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Verfahren zur Gewinnung eines neuen Wirkstoffes mit einer Hemmwirkung auf Proteasen Verschiedene Autorenhaben bereits die physiologischen Eigenschaften der Erdnuss (Arachis hypogaea) und bestimmter Erdnussextrakte untersucht. So sind schon Untersuchungen über die antihämophile und antifibrinolytische Wirkung und ganz allgemein über die hämostatische Wirkung des Erdnussmehles in seiner Gesamtheit und seiner wässerigen und alkoholischen Extrakte beschrieben worden.
Ausserdem sind auch bereits die trypsinhemmenden Eigenschaften, die gewisse Hülsenfrüchte aufweisen, beschrieben worden, ohne dass indessen, was die Erdnusskerne anbelangt, ein exaktes Verfahren zur Isolierung und Identifizierung des aktiven Prinzips, dem diese Eigenschaften zugeschrieben werden könnten. offenbart worden ist, so dass es bis jetzt nicht möglich war, die Existenz eines solchen aktiven Prinzips, z. B. in
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technisch durchführbares Verfahren zur Isolierung und Auswertung des erwähnten aktiven Prinzips offenbart.
Demgemäss betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen Wirkstoffes mit einer Hemmwirkung auf Proteasen, einschliesslich des Plasmins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den wässerigen Extrakt von entfettetem Erdnusskernmehl zwecks Entfernung von Begleitstoffen einer aufeinanderfolgendenReihevonExtraktionsbehandlungen mit einem sauren Mittel wie Essigsäure oder Salzsäure bei PH 3-5 und mit einem alkalischen Mittel, z. B.
Natronlauge, bei PR 9-10 und danach einer Wärmebehandlung bei 70-80 C und/oder einer Dialyse gegen entsalztes Wasser und/oder einer Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz und/oder Kationenaustauscherharz unterwirft und aus dem in der Endstufe anfallenden Extrakt den aus einem homogenen, wasserlöslichen Polypeptid bestehenden Hemmstoff durch aufeinanderfolgende Fällung mit Ammonsulfat und Passagen über D. E. A. E. (Diäthyl- aminoäthyl)-Cellulose bei PH 5 und PH 7, 6 isoliert.
Der neue Wirkstoff gemäss der Erfindung stellt ein homogenes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 20000 dar. Die Elektrophorese in einer Zelle ergibt eine mittlere Wanderungsgeschwindigkeit des aufsteigenden Astes von +0, 8. 10-5 cm2 sec-'V-1 in einem Michaelis-Puffer bei PH 8,0 und einer Temperatur von +1 C unter den angewendeten Messbedingungen. Beim Ultrazentrifugieren be- trägtseine Sedimentationsgeschwindigkeit in einem Phosphatpuffer bei PH 7, 3S = 0, 82 Svedberg-Einheiten. Sein isoelektrischer Punkt, durch Elektrophorese in einer Zelle bestimmt, liegt bei etwa 6,75.
Seine Konstitution und sein Prozentgehalt an Aminosäuremolekülen sind nach der Methode von Moore und Stein (J. Biol. Chem. 211, 893 D. 954]) bestimmt worden. Der Cystingehalt ist bestimmt worden als Cysteinsäure nach Oxydation mit Perameisensäure. Ebenso ist das Methionin als Methioninsulfon nach Oxydation mit Perameisensäure bestimmt worden. Das Tryptophan ist colorimetrisch und spektrophoto- metrisch bestimmt worden. Die Gesamtergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt.
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Tabelle :
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<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> mittlere <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Gewicht <SEP> der
<tb> Aminosäuren <SEP> je <SEP> 100 <SEP> g <SEP> Protein. <SEP> Aminosäuremoleküle <SEP> Aminosäuren
<tb> Cysteinsäure <SEP> 16, <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> 2523, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Asparaginsäure <SEP> 9, <SEP> 01 <SEP> 14 <SEP> 1863, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Threonin <SEP> 7, <SEP> 60 <SEP> 14 <SEP> 1667, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Serin <SEP> 5, <SEP> 05 <SEP> 10 <SEP> 1050, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Glutaminsäure <SEP> 10, <SEP> 78 <SEP> 16 <SEP> 2354, <SEP> 08 <SEP>
<tb> Prolin <SEP> 7, <SEP> 00 <SEP> 13.
