AT17129U1 - Sprühgetrocknetes Gemisch humaner Milch-Oligosaccharide - Google Patents

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AT17129U1
AT17129U1 ATGM50151/2019U AT501512019U AT17129U1 AT 17129 U1 AT17129 U1 AT 17129U1 AT 501512019 U AT501512019 U AT 501512019U AT 17129 U1 AT17129 U1 AT 17129U1
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Jennewein Stefan
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Abstract

Offenbart ist ein sprühgetrocknetes Pulver, bestehend aus einer Mischung aus strukturell unterschiedlicher Humanmilcholigosaccariden, Methoden für die Produktion des sprühgetrockneten Pulvers sowie die Verwendung für die Zubereitung der Ernährungszusammensetzungen und Ernährungszusammensetzungen mit diesem sprühgetrocknetem Pulver.

Description

Beschreibung
ERNÄHRUNGSZUSAMMENSETZUNG UMFASSEND EINE SPRÜHGETROCKNETE MlISCHUNG VON HUMANMILCHOLIGOSACCHARIDEN
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft Humanmilcholigosaccharidzubereitungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung feste Zubereitungen von Humanmilcholigosacchariden.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
[0002] Die menschliche Muttermilch enthält Kohlenhydrate in erheblichen Mengen. Zu den in der menschlichen Muttermilch vorhandenen Kohlenhydraten zählen Monosaccharide wie L-Fucose und N-AcetylIneuraminsäure, das Disaccharid Lactose und bis zu 20 g/l Oligosaccharide, die sogenannten „Humanmilcholigosaccharide (HMO)“. HMOs stellen den dritthäufigsten Bestandteil der menschlichen Muttermilch dar. Es wird vermutet, dass in der Humanmilch mehr als 150 strukturell unterschiedliche Oligosaccharide vorhanden sind. Ausgewählte HMO sind in Tabelle 1 dargestellt. Jeweils etwa 10 bis 13 dieser HMO sind in einer Konzentration von mehreren hundert Milligramm bis Gramm pro Liter in der Humanmilch vorhanden (Thurl et al., (2017), Nutrition Reviews 75(11) 920-933). Unter den HMOs sind neutrale HMOs sowie saure HMOs bekannt, die mindestens eine N-Acetylneuraminsäure (NeuAc)-Einheit enthalten. Die strukturelle Komplexität und Reichhaltigkeit dieser Oligosaccharide ist einzigartig für die Humanmilch und wird in der Milch anderer Säugetiere wie - beispielsweise - domestizierter Milchtiere nicht gefunden.
[0003] Da HMOs vom Menschen nicht verdaut werden, ist die physiologische Rolle dieser Saccharide seit mehreren Jahrzehnten Gegenstand von Untersuchungen. Die präbiotische Wirkung der HMOs wurde vor mehr als 100 Jahren entdeckt. Beim Verzehr können HMOs die Zusammensetzung des menschlichen Darmmikrobioms modulieren, indem sie das Wachstum nützlicher Bakterien unterstützen.
Name Chemische Struktur
2-FL Fuc(a1,2)Gal(ß1,4)Glc 3-FL Gal(ß1,4)(Fuc(a1,3))Glc DFL Fuc(a1,2)Gal(ß1,4)Glc (a1,2)! Fuc LNT Gal(ß1,3)GICNAc(ß 1,3)Gal(ß 1,4)Glc LNnT Gal(ß1,4)GICNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)GIc LNFP-I Fuc(a1,2)Gal(ß1,3)GICcNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)Glc LNFP-II Gal(ß1,3)(Fuc(a1,4))GICNAc(ß 1,3)Gal(ß 1,4)GIc LNFP-II Gal(ß1,4)(Fuc(a1,3))GICcNAc(ß1,3)Gal(ß1,4)Glc LNFP-V Gal(ß1,3)GICNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)(Fuc(a1,3))Glc 3'-SL NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,4)Glc 6'-SL NeuAc(a2,6)Gal(ß 1,4)Glc LSTa NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,3)GICNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)Glc
LSTb NeuAc
1(02,6) Gal(ß1,3)GICNAc(ß 1,3)Gal(ß 1,4)Glc LSTc NeuAc(a2,6)Gal(ß1,4)GICNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)Glc LNDFH-I Fuc(a1,2)Gal(ß1,3)GIcNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)Glc ı(a1,4)
Fuc LNDFH-II Gal(ß1,3)GICNAc(ß 1,3)Gal(ß 1,4)GIc 1(a1,4) (a1,3)! Fuc Fuc
Name Chemische Struktur LNDFH-IIN Gal(ß1,3)GICNAc(ß 1,3)Gal(ß 1,4)GIc 1(a1,3) (a1,3)! Fuc Fuc F-LSTa NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,3)GICcNAc(ßB1,3)Gal(ß1,4)Glc ı(a1,4) Fuc F-LSTb NeuAc 1(02,6) Fuc(a1,2)Gal(ß1,3)GICcNAc(ßB1,3)Gal(ß 1,4)Glc F-LSTc NeuAc(a2,6)Gal(ß 1,4)GICcNAc(ß1,3)Gal(ß1,4)Glc (a1,3)! Fuc FSL NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,4)Glc (a1,3)! Fuc DS-LNT NeuAc 1(a2,6) NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,3)GICNAc(ß1,3)Gal(ß 1,4)Gle FDS-LNT-I NeuAc 1(a2,6) NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,4)GICNAc(ßB1,3)Gal(ß 1,4)Gle FDS-LNT-II NeuAc 1(a2,6) NeuAc(a2,3)Gal(ß 1,4)GICcNAc(ß1,3)Gal(ß1,4)Glc (a1,3)! Fuc
Tabelle 1: Strukturen nennenswerter Oligosaccharide in der menschlichen Muttermilch.
[0004] In den letzten Jahren wurden einige weitere funktionelle Wirkungen der HMOs aufgedeckt, insbesondere deren Auswirkung auf die Entwicklung von Neugeborenen. Es ist bekannt, dass HMOs als Täuschkörper fungieren, um das Infektionsrisiko durch bakterielle und virale Erreger zu verringern, die durch Bindung an die Oberflächenglykoproteine humaner Zellen an diese haften. Zusätzlich besitzen verschiedene HMO eine entzündungshemmende Wirkung und wirken als Immunmodulatoren Daher wurde vorgeschlagen, dass HMOs das Risiko für die Entwicklung von Nahrungsmittelallergien verringern. Ein positiver Effekt von sialylierten HMOs auf die Entwicklung des Zentralnervensystems eines Neugeborenen wird ebenfalls intensiv diskutiert (besprochen in „Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Origins and functions of milk-borne oligosaccharides and bacteria“, Academic Press (2017), Herausgeber: McGuire M., McGuire M. und Bode L.).
[0005] Um die vorteilhaften Wirkungen von HMOs auszunutzen, gehen die Anstrengungen dahin, einzelne HMOs der Ernährungszusammensetzung, insbesondere der Säuglingsanfangsnahrung, zuzugeben. Besser jedoch wäre eine Ergänzung von Ernährungszusammensetzungen mit einer Kombination verschiedener HMOs, da solche Zusammensetzungen dem natürlichen Ursprung der HMOs, nämlich Humanmilch, stärker ähneln und umso wahrscheinlicher bessere Auswirkungen auf die Gesundheit und Entwicklung eines Menschen haben als Zusammensetzungen, die nur eine einzelne Art der HMOs enthalten.
[0006] Das begrenzte Angebot an HMOs zur Ergänzung von Ernährungszusammensetzungen führte zur Entwicklung von Verfahren zur chemischen Synthese von HMOs. Die Nachteile dieser chemischen Synthesen führen zu biokatalytischen Ansätzen, wobei HMOs in vitro unter Verwendung aufgereinigter Enzyme wie Glycosyltransferasen synthetisiert werden. Heute werden einzelne HMO im industriellen Maßstab durch Fermentation gentechnisch veränderter mikrobieller
Zellen hergestellt (WO 2015/150328 A1, WO 2017/043382 A1, WO 2010/070104 A1, WO 2012/ 097950 A1). Die HMOs werden von gentechnisch veränderten mikrobiellen Zellen synthetisiert und können aus dem Fermentationsmedium und/oder Zelllysat gewonnen werden, um eine im Wesentlichen reine Zubereitung des HMOs zu erhalten.
[0007] Während ihrer Gewinnung aus einer Fermentationsbrühe liegen HMO üblicherweise in Form eines flüssigen Prozessstroms vor, z.B. einer wässrigen Lösung, die das HMO von Interesse enthält und auch unerwünschte HMO enthalten kann, die Nebenprodukte sind, die während der fermentativen Herstellung des erwünschten HMO erzeugt wurden. Zusammen mit der Gewinnung des erwünschten HMOs, d.h. des HMOs von Interesse, wird dessen Konzentration im Prozessstrom und dessen Reinheit erhöht. Eine wässrige Lösung, die HMOs enthält, ist jedoch anfällig für eine Kontamination durch Bakterien oder Pilze. Daher ist es vorzuziehen, die erwünschten HMOs als trockenes oder festes Produkt bereitzustellen, das eine geringe Menge Wasser enthält. Das Wachstum von mikrobiellen Organismen ist auf/in einem solchen festen Produkt kaum möglich.
[0008] Typischerweise wird ein Saccharid in fester Form durch Kristallisation erhalten. Die Kristallisation einzelner HMO aus einer wässrigen Lösung wurde für 3-Fucosyllactose (WO 2014/ 075680 A), für 2'-Fucosyllactose (WO 2011/150939 A), Difucosyllactose (WO 2016/086947 A), Lacto-N-tetraose (WO 22017/101953 A), Lacto-N-neo-tetraose (WO 2014/094783 A) beschrieben. Die Kristallisation von HMO beinhaltet die Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, hauptsächlich Ethanol oder Methanol, oder organischen Säuren wie Eisessig. Die Verwendung von Alkoholen, insbesondere Methanol, zur Kristallisation von HMO am Ende des Rückgewinnungsprozesses ist jedoch ungeeignet, wenn die HMO für den menschlichen Verzehr verwendet werden sollen. Darüber hinaus sind organische Lösungsmittel teuer in der Anschaffung und Entsorgung. Zudem sind organische Lösungsmittel schädlich für die Umwelt und für die Mitarbeiter, die sie handhaben. Daher stellt die Kristallisation von HMO ein Nachteil bei der Herstellung von HMO im industriellen Maßstab dar und sollte insbesondere am Ende des Wiedergewinnungsprozesses des erwünschten HMO vermieden werden.
[0009] Es besteht folglich ein Bedarf zur Bereitstellung einer festen Zubereitung der genannten HMOs bereitzustellen, wobei die vorstehend angeführten Nachteile zumindest teilweise verbessert werden.
[0010] Die Aufgabe wird durch eine Ernährungszusammensetzung gelöst umfassend ein sprühgetrocknetes Pulver, das eine Mischung strukturell unterschiedlicher HMO umfasst.
