JP6082273B2 - 蛍光検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、被検出物に励起光を照射して、該被検出物が発生した蛍光を検出する蛍光検出装置に関する。

近年、ライフサイエンスの分野において、蛍光検出装置が多く使われ始めている。蛍光検出装置は簡便でかつ検出感度が高いため、時には増幅工程と併用して、蛍光を発する化学物質により標識されたＤＮＡなどの核酸の定量的な検出をする際に有効である。

例えば特許文献１には、主波長λ_１の励起光を出射する励起光用光源と、プローブを介して励起光が照射された試料から発生する主波長λ_２の蛍光（λ_２＞λ_１）を合分波する蛍光分析用光合分波器と、蛍光分析用光合分波器を透過した蛍光を受光する検出器と、励起光用光源と蛍光分析用光合分波器を接続する第１の光伝送路と、プローブを蛍光分析用光合分波器に接続する第２の光伝送路と、検出器及び蛍光分析用光合分波器を接続する第３の光伝送路とを備える蛍光分析用光学モジュールが開示されている。

特開２００５−３０８３０号公報

特許文献１に記載の発明で用いている光合分波器は、第１のロッドレンズと、該第１のロッドレンズ面に配置されたフィルタと、該フィルタに固定された第２のロッドレンズとから成り、これらを直列に一体的に組み立てることにより構成されている。このような構成の光合分波器は、ロッドレンズやフィルタを通じた光学的結合を高効率に実現するために、各部品間の位置調整に多大な労力とスキルを必要とし、高価になる傾向がある。従って、特許文献１に開示された発明には、コストの観点から改善の余地がある。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、安価な蛍光検出装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の蛍光検出装置は、励起光を発光する励起光源と、励起光源からの励起光を入射する入射端面と、励起光を出射する出射端面とを有する励起光用ファイバと、蛍光を入射する入射端面と、蛍光を出射する出射端面とを有する蛍光用ファイバと、蛍光用ファイバの出射端面から出射された蛍光を受光する検出器と、励起光用ファイバの出射端面と、蛍光用ファイバの入射端面とが近傍に位置するように、励起光用ファイバおよび蛍光用ファイバを保持する保持部材と、励起光用ファイバの出射端面に当接するように設けられた励起光選択フィルタと、蛍光用ファイバの入射端面に当接するように設けられた蛍光選択フィルタと、を備える。励起光用ファイバの出射端面から出射された励起光が励起光選択フィルタを介して被検出物に照射され、該励起光の照射により被検出物から発生した蛍光が蛍光選択フィルタを介して蛍光用ファイバの入射端面に入射する。

励起光選択フィルタおよび蛍光選択フィルタはそれぞれ、透明基材と、透明基材の一方の面上に形成された誘電体多層膜とを備えてもよい。励起光選択フィルタは、誘電体多層膜が励起光用ファイバの出射端面に当接するように設けられ、蛍光選択フィルタは、誘電体多層膜が蛍光用ファイバの入射端面に当接するように設けられてもよい。

励起光選択フィルタおよび蛍光選択フィルタはそれぞれ、透明基材の他方の面上に形成された反射防止膜をさらに備えてもよい。

励起光選択フィルタと蛍光選択フィルタとの間に設けられた光吸収性遮光部材をさらに備えてもよい。

励起光選択フィルタおよび蛍光選択フィルタはそれぞれ、透明基材と、透明基材の一方の面上に形成された回折光学素子とを備えてもよい。励起光選択フィルタは、自身の回折光学素子が励起光用ファイバの出射端面に当接するように設けられ、蛍光選択フィルタは、自身の回折光学素子が蛍光用ファイバの入射端面に当接するように設けられてもよい。

励起光選択フィルタおよび蛍光選択フィルタと対向するように設けられた対物レンズをさらに備えてもよい。対物レンズは、屈折率分布型ロッドレンズであってもよい。

対物レンズと励起光選択フィルタとの間に設けられた励起光用コリメートレンズと、対物レンズと蛍光選択フィルタとの間に設けられた蛍光用コリメートレンズとをさらに備えてもよい。励起光用コリメートレンズおよび蛍光用コリメートレンズは、励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり合わないように配置されてもよい。

