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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen 1, 2, 4-Triazolnuldeosids der Formel
EMI1.1
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man aus Verbindungen der allgemeinen Formel
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worin R'eine Alkoxygruppe und Ac je eine Acylgruppe bedeutet, nacheinander oder gleichzeitig durch Verseifung die Acylgruppen entfernt und die erhaltenen Verbindungen mit Ammoniak umsetzt.
Eine Acylgruppe Ac bedeutet vorzugsweise eine Acetyl- oder Benzoylgruppe, es können aber auch andere Acylgruppen, wie z. B. Tosylgruppen, Mesylgruppen, Brosylgruppen, Nisylgruppen usw. verwendet werden.
Die derzeit bekannten zwei Nukleosid-Antibiotika mit fünfgliedrigen heterocyclischen Ringen sind Showdomycin und Pyrazomycin, welche den nachstehend angegebenen Formeln (1) und (2) entsprechen sollen :
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Von den derzeit bekannten synthetischen nueleosidischenantivirusmitteln sind die bedeutenderen 5-Jod- - 2'-deoxyuridin (5-IDU), 9-ss-D-Arabinofuranosyladenin (Ara-A) und 1-ss-D-arabinofuranosylcytosin (Ara-C). Von diesen Substanzen ist nur 5-IDU (in 0, 1 gew.-% iger Lösung) im Handel erhältlich, u. zw. insbe- sondere als Antivirusmittel.
Diese Verbindung ist mit dem Nachteil behaftet, dass sie nur wenig löslich und stark toxisch ist, worauf die unerwünscht starke Verdünnung zurückzuführen ist, in welcher diese Verbindung derzeit verwendet wird.
Alonso et al berichtenin"J. Heterocyclic Chem."7, [1970], S. 1269-72 die Herstellung von l- (ss-D-Ribo- furanosyl) -4-carboxamido-l, 2, 3-triazol, erwähnen jedoch keinerlei biologische Aktivität. Witkowski und Robins schlagen in "The Chemical Synthesis of the 1,2,4-Triazole Nucleosides, die mit Uridin, 2'-Deoxy- uridin, Thymidin und Cytidin verwandt sind" (vgl. J. Org. Chem. 35, [1970], S. 2635-41) verschiedene 1,2,4-Triazolnukleosid-Analoga als Substanzen zur Durchführung von biologischen Tests vor, wobei jedoch keinerlei spezielle Wirkungen angegeben werden.
Spätere Untersuchungen haben gezeigt, dass von den angegebenen Analoga nur 5-Brom-3-nitro-1- (2,3,5-tri-O-acetyl-ss-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol eine geringe Antivirusaktivität besitzt, wobei man annimmt, dass diese Aktivität lediglich der Cytotoxizität der Verbindung zuzuschreiben ist.
Das erfindungsgemäss hergestellte 1- (ss-D-Ribofuraosyl)-1,2,4-triazol-3-carboxamid-Nuldeosid zeigt ein breites Spektrum hinsichtlich Antivirusaktivität und Antitumoraktivität, sowie in nichtacyllerter oder "entblookierter"Form eine wesentlich grössere Wasserlöslichkeit als die bisher bekannten Nukleosid-Antivirusmittel.
Im folgenden wird die Herstellung der Ausgangsprodukte und in den Beispielen die Erfindung beschrie - ben. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich alle Teil- und Prozentangaben auf das Gewicht und alle Temperaturangaben auf C. Alle Verdampfungen werden in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck bei 350C durchgeführt.
Herstellung der Ausgangsprodukte :
1) 1- (2,3,5-Tri-O-benzoyl-ss-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-3-carbonsäuremethylester (A) Silylierungsmethode
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(trimethylsilyl)-1, 2, 4-triazol-3-carboxylatsilazan wird unter Rühren so lange am Rückfluss gehalten, bis die Freisetzung von Ammoniak aufhört (zirka 2 h). Der Überschuss an Hexamethyldisilazan wird unter vermindertem Druck entfernt. Dabei erhält man 20, 6 g (100%) des N-Trimethylsilyl-Derivats von Methyl-1, 2, 4-triazol-3-carboxylat. b) Ribosylierung mit Halogenzucker
EMI2.2
6 g (110 mMol)chromatographie der Filtrate an Kieselgel mit Chloroform liefert reine 1-(2,3,5-Tri-O-benzoyl-ss-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-3-carbonsäuremethylester in einer Menge von 25, 1 g (44, 0%) mit einem Fp. von 137 bis 1390.
