DD298932A5 - Verfahren zur herstellung von peptidalkoholen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen- (Solid-Phase-) Herstellung von Peptidalkoholen, welche am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkohol- und eine Thiolgruppe tragen. In diesem Verfahren wird ein geschuetzter Peptidalkohol von einem Formylphenylrest in Acetalform tragenden Harz abgespaltet.{Peptidalkohole; Festphasenherstellung; Ende, C-terminal; Peptidkette; Alkoholgruppen, zwei; Alkoholgruppe; Thiolgruppe; Harz, verwendet, speziell modifiziert}

Description

XH-CHr₁-CH(NHA)-CH₂OH acetalisiert.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen· (Solid-Phuse·) Herstellung von Peptidalkoholen, welche am C-terminalon Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkohol- und eine Thioigruppe tragen. Das Verfahren eignet sich besonders für die Herstellung von Poptidalkohlen, welche einen C-terminalen Throoninol-, Serinol- oder Cystoinolrest enthalten.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Die Solid-Phase-Peptidsynthese hat sich als ein besonders schnelles und günstiges Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden

erwiesen und ist daher eine allgemein übliche Methode geworden.

Wie bekannt, wird dabei zunächst eine Aminosäure mit ihrer Carboxylgruppe unter Bildung einer Ester- oder Amidgruppe an

eine Hydroxyl- oder Aminogruppe eines unlöslichen Kunstharzes gebunden; c'nnach werden hieran die weiteren Aminosäurenin der gewünschten Reihenfolge angelagert und schließlich das vollständige Polypeptid vom Trägerharz abgespalten.

Diese Synthese verläuft für normale Polypeptide mit C-terminalen Aminosäuren problemlos. Polypeptidalkohole, welche am C-Ende einen Aminoalkohol statt einer Aminosäure tragen, lassen sich jedoch nicht so einfach an OH- oder NHj-Gruppen

tragende Trägerharze binden und/oder am Ende der Synthese wieder abspalten.

Als mögliche Solid-Phase-Verfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen wurden bisher vorgeschlagen:

a) übliche Herstellung des entsprechenden am C-Ende eine Aminosäure enthaltenden Polypeptide (als Ester eines OH-Gruppen tragenden Harzes) und nachherige reduktive Abspaltung mittels Borhydriden, wobei gleichzeitig die Carboxylgruppe in eine Alkoholfunktion umgewandelt wird. ,

(US-Patente 4254023/4)

b) Anlagerung des endständigen Aminoalkohole als Äther an ein Hydroxymethylharz mittels Carbonyldiimidazol und zuletzt nach Peptidaufbau Spaltung mit HCL/TFA oder HBr/TFA (Kimhwa Hsioh und G. R. Marshall, ACS National Meeting, New Orleans, 21.-25.3.1977).

Diese Methoden haben jedoch drastische Spaltbedingungen gemeinsam. Ziel der Erfindung

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Abspaltung des Peptide vom Harz unter gleichzeitiger Ausbildung des C-terminalen Peptidalkohols unter milden Bedingungen, wenn der C-terminale Aminoalkohol mit dem Harz über eine Acetalbindung verknüpft wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Festphasen-Herstellung von Peptidalkoholen zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung des gegebenenfalls noch Schutzgruppen tragenden Peptidalkohols durch saure Hydrolyse eines Acetals aus dem (geschützten) Peptidalkohol und einem Formylphenylreste tragenden Harz.

Schematisch kann dio Reaktion wie folgt dargestellt werden:

CH - - Cl·

CH-NII-CO-Y 0 - CH^

CHR₁ - XH ^) - Z -/f^TT + Y-CO-NH-CH-CH₂OH

worin (P) für den Rest eines unlöslichon Kunstharzes

Z für eine direkte Bindung oder einen Rest, wolchor das Harz mit der (acetalisierton)

Formylphenylgruppe verbindet X fürOoderS

R₁ für Wasserstoff oder Methyl, und Y für den Rest eines gegebenenfalls Schutzgruppon tragenden Peptidalkohols

stehen, wobei die (acetalisierte) CM'^-Gruppe sich In m- oder p-Stellung zum Rest Z befindet. Zur Vereinfachung wurde in den Formeln I und Il des obigen Schemas nur eine Substitlonsgruppe am Harz eingezeichnet; es sollte jedoch klar sein, daß oine Vielzahl solcher Gruppen an einem Molekül dos Harzpolymers gebunden ist. Die Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz durch Hydrolyse der Acetalgruppe erfolgt wie oben erwähnt unter sauren Bedingungen, z. B. mit verdünnter Trifluoreaslgsäure. Diese Hydrolyse kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