<SEP> 1496, <SEP> 69 <SEP>
<tb> Glykokoll <SEP> 4, <SEP> 14 <SEP> 12 <SEP> 900, <SEP> 84 <SEP>
<tb> Alanin <SEP> 3, <SEP> 01 <SEP> 7 <SEP> 623, <SEP> 63 <SEP>
<tb> Valin <SEP> 5, <SEP> 04 <SEP> 9 <SEP> 1054, <SEP> 35 <SEP>
<tb> Methionin <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 1 <SEP> 149, <SEP> 21 <SEP>
<tb> Isoleucin <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 1 <SEP> 131, <SEP> 17 <SEP>
<tb> Leucin <SEP> 2, <SEP> 43 <SEP> 4 <SEP> 524, <SEP> 68 <SEP>
<tb> Tyrosin <SEP> 2, <SEP> 39 <SEP> 3 <SEP> 543, <SEP> 57 <SEP>
<tb> Phenylalanin <SEP> 2, <SEP> 95 <SEP> 4 <SEP> 660, <SEP> 76 <SEP>
<tb> Lysin <SEP> 4, <SEP> 85 <SEP> 7 <SEP> 1023, <SEP> 33 <SEP>
<tb> Histidin <SEP> 2, <SEP> 33 <SEP> 3 <SEP> 465, <SEP> 48 <SEP>
<tb> Arginin <SEP> 10, <SEP> 92 <SEP> 14 <SEP> 2438, <SEP> 94 <SEP>
<tb> insgesamt <SEP> :
<SEP> 95, <SEP> 48 <SEP> 153 <SEP> 19470, <SEP> 97 <SEP>
<tb>
Die vorstehende Tabelle gibt die experimentellen Messergebnisse wieder. In dieser Tabelle stellt die Anzahl der Aminosäuremoleküle einen Durchschnittswert dar ; auf der Grundlage dieser Werte würde sich für das Polypeptid gemäss der Erfindung - wie oben angegeben-ein Molekulargewicht von ungefähr 19 471 ergeben mit Grenzwerten von 17 500 (an Hand des Isoleucins berechnet) und von 24 000 (an Hand deyMethionin berechnet).
Dieses Polypeptid ist im wesentlichen durch die Abwesenheit von Tryptophan und einen ungewöhnlich hohen Cystingehalt charakterisiert. Die Zahl der-S-S-Brücken, die im Molekül enthalten sind, scheint in der Nähe von 10 zu liegen. Die Oxydation dieser Brücken mittels Perameisensäure unter den von Hirs für die Ribonuclease angegebenen Bedingungen (J. Biol. Chem. 219. 611. [1956]) oder die Reduktion mittels Thioglykolsäure in 8-molarem Harnstoff bei PH 8, 5 unter den von Sela für die Ribonuclease angegebenen Bedingungen (Science, 125, 691.. D.1957]) heben die Hemmwirkung auf Enzyme auf.
Der erfindungsgemässe Hemmstoff ist in Wasser löslich und in Alkohol und Aceton unlöslich. Sein Molekül scheint sehr wenig ionisiert zu sein, da er von stark sauren oder basischen Austauschharzen nicht fixiert wird.
Für die Verfolgung der aktiven Fraktion im Verlauf der Extraktion sind zwei Methoden angewendet worden. Die erste Methode ist die Elektrophorese auf Agarplatten gemäss der Arbeitsweise von Uriel (Nature, 188, 853. [1960]) ; die zweite Methode ist die Bestimmung der Antitrypsin-Aktivitätnach SchwertundTakenaka (Biochem < Biophys. Acta, 16, 570. [1955]) unter Verwendung desÄthylesters des Benzoylarginins als Substrat.
