DE29602276U1 - Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität - Google Patents
Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen AktivitätInfo
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Description
Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität
Die Erfindung betrifft ein Testkit zur Bestimmung der in vivo thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral
verabreichbaren pharmazeutischen Präparats.
Bei der Anwendung von parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparaten, insbesondere solchen Präparaten, welche von
Plasma abgeleitet sind, ist man immer wieder mit der Problematik von thrombotisehen Nebenwirkungen konfrontiert.
Besonders bei der Anwendung von Prothrombinkomplexkonzentraten ist ein Thrombogenitätsrisiko immer gegeben, weshalb bei der
Herstellung und Verwendung dieser Konzentrate stets darauf geachtet werden muß, nur Produkte für den Markt bereitzustellen
bzw. am Patienten zu applizieren, bei welchen thrombotische Nebenwirkungen mit Sicherheit ausgeschlossen werden können.
In der Literatur sind zwei prinzipielle Hypothesen für die Ursache
der Thrombogenität von Prothrombinkomplexpräparaten zu finden. Die eine Hypothese besagt, daß die. Thrombogenität von
Prothrombinkomplexkonzentraten mit dem Vorhandensein von aktivierten Prothrombinkomplexfaktoren, insbesondere Faktor IXa und
Faktor Xa in Verbindung zu bringen ist (White et al., Blood 49 (1977), 159-170). Die zweite Hypothese schreibt pro-koagulatorischen
Phospholipiden in Prothrombinkomplexkonzentraten einen wesentlichen Einfluß auf die Thrombogenität in vivo zu (Giles et
al., Blood 59 (1982), 401-407).
Die Bestimmung einer thrombogenen Aktivität eines pharmazeutischen
Präparates ist auf Grund der komplexen Mechanismen, welche zur Thrombenbildung führen, äußerst schwierig. In vitro-Tests,
mit welchen eine verläßliche Aussage bezüglich der thrombogenen Wirkung in vivo erzielt werden kann, sind nicht bekannt; zur
Untersuchung der thrombogenen Aktivität wird daher meist das
sogenannte "Wessler-Modell" herangezogen.
Der von Wessler beschriebene Test (Journal of Applied Physiology
14 (6), (1959), 943-946) ist ein in vivo-Thrombosemodell in stasierendem
venösen Blut. Dabei werden Kaninchen in Pentobarbitalnarkose versetzt, worauf die Vena jugularis freipräpariert und
mit losen Ligaturen im Abstand von 1-2 cm versehen wird. Die zu testenden Substanzen werden den Tieren in.die der freipräparierten
Vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene injiziert. Die Injektion erfolgt innerhalb von 15 Sekunden. Nach einer Wartezeit
von 10 bis 15 Sekunden wird das Venenstück abgeklemmt, nach weiteren 10 Minuten wird das abgeklemmte Venenstück entnommen und
in einem Citratpuffer in eine Petrischale aufgeschnitten und die erhaltenen Thromben mittels einer Skala zwischen 0 (entspricht
keiner Thrombenbildung) bis 4 (einen zusammenhängenden Thrombus) bewertet.
Dieses Modell wurde seither bei der Evaluierung der antithrombotischen
aber auch der thrombogenen Wirkung von einer Vielzahl von Arzneimitteln und Wirkstoffen verwendet. Es zeigte sich
aber, daß, obwohl das Wessler-Modell sehr nützliche Informationen, beispielsweise zur antithrombotisehen Aktivität von Heparin
und dessen Derivaten liefern konnte, die erhaltenen Ergebnisse sehr stark von der Art des thrombogenen Mittels abhängen, welches
beim Test verwendet wird. Es zeigte sich auch, daß die Sensitivität des Wessler-Modells in vielen Fällen nicht ausreichend
war, so daß Präparate, welche nach dem Wessler-Modell als nicht-thrombogen eingestuft wurden, bei der Verabreichung an
Patienten trotzdem thrombotische Nebenwirkungen zeigten.
Es wurde daher eine ganze Reihe von Verbesserungen des Wessler-Modells
vorgeschlagen, beispielsweise Verwendung von anderen Narkosemitteln, anderen Injektionsmethoden, andere thrombogene
Sensibilisierungen etc. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis 11 (2) (1985) 155-175).
