<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Milchsäuredehydrogenasekonzentration
Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Milchsäuredehydrogenase in Serum oder andern Flüssigkeiten.
Zahlreiche Forscher haben bereits darauf hingewiesen, dass der Spiegel der Milchsäuredehydrogenase, im folgenden kurz als LD bezeichnet, im Blut ein wichtiges Hilfsmittel bei der Diagnose von Infarkten, insbesondere Infarkten der Herzmuskeln, darstellt. Hill und Levi (CancerRsch., VoL. 14, Nr. 7, 513) wiesen weiter auf einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Spiegel der Milchsäuredehydrogenase im Blut und Leukämie hin.
Die bisher bekannten Methoden zur Bestimmung der LD besitzen jedoch den Nachteil, dass zur Durchführung der Bestimmungen ein Ultraviolett-Spektrophotometer benötigt wird, zu dessen Bedienung umfangreiche technische Kenntnisse erforderlich sind. Dadurch wurden die die Bedeutung der LD-Konzentration betreffenden Untersuchungen gehemmt.
Die Bestimmungsmethoden von White (New Eng. J. Med. [1956], Nov. 22) und Wroblewski und La Due
EMI1.1
stimmten pH-Wert eingestellter Brenztraubensäure. DPNH besitzt ein Abso : ptionsmaximum bei 340 mll.
Zu beiden Seiten des bei 340 mu liegenden Absorptionsmaximums nimmt die Lichtabsorption des DPNH rasch ab, weshalb eben ein Ultraviolett-Spektrophotometer erforderlich ist.
Im Rahmen der Bestimmungsmethode von White werden bei einem pH-Wert von 7, 8 0, 0033 Mol BrenztraubensäJre und'J, 000385 Mol DPNH verwendet. Die optische Dichte wird hiebei anfänglich bestimmt, die Reaktionsmischung wird 30 min auf 380C gehalten und die Abnahme der optischen Dichte wird als Mass für die Konzentration der Milchsäuredehydrogenase genommen.
Im Rahmen der bisher am meisten durchgeführten Bestimmungsmethode nach Wroblewski und La Due werden bei einem pH-Wert von 7, 4 und bei 250C 0, 00077 Mol Brenztraubensäure und 0,0001 Mol DPNH umgesetzt. Abgesehen davon, dass auch bei dieser Bestimmungsmethode ein U1traviolett-Sektrophoto- meter verwendet werden muss, tritt bei der Bestimmungsmethode nach Wroblewski und La Due noch die Schwierigkeit auf, dass die optische Dichte zwecksBestimmung der Abnahmegeschwindigkeit der optischen Dichte in regelmässigen Zeitabständen, im allgemeinen alle halben Minuten, bestimmt werden muss.
Diese Bestimmung der optischen Dichte selbst ist nicht allzu schwierig, jedoch liegt in dem Umstand, dass die Temperatur der Reaktionsteilnehmer konstant gehalten werden muss, eine beträchtliche praktische Schwierigkeit, da d'te vom Spektrophotometer abgestrahlte Wärme die Temperatur der Reaktionsmischung zu erhöhen und damit den Reaktionsablauf zu beschleunigen trachtet.
Es ist nun Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, d arch welches die Milchsäuredehy- d-ogenase unter Anwendung einfacher Arbeitsmethoden und unter Verwendung einfacher und billiger Einrichtungen genau bestimmt werden kann. Es ist weiters Gegenstand der Erfindung, ein solches Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung derMilchsäuredehydrogenase zu schaffen, dass im Rahmen eines solchen Verfahrens ein weiter Wellenlängenbereich verwendet werden kann und auch die Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer innerhalb weiter Grenzen schwanken können.
Weitere Vorteile der Erfindung werden im folgenden noch naher erläutert.
Gemäss der Erfindung wird nun ein Verfahren zur Bestimmung der Milchsäuredehydrogenase geschaffen, im Rahmen desselben von dem Umstand Gebrauch gemacht wird, dass Milchsäuredehydrogenase
<Desc/Clms Page number 2>
Reaktionen der Brenztraubensäure bzw. des Derivates derselben katalysiert, wobei die Menge der umge- setzten Brenztraubensäure bzw. des Derivates derselben abhängig ist von der anwesenden Menge derMilch- säuredehydrogenase.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine bestimmte bekannte Menge Brenztraubensäure bzw. ein Derivat derselben verwendet, und nach Ablauf einer bestimmten Zeit wird die verbleiben- de Menge der Brenztraubensäure bzw. des Derivates derselben kolorimetrisch bestimmt. Die Menge der verbrauchten Brenztraubensäure bzw. des Derivates derselben ist eine Funktion der anwesenden Menge der
Milchsäuredehydrogenase, so dass die Menge der vorhandenen Milchsäuredehydrogenase unmittelbar be- stimmt werden kann.