Das Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemässen Inhibitors nutzt die in jeder Beziehung bemerkenswerten charakteristischen Eigenschaften des letzteren aus, um ihn von den andern Proteinen abzutrennen und zu reinigen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es zwei Reihen von Arbeitsstufen
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umfasst. Die zweite Stufenreihe kann als neue Anwendung der im übrigen klassischen Arbeitsmethoden zur Extraktion des aktiven Prinzips aus Rohmaterialien auf dieses besondere Ausgangsmaterial betrach- tet werden. Trotzdem würde die blosse und einfache Anwendung dieser Arbeitsmethoden auf das erfin- dungsgemässe Ausgangsmaterial indessenzu einem unbefriedigenden Ergebnis führen, wie es die früheren
Bearbeiter im übrigen festgestellt haben.
Das Ausgangsmaterial muss tatsächlich zunächst der ersten
Reihe von Arbeitsstufen unterworfen werden, die in einer Folge von Vorextraktionen und von Reinigungs- operationen besteht, welche das Ausgangsmaterial in eine Form überführen, die sie für die Anwendung der zweiten Stufenfolge geeignet macht.
An dieser Stelle ist darauf hinzuweisen, dass dieses erste Ausgangsmaterial aus gemahlenen und ent- fetteten Erdnusskernen besteht, wobei die Mittel, deren man sich zur Zerkleinerung und Entfettung be- dient, beliebig sein können und nicht zum Gegenstand der Erfindung gehören.
Es ist also zu berücksichtigen, dass das erfindungsgemässe Verfahren notwendigerweise beide Reihen von Arbeitsstufen umfasst, die im folgenden näher beschrieben werden, wobei die erste Stufenfolge allein originell ist, wobei aber die zweite Stufenreihe, wenngleich sie an sich bekannte Massnahmen umfasst, unwirksam sein würde, wenn ihr nicht die erste Stufenreihe vorgeschaltet werden würde.
Die erste Stufenreihe des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst selbst eine Reihe von Operationen, deren jede dem Zweck dient, verschiedene Klassen von Fremdproteinen aus dem Ausgangsmaterial zu entfernen und wobei jede Operation eines der ungewöhnlichen Verhaltensmerkmale des erfindungsge- mässen aktiven Prinzips ausnutzt. Die ersten Stufen dieser Behandlungsfolge sind aufeinanderfolgende und bei bestimmten Temperaturen durchgeführte Behandlungen mit sauren und alkalischen Mitteln, wo- bei diese Behandlungen nicht ersetzbar sind und ihre Reihenfolge vorzugsweise - aber nicht notwendiger- weise-so gewählt wird, dass zunächst die Behandlung im sauren Mittel und danach im alkalischen Mit- tel vorgenommen wird.
Die sich an diese erste Stufenfolge anschliessenden Operationen bestehen in einer thermischen Behandlung und bzw. oder einer Behandlung mit Ionenaustauschharzen.
Diese erste Stufenfolge beruht auf der Ausnutzung der folgenden bemerkenswerten Eigenschaften des erfindungsgemässen Hemmstoffes :
1. Der erfindungsgemässe Hemmstoff wird weder im sauren Medium (PH 3-4) noch im alkalischen
Medium (pH 9-10) verändert oder ausgefällt, wohingegen die meisten andern Proteine in diesen pH-Be- reichen ausgefällt werden.
2. Ebenso wird der Hemmstoff beim Durchlaufen durch schwach oder stark saure oder basische Anionen- und bzw. oder Kationenaustauschharze nicht festgehalten, wohingegen bestimmte Fraktionen von Fremdproteinen auf den Kunstharzen fixiert oder ausgefällt werden.