Die beschriebenen Verbesserungen der Tiermodelle zur Bestimmung der thrombogenen Aktivität von pharmazeutischen Präparaten
brachten zwar gewisse Fortschritte bei der Zuverlässigkeit dieser Methode, jedoch sind selbst diese verbesserten Tests oft
noch zu wenig sensitiv, so daß eine thrombogene Aktivität eines pharmazeutischen Präparates in diesen Tests übersehen werden
kann. Weiters ist die Art der thrombotischen Sensibilisierung und die Auswahl des prothrombogenen Mittels ("Thrombotic
Challenge") stets ein kritischer Faktor für die Aussagekraft des Tests. Unter einem prothrombogenen Mittel versteht man eine
Substanz, die in niedriger Dosierung gegeben und/oder für sich keine thrombogene Aktivität besitzt, aber in Kombination mit
einem anderen Mittel die thrombogene Aktivität dieses anderen Mittels erhöht bzw. dessen prothrombogene Aktivität zu einer
thrombogenen Aktivität umwandelt.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testkit gemäß der eingangs erwähnten Art zur Verfügung zu stellen, mit
welchem ein in vivo-Verfahren zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität durchgeführt werden kann, welches
Verfahren eine erhöhte Sensitivität aufweist, einfach zu standardisieren ist und vorzugsweise zur Testung von Plasmaderivaten,
insbesondere Prothrombinkomplexkonzentraten, aussagekräftig zu verwenden ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral
verabreichbaren pharmazeutischen Präparats mit einem in vivo-Modell, welches Testkit zumindest Phospholipide und/oder einen
oder mehrere aktivierte Gerinnungsfaktoren umfaßt. Die Komponenten
des Testkits können dabei in geeigneten Behältern, vorzugsweise in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden.
Vorzugsweise enthält das Testkit auch ein geeignetes Säugetier als Versuchstier. Als bevorzugte Säugetiere haben sich Kleintiere,
insbesondere Kaninchen, Ratten oder Mäuse herausgestellt, jedoch sind auch Primaten, welche naturgemäß ein dem Menschen
nahe verwandtes Blutgerinnungssystem aufweisen, besonders bevorzugte Versuchstiere.
• ·
Die Phospholipide und/oder der oder die aktivierten Gerinnungsfaktoren
sollten im Kit, vorzugsweise in Mengen oder Konzentrationen bereitgestellt werden, die das Verabreichen einer prothrombogenen
Dosis an das Versuchstier gestatten.
Das Kit kann weitere für die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode benötigte Materialien enthalten, wie z.B. Applikationsvorrichtungen,
Präparationsmaterialien für die Versuchstiere, Verdünnungspuffer oder thrombogene Referenzlösungen bzw. Lyophilisate.
Das zu testende Präparat wird an das Tier verabreicht, wobei das Verabreichen des zu testenden Präparats mit dem Verabreichen von
Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor kombiniert
wird. Anschließend werden beim Testtier in bekannter Weise Parameter bei der Thrombenbildung gemessen und analysiert.
Das mit dem erfindungsgemäßen Testkit durchzuführende Verfahren ermöglicht überraschenderweise eine empfindlichere Bestimmung
der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität in einer pharmazeutischen Präparation, obwohl mit dem Zusatz von Phospholipiden
und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor, also mit
Substanzen, welche eigentlich als hauptverantwortlich für die Thrombogenität von Prothrombinkomplexkonzentraten angesehen
werden, eigentlich zu erwarten gewesen wäre, daß durch die thrombogene Aktivität dieser Substanzen die Empfindlichkeit des
Tests verringert wird.
Als parenteral verabreichbare pharmazeutische Präparate kommen prinzipiell alle Präparate in Frage, welche auf Grund ihrer
Natur oder ihrer Herstellungsweise eine thrombogene Aktivität in einem Patienten zeigen können. Insbesondere sind zahlreiche von
Blutplasma abgeleitete Präparate potentiell thrombogen. Das mit dem erfindungsgemäßen Testkit durchzuführende Verfahren eignet
sich jedoch auch zur Testung von potentiell thrombogenen chemisch synthetischen oder rekombinant hergestellten pharmazeutischen
Präparaten.