Falls Z in der Formel I für eine direkte Bindung steht, sind die Acetalgruppon tragenden Phenylreste unmittelbar am Polymerrest gebunden und gehören zum Polymer. Beispiele für solche Verbindungen der Formel I sind die Acetale eines formylierten Polystyrolharzes (in der Formel I steht (p) dann für eine Polyäthylenketto).

Steht Z für einen Rest, so enthält dieser Rest eine Gruppe, welche durch Umsetzung einer reaktiven Gruppe, welche direkt oder indirekt am Polymer gebunden ist, mit einer anderen reaktiven Gruppe, welche direkt oder indirekt an der (acetalisierten) Formylphenylgruppe gebunden ist, entstanden ist. Der Rest Z kann beispielsweise durch die nachfolgende Formel III wiedergegeben werden:

worin Q₁ = derResteineramPolymergebundenenreaktivenGruppe

Q₂ = der Rest einer an der (acetalicierten) Formylphenylgruppe gebundenen reaktiven Gruppe D = einRest,derdieGruppoQi mitdomPolymerverbindet E = ein Rest, der die Gruppe Q₂ mit der (acetalisierten) Formylphonylgruppe verbindet

ρ und q sind unabhängig voneinander O oder 1.

Vorzugsweise ist die Q₁-Q₂-GrUPpO eine Ester- oder Amidgruppe, besonders Carbonamidgruppo. Bevorzugt steht Qi für NH und

Q₂ für CO.

D und E stehen beispielsweise unabhängig voneinander für Aikylen· oder Alkylenyloxy-Resto mit 1 bis 5 C-Atomen. Beispiele für

solche Verbindungen der Formel I, worin Z für einen Rest der Formel III steht, sind Verbindungen, worin (P)-D-Q₁ für den Resteines aminomethylierten Polystyrolharzes und der Rest

y Χ"™

H CH-NH-CO-Y für

^ 0-CH^

einen Rest der Formel IV

-C-CH- (O) -föf\ CH-NH-CO-Y 'V

worin R - Wasserstoff oder Methyl und

m = O oder 1 stehen, wobei die Acotalgruppe sich wieder in m- oder p-Stollung befindet.

In diesem Falle steht Z also für

-CH₂-NH-CO-CH-(O)_n,- und

(P) für Polystyrol

Bovorzugt steht der Rest IV für

X-CH^R1

y XCH1

-CO-CH₀-O-(O)-CH ^CH-NH-CO- Y ^{2 X}-^/ ^₀-CH₂

Statt des aminomethylierten Polystyrols können auch andere Polymoro, besondere solche mit freien NH₂-Gruppen, z.B. Aminoäthylgruppen tragende Polyacrylamide, eingesetzt werden.

Wie oben erwähnt, Ist die ncetali tierto Formylphenylgruppe vorzugsweise über eine Amldblndung mit dem Polymer verbunden. Damit ist gewährleistet, daß die Bindung des acetalislerten Formylphenylrostes am Harz während des Aufbaues des Polypeptides und während der Abspaltung stabil ist und die Spaltung, wie gewünscht, an der Acetalbindung eintritt, so daß einerseits der Peptidalkohol generiert wird und andererseits der Formylphonylrost am Harz verbleibt. Falls gewünscht, kann der Peptidalkohol weiter vom Harz verlagert werden durch Einbau von sogenannten Spacern zwischen den reaktiven Gruppen des Polymers (besonders Aminogruppen) und den reaktiven Gruppon dos acetalisiorten Formylphenyldorivatos (besonders Carboxylgruppen). Dies kann boi bestimmten Reaktionen am Polypoptidalkohol vor der Abspaltung (z. B. Oxidation von Cysteinrosten) vorteilhaft sein. In diosom Falle enthält der Rost D odor E in der Formol III noch zusätzlich don Spacer und ist Q₁ odor Q] dor reaktive Rest des Spacers.