3. Der Hemmstoff ist thermostabil und kann in wässeriger Lösung auf 1000C ohne Verlust der Akti- vität erhitzt werden, wohingegen die Fremdproteine bei 70-80Oc koaguliert werden.
4. Er ist nicht dialysierbar im Gegensatz zu zahlreichen andern Fremdsubstanzen. wie Zucker, Aminosäuren, bestimmten Polypeptiden, Mineralsäuren und organischen Säuren sowie deren Salzen.
5. Er weist dennoch die üblichen Eigenschaften auf, durch Ammonsulfat oder Alkanole und Aceton fällbar zu sein.
Unter Berücksichtigung dieser recht eigenartigen Eigenschaften besteht das Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemässen Hemmstoffes unter Verwendung von entfettetem Erdnusskernmehl als Ausgangsstoff in einer Folge der nachstehend angeführten Arbeitsstufen : IndererstenSerie von Operationen wird erfindungsgemäss die Tatsache ausgenutzt, dass der Hemmstoff, obwohl er neutral ist und Proteinnatur aufweist, weder von einem sauren noch von einem basischen Austauschharz fixiert und weder in saurem noch in basischem Milieu ausgefällt wird.
Man behandelt demzufolge die Extraktionsflüssigkeiten mit stark sauren Mitteln, dann mit stark basischen Mitteln und bzw. oder mit sauren Austauschharzen, dann mit basischen Austauschharzen, und man kann dann gegebenenfalls die erhaltene Stoffmischung einer Reinigung mittels Alkohol oder einem andern Reagenz unterwerfen oder man kann diese Stufe auch auslassen, wenn man bei den vorangehenden Behandlungen noch stärker saure oder noch stärker basische Mittel zur Anwendung gebracht hat.
Zur Erläuterung der Erfindung werden nachstehend einige Beispiele betreffs der Durchführung dieser ersten Serie von Operationen gegeben, die man als eine Art Vorreinigung des Rohproduktes ansehen kann, wobei diese Vorreinigung selbstverständlich im Rahmen der Erfindung wesentlich ist. Die Beispiele 1 und 3 erläutern die Durchführung dieses Verfahrens unter Einschluss einer Reinigung mit Alkohol und Beispiel 2 erläutert die Durchführung des Verfahrens ohne Alkoholanwendung.
Beispiel 4 schliesslich erläutert eine Variante des Verfahrens, bei der von einer thermischen Behandlung anstatt von einer Behandlung mit Austauschharzen Gebrauch gemacht wird.
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Im Anschluss an diese Beispiele wird die Isolierung des Hemmstoffes und seine endgültige Gewin- nung in reinem Zustand erläutert, welche Schritte die zweite Serie von Operationen darstellen, die zwar an sich bekannt sind, die aber für sich allein nicht hinreichend wirksam sind, um zu einem pharmazeutisch brauchbaren Produkt zu gelangen, wenn sie nicht mit der erwähnten ersten Serie von Arbeitsstufen kombiniert werden.
Beispiel l : Man suspendiert 40 kg entfettetes Erdnusskernmehl in 400 1 entsalztem Wasser und rührt 3-4 h bei gewöhnlicher Temperatur. Man stellt das pli mit reiner Essigsäure auf etwa 5 und trennt den Niederschlag und die unlöslichen Bestandteile auf einer Filterpresse oder durch Zentrifugieren ab.
Nachdem man die entstandene Lösung auf etwa 40 1 konzentriert hat, stellt man das PH mit Essigsäure wieder auf 5 ein und filtriert erneut. Zu dem klaren Filtrat gibt man 4 Volumina denaturierten Alkohol und gewinnt den abgeschiedenen Niederschlag durch Zentrifugieren. Man suspendiert ihn in 10 l entsalztem Wasser und nach 1/2-stündigem Rühren zentrifugiert man abermals und nimmt das unlösliche Produkt in 5 1 entsalztem Wasser auf. Nach erneuter Zentrifugierung vereinigt man die überstehenden Lösungen und gibt die erhaltene Lösung auf eine mit etwa 5 1 eines feuchten sulfonierten Kationenaustauschharzesin der Säureform gefüllten Kolonne (z. B. Dowex 50 oder Amberlite IR 120). Man sammelt das saure Eluat und gibt es auf eine Kolonne, die mit etwa 71 eines feuchten Anionenaustauschharzes in der Basenform (z. B.
