AT235470B - Verfahren zur Desaggregation und Reinigung von Viren - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Desaggregation und Reinigung von Viren 
Es ist bekannt, dass Viren, besonders in konzentrierten Suspensionen und in solchen, die Ballastsubstanzen wie Lipide, Proteine und Nucleinsäuren enthalten, als Aggregate verschiedenen Ausmasses auftreten. Die Aggregate schliessen einzelne Viren in ihrem Inneren ein und verhindern, dass diese bei der Bestimmung der Viruskonzentration erfasst werden, was zur Folge hat, dass ein oft wesentlich niedrigerer Virusgehalt vorgetäuscht wird, als er tatsächlich besteht. Bei der Herstellung von sogenannten Lebendimpfstoffen kann dieser Umstand von grosser Bedeutung sein. Auch bei der Inaktivierung von Viren zur Herstellung sogenannter Totimpfstoffe reagieren nur die Viren an der Oberfläche der Aggregate, während die Viren im Inneren vom Inaktivierungsmittel möglicherweise nicht erfasst werden.

   Bisher half man sich damit, dass man während der Inaktivierung mittels Formaldehyd od. dgl. eine Zwischenfiltration vornahm, um die grösseren Virusaggregate zu entfernen. Eine solche Filtration war aber mit grossen Virusverlusten verbunden. Kleinere Virusaggregate konnten das Filter passieren. Falls sie im Inneren infektiöse Viren enthielten, die für das Inaktivierungsmittel nicht zugänglich waren, stellten sie demnach eine Gefahr dar. 



   Es ist bisher kein brauchbares Verfahren bekanntgeworden, die Virusaggregate in Einzelviren aufzuteilen,   d. h.   zu desaggregieren. Man hat zwar schon Virussuspensionen der Säulenchromatographie unterworfen, wobei jedoch lediglich eine Reinigung erzielt wurde, so z. B. durch Adsorption an Calciumphosphat und Elution unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten (J. General Microbiology 19 (3), 1958,   S. 451-461).   Hiebei entsprach das Volumen der eingesetzten Virusmenge etwa dem Volumen an Calciumphosphat in der Säule. Eine Desaggregierung von Virusaggregaten und damit eine Erhöhung der Infektiosität wurde nicht erzielt. 



   Es wurde nun ein Verfahren zur Desaggregation und Reinigung von in Suspension befindlichen Viren mittels Säulenchromatographie gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Virussuspension unter Verwendung einer   Calciumphosphat-Adsorptionssäule,   die bei Unterdruck von 500 bis 600 mm Hg mittels einer Suspension von CaHPO. 2 H20 in 0,001 m Phosphatpuffer vom PH-Wert 6,   5 - 7,   5 gefüllt wurde und deren Verhältnis von Durchmesser zu Länge wie   1 :

   10 - 20   beträgt, der Chromatographie mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,001 bis 0, 400   mlfmin   cm2 unterwirft, wobei die Konzentration der Virussuspension eingestellt ist auf etwa   4000-6000 lig   N pro ml der Säulenfüllung, die Säule mit einem 0,001 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 4,   6 - 7,   5 nachwäscht, das adsorbierte Virus mit einem Phosphat-   puffer vom pH-Wert 6, 5-7, 5 konstanter Molarität im Bereich von 0, 1 bis 2,0 m bei einer Fliessgeschwindigkeit von 0,001 bis 0,400 ml/min cm eluiert und das Eluat gegebenenfalls anschliessend mit   einem   Ionenaustauscheradsorptionsmittel,   vorzugsweise   ECTEOLA'-Cellulose,   reinigt. 



   Es wurde nämlich gefunden, dass eine erfindungsgemäss durch Behandlung mit der CaHPO. 2   H 0-   Säule gewonnene Virussuspension einen im Vergleich zur ursprünglichen Virussuspension zum Teil bis zehnfachen Infektiositätstiter besitzt. Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass diese Virussuspension ohne weitere   Massnahmen - und   damit abweichend von bekannten Verfahren - mit Ionenaustauscheradsorptionsmitteln, z. B. ECTEOLA-Cellulose, gereinigt werden kann. So sind bei den bisher bekannten Abkürzung für das Umsetzungsprodukt aus Epichlorhydrin, Cellulose-alkali, Triäthanolamin (vgl. Pe-   tersonundSober, J. Am. Chem.

   Soc.,   78 (1956),   S. 751).   

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 Verfahren zur Reinigung des Poliomyelitis-Virus durch ECTEOLA-Cellulose als Vorreinigung zunächst drei niedertourige Zentrifugationen (2000 - 3000 Umdr/min) und zwei hochtourige Zentrifugationen (30000 bis 40000 Umdr/min) erforderlich. Diese Arbeitsweise ist aber für die Produktion grosser Mengen eines gereinigten sterilen Poliomyelitis-Impfstoffes zu aufwendig, zu verlustreich und aus Sterilitätsgründen ungeeignet. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens liegt demgegenüber darin, dass alle 
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 zw.ECTEOLA-Säule im geschlossenen sterilen System kontinuierlich vorgenommen werden können. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist auf alle aggregatbildenden Viren anwendbar,   z. B.   auf die zu den Enteroviren gehörenden Poliomyelitisviren aller drei Typen und auf die zu den Myxoviren gehörenden Influenzaviren aller Typen. 



     Beispiel l :   Desaggregation von Poliomyelitis-Virus Typ I/Mahoney. 