KURZDARSTELLUNG
[0011] In einem ersten Aspekt wird eine Ernährungszusammensetzung bereitgestellt umfassend ein sprühgetrocknetes Pulver, das im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs besteht oder diese enthält.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
[0012] Fig. 1 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung von sprühgetrockneter 3-Fucosyllactose veranschaulicht.
[0013] Fig. 2 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung von sprühgetrockneter Lacto-N-tetraose veranschaulicht.
[0014] Fig. 3 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung von sprühgetrockneter 6'-Sialyllactose veranschaulicht.
[0015] Fig. 4 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung von sprühgetrockneter 3'-Sialyllactose veranschaulicht.
[0016] Fig. 5 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung einer sprühgetrockneten Mischung aus 2'-Fucosyllactose und Lacto-N-tetraose veranschaulicht.
[0017] Fig. 6 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Pulverröntgenbeugung einer sprühgetrockneten Mischung aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, Lacto-Ntetraose, 3'-Sialyllactose und 6'-Sialyllactose veranschaulicht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
[0018] Gemäß einem Aspekt wird ein sprühgetrocknetes Pulver bereitgestellt, das im Wesentlichen aus strukturell unterschiedlichen HMOs besteht oder eine Mischung aus strukturell unterschiedlichen HMOs enthält.
[0019] In einer Ausführungsform besteht das sprühgetrocknete Pulver im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs.
[0020] Der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Zusammensetzungen bestehend aus der oder den nach dem Ausdruck angegebenen Verbindung(en) und - gegebenenfalls - unvermeidlichen Nebenprodukten. Diese unvermeidlichen Nebenprodukte umfassen - zum Beispiel - Verbindungen, die während der mikrobiellen Fermentation zur Herstellung eines oder mehrerer der HMO erzeugt wurden, sowie Verbindungen, die in einen Prozessstrom eingebracht wurden, aus dem das oder die HMO gewonnen werden, die aber nicht daraus entfernt werden konnten. Der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus“ in Bezug auf sprühgetrocknete Pulver umfasst sprühgetrocknete Pulver, die bezogen auf die Trockensubstanz des sprühgetrockneten Pulvers mindestens 80 Gew.%, mindestens 85 Gew.%, mindestens 90 Gew.%, mindestens 93 Gew.%, mindestens 95 Gew.%. oder mindestens 98 Gew.% HMOs enthalten. Der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus“ wird gleichermaßen in Bezug auf sprühgetrocknete Pulver, Prozessströme und Lösungen, die HMOs enthalten, verwendet.
[0021] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform besteht die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs aus zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder mehr als sieben strukturell unterschiedlichen HMOs. Die strukturell unterschiedlichen HMOs umfassen neutrale HMOs und sialylierte HMOs. Somit kann die HMO-Mischung mindestens ein neutrales HMO und/oder mindestens ein saures HMO enthalten.
[0022] Das mindestens eine neutrale HMO kann aus der Gruppe bestehend aus 2'-Fucosyllactose (2'-FL), 3-Fucosyllactose (3-FL), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-neotetraose (LNnT)) und Lacto-N-Fucopentaose | (LNPFI) ausgewählt werden.
[0023] Das mindestens eine saure HMO kann aus der Gruppe bestehend aus sialylierten HMO, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus 3'-Sialyllactose (3'-SL), 6'-Sialyllactose (6’-SL), SiaIyllacto-N-tetraose a (LST-a), Sialyllacto-N-tetraose b (LST-b), Sialyllacto-N-tetraose c (LST-c) und Disialyllacto-N-tetraose (DSLNT) ausgewählt werden.
[0024] Daher können die strukturell unterschiedlichen HMOs der Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus 2'-FL, 3-FL, LNT, LNnT, LNFPI, 3'- SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c und DSLNT besteht.
[0025] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs fünf strukturell unterschiedliche HMOs oder besteht im Wesentlichen aus diesen. In einer zusätzlichen Ausführungsform sind die fünf strukturell unterschiedlichen HMO 2'-FL, 3-FL, LNT, 3'-SL und 6'-SL. In einer beispielhaften Zusammensetzung der Mischung liegen die fünf strukturell unterschiedlichen HMOs in der Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs in Mengen wie in Tabelle 2 angegeben vor.
HMO |Gew.% 2Z-FL 52,2 3-FL 13,0 LNT 26,1 3'-SL 3,5 6’'-SL 5,2 Gesamt 100,0
Tabelle 2: Zusammensetzung einer beispielhaften Mischung, bestehend aus fünf strukturell unterschiedlichen HMOs.
[0026] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs sieben strukturell unterschiedliche HMOs oder besteht im Wesentlichen aus diesen. In einer zusätzlichen Ausführungsform sind die sieben strukturell unterschiedlichen HMO 2'-FL, 3-FL, LNT, LNnT, LNFPI, 3'-SL und 6’-SL. In einer beispielhaften Zusammensetzung der Mischung liegen die sieben strukturell unterschiedlichen HMOs in der Mischung in Mengen wie in Tabelle 3 angegeben vor.
HMO |Gew.% 2Z-FL 39,0 3-FL 12,0 LNT 23,0 LNNT 2,0 LNFPI 16,0 3'-SL 3,0 6’'-SL 5,0 Gesamt 100,0
Tabelle 3: Zusammensetzung einer beispielhaften Mischung, bestehend aus sieben strukturell unterschiedlichen HMOs.
[0027] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält oder besteht das sprühgetrocknete Pulver im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs und mindestens einem Monosaccharid. Bevorzugt ist das mindestens eine Monosaccharid aus der Gruppe bestehend aus L-Fucose und N-AcetyIneuraminsäure (NeuAc) ausgewählt. In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält das sprühgetrocknete Pulver die Monosaccharide L-Fucose und N-AcetylIneuraminsäure.
[0028] In einer besonderen Ausführungsform besteht das sprühgetrocknete Pulver im Wesentlichen aus den HMOs 2'-FL, 3-FL, LNT, LNnT, LNFPI, 3'-SL und 6'-SL sowie den Monosacchariden L-Fucose und N-Acetylneuraminsäure.
[0029] In einer beispielhaften Zusammensetzung liegen die sieben strukturell unterschiedlichen HMOs und die zwei Monosaccharide in Mengen wie in Tabelle 4 angegeben vor.
HMO |Gew.% 2Z-FL 33,6 3-FL 10,7 LNT 20,1 LNNT 2,0 LNFPI 13,4 3'-SL 2,7 6’'-SL 4,0 NeuAc 8,1 L-Fucose 5,4
100,0
Tabelle 4: Zusammensetzung einer beispielhaften Mischung, die HMOs und Monosaccharide enthält.
[0030] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst oder besteht das sprühgetrocknete Pulver im Wesentlichen aus der in Tabelle 5 angegebenen Zusammensetzung.
Saccharid A [Gew.%] B [Gew.%] 2-FL 30,0 - 55,0 33,6 - 52,2 3-FL 10,0 - 15,0 10,7 - 13,0 LNT 20,0 - 30,0 20,1 - 26,1 LNNT 0,0 - 5,0 0,0 - 2,0 LNFPI 0,0 - 20,0 0,0 - 16,0 3'-SL 2,0 - 4,0 2,7 - 3,5 6’'-SL 4,0 - 6,0 4,0 - 5,2 NeuAc 0,0 - 10,0 0,0 - 8,1 L-Fucose 0,0 - 6,0 0,0 - 5,4 Gesamt 100,0 100,0
Tabelle 5: Beispielhafte Zusammensetzungen des sprühgetrockneten Pulvers
[0031] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform wurde mindestens eines der HMOs der Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs und/oder des sprühgetrockneten Pulvers durch mikrobielle Fermentation hergestellt. In einer besonderen Ausführungsform wurden alle HMOs der Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs und/oder des sprühgetrockneten Pulvers durch mikrobielle Fermentation hergestellt.
[0032] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform, in der das sprühgetrocknete Pulver mindestens ein Monosaccharid enthält, wurde das mindestens eine Monosaccharid durch mikrobielle Fermentation hergestellt. In einer anderen Ausführungsform, in der das sprühgetrocknete Pulver L-Fucose und N-Acetylneuraminsäure enthält, wurden beide Monosaccharide durch mikrobielle Fermentation hergestellt.
[0033] Daher wurden in einer besonderen Ausführungsform alle Saccharide, die in dem sprühgetrockneten Pulver vorhanden sind, d.h. das HMO oder die HMOs und die Monosaccharide, durch mikrobielle Fermentation hergestellt.
[0034] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform liegt mindestens eines der HMO im sprühgetrockneten Pulver, bevorzugt alle HMO im sprühgetrockneten Pulver, in amorpher Form vor. In jenen Ausführungsformen, in denen das sprühgetrocknete Pulver L-Fucose und/oder N-AcetylIneuraminsäure enthält, liegt/liegen das Monosaccharid, mindestens eines der Monosaccharide oder beide Monosaccharide in amorpher Form vor.
[0035] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält das sprühgetrocknete Pulver eine geringe Menge Wasser. Der Ausdruck „geringe Wassermenge“ bezieht sich auf eine Menge von = 15 Gew.% Wasser, bevorzugt = 10 Gew.% Wasser, bevorzugter = 7 Gew.% Wasser, am meisten bevorzugt = 5 Gew.% Wasser.
[0036] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform ist das sprühgetrocknete Pulver frei von gentechnisch veränderten Mikroorganismen und frei von Nukleinsäuremolekülen, die von gentechnisch veränderten Mikroorganismen stammen.
[0037] Ein sprühgetrocknetes Pulver, das im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs besteht, optional in Kombination mit mindestens einem Monosaccharid, ist gegenüber flüssigen Zusammensetzungen insofern vorteilhaft, als das sprühgetrocknete Pulver weniger anfällig für mikrobielle Kontamination ist. Das sprühgetrocknete Pulver ist auch gegenüber Pulvern mit der gleichen Zusammensetzung von Bestandteilen, die durch Gefriertrocknen oder Lyophilisieren erhalten wurden, insofern vorteilhaft, als das sprühgetrocknete Pulver weniger hygroskopisch ist und viel länger fließfähig bleibt.
[0038] Im Folgenden ist ein Verfahren zur Herstellung eines sprühgetrockneten Pulvers bereitgestellt, das im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs besteht oder diese umfasst, wobei mindestens eines der strukturell unterschiedlichen HMOs, bevorzugt alle strukturell unterschiedlichen HMOs durch mikrobielle Fermentation hergestellt wurde(n). Das Verfahren umfasst die Schritte:
a) Gewinnen von mindestens einem der strukturell unterschiedlichen HMOs aus einer Fermentationsbrühe;
b) Bereitstellen einer wässrigen Lösung des mindestens einen HMOs von Schritt a); und
C) Unterziehen der Lösung von Schritt b) einer Sprühtrocknung.
