AT406680B

AT406680B - Festphasensynthese von peptidalkoholen

Info

Publication number: AT406680B
Application number: AT0079491A
Authority: AT
Original assignee: Novartis Erfind Verwalt Gmbh
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 2000-07-25
Also published as: ATA79491A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen, die am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiogruppe enthalten Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Peptidalkoholen, die einen C-terminalen Threoninol-, Serinol- oder Cysteinolrest enthalten. 



   Zu Beispielen für geeignete Verbindungen gehören einige der hierin beschriebenen Somatostatin- Verbindungen
Die Festphasenpeptidsynthese hat sich als besonders rasches und günstiges Verfahren zur Herstellung von Peptiden erwiesen und stellt daher ein heute   allgemein übliches   Verfahren dar Hierbei wird zuerst eine Aminosäure über ihre Carboxylgruppe unter Bildung einer Estergruppe oder Amidgruppe an eine Hydroxylgruppe oder Aminogruppe eines unloslichen Syntheseharzes gebunden, worauf in der gewünschten Sequenz die weiteren Aminosäuren gebunden werden, und abschliessend das fertige Polypeptid vom Trägerharz abgespalten wird. 



   Diese Synthese bereitet bei Polypeptiden mit C-terminalen Aminosäuren keine Probleme. 



  Polypeptidalkohole, die an ihrem C-terminalen Ende einen Aminoalkohol anstelle einer Aminosäure   erthalten,   gehen jedoch nicht ohne weiteres eine Bindung mit Trägerharzen ein, welche Hydroxylgruppen oder   Aminogruppen aufweisen, und/oder lassen   sich nach beendeter Synthese nicht so leicht vom Trägerharz abspalten
Als mögliche Festphasenverfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen wurden bereits folgende Methoden vorgeschlagen :

   a) Eine herkömmliche Herstellung des entsprechenden Polypeptids, das am C-terminalen
Ende eine Aminosäure enthält (wie der Ester eines hydroxylgruppenhaltigen Harzes) und eine anschliessende reduktive Aufspaltung unter Verwendung von Borhydriden, wodurch die Carboxylgruppe zugleich in eine   Alkoholfunktion überfuhrt   wird (US-A-4 254 023 und
US-A-4 254 024). b) Eine Bindung des terminalen Aminoalkohols als Ether an ein Hydroxymethylharz unter
Verwendung von Carbonyldiimidazol und eine nach der Synthese des Peptids erfolgende
Abspaltung unter Verwendung von HCI/TFA oder HBr/TFA (Kun-hwa Hsieh und G R. 



   Marshal, ACS National Meeting, New Orleans, 21. - 25. März 1977). 



   Diese belden Methoden erfordern jedoch drastische Bedingungen bei der Aufspaltung. 



   Es wurde nun gefunden, dass sich die Abspaltung des Peptids vom Harz bei gleichzeitiger Bildung des C-terminalen Peptidalkohols dann unter milden Bedingungen durchführen lasst, wenn der C-terminale Aminoalkohol über eine Acetalbindung an das Harz gebunden ist
Erfindungsgemäss wird der Peptidalkohol, der am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiogruppe enthält, durch saure Hydrolyse eines Acetals aus dem Peptidalkohol und einem polymeren Harz, das Formylphenylgruppen enthält, gebildet. Dieses Verfahren wird als die erfindungsgemässe Synthese bezeichnet. 



   Die dabei ablaufende Reaktion   lässt   sich   formelmässig   wie folgt darstellen : 
 EMI1.1 
 

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Darin haben die erwähnten Symbole folgende Bedeutung-   (D   ist ein unlösliches Syntheseharz,
Z ist eine direkte Bindung oder eine Gruppe der Formeln   111   oder V, wie weiter unten angegeben,
X steht für 0 oder S,   R1   ist Wasserstoff oder Methyl, n ist die Anzahl der (acetalisierten) Formylphenylgruppen,
Y ist der Rest eines Peptidalkohols, der beispielsweise Schutzgruppen tragen kann. 



   Die gegebenenfalls acetalisiert Gruppe CHO befindet sich dabei in m- oder p-Stellung zum Rest Z 
Die Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz durch Hydrolyse der Acetalgruppe erfolgt, wie bereits oben angegeben, unter sauren Bedingungen, beispielsweise mittels verdünnter Trifluoressigsäure Diese Hydrolyse kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. 