Dowex 2 oder Amberlite IRA 400) gefüllt ist. Man sammelt das neutrale oder schwach alkalische Filtrat, das sich auf etwa 20 l beläuft, und dialysiert es gegen entsalztes Wasser bei einer Temperatur von 2 bis 50C. Die nicht dialysierbare Fraktion konzentriert man auf etwa 5 l, stellt das pH mit Essigsäure wieder auf 5 und fällt das aktive Prinzip mit 4 Volumina denaturiertem Äthanol.
Nach Waschen mit Alkohol, dann mit Aceton und Vakuumtrocknung gewinnt man etwa 150 g eines vorgereinigten Produktes, das dazu bestimmt ist, den Operationen I, IIundinder zweiten Folge von Arbeitsstufen unterworfen zu werden, die nach Beispiel 4 beschrieben werden.
Beispiel 2 : Man verrührt 30 kg entfettetes Erdnusskernmehl 3-4 h in 300 l entsalztem Wasser bei gewöhnlicher Temperatur. Das Pa der Suspension stellt man durch Zusatz von reiner 2-n Salzsäure auf 3. 5-4, und man entfernt die unlöslichen Produkte auf der Filterpresse oder durch Zentrifugieren. Durch Zusatz von 2-n Natronleuge stelltman das PH der Lösung auf 9-9, 5 und entfernt den abgeschiedenen Niederschlag durch Filtration. Nach erneuter Einstellung des PH auf 5 konzentriert man die Lösung auf etwa 30 l. Man dialysiert die konzentrierte Lösung bei 2-5 C gegen entsalztes Wasser.
Die klare Lösung lässt man über eine Kolonne fliessen, die mit ungefähr 5 1 eines sulfonierten Kationenaustauschharzes in der Säureform gefüllt ist, und dann lässt man das saure Eluat über eine Kolonne laufen, die mit etwa 7 l eines stark basischen Anionenaustauschers gefüllt ist. Man sammelt das Filtrat und dialysiert es.
Nach Konzentrieren der nicht dialysierbaren Fraktion auf etwa 5 l stellt man das PH mit reiner Essigsäure auf 5 und fällt das aktive Prinzip durch Zusatz von 4 Volumina denaturiertem Äthanol. Man erhält ungefähr. 225 g eines vorgereinigten Extraktes.
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stellt das PH mit 10 ml reinem Ammoniak, dann auf etwa 10. Nach 2-3-stündigem Rühren entfernt man das Unlösliche durch Zentrifugieren. Man gibt zu der überstehenden Lösung 45 g eines sulfonierten Kationenaustauschharzes in der Säureform und rührt, bis das PH der Lösung sich auf etwa 5 eingestellt hat.
Nach Zentrifugieren und Konzentrieren der Lösung auf etwa 150 ml fällt man mit 4 Volumina Alkohol, gewinnt den Niederschlag durch Zentrifugieren und nimmt ihn in 30 ml entsalztem Wasser auf, verrührt ihn von neuem 30 min lang und zentrifugiert dann. Man dialysiert die klare Lösung bei 2-50C 24 h ge- gen entsalztes Wasser, lässt dann die nicht dialysierbare Lösung über eine Kolonne laufen, die mit einem sulfonierten Kationenaustauschharz in der Säureform gefüllt ist. und gibt sie dann auf eine mit einem stark basischen Anionenaustauschharz gefüllte Kolonne auf. Man sammelt das Filtrat, konzentriert es und fällt mit 4 Volumina Alkohol. Nach Abzentrifugieren des Niederschlages, Waschen desselben mit Alkohol und Vakuumtrocknung erhält man etwa 300 mg des vorgereinigten Produktes.