   Durch eine Glassäule (Durchmesser 2 cm, Länge 30 cm), die bei 500 mm Unterdruck mittels einer in bekannter Weise hergestellten   CaHPO..   2 HO-Suspension in 0,001 m Phosphatpuffer vom PH-Wert 
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   Nach Durchlaufen der Virussuspension wird die Säule mit 1000 ml 0,001 m Phosphatpuffer vom PHWert 6,9 gewaschen. Anschliessend wird das adsorbierte Virus mit 2000 ml 1 m Phosphatpuffer vom PHWert 7 eluiert. Alle Lösungen passieren die Säule mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ml/min cm2. 
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 Der Reinigungsfaktor bei der Absorption der   Viren'an CaHPO..   2 HO beträgt, bezogen auf Gesamtstickstoff,   1 : 25.   der Reinigungsfaktor der hochmolekularen Substanzen bei der Elution 1 : 1,2 und die Erhöhung der Infektiosität   10000/0.   Die Steigerung der Antigenität des Impfstoffes, der aus der erfindungsgemäss hergestellten Poliomyelitis-Virussuspension erhältlich ist, nachgewiesen mit dem bei Poliomyelitis üblichen "Extinction Limit-Titer-Test", ergibt die nachstehenden Werte :

   
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<tb> 
<tb> Viruskonzentration <SEP> Extinction <SEP> Limit-Titer
<tb> 1. <SEP> Ausgangsmaterial <SEP> lOID/ml <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 2. <SEP> nach <SEP> der <SEP> Desaggregierung <SEP> 10+8,0 <SEP> ID50/ml <SEP> 1,609
<tb> 3. <SEP> durch <SEP> Volumenreduktion <SEP> 10+8,7 <SEP> ID50/ml <SEP> 2,476
<tb> 
   . Beispiel 2 : Bei einer wie in Beispiel 1 desaggregierten vorgereinigten Virussuspension mit dem Titer 108, wird auf bekannte sterile Weise durch Dialyse oder Ultrafiltration der Phosphatpuffergehalt   auf 0,02 m erniedrigt ; anschliessend wird diese Virussuspension durch eine bei 0, 1 atü Überdruck blasenfrei mit ECTEOLA-Cellulose gefüllte Säule geleitet. 



   Die Ergebnisse der in Beispiel 1 und 2 steril hintereinander ablaufenden Verfahrensstufen sind in folgender Tabelle zusammengestellt : 

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 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Ausgangsm. <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> Beispiel <SEP> 2
<tb> n. <SEP> CaHP04 <SEP> n. <SEP> ECTEOLA
<tb> @ <SEP> 10000 <SEP> ml <SEP> 2000ml <SEP> 2000ml
<tb> Infektiosität <SEP> ID50/ml <SEP> 107,0 <SEP> 108, <SEP> 7 <SEP> 108, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> Anstieg <SEP> der
<tb> Infektiosität <SEP> % <SEP> (100%) <SEP> 1000%
<tb> Desaggregierungsfaktor <SEP> (1) <SEP> 10
<tb> Gesamt-N/mg <SEP> 440 <SEP> 17,6 <SEP> 5,8
<tb> Npg/ml <SEP> 44 <SEP> 8-, <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 9
<tb> ID50/ g <SEP> N <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 0,229 <SEP> 58 <SEP> 174
<tb> Reinigungsfaktor <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> 1 <SEP> :

   <SEP> 75
<tb> Reinigung <SEP> in <SEP> < %) <SEP> 0% <SEP> 96% <SEP> 98, <SEP> 7%
<tb> 
   Beisp iel 3 :   Desaggregation von   Influenza-Virus/Stamm Asia.   



   250 ml   Influenza-infizierte Allantoisflüssigkeit,   deren grobe Eibestandteile durch kurzes Zentrifugieren bei 2000 Umdr/min entfernt worden sind, wird durch eine im Beispiel 1 beschriebene Adsorptionssäule geleitet. 250   ml Allantoisflüssigkeit enthalten 2560 Hämagglutinationseinheiten   pro ml   (H.   A.-Einheiten/ml), d.   h.   in 250 ml   640000 H. A. -Einheiten.   



   Nach Waschen der Säule mit 250 ml 0,001 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,9 wird das adsorbierte 
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   ml lPATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Desaggregation und Reinigung von in Suspension befindlichen Viren mittels Säulenchromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man die Virussuspension unter Verwendung einer Cal-   ciumphosphat-Adsorptionssäule,   die bei Unterdruck von 500 bis 600 mm Hg mittels einer Suspension von   CaHPO. 2 HO   in 0,001 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6, 5 - 7, 5 gefüllt wurde und deren Verhältnis von Durchmesser zu Länge wie   1 :

   10 - 20   beträgt, der Chromatographie mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,001 bis 0,400 ml/min   cm2   unterwirft, wobei die Konzentration der Virussuspension eingestellt ist auf etwa   4000-6000 lig   N pro ml der Säulenfüllung, die Säule mittels 0, 001 m Phosphatpuffer vom PHWert 6, 5-7, 5 nachwäscht und das adsorbierte Virus mit einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6, 5-7, 5 konstanter Molarität im Bereich von 0, 1 bis 2, 0 m bei gleicher Fliessgeschwindigkeit wie oben angegeben eluiert.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man das danach erhaltene Eluat anschliessend mit einem Ionenaustauscher-Adsorptionsmittel, vorzugsweise ECTEOLA-Cellulose, reinigt.