   Ist Z in der   Forme))   eine direkte Bindung, dann sind die Acetalgruppen tragenden Phenylreste direkt an den Polymerrest gebunden und gehören zum Polymer Beispiele für solche Verbindungen der Formel   I   sind die Acetale eines formylierten Polystyrolharzes (hierbei ist   &commat;   in der   Formel I   dann eine   Polyethylenkette).   



   Ist Z keine direkte Bindung, dann ist es eine Gruppe der Formel   - (D) p-NH-CO- (E) q- 111      wonn   D für eine   Ci-Cs-Alkylgruppe,   E   für -CHR-,   wobei R Wasserstoff oder Methyl bedeutet, und die Indices p und q unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, die durch Umsetzung einer direkt oder uber einen Alkylrest an das Polymer gebundenen Aminogruppe und einer Carboxylgruppe, die direkt oder über einen Alkyl- bzw. Alkoxyrest an die (acetalisiert) Formylphenylgruppe gebunden ist, gebildet wird. 



   Beispiele für Verbindungen der Formel I, worin Z ein Rest der   Formel 111   ist, sind die Verbindungen, bei denen 
 EMI2.1 
 für ein aminomothyliertes Polystyrolharz steht und folgende Formel 
 EMI2.2 
 der Formel IV entspricht 
 EMI2.3 
 

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 worin die Substituenten obige Bedeutung besitzen, m für 0 oder 1 steht und die Acetalgruppe sich in Stellung m oder p befindet
In einem solchen Fall bedeutet Z eine Gruppe 
 EMI3.1 
 Formel IV bedeutet vorzugsweise 
 EMI3.2 
 
Anstelle des aminomethylierten Polystyrols können auch andere Polymere verwendet werden, und zwar insbesondere solche mit freien Aminogruppen, wie Polyacrylamide, welche Aminoethylgruppen tragen
Die acetalisiert Formylphenylgruppe ist, wie bereits oben erwähnt, an das Polymer vorzugweise durch eine Amidbindung gebunden Hierdurch wird sichergestellt,

   dass die Bindung des acetalisierten Formylphenylrestes an das Harz wahrend der Synthese des Polypeptids und während dessen Abspaltung vom Polypeptid stabil ist und dass die Abspaltung in der gewünschten Weise an der Acetalbindung erfolgt, so dass einerseits der Peptidalkohol gebildet wird und andererseits der Fomylphenylrest am Harz bleibt. 



   Gewünschtenfalls kann der Peptidalkohol auch in einer vom Harz weiteren Entfernung gebunden sein, indem zwischen den reaktionsfähigen Gruppen des Polymers, insbesondere Aminogruppen, und den reaktionsfähigen Gruppen des acetalisierten   Formylphenylderivats,   insbesondere Carboxylgruppen, sogenannte Abstandshalter eingebaut werden. Für bestimmte Reaktionen am Polypeptidalkohol wird dies zweckmässigenweise vor der Aufspaltung getan, wie durch Oxidation von Cyteinresten. 



   In diesem Fall enthält Z zusätzlich einen Spacer Dieser Ist vorzugsweise eine   o-   Aminocarbonsäure, z. B s-Aminocapronsäure, deren reaktive Gruppen   (-NH2, -COOH)   mit der Aminogruppe des Harzes bzw der Carboxylgruppe des   Formylphenylrestes   zu Gruppen der Formel   - (D) p-NH (s)-CO- (E) q-   V worin D,   E, (s),   p und q obige Bedeutung haben, reagieren 
Bei Anwendung eines aminomethylierten Polystyrols, eines Rests der Formel IV und von sAminocapronsäure als Abstandshalter entspricht die Gruppe Z dann beispielsweise der folgenden Formel. 
 EMI3.3 
 

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   Die Verbindungen der Formel (können unter Anwendung von Methoden hergestellt werden, wie sie bei der Festphasentechnologie üblich sind, und zwar ausgehend von einer Verbindung der Formel 
 EMI4.1 
 worin A eine Schutzgruppe fur die Aminofunktion ist und sich die Acetalgruppe in Stellung m oder p zum Rest Z befindet Zu diesem Zweck wird zuerst die Schutzgruppe A abgespalten und die freie Aminogruppe dann mit der nächsten N-geschutzten Aminosäure usw. so lange umgesetzt, bis alle Aminosäuren an das Harz in einer Sequenz gebunden sind, die dem gewünschten Peptidalkohol entspricht. 



