AT878U1 - Verfahren zur bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen aktivität - Google Patents

Description

AT 000 878 Ul

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der in vivo thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats.

Bei der Anwendung von parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparaten, insbesondere solchen Präparaten, welche von Plasma abgeleitet sind, .ist man immer wieder mit der Problematik von thrombotischen Nebenwirkungen konfrontiert.

Besonders bei der Anwendung von Prothrombinkomplexkonzentraten ist ein Thrombogenitätsrisiko immer gegeben, weshalb bei der Herstellung und Verwendung dieser Konzentrate stets darauf geachtet werden muß, nur Produkte für den Markt bereitzustellen bzw. am Patienten zu applizieren, bei welchen thrombotische Nebenwirkungen mit Sicherheit ausgeschlossen werden können.

In der Literatur sind zwei prinzipielle Hypothesen für die Ursache der Thrombogenität von Prothrombinkomplexpräparaten zu finden. Die eine Hypothese besagt, daß die Thrombogenität von Prothrombinkomplexkonzentraten mit dem Vorhandensein von aktivierten Prothrombinkomplexfaktoren, insbesondere Faktor IXa und Faktor Xa in Verbindung zu bringen ist (White et al., Blood 49 (1977), 159-170). Die zweite Hypothese schreibt pro-koagulatorischen Phospholipiden in Prothrombinkomplexkonzentraten einen wesentlichen Einfluß auf die Thrombogenität in vivo zu (Giles et al., Blood 59 (1982), 401-407).

Die Bestimmung einer thrombogenen Aktivität eines pharmazeutischen Präparates ist auf Grund der komplexen Mechanismen, welche zur Thrombenbildung führen, äußerst schwierig. In vitro-Tests, mit welchen eine verläßliche Aussage bezüglich der thrombogenen Wirkung in vivo erzielt werden kann, sind nicht bekannt; zur Untersuchung der thrombogenen Aktivität wird daher meist das sogenannte "Wessler-Modell" herangezogen.

Der von Wessler beschriebene Test (Journal of Applied Physio-logy 14 (6), (1959), 943-946) ist ein in vivo-Thrombosemodell in stasierendem venösen Blut. Dabei werden Kaninchen in Pentobarbi-talnarkose versetzt, worauf die Vena jugularis freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 1-2 cm versehen wird. Die zu testenden Substanzen werden den Tieren in die der freipräparierten Vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene injiziert. Die Injektion erfolgt innerhalb von 15 Sekunden. Nach einer Wartezeit von 10 bis 15 Sekunden wird das Venenstück abgeklemmt, nach weiteren 10 Mi- 2 AT 000 878 Ul nuten wird das abgeklemmte Venenstück entnommen und in einem Citratpuffer in eine Petrischale aufgeschnitten und die erhaltenen Thromben mittels einer Skala zwischen 0 (entspricht keiner Thrombenbildung) bis 4 (einen zusammenhängenden Thrombus) bewertet .

Dieses Modell wurde.seither bei der Evaluierung der antithrombotischen aber auch der thrombogenen Wirkung von einer Vielzahl von Arzneimitteln und Wirkstoffen verwendet. Es zeigte sich aber, daß, obwohl das Wessler-Modell sehr nützliche Informationen, beispielsweise zur antithrombotischen Aktivität von Heparin und dessen Derivaten liefern konnte, die erhaltenen Ergebnisse sehr stark von der Art des thrombogenen Mittels abhängen, welches beim Test verwendet wird. Es zeigte sich auch, daß die Sensitivität des Wessler-Modells in vielen Fällen nicht ausreichend war, so daß Präparate, welche nach dem Wessler-Modell als nicht-thrombogen eingestuft wurden, bei der Verabreichung an Patienten trotzdem thrombotische Nebenwirkungen zeigten.

Es wurde daher eine ganze Reihe von Verbesserungen des Wessler-Modells vorgeschlagen, beispielsweise Verwendung von anderen Narkosemitteln, anderen Injektionsmethoden, andere thrombogene Sensibilisierungen etc. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis 11 (2) (1985) 155-175).