Als Parameter der Thrombenbildung werden im Rahmen der vorlie-
genden Erfindung alle Parameter umfaßt, welche direkt oder indirekt
mit der Bildung von Thromben assoziiert sind. Das Messen von Parametern der Thrombenbildung umfaßt dabei insbesondere die
visuelle Beurteilung gemäß oder modifiziert nach Wessler, aber
auch die · Blutprobenbestimmung (z.B. mit einem auf Fibrinogen bezogenen Test oder einem Nachweis von Aktivierungsmarken der
Blutgerinnung, welche bei der Entstehung von Thromben bzw. Mikrothromben entstehen).
Das Verabreichen der zu testenden Substanz und das Verabreichen von Phospholipiden und/oder einem aktivierten Gerinnungsfaktor
kann gleichzeitig, getrennt oder zeitlich abgestuft vorgenommen werden. Bevorzugt werden die Phospholipide und/oder der aktivierte
Gerinnungsfaktor der zu testenden Substanz vor dem Verabreichen
zugemischt.
Vorzugsweise werden die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor in einer nicht-thrombogenen Dosis bzw. in einer
nur leicht thrombogenen Dosis verabreicht. Es ist jedoch auch möglich, das Verfahren mit höheren Dosen dieser Zusätze durchzuführen.
Besonders bevorzugte zu testende Präparate stellen Faktor IX enthaltende Präparate, wie z.B. (partielle) Prothrombinkomplexkonzentrate,
dar.
Vorzugsweise wird erfindungsgemäß die thrombogene bzw. antithrombotische
Aktivität eines Präparats bestimmt, welches einen oder mehrere Blutgerinnungsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe
der Prothrombinkomplexfaktoren bestehend aus Prothrombin Faktor IX, Faktor X und Faktor VII, enthält, insbesondere wenn das
Präparat ausgehend von Blutplasma hergestellt worden ist. Die zu testenden Präparate können auch aktivierte Gerinnungsfaktoren
enthalten. Eine besondere Ausführungsform ist aber die Testung von inaktiven Gerinnungsfaktoren, welche üblicherweise durch
Derivatisierung, Fragmentierung, Mutation oder Inaktivierung eines aktiven Gerinnungsfaktors hergestellt sind. Diese inaktiven
Gerinnungsfaktoren treten in Konkurrenz mit den aktiven Ge-
rinnungsfaktoren und werden als antithrombotisch wirksame Mittel
vorgeschlagen (siehe beispielsweise WO 92/04378, US 5 120 537, W 93/09804, WO 93/18782, US 5 288 629, WO 94/27631). Solche
Präparate müssen besonders streng auf mögliche thrombogene Verunreinigungen überwacht werden.
Als in vivo-Modell wird bevorzugt eine Stase-Modell, wie das von
Wessler beschriebene Kaninchenmodell, verwendet. Gleichwohl sind aber andere Modelle, wie DIC-Modelle (z.B., von Jones und
Kiesow, Infection and Immunity, 10, 1343-1349 (1974)) oder solche, bei denen andere Tierspezies Verwendung finden, ebenfalls
als geeignet im Sinne der vorliegenden Erfindung anzusehen.
Die Phospholipide, welche kombiniert mit der zu testenden Substanz
verabreicht werden, sollten vorzugsweise in vesikulärer Form vorliegen, um eine ausreichende Stabilität zu gewährleisten.
Vorzugsweise enthalten diese Phosphatidylserin und gegebenenfalls Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin.
Diese Ausführungsform hat sich als besonders zweckmäßig für das
erfindungsgemäße Testkit erwiesen, weil negativ geladene Phospholipide
die Calcium mediierte Assoziation der Prothrombinkomplexfaktoren im Zuge der Blutgerinnung auch beim thrombotischen
Geschehen im Menschen bewirken.
Die Phospholipide werden vorzugsweise in einer Dosis im Bereich von 1 bis 10 000 nM Phosholipide/kg Körpergewicht verabreicht,
da dies gerade den Konzentratronsbereich darstellt, in welchem die Phospholipide prothrombogen sind.