Soweit im Rahmen der Beschreibung der Ausdruck "Brenztraubensäure bzw. das Derivat derselben" verwendet wird, ist darunter eine Quelle von Ionen der Brenztraubensäure zu verstehen. Als eine solche
Quelle kann Brenztraubensäure selbst oder eines ihrer Salze verstanden werden, wobei in beiden der Fälle der pH-Wert in geeigneter Weise eingestellt wird. In den später noch gegebenen Ausführungsbeispielen wird der pH-Wert auf etwa 7,5 eingestellt. Im folgenden wird stets kurz Brenztraubensäure statt Brenztraubensäure bzw. ein Derivat derselben gesagt.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens werden insbesondere bekannte Mengen Brenztrauben- säure und Dihydro-diphospho-pyridin-nucleotid in Gegenwart eines bekannten Volumens einer in unbe- kannter Konzentration Milchsäuredehydrogenase enthaltenden Lösung vermischt. Nach Ablauf einer genau bestimmten Zeit wird die Reaktion unterbrochen, und die verbleibende Brenztraubensäure wird mit einem geeigneten Hydrazin, wie beispielsweise 2, 4-Dinitrophenylhydrazin, zu einem intensiv gefärbten Hydra- zon umgesetzt. Anschliessend wird die optische Dichte oder die Lichtdurchlässigkeit des Hyd : azons be- stimmt, und die Konzentration der Milchsäuredehydrogenase kann anschliessend aus einem Diagramm ent- nommen werden.
Zur Herstellung eines solchen Diagramms, welches einfach eine Eichkurve für ein bestimmtes Kolori- meter und eine bestimmte Wellenlänge des Lichtes darstellt, wird die optische Dichte der aus innerhalb des zu erwartenden Bereiches liegenden Brenztraubensäurekonzentrationen erhaltenen Hydrazons aufge- tragen.
Die unter den Bedingungen der nachfolgend beschriebenen Bestimmungsmethode äquivalenten Milchsäaredehydrogenaseeinheiten pro ml sind für verschiedene Konzentrationen der Brenztraubensäure in der folgenden Tabelle angegeben.
EMI2.1
<tb>
<tb> ml. <SEP> 0, <SEP> 00080 <SEP> m <SEP> Äquiv.
<SEP> den <SEP> Berger-Broida
<tb> Brenztraubensäure <SEP> Milchsäuredehydrogenasebei <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> Wasser <SEP> einheiten/ml
<tb> l, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 280
<tb> 0, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 640 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 040 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 530 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 000 <SEP>
<tb>
DieBerger-Broida-Einheiten sind willkürliche Masse für die Wirksamkeit der Milchsäuredehydrogenase, jedoch sind die unten den später beschriebenen Bedingungen erhaltenen Einheiten vergleichbar mit den nach Wroblewski erhaltenen Einheiten. Es können auch andere willkürliche Einheiten an Stelle der Berger-Broida-Einheiten verwendet werden.
Beispielsweise kann eine Eichkurve so hergestellt werden, dass sechs P : oben von brenztr ubensaurem Natrium der in der Tabelle angegebenen Art verwendet werden. Zu jeder dieser Proben wird 1 ml standardisiertes 2,4-Dinitrophenylhydrazin zugegeben. Die Proben werden, nachdem das 2, 4-Dinitrophenyl- hydrazin zugegeben wurde, 20 min bei Raumtemperatur, 25 50C stehen gelassen. Sofort nach Ablauf von 20min werden 10 ml 0, 4 n-Natriumhydroxyd zu jeder der Proben zugegeben und gut mit den Proben vermischt. 5 min, nachdem das Natriumhyd : oxyd zugegeben worden war, wird die optische Dichte oder Lichtdurchlässigkeit jeder Probe gegen Wasser als Vergleichsflüssigkeit bestimmt.
Die verwendete Lichtwellenlänge wird vorzugsweise so gewählt, dass eine optische Dichte von etwa 0, 9 (120/0 Lichtdurchlässigkeit) für die erste Probe, das ist die 1, 0 ml brenztraubensaures Natrium und 0, 1 ml Wasser enthaltende
<Desc/Clms Page number 3>
Probe, erhalten wird. Dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, und die Wellenlänge kann grösser oder kleiner gewählt werden, so dass eine geeignete Einstellung erhalten wird. Es ist jedoch wünschenswert, eine solche Einstellung zu wählen, dass fu den grössten möglichen Wert ein Wert für die optische Dichte von solcher Grösse erhalten wird, der innerhalb des Anzeigebereiches des Messinstrumentes noch ables- bar ist.
