupéré doucement pour ne pas remettre le culot en suspension) sont dosés.
Des nanoparticules à base del,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-[phospho-L-sérinej (DOPS) avec de la 1,2-dioléoyl-sn-glyéro-3-phosphocholine (DOPC) comme colipide sont préparées selon le même protocole à titre de comparaison.
Le pourcentage de libération de cis-platine est calculé selon l'équation suivante :
% de cis-platine libéré = Cx-C0/Ct-CO
Cx : concentration trouvée à un temps donné (x).
CO : concentration trouvée dans le surnageant avant incubation.
Ct : concentration totale trouvé sans incubation et sans centrifugation.
La courbe de libération du cis-platine en fonction du temps d'incubation représentés sur la figure 1 . Les nanoparticules de l'exemple 16 sont représentées par le symbole -O- et les nanoparticules à base de DOPC/DOPS par le symbole - - -Les résultats montrent que le temps de demi-vie (temps d'incubation nécessaire pour libérer 50% du cis-platine) est supérieur à 24 h pour les nanoparticules selon l'invention, alors qu'il est de l'ordre de 6,5 h pour les nanoparticules à base de DOPC/DOPS.
Exemple 18 : mesure de la taille des nanoparticules Les nanoparticules préparées selon le protocole de l'exemple 16 ont été analysées avec un zétasizer MALVERN.
Les nanoparticules sont mises en suspension dans 2 mL d'eau milliQ (volume nécessaire pour la mesure de la taille). La concentration est d'environ 0,5 mM (la suspension doit être turbide pour diffuser la lumière).
Des cuves (1 cm/1 cm) à usage unique sont utilisées pour la mesure.
Les résultats montrent que plus de 95 % des nanoparticules ont une taille entre 100 et 250 nm avec une polydispersité de 0,228.
Exemple 19 : dosage du cis-platine intracellulaire Protocole Des cellules IGROVI (lignée d'adénocarcinome ovarien) à 80 %
de confluence (boîte de 10 cm de diamètre) sont traitées avec 100 pM de cis-platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de l'exemple 16 pendant 2, 4 ou 6 h. Au terme de ce traitement deux lavages au PBS sont effectués. Les cellules sont traitées avec de la trypsine et remises en suspension dans du PBS. Deux lavages au PBS des suspensions cellulaires sont effectués (centrifugation 1000 rpm/lmin). Les cellules sont mises en suspension dans 1 mL de PBS et comptées.
Dosage en ICP-optique 106 cellules sont lysées avec 500 pL de la solution de lyse cellulaire (lysis buffer de chez SIGMA). Le volume est complété avec de l'eau milliQ à 1% d'acide HNO3 pour atteindre 5 mL.
Résultats Les résultats sont représentés sur la figure 2, qui montre la concentration en cis-platine libéré après lyse cellulaire en fonction du temps, correspondant à la concentration en cis-platine internalisé dans les cellules traitées .
Pour chaque temps, la colonne hachurée (à gauche) correspond au cis-platine libre et la colonne en pointillés (à droite) aux nanoparticules contenant du cis-platine.
Les résultats montrent que l'internalisation de cis-platine est nettement plus efficace en présence des nanoparticules. Par exemple, dans des conditions identiques (106 cellules, 100 pM, 2 h) 0,5 nanomole de cis-platine est internalisé dans le cas du cis-platine libre alors que l'internalisation est 4,5 fois plus importante dans le cas des nanoparticules (2,3 nanomoles).
Exemple 20 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules préparées selon l'invention Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 15. On a utilisé comme composé de formule (I) le composé C20dT de formule o NH
N
HO
O
HO-P=O
() n dans laquelle n=18, décrit dans Nathalie Campins et al., New J. Chem., 2007, 31, 1928-1934).
Protocole Le test mis en oeuvre utilise la lignée de cellules cancéreuses humaines HCT8 (adénocarcinome colorectal), connue pour sa résistance intrinsèque aux dérivés du platine.
Le protocole est le suivant :
- A J-3, les cellules sont implantées en plaques 96 puits à la densité de 50 000 cellules par puits.