励起光用ファイバおよび／または蛍光用ファイバは、プラスチックファイバであってもよい。

本発明によれば、安価な蛍光検出装置を提供できる。

本実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 図２（ａ）および（ｂ）は、プローブの構成を説明するための図である。 励起光選択フィルタおよび蛍光選択フィルタの構成をより詳細に説明するための図である。 本発明の第１実施例を説明するための図である。 第１実施例に係る蛍光検出装置における、ＦＩＴＣ水溶液濃度と検出信号強度の関係の測定結果を示す図である。 第１実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す図である。 図６に示す関係の測定系を示す図である。 本発明の第２実施例に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 第２実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す図である。 本発明の第３実施例を説明するための図である。 第３実施例に係る蛍光検出装置における、ＦＩＴＣ水溶液濃度と検出信号強度の関係の測定結果を示す図である。 第３実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す図である。 図１２に示す関係の測定系を示す図である。 図１４（ａ）および（ｂ）は、本発明の別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。

以下、本発明の実施形態に係る蛍光検出装置について説明する。

図１は、本実施形態に係る蛍光検出装置１０を説明するための図である。蛍光検出装置１０は、被検出物５０に対して励起光を照射し、該照射により被検出物５０から発生した蛍光を検出するものである。

図１に示すように、蛍光検出装置１０は、励起光を発光する励起光源１２と、励起光を被検出物５０に照射するとともに被検出物５０が発生した蛍光を受光するプローブ３０と、蛍光を検出する検出器１４と、励起光源１２からプローブ３０に励起光を伝搬する励起光用ファイバ１６と、プローブ３０から検出器１４に蛍光を伝搬する蛍光用ファイバ１８とを備える。オプションとして、プローブ３０と被検出物５０の間に対物レンズ２６設けられてもよい。対物レンズ２６は、例えば屈折率分布型ロッドレンズであってよい。

励起光源１２は、被検出物５０に照射するための励起光を発光するものであり、被検出物５０の励起に適した波長を発光帯域に含むＬＥＤ（Light-Emitting Diode）やＬＤ（Laser Diode）などを用いることができる。

検出器１４は、励起光の照射により被検出物５０から発生した蛍光を検出するものであり、被検出物５０が発生する蛍光の波長に受光帯域を有するＰＤ（Photodiode），ＡＰＤ（Avalanche Photodiode）、ＰＭＴ（Photomultiplier Tube）などを用いることができる。

励起光用ファイバ１６は、励起光源１２からの励起光を入射する入射端面と、励起光を出射する出射端面とを有する。励起光用ファイバ１６の入射側端部１６ａは、励起光源１２に接続される。蛍光用ファイバ１８は、蛍光を入射する入射端面と、蛍光を出射する出射端面とを有する。蛍光用ファイバ１８の出射側端部１８ａは、検出器１４に接続される。

図２（ａ）および（ｂ）は、プローブ３０の構成を説明するための図である。図２（ａ）はプローブ３０の断面図であり、図２（ｂ）はプローブ３０の正面図である。図２（ａ）および（ｂ）に示すように、プローブ３０は、励起光用ファイバ１６の出射側端部１６ｂと、蛍光用ファイバ１８の入射側端部１８ｂと、保持部材２０と、励起光選択フィルタ２２と、蛍光選択フィルタ２４から構成されている。

保持部材２０は、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃと蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃとが近傍に位置するように、励起光用ファイバ１６の出射側端部１６ｂおよび蛍光用ファイバ１８の入射側端部１８ｂを保持する。保持部材２０は、円柱状または多角柱状部材であり、対物端面２０ａから該対物端面２０ａと対向するもう一方の端面２０ｂまで貫通された２つの貫通孔、または前記励起光および蛍光用ファイバの２本を同時に入れることのできる１つの貫通孔を有する。一方の貫通孔には励起光用ファイバ１６の出射側端部１６ｂが挿入されて保持される。他方の貫通孔には、蛍光用ファイバ１８の入射側端部１８ｂが挿入されて保持される。

保持部材２０は、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃと蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃとが面一となるよう、励起光用ファイバ１６の出射側端部１６ｂおよび蛍光用ファイバ１８入射側端部１８ｂを保持してもよい。さらに、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃ、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃ、および保持部材２０の対物端面２０ａが面一となるようにしてもよい。