Die beschriebenen Verbesserungen der Tiermodelle zur Bestimmung der thrombogenen Aktivität von pharmazeutischen Präparaten brachten zwar gewisse Fortschritte bei der Zuverlässigkeit dieser Methode, jedoch sind selbst diese verbesserten Tests oft noch zu wenig sensitiv, so daß eine thrombogene Aktivität eines pharmazeutischen Präparates in diesen Tests übersehen werden kann. Weiters ist die Art der thrombotischen Sensibilisierung und die Auswahl des prothrombogenen Mittels ("Thrombotic Challenge") stets ein kritischer Faktor für die Aussagekraft des Tests. Unter einem prothrombogenen Mittel versteht man eine Substanz, die in niedriger Dosierung gegeben und/oder für sich keine thrombogene Aktivität besitzt, aber in Kombination mit einem anderen Mittel die thrombogene Aktivität dieses anderen Mittels erhöht bzw. dessen prothrombogene Aktivität zu einer thrombogenen Aktivität umwandelt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren gemäß der eingangs erwähnten Art zur Verfügung zu stellen, welches 3 AT 000 878 Ul eine erhöhte Sensitiv!tat aufweist, einfach zu standardisieren ist und vorzugsweise zur Testung von Plasmaderivaten, insbesondere Prothrombinkomplexkonzentraten, aussagekräftig zu verwenden ist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats mit einem in vivo-Modell, welches Verfahren das Verabreichen des zu testenden Präparats an ein Testtier und das Messen von Parametern bei der Thrombenbildung umfaßt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Verabreichen des zu testenden Präparats mit dem Verabreichen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfak-tor kombiniert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht überraschenderweise eine empfindlichere Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität in einer pharmazeutischen Präparation, obwohl mit dem Zusatz von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gierinnungsfaktor, also mit Substanzen, welche eigentlich als hauptverantwortlich für die Thrombogenität von Prothrombinkomplexkon-zentraten angesehen werden, eigentlich zu erwarten gewesen wäre, daß durch die thrombogene Aktivität dieser Substanzen die Empfindlichkeit des Tests verringert wird.

Als parenteral verabreichbare pharmazeutische Präparate kommen prinzipiell alle Präparate in Frage, welche auf Grund ihrer Natur oder ihrer Herstellungsweise eine thrombogene Aktivität in einem Patienten zeigen können. Insbesondere sind zahlreiche von Blutplasma abgeleitete Präparate potentiell thrombogen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch auch zur Testung von potentiell thrombogenen chemisch synthetischen oder rekombinant hergestellten pharmazeutischen Präparaten.

Als Parameter der Thrombenbildung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Parameter umfaßt, welche direkt oder indirekt mit der Bildung von Thromben assoziiert sind. Das Messen von Parametern der Thrombenbildung umfaßt dabei insbesondere die visuelle Beurteilung gemäß oder modifiziert nach Wessler, aber auch die Blutprobenbestimmung (z.B. mit einem auf Fibrinogen bezogenen Test oder einem Nachweis von Aktivierungsmarken der Blutgerinnung, welche bei der Entstehung von Thromben bzw. Mikrothromben entstehen) .

Das Verabreichen der zu testenden Substanz und das Verabrei- 4 AT 000 878 Ul chen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor kann gleichzeitig, getrennt oder zeitlich abgestuft vorgenommen werden. Bevorzugt werden die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor der zu testenden Substanz vor dem Verabreichen zugemischt.

Vorzugsweise werden.die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor in einer nicht-thrombogenen Dosis bzw. in einer nur leicht thrombogenen Dosis verabreicht. Es ist jedoch auch möglich, das Verfahren mit höheren Dosen dieser Zusätze durchzuführen.

Besonders bevorzugte zu testende Präparate stellen Faktor IX enthaltende Präparate, wie z.B. (partielle) Prothrombinkomplexkonzentrate, dar.

Vorzugsweise wird erfindungsgemäB die thrombogene bzw. antithrombotische Aktivität eines Präparats bestimmt, welches einen oder mehrere Blutgerinnungsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe der Prothrombinkomplexfaktoren bestehend aus Prothrombin Faktor IX, Faktor X und Faktor VII, enthält, insbesondere wenn das Präparat ausgehend von Blutplasma hergestellt worden ist. Die zu testenden Präparate können auch aktivierte Gerinnungsfaktoren enthalten.