- A JO, les cellules sont traitées par la formulation test, soit pour une courte durée d'exposition (30 min) dans du sérum physiologique, soit pour une longue durée d'exposition (72 h) dans du milieu de culture. La gamme de concentrations réalisée comporte les points 0 - 0,4 - 0,8 - 1,5 - 3 - 6,25 -12,5 - 25 - 50 et 100 mg/L. Des contrôles négatifs (cellules non traitées) et des contrôles positifs (cispiatine) ont été réalisés simultanément.
-A J3, le milieu de culture est changé, et le traitement de 72 h arrêté.
- A J6, le protocole est terminé, et les cellules restantes au fond des puits sont colorées au cristal violet.
Expression des résultats La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de formulation test a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de courbes effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-dire la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
Résultats préliminaires (CI50) à 30 minutes Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 Composé (I) Colipide Rapport molaire du CI 50(mg/L) mélange Aucun - Non déterminée (Cis-platine seul) 0150 > 100 mg/L
C20dT DOPC DOPC/ C20dT 33 mg/L
1 :1 Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention, contenant le composé de formule (I) C20dT présente, dans ce test, une cytotoxicité à 30 min exprimée par la C150 à une dose significativement inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 21 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules 5 préparées selon l'invention On a utilisé comme composé de formule (1) :
- le diCl6dT (Thymidine 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) de l'exemple 2 et un colipide (DOPC), ou - le 5'-(4-(1(R)-hydroxy-hexyl)-[1,2, 3]triazol-1-yl)-5',2'didéoxy-10 thymidine de l'exemple 12, mais sans ajouter de colipide.
Les nanoparticules ont été préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 15, mais avec un seul cycle de chauffage/refroidissement pour le composé de l'exemple 12.
15 Protocole 1000 à 5000 cellules IGROV1 sont incubées dans 100 ML de milieu avec sérum par puits (plaque 96 puits). Après 24 h le milieu est retiré
et les cellules sont traitées pendant 1 à 3 jours avec les formulations selon l'invention et/ou le cis-Pt libre (aux concentrations voulues). Les cellules sont 20 incubées à 37 C dans 200 pL du milieu avec sérum. La viabilité cellulaire est révélée en colorimétrie par un test MTS à la fin du traitement.
Expression des résultats La survie des cellules a été déterminée, et le pourcentage de mort 25 globale (ou cytotoxicité) obtenue aux différentes concentrations de formulations testées a été comparé à celui obtenu avec les contrôles négatifs (cellules non traitées). Les résultats de cytotoxicité ont été présentés sous forme de courbes effet-dose caractérisées par leur concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est-à-dire la concentration à laquelle on observe 50% de cellules mortes.
30 Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous, dans lequel la CI50 est exprimée soit en pM, soit en en mg/L de cis-platine (temps d'incubation : 24h).
Tableau 2 Composé (I) Colipide CI 50 C150 Exprimée en mg/L Exprimée en pM
Aucun - 9,48 31,6 Cis-latine seul) Exemple 2 DOPC 0,48 1,6 Exemple 12 - 0,95 3,16 Les résultats montrent que les nanoparticules selon l'invention, contenant les composés de formule (1), préparées en présence ou en absence de colipide, présentent dans ce test une cytotoxicité à 24 h exprimée par la C15o à une dose significativement inférieure à celle du cis-platine utilisé seul.
Exemple 22 : Etude des effets cytotoxiques des nanoparticules préparées selon l'invention Protocole al Préparation et traitement des cellules :
Dans une plaque 96 puits, 2500 cellules (IGROVI, SKOV3, lignées d'adénocarcinomes ovariens) par puits sont incubées dans 100 pL du milieu avec sérum. Après 24 heures le milieu est aspiré et les cellules sont traitées avec du cis-platine libre ou encapsulé dans les nanoparticules de l'exemple 16 dans 100 pL du milieu sans sérum à différentes concentrations (500, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 pM). Après 24 heures de traitement, le milieu est retiré et les cellules sont lavées 2 fois avec 100 pL de PBS puis incubées avec 100 pL du milieu avec sérum.
b/ Révélation de la toxicité :
48h après les deux lavages, la viabilité cellulaire est révélée en ajoutant 20 pL de MTS. L'absorbance à 490 nm est mesurée après 2 à 4 heures d'incubation à 37 C. L'absorbance est proportionnelle à la viabilité
cellulaire.
et résultats Les résultats sont représentés sur la figure 3, qui montre la concentration nécessaire pour obtenir 50 % de mort cellulaire (IC50) avec du cis-platine libre (colonne A) ou les nanoparticules contenant du cis-platine (colonne B).