AnalysefiirC H NO :
EMI2.3
<tb>
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 63, <SEP> 04 <SEP> H <SEP> 4, <SEP> 41 <SEP> N <SEP> 7, <SEP> 35 <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 62, <SEP> 91 <SEP> H <SEP> 4, <SEP> 17 <SEP> N <SEP> 7, <SEP> 10 <SEP>
<tb>
(B) Schmelzmethode
Eine Mischung aus 12, 7 (100 mMol) 1,2,4-Triazol-3-carboxylat und 55,4 g (110 mMol) 1-O-Acetyl- - 2, 3, 5-tri-O-benzoyl-ss-D-ribofuranose wird in einem Ölbad, das auf einer Temperatur von 160 bis 1650 gehalten wird, erhitzt. Nachdem der Zucker geschmolzen ist, werden 400 mg bis-(p-Nitrophenyl)-phosphat unter Rühren zugesetzt, worauf die Mischung unter vermindertem Druck auf eine Temperatur von 160 bis 1650 während einer Zeitspanne von 15 bis 20 min erhitzt wird.
Eine Umkristallisation des Rückstandes aus Äthylacetat/Äthanol liefert 42,5 g (74, 5%) eines Produktes mit einem Fp. von 137 bis 1390.
EMI2.4
3, 5-lri-O-aoetyl-ss-D-ribofuranosyl)-1, 2, 4-triazol-3-earbonsäuremethylester- Tetra-O-acetyl-ss-D-ribofuranose wird in einem Ölbad, das auf einer Temperatur von 160 bis 1650 gehalten wird, so lange erhitzt, bis der Zucker geschmolzen ist. Dann werden 250 g bis- (p-Nitrophenyl)-phosphat zugesetzt, worauf das Erhitzen auf 160 bis 165 unter Rühren unter vermindertem Druck während einer Zeitspanne von 15 bis 20 min fortgesetzt wird. Der Rückstand wird in heissem Benzol gelöst. Die Lösung wird filtriert.
Cyclohexan wird dem Filtrat zur Gewinnung von 30, 0 g (77, 8%) eines kristallinen Produktes mit einem Fp. von 107 bis 1090 zugesetzt.
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Analyse für CHN =
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<tb>
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 46, <SEP> 75 <SEP> H <SEP> 4, <SEP> 97 <SEP> N <SEP> 10, <SEP> 91 <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> :
<SEP> C <SEP> 46, <SEP> 88 <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 03 <SEP> N <SEP> 10, <SEP> 64 <SEP>
<tb>
Das als Ausgangsprodukt verwendete Methyl-1, 2, 4-triazol-3-carboxylat lässt sich in zweckmässiger Weise durch Oxydation von 3-Methyl-1, 2, 4-triazol und anschliessende Veresterung der erhaltenen8äure nach
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PSR- carbonsäuremethylester in 300 ml eines bei 00 mit wasserfreiem Ammoniak vorgesättigten Methanols wird in einem verschlossenen Druckkolben bei einer Temperatur von 250 während einer Zeitspanne von 3 Tagen gehalten. Das Lösungsmittel wird entfernt, worauf das Produkt aus Äthanol umkristallisiert wird. Dabei erhält man 6,7 g (98%) eines Materials mit einem Fp. von 174 bis 1760.
Eine Umkristallisation des Produktes aus wässerigem Äthanol liefert eine zweite kristalline Form des Nukleosids mit einem Fp. von 166 bis 1680.
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<tb>
<tb> N405 <SEP> :Berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 39, <SEP> 34 <SEP> H <SEP> 4, <SEP> 95 <SEP> N <SEP> 22, <SEP> 94 <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 39,08 <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 10 <SEP> N <SEP> 22,67
<tb>
(B) Eine Lösung von 10, 0 g (26, 0 mMol) 1- (2, 3, 5-Tri-O-acetyl-ss-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-3- -carbonsäuremethylester in 70 ml Methanol, das bei 00 mit wasserfreiem Ammoniak gesättigt worden ist, wird in einem verschlossenen Druckkolben bei 25 während einer Zeitspanne von 18 h gehalten. Das Produkt wird aus Äthanol umkristallisiert, wobei man 5,70 g (90, 0%) 1-(ss-D-Ribofuranosyl)-1, 2, 4-triazol-3-carboxamid erhält.
Biologische Wirksamkeit :
Das erfindungsgemäss erhaltene Antivirusmittel wird auf seine Aktivität gegenüber kleinen und grossen Viren sowohl von DNA- als auch von RNA-Typen nach der Virusbewertungsmethode (VR-Methode) von Sidwell et al (Appl. Microbiol. 22, [1971], S. 797) getestet. V. R. > 1, 0 bedeutet eine definitive Antivirusaktivität, V. R. von 0,5 bis 0,9 bedeutet eine mässige Antivirusaktivität und V. R. < 0,5 gibt an, dass nur eine geringfügige oder keine merkliche Antivirusaktivität vorhanden ist.
Die nachfolgend zusammengefassten Ergebnisse, denen zu Vergleichszwecken Werte gegenübergestellt werden, die unter Verwendung von bekannten Antivirusmitteln erhalten worden sind, werden durch Testen auf Mikrotest II (Falcon Plastics) -Kunststoffplatten mit einer Monoschicht von KB- oder RK13-Zellen erhalten.