Beispiel 4 : Man extrahiert 1 kg entfettetes Erdnusskernmehl 2-3 h unter Rühren mit 12 l entsalztem Wasser. Das PH der Suspension stellt man mit 2-n Salzsäure auf 3, 5-4, und man entfernt die unlöslichen Proteine. Man stellt das PH der Lösung mit 2-n Natronlauge auf 9-9, 5 und trennt den Niederschlag durch Filtrieren ab. Das pH des Filtrates stellt man abermals auf etwa 5 und konzentriert die Lösung auf zirka 2 1 Man bringt die konzentrierte Lösung 10 min auf 70-80 C, kühlt sie ab und entfernt die koagulierten Proteine durch Filtration. Die Lösung wird 48 h gegen entsalztes Wasser dialysiert und dann auf etwa 200 ml konzentriert. Man stellt das PH durch Zusatz von Essigsäure auf etwa 5, filtriert und fällt die Lösung mit 4 Volumina denaturiertem Äthanol.
Der Niederschlag wird gesammelt, mit Alkohol, dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an vorgereinigtem
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Produkt beträgt 6-8 g.
Im folgenden werden nun die Phasen der Schlussreinigung des vorgereinigten Produktes beschrieben, die zu dem erfindungsgemässen Proteasehemmer führen.
Diese Phasen bestehen aus folgendem : 1-Fällung mit Ammonsulfat II-Passage über D. E. A. E.-Cellulose bei PH 5
In-Passage über D. E. A. E.-Cellulose bei pli 7, 6 I -Fällung mit Ammonsulfat
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lässt den Niederschlag sich über Nacht bei 2-5 C absetzen und zentrifugiert dann. Man löst die in der Zentrifuge abgeschiedene feste Kruste in 150 ml destilliertem Wasser und dialysiert eine Nacht lang gegen destilliertes Wasser bei 2-5 C.
II -Passage über D. E. A. E.-Cellulose bei PH 5.
Um inaktive Proteine ebenso wie ein braunes Pigment zu entfernen, ohne die den Hemmstoff enthaltende Fraktion zurückzuhalten, behandelt man 100 gD. E. A. E. -Cellulosecap. 0, 52 mit 1-nSalz- säure, dann mit 1-n Natronlauge, darauf mit destilliertem Wasser bis zur Neutralität und schliesslich mit 0, 02-molarem Phosphatpuffer bei PH 5 bis zur Gleichgewichtseinstellung bei diesem letztgenannten pH-Wert. Man gibt die D. E. A. E.-Cellulose in eine Chromatographier-Kolonne und lässt sie absetzen.
DanebenlöstmanMononatriumphosphat in der Lösung des Hemmstoffes in der Weise, dass man eine 0, 02-molare Konzentration erhält, und man stellt das PH mit einer 0, 02-molaren Dinatriumphosphatlösung auf 5. Man lässt diese Lösung über die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellte Kolonne laufen und sammelt die Eluate, bis die nicht festgehaltenen Proteine durchgelaufen sind, was man daranfeststellen kann, dass die Absorption bei X= 280 mu immer schwächer geworden ist. Die Hemmstofflösung ist noch schwach gefärbt, und man behandelt sie mit Aktivkohle ; man dialysiert sie dann gegen destilliertes Wasser, um die Mineralsalze zu entfernen und konzentriert sie auf etwa 100 ml, vorzugsweise gleichfalls durch Dialyse gegen Polyvinylpyrrolidon (oder ein anderes hydrophiles Makromolekül) bei 2-5 C.