[0039] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst die Aufreinigung des mindestens einen HMOs aus der Fermentationsbrühe (Schritt a) einen oder mehrere der Schritte zum
i) Entfernen mikrobieller Zellen aus der Fermentationsbrühe, um einen Prozessstrom zu erhalten;
il) Unterziehen des Prozessstroms mindestens einer Ultrafiltration;
ill) Behandeln des Prozessstroms mindestens einmal mit einem Kationenaustauscherharz und/oder mindestens einmal mit einem Anionenaustauscherharz;
iv) Unterziehen des Prozessstroms mindestens einer Nanofiltration;
V) Unterziehen des Prozessstroms mindestens einer Elektrodialyse;
Vi) Behandeln des Prozessstroms mindestens einmal mit Aktivkohle; und/oder
vii) Unterwerfen des Prozessstroms mindestens einmal einem Kristallisations- und/oder Fällungsschritt.
[0040] Das mindestens eine HMO oder eines der strukturell unterschiedlichen HMOs der Mischung kann durch mikrobielle Fermentation hergestellt werden, wobei ein gentechnisch veränderter Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein HMO zu synthetisieren, in einem Kulturmedium (Fermentationsbrühe) und unter solchen Bedingungen kultiviert wird, die für die Synthese des HMOs durch den gentechnisch veränderten Mikroorganismus zulässig sind. Die Aufreinigung des HMOs, das von den Zellen des gentechnisch veränderten Mikroorganismus synthetisiert wurde, umfasst den Schritt des Abtrennens der mikrobiellen Zellen von der Fermentationsbrühe, um einen Prozessstrom zu erhalten. Der Prozessstrom ist im Wesentlichen frei von Zellen und enthält das/die HMO. Dieser Schritt ist der erste Schritt im Verfahren zur Aufreinigung des erwünschten HMO.
[0041] Geeignete Verfahren zum Abtrennen der mikrobiellen Zellen von der Fermentationsbrühe umfassen das Zentrifugieren, wobei die mikrobiellen Zellen als Pellet und die Fermentationsbrühe als Uberstand erhalten werden. In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform werden die mikrobiellen Zellen mittels Filtration von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Geeignete Filtrationsverfahren zum Abtrennen der Zellen von der Fermentationsbrühe umfassen Mikrofiltration und Ultrafiltration.
[0042] Die Mikrofiltration ist an sich ein physikalischer Filtrationsprozess, bei dem eine Partikel enthaltende Flüssigkeit durch eine Membran mit spezieller Porengröße geleitet wird, um die Partikel von der Flüssigkeit abzutrennen. Der Ausdruck „Mikrofiltration“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein physikalisches Filtrationsverfahren, bei dem Zellen aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden.
[0043] Ultrafiltration ist eine Membranfiltrationsvariante und nicht grundlegend anders. Bei der Ultrafiltration führen Kräfte wie Druck- oder Konzentrationsgradienten durch eine semipermeable Membran zu einer Abtrennung. Zellen, suspendierte Feststoffe und hochmolekulare gelöste Stoffe werden im sogenannten Retentat zurückgehalten, während Wasser und niedermolekulare gelöste Stoffe wie das erwünschte sialylierte Oligosaccharid die Membran im Permeat (Filtrat) passieren.
[0044] Ultrafiltrationsmembranen werden durch die molekulare Ausschlussgrenze (MWCO) der verwendeten Membran definiert. Bei der Ultrafiltration kommen Dead-End- und Crossflow-Verfahren zur Anwendung.
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[0045] Typischerweise synthetisieren die mikrobiellen Zellen die HMO intrazellulär. Abhängig von der Struktur des HMOs wird das HMO entweder in die Fermentationsbrühe abgegeben oder verbleibt in der mikrobiellen Zelle. Im ersteren Fall liegt das so hergestellte HMO am Ende der Fermentation in der Fermentationsbrühe vor und kann aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden, die so zum Prozessstrom wird. Im letzteren Fall werden die mikrobiellen Zellen, die die HMO tragen, von der Fermentationsbrühe getrennt und Iysiert, um die HMO freizusetzen. Somit enthält das Zelllysat das HMO und wird zum Prozessstrom zur Aufreinigung von HMO, wie nachstehend beschrieben.
[0046] Auch wenn das Verfahren zur Aufreinigung von HMO verwendet wird, die durch mikrobielle Fermentation hergestellt wurden, kann das Verfahren auch zur Aufreinigung von HMO angewendet werden, die durch enzymatische Katalyse in vitro hergestellt wurden. Das HMO kann dann am Ende der biokatalytischen Reaktion aus dem Reaktionsgemisch aufgereinigt werden. Dieses Reaktionsgemisch wird als Prozessstrom dem Aufreinigungverfahren unterzogen.
[0047] Der Prozessstrom enthält das erwünschte/die erwünschten HMO sowie Nebenprodukte und unerwünschte Verunreinigungen wie - zum Beispiel - Monosaccharide, Disaccharide, unerwünschte Oligosaccharid-Nebenprodukte, lonen, Aminosäuren, Polypeptide, Proteine und/oder Nukleinsäuremoleküle.
[0048] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des HMOs den Schritt von mindestens einer Kationenaustauscherbehandlung, um positiv geladene Verbindungen aus dem geklärten Prozessstrom zu entfernen.
[0049] Geeignete Kationenaustauscherharze zum Entfernen positiv geladener Verbindungen aus dem Prozessstrom sind Lewatit® S 6368 A (Lanxess AG, Köln, DE) in H*-Form; Lewatit® S 2568 (H*) (Lanxess AG, Köln, DE).
[0050] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des HMOs den Schritt einer Anionenaustauscherbehandlung, um unerwünschte negativ geladene Verbindungen aus dem geklärten Prozessstrom zu entfernen.
[0051] Geeignete Anionenaustauscherharze umfassen Lewatit® S 2568 (CI) (Lanxess AG, Köln, DE) Lewatit®” S 6368 A (Lanxess AG, Köln, DE), Lewatit® S 4268 (Lanxess AG, Köln, DE), Lewatit® S 5528 (Lanxess AG, Köln, DE), Dowex® AG 1x2 (Mesh 200-400), Dowex® 1x8 (Mesh 100200), Purolite® Chromalite® CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Dow® Amberlite'M FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA).
[0052] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des HMOs einen Nanofiltrations- und/oder einen Diafiltrationsschritt, um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen und um das erwünschte HMO aufzukonzentrieren.
[0053] Bei der Diafiltration wird einer Lösung frisches Wasser zugesetzt, um membranpermeable Bestandteile zu entfernen (auszuwaschen). Die Diafiltration kann verwendet werden, um Komponenten auf der Basis ihrer Molekülgröße und Ladung unter Verwendung geeigneter Membranen zu trennen, wobei eine oder mehrere Spezies wirksam zurückgehalten werden und andere Spezies membranpermeabel sind. Insbesondere ist die Diafiltration unter Verwendung einer Nanofiltrationsmembran zur Trennung von niedermolekularen Verbindungen wie kleinen Molekülen und Salzen wirksam. Nanofiltrationsmembranen haben üblicherweise eine molekulare Ausschlussgrenze im Bereich von 150 - 1000 Dalton. Die Nanofiltration wird in der Milchindustrie häufig zur Aufkonzentration und Demineralisierung von Molke eingesetzt. Geeignete Membranen für die Nanofiltration und/oder Diafiltration umfassen Dow® Filmtec'M NF270-4040, Trisep® 4040-XN45TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 und GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).
[0054] Die Diafiltration unter Verwendung von Nanofiltrationsmembranen hat sich als wirksame Vorbehandlung zur Entfernung signifikanter Mengen von Verunreinigungen vor der Elektrodialysebehandlung der Lösung, die das Oligosaccharid enthält, erwiesen. Die Verwendung von Nanofiltrationsmembranen zur Aufkonzentrierung und Diafiltration während der Aufreinigung von
HMO führt zu niedrigeren Energie- und Verarbeitungskosten und besserer Produktqualität bedingt durch eine geringere Thermalbelastung, die zu geringeren Maillard- und Aldolreaktionen führt.
[0055] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des HMO mindestens einen Elektrodialyseschritt.
Die Elektrodialyse (ED) kombiniert Dialyse und Elektrolyse und kann zur Trennung oder Konzentration von lonen in Lösungen aufgrund ihrer selektiven Elektromigration durch semipermeable Membranen verwendet werden.
[0056] Das Grundprinzip der Elektrodialyse besteht aus einer Elektrolysezelle, die zwei Elektroden umfasst, die in einen Elektrolyten zur Leitung von lonen eingetaucht und an einen Gleichstromgenerator angeschlossen sind. Die mit dem Pluspol des Gleichstromgenerators verbundene Elektrode ist die Anode und die mit dem Minuspol verbundene Elektrode ist die Kathode. Die Elektrolytlösung unterstützt dann den Stromfluss, der sich aus der Bewegung der negativen und positiven lonen zur Anode bzw. zur Kathode ergibt. Die für die Elektrodialyse verwendeten Membranen sind im Wesentlichen Folien aus porösen lonenaustauscherharzen mit negativ oder positiv geladenen Gruppen und werden daher als kationische bzw. anionische Membranen bezeichnet. Die lonenaustauschermembranen bestehen üblicherweise aus Polystyrol, das eine geeignete funktionelle Gruppe (wie Sulfonsäure für kationische Membranen oder eine quaternäre Ammoniumgruppe für anionische Membranen) trägt, die mit Divinylbenzol quervernetzt ist. Der Elektrolyt kann beispielsweise Natriumchlorid, Natriumacetat, Natriumpropionat oder Sulfaminsäure sein. Die Elektrodialyse-Stapelzelle wird dann so zusammengesetzt, dass die anionischen und kationischen Membranen parallel angeordnet sind, wie bei einer Filterpresse zwischen zwei Elektrodenblöcken, so dass der Strom, der einer lonenabreicherung unterliegt, von dem Strom, der einer lonenanreicherung unterliegt, gut getrennt ist (die beiden Lösungen werden auch als Diluat (lonenabreicherung unterliegend) und Konzentrat (lonenanreicherung unterliegend) bezeichnet. Das Herzstück des Elektrodialyseprozesses ist der Membranstapel, der aus mehreren Anionenaustauschermembranen und Kationenaustauschermembranen besteht, die durch Abstandshalter voneinander getrennt sind und zwischen zwei Elektroden installiert sind. Durch Anlegen eines elektrischen Gleichstroms wandern Anionen und Kationen über die Membranen zu den Elektroden.
[0057] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des HMOs ferner einen Schritt der kontinuierlichen Chromatographie wie die simulierte Gegenstromchromatographie (SMB).