La figure 3A concerne la lignée cellulaire IGROVI et la figure 3B
concerne la lignée cellulaire SKOV3.
Les résultats montrent les nanoparticules de l'exemple 16 contenant du cis-platine sont plus efficaces que le cis-platine libre dans les deux lignées cellulaires, IGROVI (sensible au cis-platine) et SKOV3 (résistante au cis-platine).
Sur la lignée IGROVI, on obtient 50 % de mort cellulaire avec 0,27 pM de nanoparticules contenant du cis-platine alors qu'il faut utiliser 2,41 pM de cis-platine libre pour obtenir ce résultat. Sur la lignée SKOV3, on obtient 50 % de mort cellulaire avec 0,54 pM de nanoparticules contenant du cis-platine contre 4,3 pM de cis-platine libre.
Les nanoparticules contenant du cis-platine sont respectivement 9 et 8 fois plus* efficaces que le cis-platine libre sur les lignées IGROVI et SKOV3.
Claims (21)
1. Procédé d'encapsulation d'un agent thérapeutique comprenant les étapes consistant à:
a) préparer un mélange d'au moins un composé amphiphile fonctionnel de formule (I) dans laquelle - X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène, - B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par, une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule ou encore L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
- R1 et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou - un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n =1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C 2 - C 30 ou par un reste stérol, ou encore - R 3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, et - un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, b) soumettre ledit mélange à des cycles répétés de chauffage et congélation, de manière à obtenir des nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique, et c) récupérer les nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique ainsi obtenues.
a) préparer un mélange d'au moins un composé amphiphile fonctionnel de formule (I) dans laquelle - X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène, - B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par, une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule ou encore L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
- R1 et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou - un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n =1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C 2 - C 30 ou par un reste stérol, ou encore - R 3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, et - un agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, b) soumettre ledit mélange à des cycles répétés de chauffage et congélation, de manière à obtenir des nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique, et c) récupérer les nanoparticules contenant ledit agent thérapeutique ainsi obtenues.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule (I), X représente l'oxygène.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce que, dans la formule (I), B représente la thymine ou l'adénine.
en ce que, dans la formule (I), B représente la thymine ou l'adénine.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, dans la formule (I):
- X et B sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 3;
- L 1 représente un groupe phosphate, L 2 représente l'hydrogène, R 1 représente un groupe alkyle en C 2 - C 30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C 2 - C 30 et R 3 est un groupe hydroxy ; ou - L 1 et L 2 représentent un atome d'oxygène, R1 et R2 représentent l'hydrogène et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C 2 - C 30, ou - L 1 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L 2 représente l'hydrogène, R 1 représente un groupe alkyle en C 2 - C 30, et R 3 est un groupe hydroxy , ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C 2 - C 30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R 3 est un groupe ou un groupe -(CH 2 )n-V-R 8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R 8 représente un alkyle en C 2-C 30, ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH 2)m-O-(CH 2)p-R 9 dans lequel m =
1 à 6 et p= 0 à 10 et R 9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C 2 - C 30 ou par un reste stérol , ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH 2)m-O-(CH 2)p - R 9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R 3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, ou - L 1 représente un groupe phosphate, L 2 représente l'hydrogène R 1 représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C 2 - C 30 , et est un groupement hydroxy.
- X et B sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 3;
- L 1 représente un groupe phosphate, L 2 représente l'hydrogène, R 1 représente un groupe alkyle en C 2 - C 30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C 2 - C 30 et R 3 est un groupe hydroxy ; ou - L 1 et L 2 représentent un atome d'oxygène, R1 et R2 représentent l'hydrogène et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C 2 - C 30, ou - L 1 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L 2 représente l'hydrogène, R 1 représente un groupe alkyle en C 2 - C 30, et R 3 est un groupe hydroxy , ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C 2 - C 30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R 3 est un groupe ou un groupe -(CH 2 )n-V-R 8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R 8 représente un alkyle en C 2-C 30, ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH 2)m-O-(CH 2)p-R 9 dans lequel m =
1 à 6 et p= 0 à 10 et R 9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C 2 - C 30 ou par un reste stérol , ou - L 1 représente un groupe hydroxy, L 2 représente l'hydrogène et R 3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH 2)m-O-(CH 2)p - R 9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R 3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, ou - L 1 représente un groupe phosphate, L 2 représente l'hydrogène R 1 représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C 2 - C 30 , et est un groupement hydroxy.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, dans la formule (I) :
- X, B, L2, R 1 et R 2 sont tels que définis dans la formule (I), et - le substituant L 1 ou le substituant R 3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué ou substitué.