励起光選択フィルタ２２は、励起光を選択的に透過するよう構成されたフィルタである。励起光選択フィルタ２２は、多角柱または円柱形状を有し、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃに当接するように保持部材２０の対物端面２０ａ上に設けられる。

蛍光選択フィルタ２４は、被検出物５０が発生した蛍光を選択的に透過するように構成されたフィルタである。蛍光選択フィルタ２４は、多角柱または円柱形状を有し、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接するように、保持部材２０の対物端面２０ａ上に設けられる。励起光選択フィルタ２２と蛍光選択フィルタ２４は、隣接するように設けられている。

励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４の当接面の形状および面積は、励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４の当接面が出射端面１６ｃ、入射端面１８ｃ全体を覆うことができるように定められる。励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４は高価であるため、励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４の当接面が各ファイバの出射端面１６ｃ、入射端面１８ｃにおけるファイバのコア径と同一の形状および面積を有する場合が最も経済的である。しかしながら、この場合には高い実装精度が求められるので、本実施形態のように、励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４の当接面の面積は、出射端面１６ｃ、入射端面１８ｃの面積の数倍（例えば２〜１０倍）とするのが現実的である。

図１に戻り、本実施形態に係る蛍光検出装置１０の動作について説明する。励起光源１２から出射された励起光は、励起光用ファイバ１６の入射端面から励起光用ファイバ１６内に入射する。励起光用ファイバ１６内を伝搬した励起光は、出射端面１６ｃから出射される。出射端面１６ｃから出射された励起光は、当接面から励起光選択フィルタ２２に入射し、励起光選択フィルタ２２を通って対物面から出射される。励起光選択フィルタ２２から出射された励起光は、直接または対物レンズ２６を介して被検出物５０に照射される。

励起光の照射により被検出物５０から発生した蛍光は、直接または対物レンズ２６を介して対物面から蛍光選択フィルタ２４に入射し、蛍光選択フィルタ２４内を通って当接面から出射される。蛍光選択フィルタ２４の当接面から出射された光は、入射端面１８ｃから蛍光用ファイバ１８内に入射する。蛍光用ファイバ１８を伝搬した蛍光は、検出器１４によって受光され、電気信号に変換される。この電気信号を解析することにより、被検出物５０の状態を測定できる。

被検出物５０は、励起光の光束（図１に符号Ｌ１で示す）と蛍光の受光可能範囲（図１に符号Ｌ２で示す）とが重なり合う領域に配置されることが好ましい。蛍光の受光可能範囲とは、蛍光用ファイバ１８のレンズ側端面を仮想的に光の出射端とした場合に、当該出射端からファイバのＮＡでもって出射されたときの光束の範囲である。図１に、励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり合う領域を「α」で示す。一方、被検出物５０がαよりも遠い領域（図１に「β」で示す）に位置すると、励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり合う領域が無いので、好適に蛍光検出を行うことができない。励起光の集光点と、蛍光の仮想的な発光点（蛍光用ファイバ１８のレンズ側端面の対物レンズによる像点に相当）とが一致しないからである。

励起光用ファイバ１６から照射される光には、被検出物５０の励起に適した波長帯以外の波長の光も含まれる。本実施形態では、励起光選択フィルタ２２を励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃに当接させたことにより、確実に励起光選択フィルタ２２を透過した光（すなわち励起光）のみを被検出物５０に照射することができる。

また、被検出物５０からプローブ３０方向に向かう光には、被検出物５０から発生した蛍光の他に、励起光の反射光や散乱光も存在する。この励起光の反射光や散乱光は、検出器１４での蛍光検出においてノイズとなる。本実施形態では、蛍光選択フィルタ２４を蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接させたことにより、確実に蛍光選択フィルタ２４を透過した光（すなわち蛍光）のみを蛍光用ファイバ１８内に入射させることができる。その結果、検出器１４での蛍光検出におけるノイズレベルが低下するため、蛍光を好適に検出することができる。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、保持部材２０により保持された励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃ、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接するように励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４を実装するだけでプローブ３０を構成できる。高い精度が要求される光軸合わせ等の作業はなく、また上述の特許文献１に係る発明で用いられるような高価な光合分波器は不要であるので、安価な蛍光検出装置１０を実現できる。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃ、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接するように励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４を設けたが、励起光用ファイバ１６の入射端面側、蛍光用ファイバ１８の出射端面側に励起光選択フィルタ、蛍光選択フィルタを設ける方法も考えられる。