[0058] Die simulierte moving bed chromatographie (SMB) hat ihren Ursprung in der petrochemischen und mineralischen Industrie. Heute wird die SMB-Chromatographie in der pharmazeutischen Industrie zur Isolierung von Enantiomeren aus racemischen Gemischen verwendet. Die SMB-Chromatographie in großem Maßstab wurde bereits zur Abtrennung des Monosaccharids Fructose aus Fructose-Glucose-Lösungen und zur Abtrennung des Disaccharids Saccharose aus Zuckerrüben- oder Zuckerrohrsirupen verwendet.
[0059] SMB-Chromatographieverfahren, die zur Trennung von Sacchariden verwendet werden, verwenden z.B. calciumgeladene, quervernetzte Polystyrolharze, Anionenharze in der Bisulfitform (Bechthold M., et al., Chemie Ingenieur Technik, 2010, 82, 65-75), oder Polystyrol-Gel, stark saurer Kationenaustauscher in Wasserstoff-Form (Purolite® PCR833H) (Purolite, Bala Cynwyd, USA).
[0060] Aufgrund der kontinuierlichen Arbeitsweise, des Recyclings der mobilen Phase und auch des Potenzials, große Säulengrößen zu verwenden, können SMB-Chromatographiesysteme im Prinzip skaliert werden, um Produktionsvolumina von Hunderten von Tonnen zu erreichen.
[0061] Der Verfahrensschritt der simulierten Gegenstromchromatographie ist vorteilhaft, insofern als dieser Verfahrensschritt eine weitere Entfernung von Oligosacchariden, die strukturell eng mit dem erwünschten Oligosaccharid verwandt sind, ermöglicht.
[0062] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur
Aufreinigung des mindestens einen HMOs eine Behandlung des Prozessstroms mit Aktivkohle, um verunreinigende Substanzen wie Farbstoffe aus dem Prozessstrom zu entfernen.
[0063] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des mindestens einen HMOs mindestens einen Schritt der Kristallisation oder Fällung des HMOs aus dem Prozessstrom. Die Kristallisation oder Fällung des mindestens einen HMOs aus dem Prozessstrom kann durch Hinzufügen einer geeigneten Menge eines mit Wasser mischbaren organischen Lösemittels zum Prozessstrom, der das mindestens eine HMO enthält, durchgeführt werden. Das organische Lösemittel kann aus der Gruppe bestehend aus C+- bis CeAlkoholen und C+- bis C4-Carbonsäuren ausgewählt sein. Der Schritt der Kristallisation oder Fällung des mindestens einen HMOs wird am Ende des Wiedergewinnungsprozesses nicht durchgeführt, so dass Restmengen des organischen Lösungsmittels oder der Carbonsäure durch nachfolgende Verfahrensschritte entfernt werden können.
In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform des Verfahrens zur Aufreinigung des mindestens einen HMOs erfolgt eine schrittweise Sterilfiltration und/oder Endotoxinentfernung, bevorzugt durch Filtration des Prozessstroms über ein 3 kDa-Filter oder ein 6 kDa-Filter.
[0064] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Aufreinigung des mindestens einen HMOs einen Schritt des Erhöhens der Konzentration des mindestens einen HMOs im Prozessstrom. Die Konzentration des mindestens einen HMOs im Prozessstrom kann erhöht werden, indem der Prozessstrom einer Vakuumverdampfung, Umkehrosmose oder Nanofiltration (z.B. Nanofiltration mit einer Nanofiltrationsmembran mit einer GröBenausschlussgrenze von = 20 A) unterzogen wird. Alternativ werden kristallisierte oder ausgefällte HMO in Wasser gelöst, um eine wässrige Lösung des mindestens einen HMOs zu erhalten, wobei die wässrige Lösung die gewünschte Konzentration des mindestens einen HMOs besitzt.
[0065] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform ist der resultierende Prozessstrom eine wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO in einer Konzentration von = 20 g/l, = 25 g/l, = 30 g/l, = 40 g/l, = 60 g/l, = 100 g/l, = 200 g/l oder sogar = 300 g/l enthält.
[0066] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung das mindestens eine HMO in einer Reinheit von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 93 %, mindestens 95 % oder mindestens 98 % bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz/gelösten Stoffe in der Lösung.
[0067] Der Ausdruck „Reinheit“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die chemische Reinheit, d.h. den Grad, zu dem eine Substanz unverdünnt oder unvermischt mit Fremdmaterial ist. Daher ist die chemische Reinheit ein Indikator für die Beziehung zwischen dem mindestens einen HMO und Nebenprodukten/Verunreinigungen. Die chemische Reinheit wird ausgedrückt als Prozentsatz (%) und berechnet unter Verwendung der folgenden Formel:
Masse der erwünschten Verbindung in der Probe Prozent Reinheit = 100 x
Gesamtmasse der Probe
[0068] Die Reinheit eines HMO in einer Zubereitung kann durch jedes geeignete, dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise unter Verwendung von HPLC und Berechnung des Verhältnisses der Fläche unter dem Peak (den Peaks), die die Menge an HMO darstell!/darstellen, zur Summe der Flächen unterhalb der Peaks, die das HMO (die HMO) und alle anderen Verbindungen als das HMO (die HMO) im gleichen Chromatogramm darstellt/darstellen.
[0069] Die wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO enthält, kann unter geeigneten Bedingungen gelagert werden, beispielsweise kann die wässrige Lösung eingefroren werden.
[0070] Das Verfahren zur Aufreinigung des mindestens einen HMOs ist kostengünstig und einfach zu skalieren, wodurch es als Grundlage für ein Herstellungsverfahren im Multi-Tonnen-Maßstab geeignet ist.
[0071] Das Verfahren zur Aufreinigung des mindestens einen HMOs ist auch vorteilhaft, insofern
als die wässrige Lösung frei ist von gentechnisch veränderten Mikroorganismen und von Nukleinsäuremolekülen, die von gentechnisch veränderten Mikroorganismen stammen. Darüber hinaus ist die wässrige Lösung frei von Proteinen. Durch die vollständige Entfernung von Proteinen wird das Risiko, bei einem potenziellen Verbraucher Allergien auszulösen, eliminiert.
[0072] Das Verfahren zur Herstellung des sprühgetrockneten Pulvers umfasst den Schritt des Bereitstellens einer wässrigen Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMO und - optional - das mindestens eine Monosaccharid enthält.
[0073] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform ist das mindestens eine HMO ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2'-FL, 3-FL, LNT, LNnT, LNFPI, 3'-SL, 6'-SL, LST-a, LST-b, LST-c und DSLNT.
[0074] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform besteht die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs aus fünf strukturell unterschiedlichen HMOs, bevorzugt aus 2'-FL, 3-FL, LNT, 3'-SL und 6'-SL. In einer anderen Ausführungsform besteht die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs aus sieben strukturell unterschiedlichen HMO, bevorzugt aus 2'-FL, 3FL, LNT, LNNT, LNFPI, 3'-SL und 6’'-SL.
[0075] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung ferner mindestens ein Monosaccharid, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LFucose und N-AcetyIneuraminsäure. In einer anderen Ausführungsform enthält die wässrige LÖösung ferner L-Fucose und N-AcetylIneuraminsäure.
[0076] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung das mindestens eine HMO oder die Mischung von HMOs und/oder das mindestens eine Monosaccharid in Höhe einer Saccharidmenge von insgesamt mindestens 20 % (w/v), 30 % (w/v), 35 % (w/v) und bis zu 45 % (w/v), 50 % (w/v), 60 % (W/vV).
[0077] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung das mindestens eine HMO oder die Mischung von HMO in einer Reinheit von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 93 %, mindestens 95 % oder mindestens 98 %, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz/gelösten Stoffe in der Lösung.
[0078] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung keine gentechnisch veränderten Mikroorganismen, Nukleinsäuremoleküle, die von gentechnisch veränderten Mikroorganismen stammen, und Proteine.
[0079] Bei dem Verfahren zur Herstellung des sprühgetrockneten Pulvers wird die wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs enthält, einer Sprühtrocknung unterzogen.
[0080] Die Sprühtrocknung ist ein Verfahren, um trockene Pulver zu gewinnen, wobei die Lösung, die die Substanz von Interesse enthält, zunächst zu Tröpfchen versprüht wird, welche durch Heißluft schnell getrocknet werden. Die Sprühtrocknung ist sehr schnell und die Exposition der zu trocknenden Substanz gegenüber hohen Temperaturen ist recht kurz.
[0081] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform wird die wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMO enthält, bei einer Düsentemperatur von mindestens 110 °C, bevorzugt mindestens 120 °C, bevorzugter mindestens 125 °C und bei weniger als 150 °C, bevorzugt weniger als 140 °C und bevorzugter weniger als 135 °C sprühgetrocknet.
[0082] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform wird die wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMO enthält, bei einer Auslasstemperatur von mindestens 60 °C, bevorzugt mindestens 65 °C und bei weniger als 80 °C, bevorzugt weniger als 70 °C sprühgetrocknet In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die wässrige Lösung, die das HMO (die HMO) enthält, bei einer Düsentemperatur von etwa 68 °C bis etwa 70 °C sprühgetrocknet.
[0083] Es versteht sich, dass jede Spezies der strukturell unterschiedlichen HMOs - optional in
Kombination mit dem mindestens einen Monosaccharid - einzeln gereinigt und sprühgetrocknet werden kann und dass die resultierenden sprühgetrockneten Pulver in jedem erwünschten Verhältnis gemischt werden können. In einer alternativen Ausführungsform enthalten die wässrigen Lösungen alle strukturell unterschiedlichen HMOs, und die resultierende wässrige Lösung, die die Mischung strukturell unterschiedlicher HMO in dem erwünschten Verhältnis enthält, wird einer Sprühtrocknung unterzogen.
[0084] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Lösung, die mindestens ein HMO oder eine Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs enthält, ferner mindestens ein Monosaccharid wie - zum Beispiel - L-Fucose und/oder N-AcetylIneuraminsäure. Die wässrige Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs und das mindestens eine Monosaccharid enthält, wird dann einer Sprühtrocknung unterzogen, um ein sprühgetrocknetes Pulver zu erhalten, das im Wesentlichen aus dem mindestens einen HMO und dem mindestens einen Monosaccharid oder der Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs und dem mindestens einen Monosaccharid besteht.
[0085] Das Verhältnis der Saccharide (HMO und Monosaccharid(e) im resultierenden sprühgetrockneten Pulver entspricht dem Verhältnis dieser Saccharide in der wässrigen Lösung.
[0086] Das letztere Verfahren ist vorteilhaft, insofern Monosaccharide, die nicht einzeln sprühgetrocknet werden können, in Gegenwart von einem oder mehreren HMO sprühtrockenbar werden.
[0087] Das Sprühtrocknen der wässrigen Lösung, die das mindestens eine HMO oder die Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs enthält, stellt ein Pulver mit geringer Hygroskopie bereit, wobei das HMO in amorpher Form vorliegt und die Partikelgröße homogen ist. Das sprühgetrocknete Pulver, das im Wesentlichen aus mindestens einem HMO oder einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMOs besteht, ist weniger hygroskopisch als ein Pulver mit identischer Zusammensetzung, das durch Gefriertrocknung erhalten wurde. Somit sind die hier beschriebenen sprühgetrockneten Pulver hinsichtlich ihrer weiteren Verwendung und Verarbeitung vorteilhaft.