In -Passage über D. E. A. E.-Cellulose bei pH 7,6
Man löst Dinatriumphosphat in der Lösung, um eine Konzentration von 0, 001-molar zu erreichen und stellt das PH mit einer 0, 001-molaren Mononatriumphosphatlösung auf 7, 6. Die gepufferte Lösung lässtman über eine mitD. E. A. E.-Cellulose gefüllte Kolonne laufen, wobei das PH mittels 0, 001-molarem Phosphatpuffer auf 7, 6 eingestellt ist und von 350 g trockener D. E. A. E.-Cellulose ausgegangen wurde. Man sammelt die erste Fraktion, die durchläuft und den Hemmstoff in reinem Zustand enthält. Man konzentriert die Lösung an dem Hemmstoff vorzugsweise durch Dialyse, und man lyophilisiert sie.
Man erhält 2, 5-3, 5 g des erfindungsgemässen Hemmstoffes in reinem Zustand, der die Gesamtheit der physikalischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist, die weiter oben bereits aufgezählt sind.
In biologischer Hinsicht weist das aktive Prinzip des erfindungsgemässen Produktes die bemerkenswerte Eigenschaft auf, sämtliche Proteasen, einschliesslich des Plasmins, zu hemmen, wie weiter unten näher ausgeführt wird.
Das so erhaltene Polypeptid ist also ein mächtiger Inhibitor der Esterase-Aktivitäten und der proteolytischen Trypsin-Aktivitäten. Die Hemmung der Esterase-Aktivität des Trypsins ist nach der oben erwähnten Methode von Schwert und Takenaka bestimmt worden. Hiebei wurde festgestellt, dass 1mg des erfindungsgemäss hergestellten Polypeptids ungefähr 5mg kristallisiertes Trypsin mit 11500 S. -inhei- ten im mg (oder 3 000 NFXl-Einheiten oder 35 UAE-Einheiten im mg) zu inhibieren vermag. Es sei bemerkt, dass die S. -Einheit definiert ist als die Aktivität, die eine Zunahme der optischen Dichte um
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legten Bedingungen, bewirkt. Die Inhibitor-Einheit würde dann die Aktivität sein, die erforderlich ist, um die Aktivität einer S. T. -Einheit des Trypsins zu hemmen.
In diesem Falle würde das Polypeptid ungefähr 57500 I. S. T. -Einheiten im mg aufweisen.
Die Hemmung der proteolytischen Aktivität des Trypsins wurde bestimmt unter Verwendung von Casein als Substrat nach der Methode von Kunitz (J. Gen. Physiol. 30, 291 [1947]). Diese Untersuchung gestattet festzustellen, dass lmg des erfindungsgemässen Inhibitors die proteolytische Aktivität
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von etwa SLmg kristallisiertem Trypsin mit 11500 S. T. -Einheiten hemmt.
Das erfindungsgemäss hergestellte Polypeptid ist zugleich ein Hemmstoff für die Esterase-Aktivitäten und die proteolytischen Aktivitäten des Chymotrypsins. Genauso, wie man sich bei der Ermittlung der Inhibierung der Esterase-Aktivitäten des Trypsins der Methode von Schwert und Takenaka bedient und den Äthylester des Benzoylarginins als Substrat benutzt, verwendet man im Falle desChymotrypsii1s bei der gleichen Methode den Äthylester des N-Acetyl-l-tyrosins. Gemäss dieser Bestimmungsmethode hemmt 1 mg des erfindungsgemässen Polypeptids ungefähr 2 mg des kristallisierten Chymotrypsins mit 3 375 S. T. -Einheiten im mg (oder 1 000 NFXl-Einheiten im mg oder 100 UAE-Einheiten im mg).
Die Hemmung der proteolytischen Aktivität des Chymotrypsins ist in der gleichen Weise wie beim Trypsin bestimmt worden., und gemäss dieser Bestimmungsmethode hemmt 1 mgdes erfindungsgemässen Polypeptids ungefähr 1mg des kristallisierten Chymotrypsins mit 3375 S. T. -Einheiten.