Eine besondere Ausführungsform ist aber die Testung von inaktiven Gerinnungsfaktoren, welche üblicherweise durch Derivatisierung, Fragmentierung, Mutation oder Inaktivierung eines aktiven Gerinnungsfaktors hergestellt sind. Diese inaktiven Gerinnungsfaktoren treten in Konkurrenz mit den aktiven Gerinnungsfaktoren und werden als antithrombotisch wirksame Mittel vorgeschlagen (siehe beispielsweise WO 92/04378, US 5 120 537, W 93/09804, WO 93/18782, US 5 288 629, WO 94/27631). Solche Präparate müssen besonders streng auf mögliche thrombogene Verunreinigungen überwacht werden.

Als in vivo-Modell wird bevorzugt eine Stase-Modell, wie das von Wessler beschriebene Kaninchenmodell, verwendet. Gleichwohl sind aber andere Modelle, wie DIC-Modelle (z.B., von Jones und Kiesow, Infection and Immunity, 10, 1343-1349 (1974)) oder solche, bei denen andere Tierspezies Verwendung finden, ebenfalls als geeignet im Sinne der vorliegenden Erfindung anzusehen.

Die Phospholipide, welche kombiniert mit der zu testenden Substanz verabreicht werden, sollten vorzugsweise in vesikulärer Form vorliegen, um eine ausreichende Stabilität zu gewährleisten. Vorzugsweise enthalten diese Phosphatidylserin und gegebenenfalls 5 AT 000 878 Ul

Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin. Diese Ausführungsform hat sich als besonders zweckmäßig bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erwiesen, weil negativ geladene Phospholipide die Calcium mediierte Assoziation der Prothrombinkomplexfaktoren im Zuge der Blutgerinnung auch beim thrombotischen Geschehen im Menschen bewirken.

Die Phospholipide werden vorzugsweise in einer Dosis im Bereich von 1 bis 10 000 nM Phosholipide/kg Körpergewicht verabreicht, da dies gerade den Konzentrationsbereich darstellt, in welchem die Phospholipide prothrombogen sind.

Ein zum kombinierten Verabreichen mit dem Testpräparat besonders bevorzugter aktivierter Gerinnungsfaktor im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist Faktor Xa. Dieser sollte möglichst in reine Form, d.h. mit einer hohen spezifischen Aktivität von wenigstens 100 E Faktor Xa/mg Protein bzw. in einer Dosis im Bereich von 0,2 bis 20 E Faktor Xa/kg Körpergewicht verabreicht werden.

Es hat sich gezeigt, daß, wenn die zu testenden Präparate gewisse Konzentrationen an Heparin und/oder Antithrombin XII enthalten, ein thrombogenes Potential durch das vorhandene Heparin maskiert wird. Um daher eine noch sicherere Testung der thrombogenen Aktivität eines Präparats zu gewährleisten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dieses Heparin entsprechend seinem Gehalt mit Protaminsülfat neutralisiert. Dadurch wird es möglich, daß durch das Heparin maskierte thrombo-gene Potential einer pharmazeutischen Präparation noch besser zu erkennen.

Insbesondere kann damit auch festgestellt werden, bei welchen Präparationen die Zugabe eines antithrombotischen Mittels, wie Heparin, und welche Konzentration zur Sicherung des entsprechenden Präparats essentiell ist und bei welchen Präparationen die Anwesenheit von Heparin nicht notwendig ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität eines in vivo-Tests zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats, wobei das Verabreichen des zu testenden Präparats an ein Testtier mit dem Verabreichen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor kombiniert wird. 6 AT 000 878 Ul

Gemäß einem weiteren Aspekt: betrifft die Erfindung auch einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, welcher zumindest Phospholipide und/oder einen oder mehrere aktivierte Gerinnungsfaktoren umfaßt. Die Komponenten des Testkits können dabei in geeigneten Behältern, vorzugsweise in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden.

Vorzugsweise enthält der Testkit auch ein geeignetes Säugetier als Versuchstier. Als bevorzugte Säugetiere haben sich Kleintiere, insbesondere Kaninchen, Ratten oder Mäuse herausgestellt, jedoch sind auch Primaten, welche naturgemäß ein dem Menschen nahe verwandtes Blutgerinnungssystem aufweisen, besonders bevorzugte Versuchstiere .