[0088] Das sprühgetrocknete Pulver bestehend im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMO oder enthaltend eine Mischung strukturell unterschiedlicher HMO und mindestens ein Monosaccharid, bevorzugt L-Fucose und/oder N-Acetylneuraminsäure, wird zur Herstellung einer Ernährungszusammensetzung verwendet. Das sprühgetrocknete Pulver, das im Wesentlichen aus einer Mischung strukturell unterschiedlicher HMO - und optional mindestens einem Monosaccharid, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Fucose und NAcetyIneuraminsäure, besteht, ist für den menschlichen Verzehr geeignet und kann somit in Zubereitungen für den menschlichen Verzehr wie medizinische Formulierungen, Säuglingsanfangsnahrung, Milchgetränke oder Nahrungsergänzungsmittel aufgenommen werden.
[0089] Es wird mindestens eine Ernährungszusammensetzung bereitgestellt, die ein sprühgetrocknetes Pulver, wie vorstehend beschrieben und/oder wie gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt, enthalten.
[0090] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst die Ernährungszusammensetzung eine Mischung, die im Wesentlichen aus Neub5Ac, 2'-FL, 3-FL, LNT, LNnT, LNFPI, 3'-SL, 6'-SL und L-Fucose besteht. Eine Zusammensetzung, die bevorzugte Mengen jeder dieser Verbindungen enthält, ist in Tabelle 6 angegeben.
[0091] Die Zusammensetzung gemäß der zweiten Spalte in Tabelle 6 ist von besonderem Vorteil für die Ergänzung von Säuglingsnahrung, so dass die endgültige Säuglingsnahrung für den direkten Verbrauch die Verbindungen der Mischung in den Konzentrationen enthalten kann, die in der dritten Spalte von Tabelle 6 angegeben sind.
Verbindung Anteil an der Mischung Endkonzentration in der (Gewichtsprozentsatz) Säuglingsnahrung (g/l)
2Z-FL 34 2,5 3-FL 11 0,8 LNT 20 1,5 LNNT 2 0,15 LNFPI 13 1,0 3'-SL 3 0,2 6’-SL 4 0,3 NeubAc 8 0,6 L-Fucose 5 0,4 Gesamt 100 7,45
Tabelle 6: Zusammensetzung einer repräsentativen Neu5AC enthaltenden Mischung, die für Säuglingsanfangsnahrung geeignet ist.
[0092] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die Ernährungszusammensetzung einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile. Der eine oder die mehreren zusätzlichen Bestandteile sind aus der Gruppe bestehend aus Ol, Fett und Fettsäuren (wie Olivenöl, Sonnenblumenöl, Kokosöl, Nussöl, Rapsöl, Palmöl, Leinsamenöl, Fischöl, Linolensäure, Sojaöl usw.), Kohlenhydrate (wie Glucose, Fructose, Lactose, Maltodextrin, Stärke, Saccharose, Inosit usw.), Proteine (aus Magermilch, Molke, Kasein (aus domestizierten Milchtieren) oder Sojabohnen), Vitamine (A, B1, B2, B5, B6, B12, C, D, E, K, Biotin, Folsäure, Niacin, Cholin), Mineralien und Spurenelemente (Natrium, Kalium, Chlorid, Calcium, Phosphor, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan, Fluorid, Selen, Jod, Kupfer) ausgewählt.
[0093] In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ernährungszusammensetzung mit dem enthaltenen sprühgetrockneten Pulver, das mindestens ein Humanmilcholigosaccharid oder die Mischung von Humanmilcholigosacchariden oder die Mischung mindestens eines Humanmilcholigosaccharids mit mindestens einem Monosaccharid oder die Mischung strukturell unterschiedlicher Humanmilcholigosaccharide mit anderen Fasern enthält/daraus im Wesentlichen besteht, eine Säuglingsnahrung, die den Anforderungen an die Zusammensetzung entsprechend der Verordnung (EU) 2016/127 und/oder dem Code of Federal Regulations (USA), Titel 21, 107.100 (Nährstoffspezifikationen) erfüllt. Repräsentative Zusammensetzungen von Säuglingsnahrung sind in den Tabellen 7 und 8 angegeben.
Säuglingsnahrung: Magermilch Pflanzenöle (Palmöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl) Humanmilcholigosaccharide 3-Fucosyllactose Magermilchpulver Öl aus Mortierella alpina Fischöl Calciumcarbonat Kaliumchlorid Vitamin C Natriumchlorid Vitamin E Eisenacetat Zinksulfat Niacin Calcium-D-panthothenat
Kupfersulfat Vitamin A Vitamin B1 Vitamin B6 Magnesiumsulfat Kaliumiodat Folsäure Vitamin K Natriumselenit Vitamin D
Tabelle 7: Komponenten einer repräsentativen Säuglingsnahrung.
je 100 g Pulver |je 100 ml Säuglingsnahrung
Energie kJ 1|2094-2145 283
kcal | 500-512 67-68 Fette g 24,2-26,2 3,3-3,5 hiervon: gesättigte Fettsäuren g 8,7-9,4 1,2-1,3 einfach ungesättigte Fettsäuren g 10,4 1,4 mehrfach ungesättigte Fettsäuren g 5,5-5,9 0,7-0,8 Kohlenhydrate g 56-58 7,4-7,9 hiervon: Zucker g 44-56 6-7,4 hiervon: Lactose g 44-56 6-7,4 Neub5Ac mg |440 60 L-Fucose mg 1|300 40 HMO g 4,22-4,81 0,57-0,65 hiervon 2-FL g 1,85-2,22 0,25-0,30 3-FL mg |555,56-592,6 |75-80 LNT g 1,11 0,15 LNNT mg |0-111,11 0-15 LNPF-I mg |0-740,74 0-100 3'-SL mg |148,15-170,37 | 20-23 6’'-SL mg |207,4-222,22 |-28-30 Protein g 11,11-11,85 1,5-1,6 Salz g 0,47-0,59 0,06-0,08 Vitamine Vitamin A uUg 1357-358 47,3-48,2 Vitamin D Wg 17,8 1,05 Vitamin E mg 18,15 1,1 Vitamin K WUg 1|43,7-44,4 5,9-6,0 Vitamin C mg |115-118 15-16 Vitamin B1 mg |0,51-0,60 0,068-0,079 Vitamin B2 mg 1|1,3-1,7 0,18-0,23
Niacin mg 13,63 0,49 Vitamin B6 Wg |526-600 71-81 Folsäure Ug |160-164 21,6-21,7 Vitamin B12 ug 1,7-1,9 0,23-0,25 Biotin ug |22-30 3,0-3,9 Panthothensäure mg 1|4,6-5,4 0,62-0,72 Mineralien
Natrium mg |187-236 25,3-31,2 Kalium mg |673-675 88,8-91,2 Chlorid mg |327-333 43,1-44,9 Calcium mg |460-504 62,1-66,5 Phosphor mg 1|335-352 45,2-46,5 Magnesium mg |49,3-56,3 6,66-7,43 Eisen mg 14,15 0,56
Zink mg |3,7-3,8 0,49-0,51 Kupfer wg 1274 37 Mangan Wg 196,3 13 Fluorid WUg 1|30,4-32,6 4,1-4,4 Selen Wg 1|11,1-12,3 1,5-1,6 Jod uUg |101,5-103,7 13,7-14
Tabelle 8: Zusammensetzung einer repräsentativen Säuglingsnahrung. Die Endkonzentration basiert auf einer Zubereitung von 13,5 g des Pulvers in 90 mi Wasser.
[0094] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform enthält die Ernährungszusammensetzung auch Mikroorganismen, bevorzugt probiotische Mikroorganismen. Für Säuglingsernährungsanwendungen stammen die bevorzugten Mikroorganismen aus dem Mikrobiom eines gesunden Menschen oder können in diesem gefunden werden. Bevorzugt, jedoch ohne Einschränkung, sind die Mikroorganismen aus den Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium und Saccharomyces ausgewählt. In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform ist der Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum; Enterococcus faecium; Escherichia coli; Klyveromyces marxianus; Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius, L. sakei; Lactococcus lactis (einschließlich unter anderem der Unterarten lactis, cremoris und diacetylactis); Leuconostoc mesenteroides (einschließlich unter anderem der Unterart mesenteroides); Pedicoccus acidilactici, P. pentosaceus; Propionibacterium acidipropionici, P. freudenreichii ssp. shermanii; Staphylococcus carnosus; und Streptococcus thermophi/us ausgewählt.
[0095] Zusätzlich zu den kombinierten lebenden Organismen kann die Ernährungszusammensetzung auch tote Zellkulturen enthalten. Auf dem Gebiet der Probiotika werden manchmal abgetötete Zellkulturen verwendet (z.B. tyndalisierte Bakterien). Diese abgetöteten Kulturen können Proteine, Peptide, Oligosaccharide, Zellaußenwandfragmente und natürliche Produkte liefern, was zur kurzfristigen Stimulierung des Immunsystems führt.
[0096] Das Einbeziehen probiotischer Mikroorganismen in die Ernährungszusammensetzung, insbesondere in Gegenwart von HMO, ist besonders vorteilhaft, insofern es auch die Etablierung eines gesunden Darmmikrobioms fördert.
[0097] In einer zusätzlichen und/oder alternativen Ausführungsform umfasst die Ernährungszu-
sammensetzung auch Präbiotika wie Galactooligosaccharide (GOS), Fructooligosaccharide (FOS), Inulin oder Kombinationen davon.
[0098] Die Ernährungszusammensetzung kann in flüssiger Form oder in fester Form vorliegen, einschließlich unter anderem Pulver, Granulate, Flocken und Pellets.
[0099] In einer zusätzlichen Ausführungsform ist die Ernährungszusammensetzung aus der Gruppe bestehend aus medizinischen Formulierungen, Säuglingsnahrung und Nahrungsergänzungsmitteln ausgewählt.
[00100] Die vorliegende Erfindung wird in Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, aber die Erfindung ist diesbezüglich nicht beschränkt, sondern nur durch die Ansprüche. Darüber hinaus werden die Ausdrücke erstens, zweitens und dergleichen in der Beschreibung und in den Ansprüchen zur Unterscheidung zwischen ähnlichen Elementen und nicht notwendigerweise zur zeitlichen, räumlichen, rangmäßigen oder sonstigen Beschreibung einer Sequenz verwendet. Es versteht sich, dass die so verwendeten Ausdrücke unter geeigneten Umständen austauschbar sind und dass die hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung in anderen Sequenzen als hier beschrieben oder dargestellt einsatzfähig sind.