Ein zum kombinierten Verabreichen mit dem Testpräparat besonders bevorzugter aktivierter Gerinnungsfaktor im Rahmen der vorliegenden
Erfindung ist Faktor Xa. Dieser sollte möglichst in reine Form, d.h. mit einer hohen spezifischen Aktivität von wenigstens
100 E Faktor Xa/mg Protein bzw. in einer Dosis im Bereich von 0,2 bis 20 E Faktor Xa/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Es hat sich gezeigt, daß, wenn die zu testenden Präparate gewisse Konzentrationen an Heparin und/oder Antithrombin III ent-
halten, ein thrombogenes Potential durch das vorhandene Heparin maskiert wird. Um daher eine noch sicherere Testung der thrombogenen
Aktivität eines Präparats zu gewährleisten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
dieses Haparin entsprechend seinem Gehalt mit Protaminsulfat neutralisiert. Dadurch wird es möglich, daß durch das Heparin
maskierte thrombogene Potential einer pharmazeutischen Präparation noch besser zu erkennen.
Insbesondere kann damit auch festgestellt werden, bei welchen Präparationen die Zugabe eines antithrombotischen Mittels, wie
Heparin, und welche Konzentration zur Sicherung des entsprechenden Präparats essentiell ist und bei welchen Präparationen die
Anwesenheit von Heparin nicht notwendig ist.
Das erfindungsgemäße Testkit eignet sich auch zur Durchführung eines Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität eines in vivo-Tests
zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen
Präparats.
Weiters eignet sich das erfindungsgemäße Testkit auch in hervorragender
Weise zur verantwortungsbewußten Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung von pharmazeutischen Zwischen- bzw. Endprodukten,
wobei das Fehlen von thrombogenen bzw. antithrombotischen Verunreinigungen chargenweise getestet werden kann.
Das erfindungsgemäße Testkit kann aber auch dazu verwendet werden,
die erwünschte antithrombotische Wirkung eines Testpräparates, wie z.B. ein Präparat enthaltend einen inaktiven Gerinnungsfaktor,
Heparin oder Hiridin, zu kontrollieren. Dabei wird das Tier erfindungsgemäß mit Phospholipiden und/oder einem aktivierten
Gerinnungsfaktor, gegebenenfalls mit einer weiteren thrombogenen Substanz, so weit behandelt, daß an sich durch diese
Sustanz(en) eine Thrombose hervorgerufen werden würde. Die kombinierte Verabreichung dieser Sustanz(en) mit einem antithrombotisch
wirksamen Testpräparat verhindert jedoch die Thrombose in dem Ausmaß einer antithrombotischen Aktivität.
Ebenso kann festgestellt werden, welche Schritte in einem Herstellungsverfahren
verantwortlich für mögliche thrombogene bzw. antithrombotische Verunreinigungen sein könnten und gegebenenfalls
die Notwendigkeit von Vorsichtsmaßnahmen entweder im Herstellungsprozeß oder am Endprodukt anzeigen.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher parenteral verabreichbare pharmazeutische Präparate, welche
unter Verwendung eines oder mehrerer Thrombogenizitätstests mit dem erfindungsgemäßen Testkit als Qualitätssicherungsschritte
erhältlich sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Testsystem zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen
Aktivität einer Substanz oder zur Erhöhung der Sensitivität eines in vivo-Tests zur Bestimmung der thrombogenen bzw.
antithrombotischen Aktivität einer Substanz oder zur Qualitätskontrolle
und Qualitätssicherung von pharmazeutischen Zwischen- und Endprodukten, welches Testsystem mindestens ein erfindungsgemäßes
Testkit, ein geeignetes Versuchstier und die zu testende Substanz umfaßt.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt
sein soll, noch weiter erläutert.
Material und Methoden:
Ein in Bezug auf thrombotische Nebenwirkungen sicheres Präparat,
nämlich ein auf Faktor II, VII, IX und X eingestelltes PPSB-Konzentrat (Prothromplex S-TIM 4 der Fa. Immuno) und ein partieller
Faktor II, IX und X enthaltender Prothrombinkomplex wurden jeweils mit einem gereinigten Beta-Faktor Xa oder einer gerinnungsaktiven
Phospholipidpräparation versetzt. Diese Mischungen wurden dann im Kaninchen in einem modifizierten Stase-Modell
nach Wessler auf Thrombogenität getestet.
Die Zusammensetzung des PPSB-Konzentrates sowie des partiellen
Prothrombinkomplexes ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die Präparate
enthielten in einer ähnlichen Dimension auch die Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren Protein C und Protein S.