Als Spacer kann man beispielsweise eine ω-Aminocarbonsäure, wie c-Aminocapronsäuro verwenden. In einem spezifischen Fall bei Verwendung von aminomethyliertom Polystyrol, einom Rest der Formol IV und ε-Aminocapronsäure als Spacer, steht Z für

-CH₂-NH-CO-(CH₂U-NH-CO-CH-(O)_n,-

Die Verbindungen der Formel I könnon nach in der Solid-Phase-Technik üblichen Methoden, ausgehend von einer Verbindung der Formel V

^ CH-NH-Λ ^v

0-CH₂

worin A für eine Schutzgruppe der Aminofunktion steht und die Acetalgruppe sich in m- oder p-Stellung zum Rest Z befindet, hergestellt werden. Zu diesem Zweck wird zuerst die Schutzgruppe A abgespalten und dann die freie Aminogruppe mit dor nächsten N-ge.schützten Aminosäure umgesetzt, usw., bis alte Aminosäuren in der dem gewünschten Peptidalkohol entsprechenden Reihenfolge am Harz angelagert worden sind. ·

Als Aminoschutzgruppon in den vorwendeten Aminosäuren, bzw. in dom Aminoalkohol, müsson solche gewählt werden, welche unter nicht sauren Bedingungen abgespalten werden, da unter sauren Bedingungen eine Hydrolyse der Acetalgruppe stattfindet. Als solche Aminoschut/gruppen können z.B. die CF₁CO- oder die HMOC-Gruppe (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) verwendet werden. Diese Schutzgruppon worden auf in der Peptidchemie üblichem Weg in basischem Milieu abgospalton. Nur die Schutzgruppe der zuletzt anyolagerten Aminosäure kann säurelabil sein und wird dann gleichzeitig mit der Freisetzung dos Peptidalkohols vom Harz abgespalten. Für diesen Fall ist z. B. die Boc-Gruppe einzusetzen. Als Basen können z. B. KOH, Piperidin oder auch NaBH₄ verwendet werden.

Auch der Aufbau der Polypeptidkette erfolgt in an sich bekannter Weise aus dem Peptidrest mit freier Aminogruppe und einer Aminosäure mit freier oder aktivierter Carboxylgruppe. Es können auch wasserbindende Mittel zugefügt werden. So kann die Reaktion z. B. unter Zusatz von Hydroxybenzotriazol und Dicyclohoxylcrbodiimid durchgeführt werden. Die Verbindungün der Formel V können hergestellt werden, indem man entweder a) ein Aluohydgruppen tragendes Harz der Formel Il

CCHO

worin die CHO-Gruppe sich in m- oder p-Stellung zum Z-Substituenten befindet, mit einen N-geschützten Aminoalkohol der Formel HX-CHR₁-CH(NHA)-CHjOH oder einer aktivierten Form dieser Verbindung umsetzt, oder b) ein Harzderivat der Formol

mit elnor Vorbindung der Formol VI

X-CH

^N vi

CH CH-NH-A

worin die Acetalgruppo sich in m- oder p-Stellung zu dem Qi-(E)₄-RoSt befindet und Qi und QJ für zwei reaktiven Gruppon, welche miteinander unter Bildung dor Qi-Qj-Brücko roagloren können, stohon, umsotzt.

Die Acetalisiorung (Vorfahron a) wird auf übliche Welse mit olnor Säure als Katalysator durchgeführt. Als Säure kann man z. B. p-Toluolsulfonsöure odor Trifluormothansulfonsäuro vorwondon

Statt dos froion Alkohols kann beispielsweise das Trimothylsllylderivat eingesetzt werdon.

Das Vorfahren b) (z. B. Veresterung odor bosondors Amidierung) erfolgt ebenfalls auf üblichem Wngo, z. B. durch Reaktion eines reaktiven Carbonsäurederivate mit einem OH- oder NH,-Gruppe tragendon Polymer. Die Vorbindungen dor Vormol Vl werdon durch Acotalislorung olner Vorbindung dor Formol

¹ /""^"ΌΗΟ

Q- -(D)_q-\O/ mit einer Verbindung der Formel

HX-CHRi-CH(NHA)-CH]OH hergestellt. Diese Acotallsierung erfolgt wie oben für das Vorfahren a) boschrieben. Während des Aufbaus und vor Abspaltung dos Poptldalkohols vom Harz können such Reaktionen am Poplidalkoholrest vorgenommen worden, z. B. Entfernung von Schutzgruppen, z.B. S-Schutzgruppon, oder Oxidation von Cystoinresten. Dieso Reaktionen können selbstverständlich auch nach Abspaltung des (geschützton) Peptidalkohols in Lösung erfolgen. Die Vorbindungen der Formel I, V und Vl sind nou und gehören ebenfalls zur Erfindung.