   Die Aminoschutzgruppen, welche für die verwendeten Aminosauren oder den Aminoalkohol ausgewählt werden, müssen so beschaffen sein, dass sie sich unter nicht sauren Bedingungen abspalten lassen, da es unter sauren Bedingungen zu einer Hydrolyse der Acetalgruppen kommt Als derartige Schutzgruppen lassen sich beispielsweise die Gruppen CF3CO- oder FMOC- (9Fluorenylmethyloxycarbonyl) verwenden. Diese Schutzgruppen lassen sich in einem basischen Medium unter Anwendung von in der Peptidchemie üblichen Methoden abspalten. 



   Es konnen auch lediglich die Schutzgruppen in den Seitenketten und die Aminoschutzgruppe der als letzte angewandten Aminosäure   säurelabil   sein und dann gleichzeitig mit der Bildung des Peptidalkohols vom Harz abgespalten werden. 



   Als Schutzgruppe wird die BOC-Gruppe bevorzugt. 



   Als Basen werden vorzugsweise KOH, Piperidin oder NaBH4 verwendet. 



   Der Aufbau der Peptidkette kann in herkömmlicher Weise ausgehend von einem Peptidrest mit freien Aminogruppen und einer Aminosäure mit freien oder aktivierten Carboxylgruppen   durchgefuhrt   werden. 



   Die Umsetzung kann unter Zusatz von beispielsweise Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid erfolgen
Die Verbindungen der Formel   V)   können beispielsweise hergestellt werden, indem a) ein Harz der Formel 11 mit einem N-geschützten Aminoalkohol oder -thiol der Formel   HX-CHR1-GH (NHA) -CH2OH,    worin X,   R1   und A die oben angegebene Bedeutung haben, der gegebenenfalls in aktivierter
Form vorliegt, oder b) ein Harz der Formel 
 EMI4.2 
 mit einer Verbindung der Formel 
 EMI4.3 
 

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 worin sich die Acetalgruppe in   m- oder p-Stellung   zur Gruppe HOOC- (E) q befindet und die
Amino- und Carboxylgruppe unter Ausbildung einer Säureamidbindung reagieren, umgesetzt wird 
Die Acetalisierung gemäss Verfahren a)

   kann in Gegenwart einer Säure als Katalysator durchgeführt werden Zu hierfür geeigneten Säuren gehören   p-Toluolsulfonsaure   und p-   Trifluormethylsulfonsäure Gegebenenfalls   kann eine Trimethylsilylgruppe als Schutzgruppe für einen freien Alkohol verwendet werden
Die Bildung des Säureamides   gemäss   Verfahren b) kann unter sehr milden Bedingungen durchgeführt werden, beispielsweise wie im Beispielteil 2) beschrieben
Die Verbindung der Formel VII können durch Acetylierung einer Verbindung der Formel 
 EMI5.1 
 mit einem geschützten Aminoalkohol oder -thiol der Formel   HX-CHRi-CH (NHA)-CH20H    worin X, R, und A die oben angegebene Bedeutung haben, hergestellt werden. 



   Diese Acetylierung kann, wie oben beim Verfahren a) beschrieben, durchgeführt werden. 



   Während des Aufbaus und der Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz können weitere Umsetzungen bewerkstelligt werden, beispielsweise eine Entfernung von Schutzgruppen, wie SSchutzgruppen, oder eine Oxidation von Cysteinresten Solche Umsetzungen können auch nach erfolgter Abspaltung des Peptidalkohols in flüssiger Phase durchgeführt werden. 



   Unter Anwendung der erfindungsgemässen Synthese lassen sich in einfacher Weise pharmakologis h wirksame Peptide herstellen, die am C-terminalen Ende zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe enthalten. 



   In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben und die   [a] o  -   Werte nicht korrigiert Es werden dann die folgenden Abkürzungen verwendet : 
BOC   tert.-Butyloxycarbonyl  
But   = tert.-Buty)  
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid 
 EMI5.2 
 
Bei allen erhaltenen Peptiden handelt es sich um Polyacetate-Polyhydrate mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90 %
Durch HPLC-Analyse ergibt sich, dass die Peptide weniger als 5 % an anderen Peptiden enthalten
Die erfindungsgemässen Synthesen können wie folgt durchgeführt werden. 