S-TIM 4 | der Aktivität | PPSB-Konzentrat | |
200 | |||
I Zusammensetzung ; | 200 | ||
I PROTHROMPLEX® | 170 | 600 | |
i &igr;- j j Packungsgröße ! |
200 | ||
i 1 Durchstechflasche enthält: | 200 | 600 3 | |
!Faktor Il (IE)* | 85 | - 500 j | |
!Faktor Vl! (IE)* | 5-10 | ||
!Faktor IX (IE)* | 20 | ||
!Faktor X (IE)* | * 1 IE Faktor II, IX, X (gemäß WHO-Standard 84/681) | ||
i Heparin (!E) | WHO-Standard 84/665) entsprechen | ||
jAntithrombin III (IE) | in 1 ml frischem Normalplasma. | ||
j Lösevolumen (ml) | 600 j | ||
600 I | |||
250 ] | |||
15-30 ■ | |||
20 | |||
und 1 )E Faktor VII (gemäß | |||
des jeweiligen Faktors | |||
Tabelle Ib
240 | 600 | 1200 | * 1 IE Faktor il, IX1 X (gemäß WHO-Standard 84/681) entsprechen der Aktivität des jeweiligen Faktors in 1 ml frischem Normalplasma. |
|
200 240 240 80-240 <30 10 |
600 600 600 200-600 <75 10 |
- 1200 1200 1200 400-1200 <150 20 |
||
- | ||||
Zusammensetzung Partieller Pro thrombin komplex ■ |
||||
Packungsgröße | ||||
I 1 Durchstechflasche enthält: Faktor IX (IE) * Faktor I! (IE)* Faktor X (IE)* Protein (mg) Heparin (IE) Lösevolumen (ml) |
Als Faktor Xa-Quelle diente eine gemäß DE 4.325 872 hergestellte
Präparation, die aus einem Faktor X gewonnen wurde, der durch mehrere chromatographische Schritte aus einem Zwischenprodukt
der Herstellung des partiellen Prothrombinkomplexes gereinigt worden war. Diese Präparation wurde mit Russeis's Viper Venom
(RVV) aktiviert, durch Affinitätschromatographie weiter gereinigt
und zu einer stabilen Beta-Faktor Xa-Präparation umgewandelt, die elektrophoretisch homogen war und eine spezifische
Aktivität von etwa 2300 E/mg Protein aufwies.
Gerinnungsaktive Phospholipide wurden mittels einer Extrusionsmethode
aus den synthetischen Phospholipidkomponenten 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
und l-Palmitoyl-2-oleoyl-snglycero-3-phosphoserin
im molaren Verhältnis von 80 : 20 hergestellt. Aus diesem Prozeß resultierten Phospholipidvesikel mit
einem mittleren Durchmesser von 100 nm.
Dieser Durchmesser wurde mittels dynamischer Laserlichtstreuung gemessen und konnte auch im Elektronenmikroskop nachgewiesen
werden.
Zum Nachweis, daß die Phospholipidvesikel bzw. der Beta-Faktor Xa tatsächlich gerinnungsaktive Eigenschaften aufweisen, wurden
beide Substanzen in einem nicht aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest eingesetzt. Gleiche Teile,eines Tris-Puffers und
eines Normalplasmas wurden recalcifiziert und die Gerinnung durch Zugabe von einerseits Beta-Faktor Xa oder andererseits
Phospholipiden oder Mischungen derselben gestartet. Die Gerinnungszeiten aus diesem Experiment sind in tabellarischer sowie
graphischer Form Fig. 1 zu entnehmen.
Es zeigte sich, daß Phospholid einen konzentrationsabhängig vergleichsweise
moderaten, aber nachweisbaren, verkürzenden Effekt auf die Gerinnungszeit hat, Beta-Faktor Xa aber eine deutliche
Gerinnungszeitverkürzung hervorruft. Bei Mischungen von steigenden Phosholipidkonzentrationen in Kombination mit verschiedenen
Faktor Xa-Mengen potenziert sich die Wirkung von Beta-Faktor Xa und Phospholipid.