Von den zur Durchführung des Tests eingesetzten Viren erzeugt der Herpes-Typ 1 Labialis (kalte Entzündungen), Herpes-Keraütls und Herpes-Enzephalitis. Der Herpes-Typ 2 erzeugt Herpes genitalis, eine vorbereitete und übertragbare Form der Geschlechtskrankheit. Myxoma verursacht den Tod von Hauskaninchen und wilden Kaninchen, dem eine Erkrankung der Atemwege und starke Schwellungen vorangehen. Pseudorabies erzeugt eine infektiöse bulbäre Paralyse, die auch bei Vieh, Schafen, Schweinen, Hunden und Nerzen als "mad itch"-Krankheit bekannt ist. Der Parainfluenza-Virus erzeugt eine schwache Erkrankung der oberen Atemwege von Menschen, insbesondere kleinen Kindern, und wird mit der Konjunktivitis von Vieh in Verbindung gebracht. Vacoinia ist eine avirulente Form des Pockenvirus, der zur Pockenimpfung verwendet wird.
Seine Verwendung hat gelegentlich unerwünschte Nebenwirkungen zur Folge. Der Rhino-Typ 13 ist einer der vielen Viren, auf welche die üblichen Erkältungen zurückzuführen sind.
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Tabelle 1 Vergleichende Antivirusaktivität
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Verbindung <SEP> Typ <SEP> 1 <SEP> Typ <SEP> 2'Myxoma <SEP> pseudo- <SEP> Vaccinia <SEP> Adeno <SEP> Para-Typ <SEP> 13 <SEP>
<tb> Herpes <SEP> Herpes <SEP> rabies <SEP> influenza <SEP> Rhino
<tb> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP> VR <SEP>
<tb> 1 <SEP> 1- <SEP> (ss-D-Ribofurano- <SEP> 1,5
<tb> syl)-l, <SEP> 2, <SEP> 4-triazol- <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0, <SEP> 1, <SEP> 0, <SEP>
<tb> - <SEP> 3-carboxamid <SEP> 1,2 <SEP> 1,3 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 5-IDU <SEP> 1, <SEP> 4, <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Ara-C <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Ara-A <SEP> 0,7- <SEP> 0,0
<tb> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 8, <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 6, <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 7, <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
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Die vorstehend angegebene Verbindung 1 wurde in Kaninchen und Hamstern getestet. Bei nicht toxischen Dosen wird eine merkliche Anti-HSV-Keratitisaktivität festgestellt. Die Verbindung inhibiert merklich die Entwicklung von HSV-induzierten Veränderungen von Mäuseschwänzen, wenn eine lokale Verabreichung an die Infektionsstelle erfolgt.
Die Verbindung wurde auch in Mäusen gegenüber Influenza A 2, Influenza B und Parainfluenza 1 getestet, wobei eine sehr hohe Antivirusaktivität beobachtet worden ist. Diese Verbindung zeigt, wie aus der Tabelle I zu ersehen ist, ein Spektrum der Antivirusaktivität, das wesentlich breiter ist als das Spektrum von IDU, Ara-A oder Ara-C. Zusätzlichzu der vorstehend gezeigten Antivirusaktivität inhibiert 1- (P-D-Ribofuranosyl)-1, 2, 4-triazol-3-earboxamid das Wachstum der Bakterien Pseudomonas aeroginosa und der Fungi Candida albicans und Cryptococcus diffluents.
Die Verbindung 1 besitzt eine niedrige Cytotoxizität und ist in wässerigen Medien löslich.
Das l-ss-D-Ribofuranosyl-l, 2, 4-triazol-3-carboxamid besitzt ferner eine interessante Antitumorakti- vität. An drei Gruppen von C 57 Blk/6-Mäusen (6 Tiere pro Gruppe) wird subkutan Adenocarcinoma-755 verabreicht. Zwei Gruppen erhalten die Verbindung (100 mg/kg x 7 Tage und 200 mg/kg x 7 Tage) intrapertoneal, während die dritte Gruppe, die als Vergleichsgruppe dient, nur eine Salzlösung erhält. Am 16. Tag zeigen die behandelten Tiere eine 18 bzw. 63%ige Inhibierung des Tumors Im Vergleich zu den Vergleichstieren. Bei der Durchführung eines ähnlichen Versuches werden DBA/2-Mäuse mit L-1210 Leukämiezellen (1 x 105 Zellen pro Tier) geimpft.
Man stellt eine 31%ige Zunahme der mittleren Überlebensdauer gegenüber Vergleichstieren fest, wenn eine Behandlung mit der Verbindung (250 mg/kg x 7 Tage) durchgeführt wird.
Erfolgt eine Verabreichung in einer Dosierung von 250 mg/kg x 14 Tage, dann hat die Verbindung 80% überlebende Tiere (Mäuse) zur Folge, denen intraperitoneal Ehrlich-Ascitescarcinom eingepflanzt worden ist.
Ferner wird eine in vivo-Aktivität gegenüber Novikoff-Hepatoma festgestellt.