Die Phospholipide und/oder der oder die aktivierten Gerinnungsfaktoren sollten im Kit, vorzugsweise in Mengen oder Konzentrationen bereitgestellt werden, die das Verabreichen einer pro-thrombogenen Dosis an das Versuchstier gestatten.

Der Kit kann weitere für die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode benötigte Materialien enthalten, wie z.B. Applikationsvorrichtungen, Präparationsmaterialien für die Versuchstiere, Verdünnungspuffer oder thrombogene Referenzlösungen bzw. Lyophilisate.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch in hervorragender Weise zur verantwortungsbewußten Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung von pharmazeutischen Zwischen- bzw. Endprodukten, wobei das Fehlen von thrombogenen bzw. antithrombotischen Verunreinigungen chargenweise getestet werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch dazu verwendet werden, die erwünschte antithrombotische Wirkung eines Testpräparates, wie z.B. ein Präparat enthaltend einen inaktiven Gerinnungsfaktor, Heparin oder Hiridin, zu kontrollieren. Dabei wird das Tier erfindungsgemäß mit Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor, gegebenenfalls mit einer weiteren thrombogenen Substanz, so weit behandelt, daß an sich durch diese Sustanz(en) eine Thrombose hervorgerufen werden würde. Die kombinierte Verabreichung dieser Sustanz(en) mit einem antithrombotisch wirksamen Testpräparat verhindert jedoch die Thrombose in dem Ausmaß einer antithrombotischen Aktivität.

Ebenso kann festgestellt werden, welche Schritte in einem Herstellungsverfahren verantwortlich für mögliche thrombogene bzw. 7 AT 000 878 Ul anti-thrombotische Verunreinigungen sein könnten und gegebenenfalls die Notwendigkeit von Vorsichtsmaßnahmen entweder im Herstellungsprozeß oder am Endprodukt anzeigen.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparaten, welches ein oder mehrere erfindungsgemäße Thrombogenizitätstests als Qualitätssicherungsschritte umfaßt.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert.

Material und Methoden:

Ein in Bezug auf thrombotische Nebenwirkungen sicheres Präparat, nämlich ein auf Faktor II, VII, IX und X eingestelltes PPSB-Konzentrat (Prothromplex S-TIM 4 der Fa. Immuno) und ein partieller Faktor II, IX und X enthaltender Prothrombinkomplex wurden jeweils mit einem gereinigten Beta-Faktor Xa oder einer gerinnungsaktiven Phospholipidpräparation versetzt- Diese Mischungen wurden dann im Kaninchen in einem modifizierten Stase-Modell nach Wessler auf Thrombogenität getestet.

Die Zusammensetzung des PPSB-Konzentrates sowie des partiellen Prothrombinkomplexes ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die Präparate enthielten in einer ähnlichen Dimension auch die Vitamin K-abhän-gigen Gerinnungsfaktoren Protein C und Protein S. 8 AT 000 878 Ul

Tabelle la

ZusammensetzungPROTHROMPLEX® S-TIM 4 PPSB-Konzentrat

Packungsgröße 1 Durchstechflasche enthält: 200 600 Faktor II (IE) * 200 600 Faktor VII (IE)* 170 500 Faktor IX (IE) * 200 600 Faktor X (IE)* 200 600 Heparin (IE) 85 250 Antithrombin III (IE) 5-10 15-30 Lösevolumen (ml) 20 20 * 1 IE Faktor II, IX, X (gemäß WHO-Standard 84/681) und 1 IE Faktor VII (gemäß WHO-Standard 84/665) entsprechen der Aktivität des jeweiligen Faktors in 1 ml frischem Normalplasma.

Tabelle lb

Zusammensetzung Partieller Prothrombinkomplex

Packungsgröße 240 600 1200 1 Durchstechflasche enthält: Faktor IX (IE) * 200 600 1200 Faktor II (IE)* 240 600 1200 Faktor X (IE) * 240 600 1200 Protein (mg) 80 - 240 200 - 600 400-1200 Heparin (IE) <30 < 75 <150 Lösevolumen (ml) 10 10 20 * 1 IE Faktor II, IX, X (gemäß WHO-Standard 84/681) entsprechen der Aktivität des jeweiligen Faktors in 1 ml frischem Normalplasma. 9 AT 000 878 Ul

Als Faktor Xa-Quelle diente eine gemäß DE 4 325 872 hergestellte Präparation, die aus einem Faktor X gewonnen wurde, der durch mehrere chromatographische Schritte aus einem Zwischenprodukt der Herstellung des partiellen Prothrombinkomplexes gereinigt worden war. Diese Präparation wurde mit Rüssels's Viper Venom (RW) aktiviert, durch Affinitätschromatographie weiter gereinigt und zu einer stabilen Beta-Faktor Xa-Präparation umgewandelt, die elektrophoretisch homogen war und eine spezifische Aktivität von etwa 2300 E/mg Protein aufwies.