[00101] Es ist anzumerken, dass der Ausdruck „umfassend“, wie er in den Ansprüchen verwendet wird, nicht so interpretiert werden sollte, dass er auf die nachstehend aufgeführten Mittel beschränkt ist; mit ihm werden andere Elemente oder Schritte nicht ausgeschlossen. Er ist daher als Angabe des Vorhandenseins der genannten Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte oder Komponenten wie erwähnt zu interpretieren, ohne jedoch das Vorhandensein oder Hinzufügen von einem oder mehreren anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten oder Komponenten oder Gruppen davon auszuschließen. Daher sollte der Umfang des Ausdrucks „eine Vorrichtung, die Mittel A und B umfasst“ nicht auf Vorrichtungen beschränkt werden, die nur aus den Komponenten A und B bestehen. Er bedeutet, dass in Bezug auf die vorliegende Erfindung die einzigen relevanten Komponenten der Vorrichtung A und B sind.
[00102] Eine Bezugnahme in dieser Beschreibung auf „eine Ausführungsform“ oder „eine Ausführungsform“ bedeutet, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder eine bestimmte Eigenschaft, die in Verbindung mit der Ausführungsform beschrieben wurden, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Das Auftreten der Ausdrücke „in einer Ausführungsform“ oder „in einer Ausführungsform“ an verschiedenen Stellen in dieser Beschreibung bezieht sich daher nicht notwendigerweise immer auf dieselbe Ausführungsform. Darüber hinaus können die besonderen Merkmale, Strukturen oder Eigenschaften in einer oder mehreren Ausführungsformen auf jede geeignete Weise kombiniert werden, wie es einem Durchschnittsfachmann aus dieser Offenbarung ersichtlich sein würde.
[00103] In ähnlicher Weise versteht es sich, dass in der Beschreibung repräsentativer Ausführungsformen der Erfindung verschiedene Merkmale der Erfindung manchmal in einer einzigen Ausführungsform, Figur oder Beschreibung derselben zum Zwecke der Vereinfachung der Offenbarung und der Erleichterung des Verständnisses von einem oder mehreren der verschiedenen erfinderischen Aspekte zusammengefasst sind. Dieses Offenbarungsverfahren ist nicht so auszulegen, dass es die Absicht widerspiegelt, dass die beanspruchte Erfindung mehr Merkmale erfordert, als in jedem Anspruch ausdrücklich aufgeführt sind. Vielmehr können, wie die folgenden Ansprüche widerspiegeln, erfinderische Aspekte weniger als alle Merkmale irgendeiner vorangehenden offenbarten Ausführungsform erfordern. Somit werden die Ansprüche, die auf die detaillierte Beschreibung folgen, hiermit ausdrücklich in diese detaillierte Beschreibung aufgenommen, wobei jeder Anspruch für sich als separate Ausführungsform dieser Erfindung steht.
[00104] Während einige hierin beschriebene Ausführungsformen einige, aber nicht andere Merkmale aufnehmen, die in anderen Ausführungsformen aufgenommen sind, sollen Kombinationen von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen im Umfang der Erfindung liegen und unterschiedliche Ausführungsformen bilden, wie es von Fachleuten auf diesem Gebiet verstanden wird. Beispielsweise kann in den folgenden Ansprüchen jede der beanspruchten Ausführungsfor-
men in irgendeiner Kombination verwendet werden.
[00105] Darüber hinaus werden einige der Ausführungsformen hierin als ein Verfahren oder eine Kombination von Elementen eines Verfahrens beschrieben, das von einem Prozessor eines Computersystems oder durch andere Mittel zum Ausführen der Funktion implementiert werden kann. Ein Prozessor mit den notwendigen Anweisungen zur Durchführung eines solchen Verfahrens oder Elements eines Verfahrens bildet somit ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens oder Elements eines Verfahrens. Darüber hinaus ist ein hierin beschriebenes Element einer Vorrichtungsausführungsform ein Beispiel eines Mittels zur Ausführung der Funktion, die von dem Element zum Zwecke der Ausführung der Erfindung durchgeführt wird.
[00106] In der Beschreibung und den Zeichnungen, die hierin bereitgestellt werden, sind zahlreiche spezifische Details dargelegt. Es versteht sich jedoch, dass Ausführungsformen der Erfindung ohne diese spezifischen Details ausgeführt werden können. In anderen Fällen werden bekannte Verfahren, Strukturen und Techniken nicht im Detail gezeigt, um das Verständnis der Beschreibung und der Zeichnungen zu erleichtern.
[00107] Die Erfindung wird nun durch eine detaillierte Beschreibung mehrerer Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Es ist klar, dass andere Ausführungsformen der Erfindung gemäß dem Wissen des Fachmanns konfiguriert werden können, ohne vom wahren Geist oder technischen Wert der Erfindung abzuweichen, wobei die Erfindung nur durch die Ausdrücke der beigefügten Ansprüche beschränkt ist.
Beispiel 1: Aufreinigung von 2'-Fucosyllactose aus Fermentationsbrühe
[00108] Die Herstellung von 2'-Fucosyllactose durch Fermentation unter Verwendung eines genetisch veränderten E. coli-Stammes wurde wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 16 196 486.1 beschrieben durchgeführt. Die 2'-Fucosyllactose wurde aus der Fermentationsbrühe durch Filtration, lonenaustauschchromatographie, Nanofiltration, Diafiltration oder Elektrodialyse und Behandlung mit Holzkohle wie in WO 2015/106943 A1 beschrieben aufgereinigt. Die resultierende Lösung, die 2'-Fucosyllactose enthielt, wurde einer Sprühtrocknung unterzogen, um ein stabiles festes Produkt zu erhalten.
Beispiel 2: Aufreinigung von 3-Fucosyllactose aus Fermentationsbrühe
[00109] 3-Fucosyllactose wurde durch Fermentation unter Verwendung eines genetisch veränderten E. coli-Stammes hergestellt, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 16 196 486.1 beschrieben.
[00110] Die Zellen wurden durch Ultrafiltration (0,05 um Cut-off) (CUT-Membrantechnologie, Erkrath, Deutschland) vom Kulturmedium getrennt, gefolgt von einem Cross-Flow-Filter mit einem MWCO von 150 kDa (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Deutschland). Das zellfreie Fermentationsmedium, das etwa 30 g/l 3-Fucosyllactose enthielt, wurde über einen starken kationischen lonenaustauscher (Lewatit S 2568 (Lanxess, Köln, Deutschland) in H*-Form geleitet, um positiv geladene Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wurde die Lösung mit Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt und auf einen anionischen lonenaustauscher (Lewatit S6368 A, Lanxess) in Chloridform aufgebracht. Beide lonenaustauscher wurden in Volumen von 200 | verwendet. Nach einer zweiten Filtration (150 kDa; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Deutschland) wurde die partikelfreie Lösung durch Nanofiltration unter Verwendung einer Filmtech NF270-Membran (Dow, Midland, USA) 5-fach und durch Vakuumverdampfung 2,5-fach aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte LÖösung mit einer Leitfähigkeit von etwa 15 mS cm“ wurde filtriert (10 kDa; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Deutschland), mit Aktivkohle (CAS: 7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) geklärt und durch Elektrodialyse entionisiert. Hierzu wurde ein PC-Cell BED 1-3-Elektrodialysegerät (PCCell, Heusweiler, Deutschland) mit einem PC-Cell E200-Membranstapel verwendet, der die folgenden Membranen enthielt: Kationenaustauschermembran CEM:PC SK und Anionenmembran AEM: PCAcid60. Sulfaminsäure 0,25 M wurde dabei als Elektrolyt verwendet. Zur Verminderung der durch Maillard-Reaktionen verursachten bräunlichen Färbung und der aus dem Fermentationsprozess stammenden Aldolprodukte wurde eine zweite Runde der lonenaustauschchromato-
graphie unter Verwendung des gleichen lonenaustauschermaterials durchgeführt, wie zuvor erwähnt in Na*- und CI'-Form, jedoch in einem Volumen von 50 I. Nach dem Aufkonzentrieren der Zuckerlösung durch Verdampfen wurde die Leitfähigkeit erneut durch Elektrodialyse unter Verwendung des vorstehend erwähnten PC-Cell BED 1-3 von 4 mS cm” auf 0,4 mS cm“ oder weniger verringert. Zur weiteren Entfärbung wurde die Lösung mit Aktivkohle (CAS: 7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) versetzt und durch Filtration eine nahezu farblose Lösung erhalten.
Beispiel 3: Aufreinigung von Lacto-N-tetraose aus Fermentationsbrühe
[00111] Die fermentative Produktion von Lacto-N-tetraose wurde unter Verwendung eines genetisch veränderten E. coli BL21(DE3) A/acZ-Stammes mit genomisch integrierten Genen durchgeführt, die für die In-vivo-Synthese von Lacto-N-tetraose essentiell sind, nämlich einer N-Acetylglucosaminglycosyltransferase (IgtA von Neisseria meningitidis MC58), eine ßB-1,3- Galactosyltransferase (wbdO von Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside), lacY von E. co K12, die UDP-Glucose-4-Epimerase galE, und die UTP-Glucose-1-Phosphat-Uridyltransferase galU, beide aus E. coli K12. Zur fermentativen Herstellung von Lacto-N-tetraose wurde der Stamm in einem definierten Mineralsalzmedium gezüchtet, das 7 g I" NH4H-PO-«, 7 g I” K»HPO«s, 2 g I KOH, 0,3g I” Zitronensäure, 5 g I NH4CI, 0,1 mM CaCl, 8 mM MgSO«, Spurenelemente (0,101 g I Nitrilotriessigsäure, pH 6,5, 0,056 g I Ammoniumeisencitrat, 0,01 g I MnCI2 x 4 H2O, 0,002 g I” CoCl» x 6 H2O, 0,001g I” CuCIz x 2 H2O, 0,002 g I" Borsäure, 0,009 g I ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 g I” Na2MoO« x 2 H;O, 0,002 g I” Na2SeOs, 0,002 g I NiSO4 x 6 H:O) und 2% Glucose als Kohlenstoffquelle umfasste. Bei Bedarf wurde Antischaummittel (Struktol J673, Schill + Seilacher) zugesetzt. Der pH wurde unter Verwendung einer 25%-igen Ammoniaklösung kontrolliert. Lactose wurde schrittweise bis zu einer Endkonzentration von 15 mM aus einer 216 g I-Lactosestammlösung zugegeben, wobei die Lactosekonzentration im Kulturmedium während des Fermentationsprozesses konstant gehalten wurde. Restlactose und Lacto-N-Triose Il, die während des Verfahrens als Nebenprodukt anfielen, wurden durch einen zweiten E. coli-Stamm hydrolysiert, der dem Fermenter zugesetzt wurde. Dieser Stamm exprimierte eine funktionelle BetaLactamase, eine Beta-N-Acetylhexosaminidase (bbh/ von Bifidobacterium bifidum JCM1254) und ein funktionelles Gal-Operon zum Abbau von Monosacchariden (EP 2 845 905 A).