Anderseits entfaltet der erfindungsgemäss hergestellte Inhibitor seine Hemmwirkung ebenfalls auf Plasmin, und'diese Antiplasminwirkung wird veranschaulicht durch die Hemmung der Fibrinolyse, wie sie durch Blut oder Urin tierischer (Kaninchen) oder menschlicher Herkunft erzeugt wird, da dieses Blut oder dieser Urin die erforderlichen Aktivitäten enthalten, u. zw. Streptokinase für das Blut und Urokinase für den Urin.
In beiden Fällen wird die Hemmung an Hand der Fibrinplättchen-Methode von Astrup und Müllertz
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Diese antifibrinolytische Eigenschaft gestattet, darauf beruhende therapeutische Anwendungen in Betracht zu ziehen, die zu unterscheiden sind von den Anwendungen, die sich aus der Antitrypsin-Wirkung ergeben.
Während also die Antitrypsin-Wirkung in der Tat für die Behandlung der Pankreatitis ausgenutzt wird, wie weiter unten näher ausgeführt wird, nutzt man die Antiplasminwirkung zur Behandlung von Fibrinolysen (chirurgische, geburtshilfliche oder medizinische Fibrinolysen bzw. Transfusionsfibrinolysen), wie sie von Marchal und Mitarbeitern (Semaine des Hopitaux, Nr. 34/6, [1962J, S. 1985-1991) gruppenmässig zusammengefasstundbeschriebensind, aus, wobei deren wesentliche Formen die folgenden sind :
Chirurgische Fibrinolysen :
Chirurgie des Thorax, Pankreas, Uterus ;
Chirurgie der Gallenwege ;
Chirurgie der Cirrhose (Pfortader-Anastomosen) ;
Chirurgie des geöffneten Herzens.
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:Rhesus-Unverträglichkeit ;
retroplazentares Hämatom ; vorzeitige Lösung der Plazenta, verzögerte Ausstossung des abgestorbenen Eies ; Fruchtwasserembolie ; absichtlich herbeigeführte Fehlgeburten.
Transfusions-Fibrinolysen :
Blutgruppenunverträglichkeit, Transfusion von Plättchen (Ausnahmefälle).
Medizinische Fibrinolysen :
Hämorrhagischer Schock, sehr ausgedehnte Verbrennungen oder Verletzungen ;
Knochenmarksleukämie, akute Leukosen ;
Verletzungen des Leberparenchyms, Cirrhosen ;
Vaquez'Krankheit ;
Purpura fulminans, purpura thrombopenica ;
Krebsmetastasen der Prostata, des Verdauungstraktes, des Pankreas ;
Zwischenfälle bei der thrombolytischen Therapeutik.
Die Wirkung des erfindungsgemässen Peptidasenhemmers ermöglicht schliesslich auch die Behandlung der Pankreatitis, und auf diesem Anwendungsgebiet kann die therapeutische Indikation des Produktes folgendermassen unterteilt werden : a) akute Pankreatitis in allen ihren Formen (ödematöse, kongestive, nekrotische oder hämorrhagische Pankreatitis) ; b) chronische Pankreatitis ; c) andere Pankreasschäden.
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Diese Wirkung gestattet zugleich die Behandlung von Geschwüren am Zwölffingerdarm und verwandten Syndromen.
Ausser den Anwendungen, die sich unmittelbar aus der oben beschriebenen Hemmwirkung des erfindungsgemäss hergestellten Polypeptides herleiten lassen, weist das letztgenannte Produkt Eigenschaften auf, die von Bedeutung auf solchen Anwendungsgebieten sind, die ausserhalb der durch diese Aktivität für gewöhnlich bestimmten Gebiete liegen. So ist festgestellt worden, dass die äusserliche Anwendung des erfindungsgemässen Polypeptides auf Wunden eine recht bemerkenswerte Beschleunigung der Vernarbung bewirkte. Die Behandlung von Wunden mit dem erfindungsgemässen Proteasehemmer gehört daher gleichfalls zu den Anwendungsmöglichkeiten, welche dieser Hemmstoff finden kann.