- X, B, L2, R 1 et R 2 sont tels que définis dans la formule (I), et - le substituant L 1 ou le substituant R 3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué ou substitué.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à:
- mettre en solution le composé de formule (I) dans un solvant organique pour former un mélange lipidique, - évaporer ledit mélange pour former un film , - mettre en solution la quantité voulue d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral dans de l'eau distillée , - réhydrater le film lipidique dans la solution d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, - soumettre le mélange ainsi obtenu à un cycle de chauffage et de refroidissement effectué de 1 à 10 fois.
- mettre en solution le composé de formule (I) dans un solvant organique pour former un mélange lipidique, - évaporer ledit mélange pour former un film , - mettre en solution la quantité voulue d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral dans de l'eau distillée , - réhydrater le film lipidique dans la solution d'agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, - soumettre le mélange ainsi obtenu à un cycle de chauffage et de refroidissement effectué de 1 à 10 fois.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le composé de formule (I) est mis en solution dans un solvant organique en présence d'un colipide.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le colipide est choisi parmi la dioléylphosphatidylcholine (DOPC) et la dioléyl-phosphatidyluridinephosphatidylcholine (DOUPC).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent thérapeutique est choisi parmi les complexes de platine ou le ruthénium capable de se lier à des complexes de platines, ou encore les complexes inorganiques sans platine à base de ruthénium II ou III, de titane de gallium, de cobalt, de fer ou d'or.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'agent thérapeutique est choisi parmi le cis-platine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine et le lobaplatine.
11. Nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé
selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Nanoparticules solides, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un coeur riche en agent thérapeutique, de préférence un agent anti-tumoral, entouré par une ou plusieurs couches lipidiques constituées de composé de formule (I), dans laquelle - X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupe méthylène, - B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à 7 chaînons, éventuellement substituée ;
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par, une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule ou encore L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
R1 et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy , ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou - un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n = 1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol, ou encore - R3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, avec ou sans co-lipide.
- L1 et L2, identiques ou différents, représentent l'hydrogène, un groupe oxycarbonyl -O-C(O)-, un groupe thiocarbamate -O-C(S)-NH-, un groupe carbonate -O-C(O)-O-, un groupe carbamate -O-C(O)-NH-, un atome d'oxygène, un groupe phosphate, un groupe phosphonate ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, substitué ou non substitué par, une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée en C2-C30, ou encore, L1 et L2, ensemble, forment un groupement cétal de formule ou encore L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30;
R1 et R2, identiques ou différents, représentent - une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée en C2-C30, de préférence en C6-C25, notamment en C8-C25, saturée ou partiellement insaturée, éventuellement totalement ou partiellement fluorée, non substituée ou substituée sur le carbone d'extrémité de chaîne par un atome de fluor ou par un ester ou un éther benzylique ou naphtylique, ou - une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne acyle en C2-C30, ou - un groupe diacylglycérol, sphingosine ou céramide, ou - lorsque L1 ou L2 représente l'hydrogène, et l'autre représente un groupe hydroxy ou un groupe hétéroaryle comprenant 1 à 4 atomes d'azote, R1 et R2 n'existent pas ;
R3 représente un groupement hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O-alkyl phosphatidylcholine, thiophosphate, phosphonium, NH2-R4, NHR4R5 ou NR4R5R6 dans lesquels R4, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle ou hydroxyalkyle linéaire ou ramifiée en C1-C5, ou - une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C30 éventuellement substituée par un groupe hydroxy , ou - un reste cyclodextrine, ou - un reste dans lequel V représente une liaison -O-,-S-, ou -NH-, R7 représente H ou CH3, et n= 1 à 500 , ou - un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel R8 représente un alkyle en C2-C30, et n = 1 à 500, ou - un groupe hétéroaryle renfermant 1 à 4 atomes d'azote, non substitué ou substitué par un alkyle en C2-C30, ou par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m = 1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à 7 atomes de carbone, non substitué ou substitué
par au moins un alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol, ou encore - R3 est lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique ou différent, d'un autre composé de formule (I), identique ou différent, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, avec ou sans co-lipide.