Mit der erfindungsgcmäßon Methode lassen sich alle und bosonders die pharmakologlsch aktivon Poptidalkoholo, welche am C-Endo zwei Alkoholgruppen oder · ne Alkohol- und eine Thlolgruppo enthalten, auf oinfacho Woiso herstellen.

Ausführungsbelsplel

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel, welches dio Herstellung des Somatostatindorivates der Formel

H-DPhe-Cys-Pho-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol betrifft, veranschaulicht.

Beispiel . j

Herstellung von H-DPhe-Cyt-Phe-DTrp-Lyt-Thr-Cvt-Thr-ol

1) Herstellung des Ankeracetals (N-CF₃CO-Threoninol-acetal der p-Formylphonoxy-essigsäure)

105g (1,0 Mol) L-Threoninol worden in 20OmI Methanol unter Stickstoffspülung vorgelegt. Zu der orhaltonon klaren Lösung wird bei O⁰C eine Lösung aus 200ml Trifluores jigsöuromethylostor in 250ml Methanol zugetropft. Dabei wird die Innentemperatur mittels Eisbad auf ca. 10⁰C gehalten. Nach 1,5 Stunden ist in der Roaktionslösung kein Threoninol mehr nachweisbar. Eindampfen bei 40°C ergibt einen weißen kristallinen Rückstand. Diesor wird in 200ml Essigsäureäthyloster bei 70⁰C gelöst und mit 100ml Hexan gefällt. Dann wird auf O⁰C abgekühlt, mit Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält das N-Trifluoracetylthreonlnol.

50,3g (0,25 Mol) des erhaltenen Produktes werden unter Stickstoff in 1,25 Litor Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemporatur 75ml Trimethylchlorsilan zugetropft. Sofort anschließend wird eino Mischung aus 70ml Triäthylamin und 250ml Tetrahydrofuran zugegeben. Es entsteht eine weiße Suspension, dio 4 Stunden bol Raumtomperatur gerührt wird. Dann wird filtriert und das Filtrat bei 4O⁰C eingedampft. Man erhält eino ölige Substanz. Diese wird in 1,5 Liter Mothylonchlorid gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit 90,4g p-Formyl-Phonoxyossigsäure vorsetzt. Dann werden portionenweise Insgesamt 9ml Trifluormethansulfonsäuro-trimethylsilyloster zugegeben. Es wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und der Rückstand gut mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat wird bei 4O⁰C eingedampft und ergibt als Rückstand ein orangorotes harzartiges Produkt. Das orangeroto Produkt wird über Kieselgel chromatographiert. Elution mit Essigsäureäthylester. Durch Eindampfen der gewünschten Fraktionen wird das oben erwähnte Acetal erhalten. Reinheit HPLC 97%.

2) Aufbau des geschützten Oktapeptlds, Oxidation am Harz und Abspaltung

17,2g Aminomethyliertes Polystyrol (0,7 Gew.-% N, dies entspricht 0,50mMol/g) werden in 80ml Methylen^ "orid/ Dimethylformamid^:! suspendiert. Dazu werdon sukzessive4,17g des Endproduktes der Stufe 1), 1,6g Hydro. ' ..tztriazolund 4,0g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemporatur ist der Kaisertest negativ. Filtrieren und Waschen. Das gewaschene Harz wird in 100ml Tetrahydrofuran/Methanol 3:1 suspendiert und portionsweise mit 10,4g Natriumborhydrid versetzt. Es wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und gewaschen. Das Harz wird wieder in Methytenchlorid/Dimethylformamid suspondiert und 5,57g FMOC-Cys(S-t-Bu)OH 1,74g Hydroxybenztriazcl (HOBT) und 3,6g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) zugegeben. Nach Abspaltung der FMOC-Schutzgruppe mit Piperidin (2x 20 Min.) werden

sukzessive welter die N-FMOC-geschützten Aminoslluren Thr-OH, Lys(BOO-OH, D-Trp-OH, Phe-OH, Cys(S-t-Bu)OH und D-Phe-OH mittel* HOBT/DCCI angekuppelt. Es wird zulotzt das FMOC ^oschütilo Oktapeptld-Harz erhalton. Beladung 0,26mMol/g.