Für das eigentliche Bestimmungsverfahren wurden Kaninchen mit Pentobarbital narkotisiert, dann unter zusätzlicher Lokalanästhesie
die Vena jugularis freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 2 cm versehen. Schließlich wurden die zu testenden
Substanzen in der der Vena jugularis gegenüberliegenden Ohrvene innerhalb von 15 Sekunden injiziert. Dabei sollte beachtet werden,
daß die Injektion ein Dosisvolumen von 10 ml/kg Körpergewicht nicht übersteigt. Nach weiteren 25 Sekunden wurden die
Ligaturen zugezogen und 10 Minuten gewartet, bis das abgebundene Venenstück entnommen und in einer mit Citratpuffer gefüllten
Petrischale aufgeschnitten und bewertet wurde. Die Bewertungskriterien modifiziert nach Wessler sind Tabelle 2 zu entnehmen.
IM-
Mh
- 12 -
THROMBOSEGRAD | BEWERTUNG |
keine Thrombenbiidung | 0 |
wenige kleine Thromben | 0,5-1 |
wenige mittelgroße und viele kleine Thromben |
2 |
viele mittelgroße Thromben |
3 |
wenige große Thromben | 3,5 .. |
ein zusammenhängender Thrombus |
4 |
modifiziert nach Wessier S. et al., J. Appl.Physiol. 14:943-946 (1959)
Im vorliegenden Modell wurden dann die Prothrombinkomplexkonzentrate
in einer Dosis von 200 E/kg Körpergewicht bezogen auf Faktor IX untersucht. Dies ist mehr als die doppelte Dosis, welche
gemäß Dosisempfehlung des Herstellers maximal verabreicht werden soll. Die beiden Präparationen wurden jeweils mit Phospholipid
gemischt, so daß sich Dosen bis zu 10000 nM/kg ergaben; ebenso wurden die Präparate mit Beta-Faktor Xa in Dosen bis zu 20 E/kg
gemischt.
Anschließend wurden die mittleren Wessler-Scores jeweils aus
sechs oder mehr Tieren pro Gruppe untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 6 dargestellt.
Bei partiellem Prothrombinkomplex wurde folgendes Resultat erzielt:
- 13 Tabelle
Partieller Prothrombinkomplex und
gerinnungsaktives Phospholipid
gerinnungsaktives Phospholipid
FIX Phospholipid (nM/kg)
(IE/kg) O 1 10 100 1.000 10000
' 0 0,2 n.d. 0 0,5 0 0,5
200 0,1 0,2 0,3 0,6 0,2 0,3
200
. nach Heparin- 0,7 1,2 0,5 1,0 1,2 3,2
neutralisation
mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler
Tabelle 4
Partieller | Prothrombinkomplex und Faktor Xaß | Faktor Xaß (E/kg) | 0,2 | 2 | 20 |
FIX | 0,02 | 0,7 | 0,2 | 2,2 | |
.((E/kg) | 0 | 0 | 0,7 | 0,7 | 0,8 |
0 | 0,2 | 0,5 | • | ||
200 | 0,7 | 0,8 | 0,8 | 1,8 | |
200 | 0,5 | ||||
nach Heparin- | 0,5 | modifiziert nach | Wessler | ||
neutralisation | Thrombosegrad, | ||||
mittlerer |
Der Zusatz von gerinnungsaktivem Phospholipid (Tabelle 3) führt bei einer Dosis von 200 E Faktor IX/kg Körpergewicht zu keiner
Erhöhung der Thrombogenität, auch nicht in den höchsten Konzenrationen. Als Kontrolle wurde ein Tris-Puffer oder eine isotone
Kochsalzlösung zugegeben. Es ist zu beachten, daß alle Thrombogenitäts-Scores unter 1 als negativ einzustufen sind.
In einer weiteren Versuchsreihe wurde zum.Zwecke der Heparinneutralisation
den zu testenden Präparaten Protaminsulfat als heparinneutralisierendes
Agens zugegeben und in analoger Weise Mischungen von Prothrombinkomplex mit Phospholipid bzw. Faktor Xa
an die Versuchstiere verabreicht (siehe jeweils letzte Zeile der Tabellen).