13. Composé de formule (I) dans laquelle X représente un atome d'oxygène ou de soufre, B représente une base purique ou pyrimidique telle que uracile, adénine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, ou leurs dérivés, ou encore une base hétérocylique mono-ou bi-cyclique non naturelle dont chaque cycle comporte 4 à
7 chaînons, éventuellement substituée ; et L1, L2, R1, R2 et R3 sont choisis parmi l'une des définitions suivantes :
- L1 représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène, R1 représente un groupe alkyle en C2-C30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy ; ou - L1 et L2 représentent un atome d'oxygène, R1 et R2 représentent l'hydrogène et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C2-C30, ou - L1 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L2 représente l'hydrogène, R1 représente un groupe alkyle en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy , ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C2-C30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R3 est un groupe ou un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R8 représente un alkyle en C2-C30, ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol , ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p= 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, ou - L1 représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène R1 représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C2-C30, et R3 est un groupement hydroxy.
7 chaînons, éventuellement substituée ; et L1, L2, R1, R2 et R3 sont choisis parmi l'une des définitions suivantes :
- L1 représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène, R1 représente un groupe alkyle en C2-C30 ou un groupe diacyl dans lequel chaque chaîne acyle est en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy ; ou - L1 et L2 représentent un atome d'oxygène, R1 et R2 représentent l'hydrogène et R3 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole substitué par un groupe alkyle en C2-C30, ou - L1 représente un groupe triazole, tétrazole, pyrazole ou imidazole, L2 représente l'hydrogène, R1 représente un groupe alkyle en C2-C30, et R3 est un groupe hydroxy , ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par une chaîne alkyle en C2-C30, éventuellement substituée par un groupe hydroxy, ou R3 est un groupe ou un groupe -(CH2)n-V-R8, dans lequel V représente -O- ou -NH- et R8 représente un alkyle en C2-C30, ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p = 0 à 10 et R9 représente un groupe cétal cyclique renfermant 5 à
7 atomes de carbone, non substitué ou substitué par au moins un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C2-C30 ou par un reste stérol , ou - L1 représente un groupe hydroxy, L2 représente l'hydrogène et R3 est un groupe triazole substitué par un groupe (CH2)m-O-(CH2)p-R9 dans lequel m =
1 à 6 et p= 0 à 10 lié par liaison covalente à un autre substituant R3, identique, d'un autre composé de formule (I), identique, pour former un composé de formule (I) sous forme de dimère, ou - L1 représente un groupe phosphate, L2 représente l'hydrogène R1 représente une chaîne diacyle dans laquelle chaque chaîne diacyle est en C2-C30, et R3 est un groupement hydroxy.
14. Composé de formule (I) dans laquelle - X, B, L2, R1 et R2 sont tels que définis dans la revendication 1;
- L1 ou R3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué ou substitué.
- L1 ou R3 est constitué de ou comporte un groupe triazole, non substitué ou substitué.
15. Nanoparticule comprenant un composé de formule (I) selon l'une des revendications 13 ou 14 et un agent thérapeutique.
16. Nanoparticule selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'agent thérapeutique est un agent anti-tumoral.
17. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 11, 12, 15 ou 16, caractérisée en ce que l'agent thérapeutique est choisi parmi le cis-platine, le carbopiatine, l'oxaliplatine, le nédaplatine et le lobaplatine.
18. Utilisation des nanoparticules selon l'une quelconque des l'une des revendications 11, 12, 15, 16 ou 17 pour le transport ou la vectorisation d'agent thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
19. Utilisation des nanoparticules selon l'une quelconque des l'une des revendications 11, 12, 15, 16 ou 17, pour la délivrance intracellulaire d'agents thérapeutiques, en particulier d'agents anti-tumoraux.
20. Utilisation des nanoparticules selon l'une quelconque des l'une des revendications 11, 12, 15, 16 ou 17, pour la préparation de médicaments anti tumoraux.
21. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 11, 12, 15, 16 ou 17 pour le traitement de maladies tumorales.
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