Dieses Harz wird in 10OmI Trlfluoräthanol/Methylonchlorld 1:1 suspendiert und mit 50ml Tributylphosphin vorsetzt. Rühron 70 Stunden boi Raumtemperatur. Dann wird filtriert, gewaschen und mit 100ml einer 1:1-Mischung aus Tetrahydrofuran/I molaror Ammonacetat-Lösung versetzt. Dazu werden 1,1 ml 30%lges wäßrigos Wasserstoffperoxid gegeben und boi Raum'omporatur 24 Stunden gerührt. Dann wird gewaschen und mit einer Mischung von 20ml Trlfluoressigsäuro, 80ml Methylenchlorid, 10ml Wasser und 2 ml Thioanisol versetzt und 2 Stunden gerührt. Filtration und Waschen mit TrifluoressigsBure und Methylenchlorid. Zum Filtrat werden 200 ml Diethylether gegeben, vom Ausgefallenen abfiltriort, diosos, im wäßrigem Puffer gelöst, durch Duolit-Behandlung ontsalzt und als Acetat gofrlorgetrocknet. Man erhält die Titelvorbindung als Essigsäurosalz.

Claims (6)

1. Verfahren zur Festphason- (Solid-Phase-) Herstellung von gegebenenfalls noch Schutzgruppen tragenden Peptidalkoholon, welche am C-terminalen Ende der Poptidkotte zwei Alkoholgruppen oder eine Alkohol- und eine Thiolgruppe tragen, dadurch gekennzeichnet, daß man don (geschützten) Peptidaikohoi unter sauren Bedingungen abspaltet von einem Harz, welches Formylphenylreste enthält, woran dieser (geschützte) Peptidaikohoi mit den C-terminalen Alkoholgruppen bzw. Alkohol- und Thiolgruppen über eine Acetalgruppe gebunden ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, zur Festphasen- (Solid-Phase·) Herstellung von gegebenenfalls noch Schutzgruppen tragenden Peptidalkoholen der Formel

Y-CO-NH-CH

CHR₁-XH CH₂OH

worin Y für den Rest eines gogebenenfalls noch Schutzgruppen tragenden Peptidalkohols, R₁ für Wasserstoff oder Methyl und

X für O oder S

stehen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein den (geschützten) Peptidaikohoi tragendos Harz der Formel I

P)- Z

CH-NH-CO-Y

worin (P) für den Rest eines unlöslichen Kunstharzes und Z für eine direkte Bindung oder einen Rest, welcher das Harz mit der acotalisierten

Formylphenylgruppe verbindet

stehen, wobei die acetaiisierte CHO-Gruppe sich in m- oder p-Stellung zum Rest Z befindet und eine Vielzahl von acetalisierten Formylphenyigruppen an einem Molekül des Harzpolymers gebunden sind, unter sauren Bedingungen hydrolysiert,
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

(P)-Z- \O / ^^{r β}'^ηθη Polystyrolrest steht.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet^daß Z für eine Gruppe der Formel

-(D)P-Q₁-Q₂-(E),,-

worin Q₁ = der Rest einer am Polymer gebundenen reaktiven Gruppe Q₂ = der Rest einer an der acetalisierten Formylphenylgruppe gebundenen reaktiven Gruppe D = ein Rest, der die Gruppe Q₁ mit dem Polymer verbindet E = einRest,derdieGruppeQ₂mitderacotalisiertenFormylphenylgruppeverbindet ρ und q sind unabhängig voneinander O oder 1, steht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß Z für die Gruppe

-CH₂-NH-CO-CH-(OL-

worinR = H oder CH₃

m =0oder1
und (P) für einen Polystyrolrest stehen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X und O und R₁ für CH₃ stehen.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

R.

CH-NH-CO-Y

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

CIIO

^Q12-mit einer Verbindung der Formel