Es zeigte sich, daß selbst nach Heparinneutralisation keine nennenswerte
Zunahme der Thrombogenität zu erkennen ist, lediglich bei der höchsten Konzentration, nämlich 10000 nM Phospholipid/kg
steigt der Thrombosegrad auf 3,2 an. Es zeigte sich auch (siehe Tabelle 4), daß die höchste Konzentration von Faktor Xa, die
ohne Zusatz des Präparats einen mittleren Thrombosegrad von 2,2 aufwies, in der Mischung durch das vorhandene Heparin maskiert
wurde. Nach Heparinneutralisation ist dieser Effekt wieder aufgehoben, . was allerdings in den niedrigeren Dosen nicht zu einer
Steigerung der Thrombogenität führt.
Mit dem PPSB-Konzentrat wurden folgende Resultate erzielt:
Tabelle 5
- | PROTHROMPLEX® S-TIM 4 und gerinnungsaktives Phospholipid |
10000 0,5 |
• FIX ' (IE/kg) O |
Phospholipid (nM/kg) 0 1 10 100 1000 0,2 n.d. 0 0,5 0 |
0,2 |
200 | 0,3 0,3 0,5 0,1 0,2 | 4,0 |
200 nach Heparin- neutraüsation |
2,6 3,3 3,5 3,8 3,7 | mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach Wessler |
Tabelle 6
PROTHROMPLEX® S-TIM 4 | und Faktor | Xaß | 3 |
FiX Faktor Xaß (IE/kg) O 0,02 0,2 0 0,2 0 0,7 |
(E/kg) 2 0,2 |
,20 2,2 |
6 |
200 0,3 0,3 0,5 | 0,3 | 0 | Wessier |
200 nacli Heparin- 2,6 3,3 3,7 neutralisation |
3,6 | 3 | |
mittlerer Thrombosegrad, modifiziert nach |
- 16 -
Der Zusatz von Phospholipid (siehe Tabelle 5) führt in keiner
der eingesetzten Konzentrationen zu einer Erhöhung der Thrombogenität. Wenn aber Heparin entsprechend seinem Gehalt mit
Protaminsulfat neutralisiert wird, wird ein thrombogenes Potential
im Kaninchen erkennbar, welches durch Zusatz von Phospholipid konzentrationsabhängig gesteigert werden kann.
Analog dazu zeigte Faktor Xa alleine in der höchsten Konzentration
wieder eine leichte Thrombogenität (siehe Tabelle 6). In der Mischung mit dem Prothrombinkomplex ist jedoch dieser Effekt
bedingt durch das Vorhandensein von Heparin/Antithrombin III
nicht erkennbar. Der Zusatz von Faktor Xa bringt erst und ausschließlich in jenen Proben, bei welchen das enthaltene Heparin
neutralisiert wurde, eine Steigerung der Thrombogenität.
Die vorliegenden Beispiele zeigen eindeutig, daß durch das erfindungsgemäße
Testkit die Empfindlichkeit von herkömmlichen Thrombogenitätstests deutlich erhöht werden konnte.
Es zeigte sich auch, daß der Gehalt an Heparin bzw. der Zusatz von Heparin während der Aufarbeitung, insbesondere bei PPSB-Präparaten,
essentiell für ihre Thrombosesicherheit ist. Durch den Zusatz von gerinnungsaktivem Phospholipid oder einem aktivierten
Prothrombinkomplexfaktor, nämlich Faktor Xa, konnte in realistischen Konzentrationen das thrombogene Potential einer
für sich sicheren Prothrombinkomplexpräparation nicht gesteigert werden.
Da der Gehalt an Faktor Xa in den eingesetzten Prothrombinkomplexpräparaten
zumeist unter der Nachweisgrenze liegt, entzog dieser sich bisher der Bestimmung in Thrombogenitätstests. Erst
mit der vorliegenden Untersuchungsmethode kann verläßlich ausgesagt werden, daß sich die den Kaninchen applizierten und den
Prothrombinkomplexpräparaten zugesetzten Faktor Xa-Mengen beispielsweise bis zu zwei Zehnerpotenzen über jener Konzentration,
die theoretisch im Präparat enthalten sein könnte, befinden. Ähnliches gilt selbstverständlich auch für den Gehalt an gerinnungsaktivem
Phospholipid.