[00112] Die Zellen wurden von der Fermentationsbrühe abgetrennt und die Lacto-N-tetraose enthaltende Flüssigkeit wurde auf eine Reinheit von 75-80% aufgereinigt, bestimmt durch Massenbilanz gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren.
[00113] Verunreinigende Kohlenhydratnebenprodukte, die aus einem ineffizienten enzymatischen Abbau und einer ineffizienten Metabolisierung resultieren, wurden durch Chromatographie unter Verwendung einer simulierten Gegenstromchromatographie (SMB-Chromatographie) gemäß WO 2015/049331 entfernt. Alternativ wurde die Lacto-N-tetraose durch Kristallisation mit Isopropanol aufgereinigt. Zur Kristallisation wurde die Lacto-N-tetraose enthaltende Lösung durch Eindampfen auf eine Konzentration von 20 % aufkonzentriert und sprühgetrocknet. Unter Verwendung eines NUBILOSA LTC-GMP-Sprühtrockners (NUBILOSA, Konstanz, Deutschland) wurde die Lösung unter einem Stickstoffstrom durch die Sprühtrockendüsen mit einer Einlasstemperatur von 130 °C geleitet, während der Produktstrom so gesteuert wurde, dass eine Auslasstemperatur von 67 °C bis 68 °C aufrechterhalten wurde.
[00114] Das feste Material wurde zu einer Mischung von Isopropanol und Wasser (3:1 (Vol./Vol.)) in einem Verhältnis von 1 kg Pulver in 12 | Isopropanol/Wasser gegeben. Die Suspension wurde kräftig gerührt, dann die unlösliche Lacto-N-tetraose filtriert und bei 40°C getrocknet. Ausgehend von einem Material mit einer Reinheit von 73-89 % wurde die kristallisierte Lacto-N-tetraose auf etwa 95 % mit einer Ausbeute von 85 % aufgereinigt. Der Zucker wurde in Wasser auf eine Konzentration von 25 % gelöst und nacheinander durch ein 6 kDa-Filter (Pall Microza Ultrafiltrationsmodul SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Deutschland) und ein 0,2 um-Sterilfilter geleitet. Festes Material wurde durch Sprühtrocknen des sterilen Materials unter den oben beschriebenen Bedingungen erhalten.
Beispiel 4: Aufreinigung von 3'- und 6'-Sialyllactose aus Fermentationsbrühe
[00115] Zur Herstellung von 3'- und 6’-Sialyllactose wurden rekombinante E. coli BL21 (DE3) AlacZ-Stämme verwendet. Die Stämme wiesen gemeinsame genetische Modifikationen auf: chromosomale, konstitutive Expression der Glucosamin-6-phosphat-Synthase GImS aus E. coli, der N-Acetylglucosamin-2-Epimerase SIr1975 aus Synechocystis sp., der Glucosamin-6-phosphat-N-acetyltransferase Gna1 aus Saccharomyces cerevisiae, der Phosphoenolpyruvat-Synthase PpsA aus E. col, der N-AcetylIneuraminsäure-Synthase NeuB und die CMP-Sialsäure-Synthetase NeuA, letztere beide aus Campylo-bacterjejuni. Zusätzlich wurden die Gene, die die Lactosepermease LacY aus E. col, cscB (Saccharosepermease), cscK (Fructokinase), cscA (Saccharosehydrolase) und cscR (Transkriptionsregulator) aus E. col/W kodieren, und ein funktionelles gal-Operon, bestehend aus den Genen ga/E (UDP-Glucose-4-Epimerase), galT (Galactose1-phosphat-Uridylyltransferase), galk (Galactokinase) und ga/M (Galactose-1-Epimerase) aus E. coli K12 in das Genom des BL21-Stamms integriert und konstitutiv exprimiert.
[00116] Der Stamm, der 3'-Sialyllactose synthetisiert, beherbergt das 3'-Sialyltransferase-Gen von Vibrio sp. JT-FAJ-16, während der 6'-Sialyllactose produzierende Stamm die alpha-2,6- Sialyltransferase plsT6 aus Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119 enthält.
[00117] Die Sialyllactose-produzierenden Stämme wurden in einem definierten Mineralsalzmedium gezüchtet, das 7 g I" NHıH2-PO-., 7 g I K2HPOs, 2 g I" KOH, 0,3g I” Zitronensäure, 5 g I NH4CI, 1 ml 1” Antischaummittel (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 mM CaCl», 8 mM MgSO-, Spurenelemente und 2% Saccharose als Kohlenstoffquelle umfasste. Die in der Fed-BatchPhase zugeführte Saccharosezufuhr (500 g I") wurde mit 8 mM MgSO-«, 0,1 mM CaCl,, Spurenelementen und 5 g I NH4CI ergänzt.
[00118] Die Spurenelemente bestanden aus 0,101 g I” Nitrilotriessigsäure, pH 6,5, 0,056 g I Ammoniumeisen(Ill)-citrat, 0,01 gg I MnCI2 x 4 H2:O, 0,002 g I" CoCl» x 6 H2:O, 0,001g I” CuCl, x 2 H2O, 0,002 g I” Borsäure, 0,009 g I" ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 g I NazMoO« x 2 H2:O, 0,002 g I” Na2SeOs, 0,002 g I” NiSO: x 6 H2:O.
[00119] Für die Sialyllactose-Bildung wurde eine Lactose-Zufuhr von 216 g I" verwendet. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Ammoniaklösung (25 % Vol./Vol.) kontrolliert. Die FedBatch-Fermentation wurde bei 30 °C unter konstanter Belüftung und Bewegung durchgeführt. Um am Ende der Fermentation restliche Lactose zu entfernen, wurde ßB-Galactosidase in das Fermentationsgefäß gegeben. Die resultierenden Monosaccharide wurden vom Produktionsstamm metabolisiert.
Die zellfreie Flüssigkeit wurde dann durch lonenaustauschchromatographie entionisiert. Zunächst wurden kationische Verunreinigungen auf einem starken Kationenaustauscher in einem Volumen von 200 I (Lewatit® S 2568 (Lanxess, Köln, Deutschland) in H*-Form entfernt. Unter Verwendung von NaOH wurde der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 eingestellt. In einem zweiten Schritt wurden mit dem starken Anionenaustauscher Lewatit® S 6368 S (Lanxess, Köln, Deutschland) in Chloridform anionische lonen und unerwünschte Farbstoffe aus der Lösung entfernt. Der lonenaustauscher hatte ein Bettvolumen von 200 I. Unter Verwendung eines zweiten Filtrationsschritts auf dem Querstromfilter (150 kDa Cut-Off) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Deutschland) wurden Niederschläge entfernt, die aus dem Ansäuern der Lösung stammten. Zur Aufkonzentration des Zuckers wurde die Lösung über eine Dow FILMTECH NF270-4040 (Inaqua, Mönchengladbach, Deutschland) oder alternativ über eine Trisep 4040-XN45-TSF-Membran (0,5 kDa Cutoff) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Deutschland) nanofiltriert. Mit letzterer wurde das aus dem Fermentationsprozess stammende und die Sialyllactoselösung verunreinigende Monosaccharid N-Acetylglucosamin vom Produkt abgetrennt. Die aufkonzentrierte Sialyllactoselösung wurde dann mit Aktivkohle (CAS: 7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) behandelt, um Farbstoffe wie Maillard-Reaktionsprodukte und Aldol-Reaktionsprodukte zu entfernen. Um die Sialyllactose von Nebenprodukten, die aus dem Fermentationsprozess stammen, wie Sialinsäure und N-Acetylglucosamin, abzutrennen, wurde die Lösung mit einer 1 kDa-Ausschlussmembran GE4040F30 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, Deutschland) filtriert und auf eine Leitfähigkeit von 0,6 bis 0,8 mS cm diafiltriert. Die verdünnte Lösung wurde am Rotationsver-
dampfer auf eine Konzentration von ca. 300 g/l eingeengt. In einer abschließenden chromatographischen Trennung wurden andere verunreinigende Zucker wie Disialyllactose entfernt. Hierzu wurde die aufkonzentrierte Lösung auf ein schwaches Anionenaustauscherharz in Acetatform (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA) aufgebracht. Während die Sialyllactose selten an das Harz bindet, wird die Disialyllactose adsorbiert. Somit wird die Sialyllactose mit 10 mM Ammoniumacetat eluiert, während die Disialyllactose mit 1 M Ammoniumacetat eluiert wird. Zur Entfernung des Ammoniumacetats wurde die Sialyllactose mit einem 10-fachen Überschuss Ethanol ausgefällt. Die feste Fraktion wurde filtriert und getrocknet.
[00120] Das Produkt wurde fertiggestellt, indem eine 20%-ige Sialyllactoselösung nacheinander durch einen 6 kDa-Filter (Pall Microza Ultrafiltrationsmodul SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Deutschland) und einen 0,2 um-Sterilfilter geleitet wurde.
Ein Teil der Lösung wurde unter Verwendung eines Büchi-Sprühtrockners (Büchi Mini Spray Dryer B-290) (Büchi, Essen, Deutschland) unter Anwendung der folgenden Parameter sprühgetrocknet: Einlasstemperatur: 130°C, Auslasstemperatur 67 °C bis 71 °C, Gasfluss 670 l/h, Aspirator 100 %.
[00121] Die sprühgetrocknete 6'-Sialyllactose wies eine Reinheit von 91 % auf, während das 3'Sialyllactosematerial eine Reinheit von 93 % aufwies.
Beispiel 5: Herstellung von HMO-Mischungen
[00122] Es wurden Mischungen verschiedener HMOs aus festen Produkten hergestellt. Dafür wurden die einzelnen HMO sprühgetrocknet und die erhaltenen Pulver gemischt. HMO-Mischung | enthielt 2’-Fucosyllactose und Lacto-N-tetraose in einem Verhältnis von 70 Gew.% zu 30 Gew.%; HMO-Mischung II enthielt 2’-Fucosyllactose (52 Gew.%), 3-Fucosyllactose (13 Gew.%), Lacto-N-tetraose (26 Gew.%, 3’-Sialyllactose (4 Gew.%), und 6’-Sialyllactose (5 Gew.%). Die vermischten Pulver wurden in Wasser zu einer Lösung gelöst, die 20 Gew.% HMO enthielt, und die resultierende Lösung wurde erneut unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen BüchiSprühtrockners sprühgetrocknet.
[00123] Die Analyse des resultierenden sprühgetrockneten Pulvers ergab, dass es hinsichtlich des Verhältnisses der verschiedenen HMOs dieselbe Zusammensetzung aufwies wie die Lösung, die sprühgetrocknet wurde.