Gerinnungsaktive Phospholipide wurden mittels einer Extrusionsmethode aus den synthetischen Phospholipidkomponenten 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoserin im molaren Verhältnis von 80 : 20 hergestellt. Aus diesem Prozeß resultierten Phospholipidvesikel mit einem mittleren Durchmesser von 100 nm.

Dieser Durchmesser wurde mittels dynamischer Laserlichtstreuung gemessen und konnte auch im Elektronenmikroskop nachgewiesen werden.

Zum Nachweis, daß die Phospholipidvesikel bzw. der Beta-Faktor Xa tatsächlich gerinnungsaktive Eigenschaften aufweisen, wurden beide Substanzen in einem nicht aktivierten partiellen Thrombo-plastinzeittest eingesetzt. Gleiche Teile eines Tris-Puffers und eines Normalplasmas wurden recalcifiziert und die Gerinnung durch Zugabe von einerseits Beta-Faktor Xa oder andererseits Phospholipiden oder Mischungen derselben gestartet. Die Gerinnungszeiten aus diesem Experiment sind in tabellarischer sowie graphischer Form Fig. 1 zu entnehmen.

Es zeigte sich, daß Phospholid einen konzentrationsabhängig vergleichsweise moderaten, aber nachweisbaren, verkürzenden Effekt auf die Gerinnungszeit hat, Beta-Faktor Xa aber eine deutliche Gerinnungszeitverkürzung hervorruft. Bei Mischungen von steigenden Phosholipidkonzentrationen in Kombination mit verschiedenen Faktor Xa-Mengen potenziert sich die Wirkung von Beta-Faktor Xa und Phospholipid. Für das eigentliche Bestimmungsverfahren wurden Kaninchen mit Pentobarbital narkotisiert, dann unter zusätzlicher Lokalanästhesie die Vena jugularis freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 2 cm versehen. Schließlich wurden die zu testenden Substanzen in der der Vena jugularis gegenüberliegenden Ohrvene 10 AT 000 878 Ul innerhalb von 15 Sekunden injiziert. Dabei sollte beachtet werden, daß die Injektion ein Dosisvolumen von 10 ml/kg Körpergewicht nicht übersteigt. Nach weiteren 25 Sekunden wurden die Ligaturen zugezogen.und 10 Minuten gewartet, bis das abgebundene Venenstück entnommen und in einer mit Citratpuffer gefüllten Petrischale auf-geschnitten und bewertet wurde. Die Bewertungskriterien modifiziert nach Wessler sind Tabelle 2 zu entnehmen.

Tabelle 2 THROMBOSEGRAD BEWERTUNG keine Thrombenbildung 0 wenige kleine Thromben 0,5-1 wenige mittelgroße und 2 viele kleine Thromben viele mittelgroße Thromben 3 wenige große Thromben 3,5 ein zusammenhängender Thrombus 4 modifiziert nach Wessler S. et al., J. Appt.PhysioL 14:943-946 (1959)

Beispiel :

Im vorliegenden Modell wurden dann die Prothrombinkomplexkonzentrate in einer Dosis von 200 E/kg Körpergewicht bezogen auf Faktor IX untersucht. Dies ist mehr als die doppelte Dosis, welche gemäß Dosisempfehlung des Herstellers maximal verabreicht werden soll. Die beiden Präparationen wurden jeweils mit Phospholipid gemischt, so daß sich Dosen bis zu 10000 nM/kg ergaben; ebenso wurden die Präparate mit Beta-Faktor Xa in Dosen bis zu 20 E/kg gemischt.

Anschließend wurden die mittleren Wessler-Scores jeweils aus sechs oder mehr Tieren pro Gruppe untersucht. Die Ergebnisse sind 11 AT 000 878 Ul in den Tabellen 3 bis 6 dargestellt:.