   Beispiel : Herstellung von Octreotid 
1 Herstellung des   Ankeracetals (N-CFaCO-Threoninol-acetal   der   p-Formylphenoxy-   essigsäure 
105 g   L-Threoninol werden   in 200 mi Methanol unter Stickstoffspülung vorgelegt. Zu der erhaltenen klaren Lösung wird bei 00 eine Lösung aus 200 ml   Trifluoressigsäuremethylester   in 250 ml Methanol zugetropft. Dabei wird die Innentemperatur mittels Eisbad auf ca. 100 gehalten. Nach 1, 5 Stunden ist in der Reaktionslösung kein Threoninol mehr nachweisbar. Eindampfen bei   40    ergibt einen weissen, kristallinen Rückstand. Dieser wird in 200 mi Essigsäureethylester bei 700 

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 gelöst und mit 100 ml Hexan gefällt. Dann wird auf   0"abgekühlt,   mit Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

   Man erhält das   N-Trifluoracetyl-threonlnol  
50, 3 g des erhaltenen Produktes werden In 1, 25 Liter Tetrahydrofuran gelöst und tropfenweise mit 75   ml Trimethylchlorsilan   versetzt Sofort anschliessend wird eine Mischung aus 70 ml Tnothylamin und 250 ml Tetrahydrofuran zugegeben Es entsteht eine weisse Suspension, die 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird.

   Dann wird filtriert und das Filtrat bei 400 unter Bildung eines   Ö ! s   eingedampft
Das 01 wird in 1, 5 Liter Methylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit   90, 4g p-Formyl-phenoxyessigsäure   versetzt Dann werden portionsweise insgesamt 9 ml   Trifluormethansulfonsäuretrimethylsilylester   zugegeben Es wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und der Rückstand gut mit Methylenchlorid gewaschen. 



   Das Filtrat wird bei 400 eingedampft und ergibt als Rückstand ein orangerotes, harzartiges Produkt Dieses Produkt wird über Kieselgel chromatographiert Die Elution wird mit Essigsäureethylester durchgeführt. Durch Eindampfen der gewünschten Fraktionen wird die Titelverbindung mit einer Reinheit von 97 % (Hochleistungsflussigkeltschromatographie) erhalten 
2 Aufbau   des geschützten Octapeptids     17, 2g aminonethyhertes Polystyrol   (Brand Dow 0, 7 Gewichtsprozent N, was   0,50 mol   Aminomethylgruppen pro g Harz entspricht) werden in   80ml     Methylenchlorid/Dimethylformamid   (4/1) suspendiert.

   Dazu werden sukzessive 4, 17 g des Endprodukts der Stufe 1), 1, 6 Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 4, 0 g   Dicyclohexylcarbodilmid   (DCCI) gegeben Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist der Kaisertest negativ. Das Gemisch wird filtriert und gewaschen Das gewaschene Harz wird in 100ml Tetrahydrofuran/Methanol (3/1) suspendiert und portionsweise mit 10, 4 g Natriumborhydrid versetzt Es wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und gewaschen Das Harz wird wieder in   Methylenchlorid/Dtmethylformamid   (4/1) suspendiert und mit 5, 57g FMOC-Cys (S-t-Bu) OH, 1, 74 g HOBT und 3, 6 g DCCI versetzt.

   Hierauf wird die FMOC-Schutzgruppe mit Piperidin (2 x 20 Minuten Kontaktzeit) abgespalten
In analoger Weise werden sukzessive die N-FMOC-geschützten Aminosäuren Thr-OH, Lys (BOC)-OH D-Trp-OH, Phe-OH, Cys (S-t-Bu) OH und D-Phe-OH mittels HOBT/DCCI angekuppelt, wodurch man das FMOC-geschützte Oktapeptid-Harz erhält. Die Endbeladung beträgt   0, 26 mMol/g.   



   3. Oxidation und Abspaltunq 
Das erhaltene Harz wird in 100 ml   TrifluorethanollMethylenchlorid (1/1)   suspendiert und mit 50ml Tributylphosphin versetzt. Hierauf wird 70 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird filtriert, gewaschen und mit 100ml eines 1 : 1-Gemisches aus Tetrahydrofuran und einer   einnormalen Aminacetatlösung   versetzt. Dazu werden 1, 1 mi 30%-iges wässriges Wasserstoffperoxyd gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt Dann wird das Harz gewaschen und mit einem Gemisch aus 20 ml Trifluoressigsäure, 80ml Methyienchlorid, 10ml Wasser und 2ml Thioanisol versetzt Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt und filtriert und dann mit Trifluoressigsäure und Methylenchlorid gewaschen. Zum Filtrat werden 200 ml Diethylether gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert.