しかしながら、例えば励起光用ファイバ１６の入射端面と励起光源１２の発光素子との間に励起光選択フィルタを設ける場合、発光素子から励起光用ファイバ１６の入射端面までの光学的距離が長くなる。従って、高い効率で発光素子からの光を励起光用ファイバ１６に入射させるために別途レンズを設ける必要があり、コスト高になるというデメリットがある。励起光選択フィルタを薄くすることにより、ファイバ端面から発光素子までの光学的距離を短くできるが、この場合は、フィルタに反りが発生するという別の問題が生じる可能性がある。また、励起光用ファイバ１６の入射端面と励起光源１２の発光素子との間に励起光選択フィルタを設ける場合には、専用の励起光源を製造しなければならず、やはりコスト高になるというデメリットがある。また、励起光用ファイバ１６の入射端面側に励起光選択フィルタを設ける場合、励起光選択フィルタの面積が大きくなりがちである。励起光選択フィルタは高価であるため、その面積が大きくなるとコスト面への影響が大きい。上記では、励起光に関する構成要素について述べたが、蛍光に関する構成要素についても事情は同じである。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃ側、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃ側に励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４を設ける構成なので、上記のような問題は生じず、安価な蛍光検出装置１０を実現できる。すなわち、本実施形態においては、励起光用ファイバ１６の入射端面側、蛍光用ファイバ１８の出射端面側に励起光選択フィルタ、蛍光選択フィルタを設けていないので、励起光源１２の発光素子と励起光用ファイバ１６の入射側端部１６ａとの間、検出器１４の受光素子と蛍光用ファイバ１８の出射側端部１８ａとの間に別途レンズを設ける必要がない。また、本実施形態においては、安価な汎用品の励起光源１２、検出器１４を用いることができる。また、本実施形態においては、励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４の大面積化を回避でき、励起光選択フィルタ２２、蛍光選択フィルタ２４のコストを低減できる。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、励起光用ファイバ１６および蛍光用ファイバ１８の種類は特に限定されず、例えばガラス光ファイバ、石英光ファイバ、プラスチック光ファイバなどを用いることができる。特に安価なプラスチック光ファイバを用いることができることは、本実施形態に係る蛍光検出装置１０の大きな利点である。プラスチック光ファイバは、プラスチックの材料特性上、励起光によりファイバ自体から蛍光が発生するという特性を有する。本実施形態と異なり励起光用ファイバの出射端面に励起光選択フィルタが設けられていない形態で励起光用ファイバとしてプラスチック光ファイバを用いた場合、励起光用ファイバから発生した蛍光が励起光とともに被検出物に照射されると、この蛍光が蛍光用ファイバに入射し、検出器で検出される可能性がある。これは、蛍光の分析確度に支障を生じさせる可能性がある。一方、本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、励起光用ファイバ１６としてプラスチック光ファイバを用いた場合でも、励起光用ファイバ１６で発生した蛍光は励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃに当接させた励起光選択フィルタ２２で確実に除去される。従って、本実施形態によれば、蛍光の分析確度に支障を生じることなくプラスチック光ファイバを用いることができるので、安価な蛍光検出装置１０を実現できる。

図３は、励起光選択フィルタ２２および蛍光選択フィルタ２４の構成をより詳細に説明するための図である。励起光選択フィルタ２２は、第１透明基材２２ａと、第１透明基材２２ａの一方の面上に形成された第１誘電体多層膜２２ｂと、第１透明基材２２ａの他方の面上に形成された第１反射防止膜２２ｃとから構成されている。第１誘電体多層膜２２ｂは、励起光を選択的に透過するよう構成されている。また、蛍光選択フィルタ２４は、第２透明基材２４ａと、第２透明基材２４ａの一方の面上に形成された第２誘電体多層膜２４ｂと、第２透明基材２４ａの他方の面上に形成された第２反射防止膜２４ｃとから構成されている。第２誘電体多層膜２４ｂは、蛍光を選択的に透過するよう構成されている。