Beispiel 6: Herstellung von Saccharid-Mischungen
[00124] Es wurden 8 g 2‘-FL und 1 g L-Fucose in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Die resultierende Lösung wurde unter Verwendung des Büchi-Sprühtrockners wie in Beispiel 4 beschrieben sprühgetrocknet. Es wurde ein sprühgetrocknetes Pulver erhalten, das im Wesentlichen aus 2'FL und L-Fucose bestand, wobei das Verhältnis von 2'-FL und L-Fucose im sprühgetrockneten Pulver dem Verhältnis von 2'-FL und L-Fucose in der Lösung, die sprühgetrocknet wurde, identisch war. Somit kann L-Fucose in Gegenwart eines HMO sprühgetrocknet werden.
Beispiel 7: Charakterisierung von sprühgetrockneten Humanmilcholigosacchariden 1. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC)
[00125] Unter Verwendung der dynamischen Differenzkalorimetrie (DSC) an einem Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Deutschland) wurden thermische Ereignisse der sprühgetrockneten Humanmilcholigosaccharide, nämlich 3-Fucosyllactose, 6'-Sialyllactose, 3'-Sialyllactose, Lacto-N-tetraose und der sprühgetrockneten Mischungen von Humanmilcholigosacchariden, einer Mischung (HMO-Mischung |) von 2'-Fucosyllactose/Lacto-N-tetraose bzw. einer Mischung (HMO-Mischung Il) von 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, Lacto-N-tetraose, 6'-SiaIyllactose, 3'-Sialyllactose bestimmt.
[00126] Mit einem Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Deutschland) wurden thermische Ereignisse der sprühgetrockneten Produkte (Glasübergangstemperatur (Tg), weitere exound endotherme Ereignisse) bestimmt.
[00127] Ungefähr 25 mg der sprühgetrockneten Humanmilcholigosaccharide wurden in gecrimpten Al-Tiegeln (Mettler Toledo, Gießen, Deutschland) analysiert. Die Proben wurden mit 10 K/min auf 0 °C abgekühlt und mit einer Abtastrate von 10 K/min wieder auf 100 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen der Proben auf 0 °C in einem zweiten Erwärmungszyklus wurden die Proben erneut auf 150 °C erwärmt. Der Mittelpunkt der endothermen Verschiebung der Grundlinie während des Erwärmungsscans wurde als Glasübergangstemperatur (Tg) genommen. Exotherme und endotherme Peaks werden anhand der Peaktemperatur und der normalisierten Energie des Ereignisses angegeben.
[00128] Der erste Erwärmungsscan in allen Proben zeigte ein Hauptglasübergang im gesamten Wärmestrom, was durch einen Hauptstufenübergang im Bereich von ungefähr 48-58 °C in den meisten Proben belegt wird, wobei das im ersten Erwärmungsscan beobachtete wichtige Glasübergangsereignis im zweiten Erwärmungsscan wiederauftrat. Die Ergebnisse der DSC-Analysen sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Probe 1. 2. Erwärmungsscan Erwärmungsscan Tg [°C] Tg [°C]
3-Fucosyllactose 57,6 59,9 Lacto-N-tetraose 49,9 79,4 6&’-Sialyllactose 47,6 49,6 3’-Sialyllactose 48,8 54,3 Z’-Fucosyllactose/Lacto-N-tetraose 56,3 59 HMO-Mischung 54,2 55,6
Tabelle 9: Thermische Ereignisse von HMOs, bestimmt durch dynamische Differenzkalorimetrie
[00129] Für 3-Fucosyllactose wurde ein endothermer Relaxationspeak nach Tg im ersten Erwärmungsscan festgestellt. Für Lacto-N-tetraose wurde im 2. Erwärmungsscan im Vergleich zu den anderen Proben eine viel höhere Tg von etwa 79 °C festgestellt. Dies kann durch ein endothermes Ereignis während des ersten Erwärmungsscans bei etwa 89 °C (-6,04 J/g) verursacht werden. Wie für 3-Fucosyllactose wurde auch für 6'-Sialyllactose ein endothermer Relaxationspeak nach Tg festgestellt, Jedoch trat in dieser Probe zusätzlich ein endothermes Ereignis bei 77 °C (0,22 J/g) auf. Für die 3'-Sialyllactose und die HMO-Mischung | wurden keine endothermen Ereignisse festgestellt, für den HMO-Mischung Il war das endotherme Ereignis während des ersten Erwärmungsscans bei 79 °C (0,34 J/g).
2, Pulverröntgenbeugung (XRD)
[00130] Weitwinkel-Pulverröntgenbeugung (XRD) wurde verwendet, um die Morphologie Iyophilisierter Produkte zu untersuchen. Das Röntgendiffraktometer Empyrean (Panalytical, Almelo, Niederlande) mit einer Kupferanode (45 kV, 40 mA, Ka1-Emission bei einer Wellenlänge von 0,154 nm) und einem PIXcel3D-Detektor wurde verwendet. Ungefähr 100 mg der sprühgetrockneten Proben wurden im Reflexionsmodus im Winkelbereich 5-45° 268, bei einer Schrittgröße von 0,04° 26 und einer Zählzeit von 100 Sekunden pro Schritt analysiert.
[00131] Alle singulären Oligosaccharide sowie die HMO-Mischungen | und II zeigten einen vollständig amorphen Zustand (Figur 1 bis 6). Für Lacto-N-tetraose wurde ein zweites (amorphes) Signal um 9-10° nachgewiesen.
3 Laserbeugung
[00132] Die Pulverpartikelgröße wurde durch Laserbeugung bewertet. Das System erfasst gestreutes und gebeugtes Licht durch eine Anordnung konzentrisch angeordneter Sensorelemente. Der Software-Algorithmus approximiert dann die Partikelzahlen, indem er die z-Werte der Lichtintensitätswerte berechnet, die zu den verschiedenen Sensorelementen gelangen. Die Analyse wurde unter Verwendung eines quantitativen Laserbeugungssystems (gqLD) SALD-7500 Aggre-
gate Sizer (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) durchgeführt.
[00133] Eine kleine Menge (Spatelspitze) jeder Probe wurde in 2 ml Isooctan dispergiert und durch fünfminütige Ultraschallbehandlung homogenisiert. Die Dispersion wurde in eine mit Isooctan gefüllte Batch-Zelle überführt und im manuellen Modus analysiert.
[00134] Die Einstellungen für die Datenerfassung waren wie folgt: Anzahl der Signalmittelungen pro Messung: 128, Anzahl der Signalanhäufungen: 3, und Intervall: 2 Sekunden.
[00135] Vor der Messung wurde das System mit Isooctan genullt. Jede Probendispersion wurde dreimal gemessen und die Mittelwerte und die Standardabweichung werden angegeben. Die Daten wurden mit der Software WING SALD II Version V3.1 ausgewertet. Da der Brechungsindex der Probe unbekannt war, wurde der Brechungsindex von Zuckerteilchen (Disaccharidteilchen) (1,530) zur Bestimmung der Größenverteilungsprofile verwendet. Die Größenwerte für den mittleren und medianen Durchmesser sind angegeben.
[00136] Die mittleren Partikelgrößen für alle Proben waren sehr ähnlich, für HMO-Mischung II wurden etwas niedrigere Werte gemessen. Die Partikelgrößeneigenschaften sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Zusätzlich zeigte die Partikelgrößenverteilung für alle Proben das Vorhandensein von einer vorwiegenden Größenpopulation.
[nm] +0,7 |+1,5 + 0,6 Median [141,3 141,3 [|141,3+*0,0 [121,9 [141,3+0,0 [112,2 [nm] + 0,0 + 0,0 + 16,7 +0,0
Tabelle 10: Teilchengröße der HMO, bestimmt durch Laserbeugung

Claims (13)

Ansprüche
1. Ernährungszusammensetzung umfassend ein sprühgetrocknetes Pulver, das eine Mischung strukturell unterschiedlicher Humanmilcholigosaccharide enthält, wobei die genannte Mischung strukturell unterschiedlicher Humanmilcholigosaccharide 2’-FL, 3-FL, 3’-SL, 6’-SL, und LNT und/oder LNnT enthält.
2. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das genannte sprühgetrocknete Pulver weiterhin LNFP | enthält.
3. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das sprühgetrocknete Pulver ferner mindestens ein Monosaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Fucose und N-AcetyIneuraminsäure enthält.
4. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das sprühgetrocknete Pulver enthält oder besteht aus:
Saccharid A [Gew.-%] B [Gew.-%] 2-FL 30.0 - 55.0 33.6 - 52.2 3-FL 10.0 - 15.0 10.7 - 13.0 LNT 20.0 - 30.0 20.1 - 26.1 LNNT 0.0 - 5.0 0.0 - 2.0 LNFPI 0.0 - 20.0 0.0 - 16.0 3'-SL 2.0 - 4.0 2.7-3.5 6'-SL 4.0 - 6.0 4.0 - 5.2 NeuAc 0.0 - 10.0 0.0 - 8.1 L-fucose 0.0 - 6.0 0.0 - 5.4 Total 100.0 100.0
5. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Mischung der strukturell unterschiedlichen HMOs besteht aus 52.2 %-Gew. 2’-FL, 13.0 %-Gew. 3-FL, 26.1 %-Gew. LNT, 3.5 %-Gew. 3’-SL und 5.2 %-Gew. 6’-SL.
6. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Mischung der strukturell unterschiedlichen HMOs besteht aus 39.0 %-Gew. 2’-FL, 12.0 %-Gew. 3-FL, 23.0 %-Gew. LNT, 2.0 %-Gew. LNnT, 16.0 %-Gew. LNFP I, 3.0 %-Gew. 3’-SL und 5.0 %-Gew. 6’-SL.
7. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das sprühgetrocknete Pulver besteht aus 33.6 %-Gew. 2’-FL, 10.7 %- Gew. 3-FL, 20.1 %- Gew. LNT, 2.0 %- Gew. LNnT, 13.4 %- Gew. LNFP I, 2.7 %- Gew. 3’-SL, 4.0 %- Gew. 6’-SL, 8.1 %- Gew. NeuAc, und 5.4 %- Gew. L-fucose.
8. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei bevorzugt das ganze sprühgetrocknete Pulver mindestens 80 %- Gew., mindestens 85 %- Gew., mindestens 90 %- Gew., mindestens 93 %- Gew., mindestens 95 %- Gew. oder mindestens 98 %Gew. Humanmilcholigosaccharide enthält.
9. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei mindestens ein Humanmilcholigosaccharid, bevorzugt alle Humanmilcholigosaccharide, und das mindestens eine Monosaccharid in amorpher Form enthalten sind.
10. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Ernährungszusammensetzung weiterhin mindestens einen probiotischen Mikroorganismus enthält.
11. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Ernährungszusammensetzung ein oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ol, Fett, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Proteine, Vitamine, Mineralien und Spurenelemente enthält.
12. Ernährungszusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe der aus entrahmter Milch, Molke, Kasein und Sojabohnen stammenden Proteine.
13. Ernährungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Ernährungszusammensetzung mindestens ein Prebiotikum enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Galacto-Oligosacchariden, Fructo-Oligosacchariden und Inulin.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
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