Dies zeigt, daß sich das erfindungsgemäße Testkit in hervorragender
Weise auch für die Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung der Zwischen- und Endprodukte von Präparaten mit
potentiellem Thrombogenxtätsrisiko eignet.
Claims (18)
1. Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen
Aktivität eines parenteral verabreichbaren pharmazeutischen Präparats in einem in vivo-Modell, dadurch gekennzeichnet,
das das Testkit
- Phospholipide und/oder
-. einen oder mehrere aktivierte Gerinnungsfaktoren umfaßt.
2. Testkit nach Anspruch 1, welches zusätzlich ein geeignetes Säugetier als Versuchstier enthält.
3. Kit nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Phospholipide
und/oder der oder die aktivierten Gerinnungsfaktoren in Konzentrationen bereitgestellt werden, die zur Verabreichung einer
prothrombogenen Dosis in dem Versuchstier geeignet sind.
4. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor
in Verabreichungsdosen vorliegen, die nicht thrombogen sind.
5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor
in Verabreichungsdosen vorliegen, die schwach thrombogen sind.
6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das auf seine thrombogene bzw. antithrombotische
Aktivität zu testende Präparat ein Faktor IX enthaltendes Präparat ist.
7. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das auf seine thrombogene bzw. antithrombotische
Aktivität zu testende Präparat ein Präparat, welches einen oder mehrere Blutgerinnungsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe be-
stehend aus Prothrombin, Faktor X und Faktor VII, enthält, ist.
8. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als in vivo-Modell ein Stase-Modell, wie das
Wessler-Modell, verwendet wird.
9. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Kit in vesikulärer Form vorliegende Phospholipide,.welche
Phosphatidylserin und gegebenenfalls Phosphatidylcholin enthalten, umfaßt.
10. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipide in einer Verabreichungsdosis
vorliegen, die im Bereich von 1 bis 10000 nM Phospholipide/kg
liegt.
11. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
daß als aktivierter Gerinnungsfaktor Faktor Xa, vorzugsweise
mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 100 E Faktor Xa/mg, vorliegt.
12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Faktor Xa in einer Dosis im Bereich von 0,2 bis 20 E Faktor Xa/kg
vorliegt.
13. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich ein Heparin-neutralisierendes Agens
umfaßt, mit welchem in dem zu testenden Präparat gegebenenfalls vorhandenes Heparin vor der Bestimmung der thrombogenen bzw.
antithrombotischen Aktivität neutralisiert wird.
14. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die Phospholipide und/oder der aktivierte Gerinnungsfaktor in einer Verabreichungsform vorliegen, welche
ermöglicht, daß sie gemeinsam mit dem zu testenden Präparat verabreicht werden können.
15. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Erhöhung der
Sensitivität eines in vivo-Tests zur Bestimmung der thrombogenen
bzw. antithrombotisehen Aktivität eines parenteral verabreichbaren
pharmazeutischen Präparats.
16. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung.
17. Testsystem zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotisehen
Aktivität einer Substanz oder zur Erhöhung der Sensitivität eines in vivo-Tests zur Bestimmung der thrombogenen
bzw. antithrombotisehen Aktivität einer Substanz oder zur Qualitätskontrolle
und Qualitätssicherung von pharmazeutischen Zwischen- und Endprodukten, welches Testsystem mindestens ein erfindungsgemäßes
Testkit, ein geeignetes Versuchstier und die zu testende Substanz umfaßt.
18. Parenteral verabreichbare pharmazeutische Präparate, dadurch
gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung eines oder mehrerer Thrombogenizitätstests mit einem Testkit nach einem der Ansprüche
1 bis 14 als Qualitätssicherungsschritte erhältlich sind.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT43995U AT878U1 (de) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | Verfahren zur bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen aktivität |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE29602276U1 true DE29602276U1 (de) | 1996-04-11 |
Family
ID=3490641
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE29602276U Expired - Lifetime DE29602276U1 (de) | 1995-08-08 | 1996-02-09 | Testkit zur Bestimmung der thrombogenen bzw. antithrombotischen Aktivität |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
AT (1) | AT878U1 (de) |
DE (1) | DE29602276U1 (de) |
-
1995
- 1995-08-08 AT AT43995U patent/AT878U1/de not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-02-09 DE DE29602276U patent/DE29602276U1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AT878U1 (de) | 1996-07-25 |
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