Es ist ersichtlich, dass bei der praktischen Durchführung der Bestimmung der Wirksamkeit der Milchsäu- redehydrogenase die schliesslich erhaltene optische Dichte der Lösung eine inverse Funktion der Wirksamkeit der Milchsäuredehydrogenase ist, da, je grösser die Wirksamkeit der Milchsäuredehydrogenase ist, umso we- niger Brenztraubensäure verbleibt.
Deshalb kann es, wenn eine hohe Milchsäuredehydrogenasewirksamkeit gemessen werden soll und wenn das verwendete SpectrophotometeroderColorimeter bei sehr hohen und bei sehr niedrigen optischen Dichten weniger genau arbeitet als im mittleren Bereich, wünschenswert sein, eine
Wellenlänge zu wählen, welche für das erste Eichmuster einen grösseren Wert fü, die optische Dichte gibt als er normalerweise verwendet würde, d. h., eine optische Dichte, welche zu gross ist, um mit grosser
Genauigkeit gemessen werden zu können, so dass die Versuchsergebnisse näher innerhalb des mittleren Be- reiches liegen.
Umgekehrt kann, wenn sehr niedere Wirksamkeiten der Milchsäuredehydrogenase zu er- warten sind, die Wellenlänge so gewählt werden, dass anfänglich ein niedrigerer Wert für die optische
Dichte erhalten wird, als er unter normalen Bedingungen verwendet werden würde, so dass der erhaltene
Wert für die optische Dichte im mittleren, d. h. leicht ablesbaren Bereich liegt.
Brauchbare Wellenlän- gen liegen innerhalb eines Bereiches von etwa 400 mu bis 550 mil. Wenn jedoch einmal eine bestimmte
Wellenlänge des Lichtes für die Messzwecke gewählt wurde, muss fou due gesamte Eichung und auch für hinkünftige Bestimmungen der Milchsäuredehydrogenase, welchen die bei Verwendung einer bestimmten
Lichtquellenlänge erhaltene Eichkurve zugrunde liegt, Licht genau derselben Wellenlänge verwendet wer-
EMI3.1
kurve gezeigt, und die in der Fig. laufscheinenden optischen Dichten wurden mit Lichtvon einer Wellenlänge von 525 mbt in einem Colemanjr. Colorimeter in 19 mm-Röhren bestimmt.
Es konnte eine praktisch identische Kurve erhalten werden, went dis optischen Dichten in einem Beckmann DU-Spectrophotometer in 10 mm-Küvetten und unter Verwendung von Licht einer Wellenlänge von 464 mu bestimmt wurden.
EMI3.2
der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode1, 0 mg Dihydro-diphospho-pyridin-nuc1eotid in trockener Form in einer Phiole eingebracht. 1, 0 cm einer 0, 00080 m-Lösung von brenztraubensaurem Natrium wird in die Phiole einpipettiert und die Phiole hierauf zwecks Aufwärmung der Reaktionspartner einige Minuten in ein auf 370C erwärmtes Wasserbad gebracht.
Es können auch andere Temperaturen verwendet werden, soferne der graphisch festgehaltenen Lichtdurchlässigkeitskurve eine geeignete Temperaturkorrekturskala beigegeben ist. Höhere Temperaturen
EMI3.3
Milchsäuredehyd : ogenase zunimmt,umgekehrt.
Nun werden 0,10 cm3 verdümtes Serum (l Teil Serum auf 5 Teile Wasser) in die Phiole gegeben, der Inhalt leicht umgeschüttelt, die Uhr eingestellt, und hierauf wird die Phiole in ein Wasserbad eingebracht.
Nach Ablauf von genau 30 min nach der Zugabe des Serums werden 1, 0 cm3 einer standardisierten Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydazin(1 mMol/l in ln-HCl) zugegeben. Die Lösung wird durch Schütteln gut durchgemischt, die Phiole aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemperatur sodann stehen gelassen. 20 min nach Zugabe des 2, 4-Dinitrophenylhydrazins werden 10 cm3 0, 4n-NaOH-Lösung zugegeben und die erhaltene Lösung durch mehrmaliges Umkehren der Phiole geschüttelt, worauf die Lösung in eine Küvette übergeführt wird. Nach Ablauf von weiteren 5 min wird die optische Dichte bzw. die Lichtdurchlässigkeit der Lösung abgelesen, wobei Licht jener Wellenlänge verwendet wird, mit welchem die Eichkurve zu diesem Instrument gewonnen wurde.