Bei partiellem Prothrombinkomplex wurde folgendes Resultat er zielt:

Tabelle 3

Partieller Prothrombinkomplex und gerinnungsaktives Phospholipid FIX Phospholipid (nM/kg) mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler (IE/kg) 0 1 10 100 1000 10000 0 0,2 n.d. 0 0,5 0 0,5 200 0,1 0,2 0,3 0,6 0,2 0,3 200 nach Heparin- 0,7 1,2 0,5 1,0 1,2 3,2 neutralisation 12 AT 000 878 Ul

Tabelle 4 (IE/kg) 0 0,02 0,2 2 20 0 0,2 Q 0,7 0,2 2,2 200 0,7 0,5 0,7 0,7 0,8 200 nach Heparin- 0,5 0,5 0,8 0,8 1,8 neutralisation

Partieller Prothrombinkomplex und Faktor Xaß FIX Faktor Xaß (E/kg) mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler

Der Zusatz von gerinnungsaktivem Phospholipid (Tabelle 3) führt bei einer Dosis von 200 E Faktor IX/kg Körpergewicht zu keiner Erhöhung der Thrombogenität, auch nicht in den höchsten Konzentrationen. Als Kontrolle wurde ein Tris-Puffer oder eine isoto-ne Kochsalzlösung zugegeben. Es ist zu beachten, daß alle Thrombo-genitäts-Scores unter 1 als negativ einzustufen sind.

In einer weiteren Versuchsreihe wurde zum Zwecke der Heparinneutralisation den zu testenden Präparaten Protaminsulfat als heparinneutralisierendes Agens zugegeben und in analoger Weise Mischungen von Prothrombinkomplex mit Phospholipid bzw. Faktor Xa an die Versuchstiere verabreicht (siehe jeweils letzte Zeile der Tabellen).

Es zeigte sich, daß selbst nach Heparinneutralisation keine nennenswerte Zunahme der Thrombogenität zu erkennen ist, lediglich bei der höchsten Konzentration, nämlich 10000 nM Phospholipid/kg steigt der Thrombosegrad auf 3,2 an. Es zeigte sich auch (siehe Tabelle 4), daß die höchste Konzentration von Faktor Xa, die ohne Zusatz des Präparats einen mittleren Thrombosegrad von 2,2 auf-wies, in der Mischung durch das vorhandene Heparin maskiert wurde. Nach Heparinneutralisation ist dieser Effekt wieder aufgehoben, was allerdings in den niedrigeren Dosen nicht zu einer Steigerung der Thrombogenität führt. 13 AT 000 878 Ul

Mit dem PPSB-Konzentrat wurden folgende Resultate erzielt: Tabelle 5 PROTHROMPLEX® S-TIM 4 undgerinnungsaktives Phospholipid FIX Phospholipid (nM/kg) (lE/kg) 0 1 10 100 1000 10000 0 0,2 n.d. 0 0,5 0 0,5 200 0,3 0,3 0,5 0,1 0,2 0,2 200 nach Heparinneutralisation 2,6 3,3 3,5 3,8 3-,7 4,0 mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler

Tabelle 6

PROTHROMPLEX® S-TIM 4 und Faktor XaB FIX Faktor Xae (E/kg) (lE/kg) 0 0,02 0,2 2 20 0 0,2 0 0,7 0,2 2,2 200 0,3 0,3 0,5 0,3 0,3 200 nach Heparin- 2,6 3,3 3,7 3,6 3,6 neulralisation mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler 14 AT 000 878 Ul

Der Zusatz von Phospholipid (siehe Tabelle 5) führt in keiner der eingesetzten Konzentrationen zu einer Erhöhung der Thromboge-nität. Wenn aber Heparin entsprechend seinem Gehalt mit Protaminsulfat neutralisiert wird, wird ein thrombogenes Potential im Kaninchen erkennbar, welches durch Zusatz von Phospholipid konzentrationsabhängig gesteigert werden kann.

Analog dazu zeigte Faktor Xa alleine in der höchsten Konzentration wieder eine leichte Thrombogenität (siehe Tabelle 6). In der Mischung mit dem Prothrombinkomplex ist jedoch dieser Effekt bedingt durch das Vorhandensein von Heparin/Antithrombin III nicht erkennbar. Der Zusatz von Faktor Xa bringt erst und ausschließlich in jenen Proben, bei welchen das enthaltene Heparin neutralisiert wurde, eine Steigerung der Thrombogenität.