本実施形態では、図３に示すように、励起光選択フィルタ２２は、第１誘電体多層膜２２ｂが励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃに当接するように設けられる。これにより、励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃから出射された光がすぐに第１誘電体多層膜２２ｂを通るので、所望の帯域以外の光を効果的に除去できる。

また、蛍光選択フィルタ２４は、第２誘電体多層膜２４ｂが蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接するように設けられる。これにより、蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに入射される光の殆どが第２誘電体多層膜２４ｂを通るので、所望の帯域以外の光を効果的に除去できる。

第１透明基材２２ａの他方の面上に設けられた第１反射防止膜２２ｃは、該他方の面にける励起光の表面反射を防止する。第１反射防止膜２２ｃにより、励起光用ファイバ１６の方向に戻る反射光が減り、励起光の照射量を増やすことができる。

第２透明基材２４ａの他方の面上に設けられた第２反射防止膜２４ｃは、該他方の面にける蛍光の表面反射を防止する。第２反射防止膜２４ｃにより、被検出物５０の方向に戻る反射光が減り、蛍光の検出量を増やすことができる。

図３に示すように、励起光選択フィルタ２２と蛍光選択フィルタ２４との間に光吸収性遮光部材２８が設けられてもよい。光吸収性遮光部材２８は、第１透明基材２２ａの側面と第２透明基材２４ａの側面に当接するように設けられる。光吸収性遮光部材２８を設けることにより、第１透明基材２２ａ内で迷光となった光が第２透明基材２４ａに入射したり、逆に第２透明基材２４ａ内で迷光となった光が第１透明基材２２ａに入射したりするのを防止できる。言い換えると、励起光選択フィルタ２２と蛍光選択フィルタ２４のアイソレーションを保つことができる。光吸収性遮光部材２８としては、例えば黒色のポリアセタール樹脂など蛍光を発しない樹脂等で構成させることができる。

上記では、誘電体多層膜を用いてフィルタを形成したが、回折光学素子を用いてフィルタを形成してもよい。すなわち、励起光選択フィルタ２２および蛍光選択フィルタ２４は、透明機材と、該透明機材の一方の面上に形成された回折光学素子から構成されてもよい。この場合、励起光選択フィルタ２２は、回折光学素子が励起光用ファイバ１６の出射端面１６ｃに当接するように設けられる。また、蛍光選択フィルタ２４は、回折光学素子が蛍光用ファイバ１８の入射端面１８ｃに当接するように設けられる。

本実施形態において、励起光選択フィルタ２２の基材をなす第１透明基材２２ａ、蛍光選択フィルタ２４の基材をなす第２透明基材２４ａは、励起光により蛍光を実質的に発生しない物質により形成されることが望ましい。このような物質としては、例えばＢＫ７、石英等からなる光学ガラスを例示できる。

次に、本発明の実施例について説明する。図４は、本発明の第１実施例を説明するための図である。本第１実施例では、対物レンズ２６として、屈折率分布型ロッドレンズを用いている。対物レンズ２６は、筒状の固定部材３２により、励起光選択フィルタ２２および蛍光選択フィルタ２４と対向するように保持部材２０に固定されている。

本第１実施例で用いた各構成要素の種類および特性を以下に示す。
・励起光源：ＬＥＤ、主波長λ_１＝４７０ｎｍ
・励起光用ファイバ：石英光ファイバ、ＳＩ２００／２５０（ＮＡ＝０．３）、コア径＝０．２ｍｍ
・保持部材：キャピラリ、外径＝１．８ｍｍ、二軸平行孔
・励起光選択フィルタ：バンドパスフィルタ、透過域＝波長４５５ｎｍ以上４８０ｎｍ以下
・レンズ：屈折率分布型ロッドレンズ
・蛍光用ファイバ：石英光ファイバ、ＳＩ２００／２５０（ＮＡ＝０．３）、コア径＝０．２ｍｍ
・蛍光選択フィルタ：バンドパスフィルタ、透過域＝波長５１５ｎｍ以上５４０ｎｍ以下
・検出器：光電変換素子（ＰＤ）
・励起光用ファイバおよび蛍光用ファイバのコア間距離＝０．２５ｍｍ