   Der Rückstand wird in einem wässrigen Puffer gelöst und dann beispielsweise unter Verwendung von Duolit entsalzt. Durch anschliessendes Gefriertrocknen des Acetats erhält man die Titelverbindung als Essigsäuresalz. 

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

Patentansprüche : 1 Verfahren zur Herstellung eines Peptidalkohols, der am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiogruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidalkohol durch saure Hydrolyse aus einem Acetal des Peptidalkohols und einem Formylphenylreste enthaltenden Harz hergestellt wird. <Desc/Clms Page number 7> 2.

Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Peptidalkohols der Formel EMI7.1 worin Y für den Rest eines Peptidalkohols, R für Wasserstoff oder Methyl und X fur 0 oder S stehen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Harz der Formel I EMI7.2 welches den Peptidalkohol trägt, worin (ê) für ein unlösliches Syntheseharz, Z für eine direkte Bindung oder eine Gruppe der Formeln 111 oder V - (D) p-NH-CO- (Ek 111 - (D) p-NH- (µ)-CO- (E) q- V wobei D fur eine Cl-C5 Alkylgruppe, E für -CHR-, wobei R Wasserstoff oder Methyl bedeutet, und die Indices p und q unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen und ein Spacer ist, und n fur die Anzahl der (acetalisierten) Formylphenylgruppen stehen, und R1, X und Y die oben genannte Bedeutung haben,

wobei sich die actalisierte Gruppe CHO in m- oder p- Stellung zum Rest Z befindet, unter sauren Bedingungen hydrolisiert wird 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest EMI7.3 ein Polystyrolrest ist, wobei Z die in Anspruch 2 genannte Bedeutung hat, und die freie Bindung die Verknüpfung zur acetalisierten CHO-Gruppe darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Z eine Gruppe der Formel 111 - (D) P-NH-CO- (E) q- 111 ist, wonn D für eine Ci-Cs Alkylgruppe, E für -CHR-, wobei R Wasserstoff oder Methyl bedeutet, und die Indices p und q unabhängig voneinander fur 0 oder 1 stehen <Desc/Clms Page number 8> 5 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Z eine Gruppe der Formel EMI8.1 bedeutet, worin R fur Wasserstoff oder Methyl und m für 0 oder 1 stehen 6 Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X für 0 und R1 für Methyl stehen.

7 Verbindungen der Formel 1 EMI8.2 wobei (fi), Z, X, Ri, Y und n die in Anspruch 2 genannte Bedeutung haben, wobei sich die acetalisiert Gruppe CHO In Stellung m oder Stellung p zum Rest Z befindet, zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 2.

8. Verbindungen der Formel VI EMI8.3 worin &commat; Z, X, R1 und n die in Anspruch 2 genannte Bedeutung haben und A eine Aminoschutzgruppe ist, wobei sich die Acetalgruppe in Stellung m oder Stellung p zum Rest Z befindet.

9. Verbindungen der Formel VIII EMI8.4 worin X, E, R1 und q die in Anspruch 2 und A die in Anspruch 8 genannte Bedeutung besitzen, wobei sich die Acetalgruppe in m- oder p-Stellung zum Rest HOOC- (E) qbefindet. <Desc/Clms Page number 9> 10 Verbindungen der Formel EMI9.1 worin (P) für ein unlösliches Syntheseharz, Z fur eine Gruppe der Formeln 111 oder V - (D) p-NH-CO- (E) q- 111 - (D) p-NH-O-CO- (E) q- V wobei D für eine Cl-C5 Alkylgruppe, E für -CHR-.

wobei R Wasserstoff oder Methyl bedeutet, und die Indices p und q unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, und S ein Spacer Ist, und n für die Anzahl der (acetalisierten) Formylphenylgruppen stehen, wobei sich die Formylgruppe in m- oder p-Stellung zum Rest Z befindet 11 Verbindungen gemass Anspruch 9, der Formel EMI9.2