Die vorliegenden Beispiele zeigen eindeutig, daß durch die erfindungsgemäße Vorgangsweise die Empfindlichkeit von herkömmlichen Thrombogenitätstests deutlich erhöht werden konnte.

Es zeigte sich auch, daß der Gehalt an Heparin bzw. der Zusatz von Heparin während der Aufarbeitung, insbesondere bei PPSB-Präpa-raten, essentiell für ihre Thrombosesicherheit ist. Durch den Zusatz von gerinnungsaktivem Phospholipid oder einem aktivierten Prothrombinkomplexfaktor, nämlich Faktor Xa, konnte in realistischen Konzentrationen das thrombogene Potential einer für sich sicheren Prothrombinkomplexpräparation nicht gesteigert werden.

Da der Gehalt an Faktor Xa in den eingesetzten Prothrombinkomplexpräparaten zumeist unter der Nachweisgrenze liegt, entzog dieser sich bisher der Bestimmung in Thrombogenitätstests. Erst mit der vorliegenden Untersuchungsmethode kann verläßlich ausgesagt werden, daß sich die den Kaninchen applizierten und den Prothrombinkomplexpräparaten zugesetzten Faktor Xa-Mengen beispielsweise bis zu zwei Zehnerpotenzen über jener Konzentration, die theoretisch im Präparat enthalten sein könnte, befinden. Ähnliches gilt selbstverständlich auch für den Gehalt an gerinnungsaktivem Phospholipid.

Dies zeigt, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren in hervorragender Weise auch für die Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung der Zwischen- und Endprodukte von Präparaten mit potentiellem Thrombogenitätsrisiko eignet. 15

Claims (17)

1. AT 000 878 Ul Ansprüche : 1. Verfahren zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats mit einem in vivo-Modell, welches Verfahren das Verabreichen des zu testenden Präparats an ein Testtier und das Messen von Parametern einer Thrombose umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Verabreichen des zu testenden Präparats mit dem Verabreichen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor kombiniert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor in einer nicht thrombogenen Dosis verabreicht werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor in einer schwach thrombogenen Dosis verabreicht werden.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die thrombogene bzw. antithrombotische Aktivität eines Faktor IX enthaltenden Präparats bestimmt wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die thrombogene bzw. anti thrombotische Aktivität eines Präparats bestimmt wird, welches einen oder mehrere Blutge-rinnungsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Prothrombin, Faktor X und Faktor VII, enthält.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als in vivo-Modell ein Stase-Modell, wie das Wessler-Modell, verwendet wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in vesikulärer Form vorliegende Phospholipide, welche Phosphatidylserin und gegebenenfalls Phosphatidylcholin enthalten, verwendet werden. 16 AT 000 878 Ul
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide in einer Dosis im Bereich von 1 bis 10000 nM Phospholipide/kg verabreicht werden.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als aktivierter Gerinnungsfaktor Faktor Xa, vorzugsweise mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 100 E Faktor Xa/mg, verabreicht wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Faktor Xa in einer Dosis im Bereich von 0,2 bis 20 E Faktor Xa/kg verabreicht wird.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in dem zu testenden Präparat gegebenenfalls vorhandenes Heparin vor der Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität neutralisiert wird.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor gemeinsam mit dem zu testenden Präparat verabreicht werden.
13. 13. Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität eines in vivo-Tests zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats, dadurch gekennzeichnet, daß das Verabreichen des zu testenden Präparats an ein Testtier mit dem Verabreichen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor kombiniert wird.
14. 14. Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats umfassend - Phospholipide und/oder - einen oder mehrere aktivierte Gerinnungsfaktoren.
15. 15. Testkit nach Anspruch 14, welcher zusätzlich ein geeignetes Säugetier als Versuchstier enthält. 17 AT 000 878 Ul
16. 16. Kit: nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Phospholipide und/oder der oder die aktivierten Gerinnungsfaktoren in Konzentrationen bereitgestellt werden, die für eine prothrombogene Dosis in dem Versuchstier geeignet sind.
17. 17. Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Qualitäts-kontrollschritt(e) umfaßt. 18