Die Wirksamkeit der Milchsäjredehydrogenase wird direkt aus dem Diagramm entnommen.
Soferne ein grösserer Wert als er 2000 Einheiten/cm3 entspricht, erhalten wird, ist es zu empfehlen, den Versuch unter Verwendung weiter proportional verdünnten Serums zu wiederholen. Der nun nach der
EMI3.4
pliziert, der richtige Wert für die Einheiten/cm. Wenn niedrige Werte für die Milchsäuredehydrogenase zu erwarten sind, kann unverdl1n. 1tes Serum verwendet werden, wobei dann allerdings die in der dritten Kolonne der Tabelle angegebenen Einheilen entsprechend richtiggestellt werden müssen.
Es ist leicht einzusehen, dass es unbedingt erforderlich ist, dass die verschiedenen Reagentien standardisiert werden müssen, wenn gleichbleibende Ergebnisse erhalten werden sollen. Wenn die Reagentien in
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
<Desc/Clms Page number 5>
worden war, darf mindestens erst 10 min nachher erfolgen, jedoch kann eine Verzögerung von mehr als
1 h in Kauf genommen werden, d. h., dass unter den im Beispiel angegebenen Bedingungen eine minima- le Zeitspanne von 10 bis 15 min eingehalten werden muss, und dass die im Ausführungsbeispiel angegebene
Zeitspanne von 20 min Wartezeit einfach aus Sicherheitsgründen so gewählt wurde. Nachdem das Natri- umhydroxyd zugegeben worden war und die Lösung geschüttelt wurde, entwickelt sich die Farbe in etwa
5 min vollständig. Diese Farbe bleibt mindestens 1 h lang stabil.
Die in den Beispielen erwähnte Milchsäuredehydrogenase stammte aus dem Blutserum. Dasselbe Be- stimmungsverfahren kann aber auch unterVerwendung von Extrakten der Rückenmarksflüssigkeit, von He- fe, von Bakterien, von Pflanzen von Geweben oder von andern Milchsäuredehydrogenase enthaltenden I Flüssigkeiten durchgeführt wèrden.
Der pH-Wert der Lösung kann auf einen von 7, 5 verschiedenen pH-Wert eingestellt werden. Es wurde jedoch gefunden, dass die Milchsäuredehydrogenaseaktivität mit verschiedenen pH-Werten merklich schwanken kann, und dass eine Änderung der Konzentration der Brenztraubensäure bei verschiedenen pH-Werten die Wirksamkeit der Milchsäuredehydrogenase derart verändern kann, dass in dem Masse, als die Konzentration der Brenztraubensäure im Laufe der Reaktion abnimmt, die Reaktionsgeschwindigkeit sich derart verändert, dass sie ein entschieden nichtlineares Zeitverhalten zeigt. In dem oben angegebe- nen Ausführungsbeispiel ist dieses Problem jedoch nicht behandelt. Unter verschiedenen Bedingungen ist es, wie bereits oben erwähnt wurde, erforderlich, die Eichkurve in einer gegebenen optischen Dichte ent- sprechenden Einheiten neu zu eichen.
Wenn auch durch das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren die Zusammengehörigkeit der Milch- säuredehydrogenaseeinheiten mit der entsprechenden Krankheit keinen Gegenstand der vorliegenden Er- findung bildet, so ist doch die Feststellung interessant, dass, wie die Patentinhaberin gefunden hat, im normalen Fall etwa 165-332 Berger-Broida-Einheiten/cms Blutserum, u. zw. bestimmt nach dem erfin- dungsgemässen Verfahren, erwartet werden können, während in Fällen von Herzinfarkt die Maximalwerte
EMI5.1
Werte sind für heptocellulare Nekrosis, metastatische Karzinome, diabetische Ketosis, infektiöse Mononucleosids und cerebrale Infarkte angegeben worden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Milchsäuredehydrogenasekonzentration, dadurch gekennzeichnet, dass Brenztraubensäure bzw. ein Derivat derselben mit Dihydro-diphospho-pyridin-nuc- leotid in Gegenwart einer unbekannten Menge von Milchsäuredehydrogenase, bei einer bestimmten Temperatur, während einer bestimmten Zeit, in einem bestimmten Lösungsmittelvolumen umgesetzt wird, wobei die Anfangsmenge der Brenztraubensäure bzw. des Derivates derselben bekannt ist, und nach abgeschlossener Umsetzung die nicht umgesetzte Brenztraubensäure bzw. das Derivat derselben kolorimetrisch bestimmt wird.