上記の第１実施例に係る蛍光検出装置を用いて、試料の蛍光測定を行った。今回、蛍光を発生する試料として、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）水溶液を用いた。用いたＦＩＴＣ水溶液の溶液濃度は、１，１０，１００，３００，１０００ｎｍｏｌ／Ｌ（ナノモル／リットル）である。このＦＩＴＣが発生する蛍光の主波長λ_２は、５２０ｎｍである。試料３６を１０ｍｍ角の石英セル３４に入れて、図４に示すようにプローブ３０の端面（すなわち対物レンズ２６の端面）をセル３４の側面から突き当て、検出器から出力された電気信号（電流）をアンプを通じて電圧に変換した値を測定した。以下に、測定結果を説明する。

図５は、第１実施例に係る蛍光検出装置における、ＦＩＴＣ水溶液濃度と検出信号強度の関係の測定結果を示す。図５に示されるように、第１実施例に係る蛍光検出装置は、線形性を維持できており、蛍光の測定が可能であることが分かる。

図６は、第１実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す。図７は、図６に示す関係の測定系を示す。本測定では、「１０００ｎｍｏｌ／Ｌ」のＦＩＴＣ溶液濃度を計測した際の蛍光信号強度と同等の蛍光信号強度を得られる樹脂製基板を試料３６として用いた。本測定では、試料３６の厚みは１ｍｍである。本測定系において、プローブ３０は励起光に焦点を持たせている。図７に示すように、プローブ３０の端面から測定試料表面までの距離Ｘを変化させながら蛍光の強度を検出し、図６に示す測定結果を得た。図６の測定結果から、図７に示す測定系により蛍光の測定が可能であり、また、蛍光の検出信号強度が距離Ｘに依存することが分かる。

図１の説明において、励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり合う領域αに試料が配置されることが好ましく、領域αより遠い領域βでは好適に蛍光検出を行うことができないことを述べた。図６から、照射された励起光の強度、絞り込まれるスポットの大きさや位置等と試料の位置との最適化が図れる位置で信号強度の最大値を示す一方、距離Ｘが更に大きくなるにつれ、励起光の光束と蛍光受光可能範囲とのミスマッチが生じ、検出信号強度が急激に低下していくことが分かる。

図８は、本発明の第２実施例に係る蛍光検出装置を説明するための図である。本第２実施例では、プローブ３０は、励起光に焦点を持たせる代わりに、励起光を無限遠に出射するよう構成されている。図９は、第２実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す。図９から、本第２実施例に係る蛍光検出装置は蛍光の測定が可能であることが分かる。本第２実施例に係る蛍光検出装置は、対物レンズ２６の端面からの距離Ｘについて冗長性が得られるという利点を有する。

図１０は、本発明の第３実施例を説明するための図である。本第３実施例は、第１実施例において対物レンズ２６を省いた構成となっている。

本第３実施例で用いた各構成要素の種類および特性を以下に示す。
・励起光源：ＬＥＤ、主波長λ_１＝４７０ｎｍ
・励起光用ファイバ：石英光ファイバ、ＳＩ２００／２５０（ＮＡ＝０．３）、コア径＝０．２ｍｍ
・保持部材：キャピラリ、外径＝１．８ｍｍ、二軸平行孔
・励起光選択フィルタ：バンドパスフィルタ、透過域＝波長４５５ｎｍ以上４８０ｎｍ以下
・蛍光用ファイバ：石英光ファイバ、ＳＩ２００／２５０（ＮＡ＝０．３）、コア径＝０．２ｍｍ
・蛍光選択フィルタ：バンドパスフィルタ、透過域＝波長５１５ｎｍ以上５４０ｎｍ以下
・検出器：光電変換素子（ＰＤ）
・励起光用ファイバおよび蛍光用ファイバのコア間距離＝０．２５ｍｍ

上記の第３実施例に係る蛍光検出装置を用いて、試料の蛍光測定を行った。今回、蛍光を発生する試料として、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）水溶液を用いた。用いたＦＩＴＣ水溶液の溶液濃度は、１，１０，１００，３００，１０００ｎｍｏｌ／Ｌ（ナノモル／リットル）である。このＦＩＴＣが発生する蛍光の主波長λ_２は、５２０ｎｍである。試料３６を１０ｍｍ角の石英セル３４に入れて、図１０に示すようにプローブ３０の端面（すなわち励起光選択フィルタ２２および蛍光選択フィルタ２４の端面）をセル３４の側面から突き当て、検出器から出力された電気信号（電流）をアンプを通じて電圧に変換した値を測定した。以下に、測定結果を説明する。

図１１は、第３実施例に係る蛍光検出装置における、ＦＩＴＣ水溶液濃度と検出信号強度の関係の測定結果を示す。図１１に示されるように、第３実施例に係る蛍光検出装置は、線形性を維持できており、蛍光の測定が可能であることが分かる。

図１２は、第３実施例に係る蛍光検出装置における、プローブ端面から測定試料表面までの距離Ｘと検出信号強度との関係の測定結果を示す。図１３は、図１２に示す関係の測定系を示す。本測定では、「１０００ｎｍｏｌ／Ｌ」のＦＩＴＣ溶液濃度を計測した際の蛍光信号強度と同等の蛍光信号強度を得られる樹脂製基板を試料３６として用いた。本測定では、試料３６の厚みは１ｍｍである。図１２から、本第３実施例に係る蛍光検出装置は蛍光の測定が可能であることが分かる。

図１４（ａ）および（ｂ）は、本発明の別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。図１４（ａ）はプローブ３０の断面図であり、図１４（ｂ）はプローブ３０の正面図である。本実施形態に係る蛍光検出装置１０は、複数の波長に対応することができる。この蛍光検出装置は、第１および第２励起光源（図示せず）と、第１および第２検出器（図示せず）と、第１励起光用ファイバ１６（１）と、第２励起光用ファイバ１６（２）と、第１蛍光用ファイバ１８（１）と、第２蛍光用ファイバ１８（２）と、これらのファイバの一方の端部を支持する保持部材２０と、第１励起光用ファイバ１６（１）の出射端面に当接するように設けられた第１励起光選択フィルタ２２（１）と、第２励起光用ファイバ１６（２）の出射端面に当接するように設けられた第２励起光選択フィルタ２２（２）と、第１蛍光用ファイバ１８（１）の入射端面に当接するように設けられた第１蛍光選択フィルタ２４（１）と、
第２蛍光用ファイバ１８（２）の入射端面に当接するように設けられた第２蛍光選択フィルタ２４（２）とを備える。本実施形態のように複数波長に対応可能に構成した場合も、安価な蛍光検出装置を実現できる。

図１５は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。本実施形態に係る蛍光検出装置１０において、図１に示す蛍光検出装置と同一または対応する構成要素には同一の符号を付すとともに、重複する説明は適宜省略する。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０では、対物レンズ２６と、励起光選択フィルタ２２および蛍光選択フィルタ２４との間に、励起光と蛍光のそれぞれの光束に対応し、且つ励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり部分が無いように、励起光用コリメートレンズ２３および蛍光用コリメートレンズ２５が配置されている。すなわち、励起光用ファイバ１６の端面と集光点、及び、蛍光の発光点と蛍光用ファイバ１８の端面とが、それぞれ単位共役点を構成し、励起光集光点と蛍光の発光点とが略一致する構成となっている。このように構成することにより、対物レンズ２６の前方の所定の位置に配した被検出物５０に励起光が集光され、その領域で発光した蛍光を効率よく蛍光用ファイバ１８に導くことが可能となる。

本実施形態のように構成することにより、被検出物５０や試料への光パワーの集中が比較的良くなり、多くの蛍光の発光を促進することが可能となる。

また、蛍光検出器またはその光学系においては、如何にノイズを低減させるかという課題がある。そのノイズの原因の一つとして、励起光の光路における予期しない（期待しない）蛍光をファイバ等の蛍光検出光学系で受光する現象が挙げられる。本実施形態に係る蛍光検出装置１０によれば、励起光の光束と蛍光の受光範囲が重ならないように光学系を構成することにより、上記の予期しない蛍光を蛍光用ファイバで取り込む現象を回避でき、ノイズの低減を達成できる。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

１０ 蛍光検出装置、 １２ 励起光源、 １４ 検出器、 １６ 励起光用ファイバ、 １８ 蛍光用ファイバ、 ２０ 保持部材、 ２２ 励起光選択フィルタ、 ２３ 励起光用コリメートレンズ、 ２４ 蛍光選択フィルタ、 ２５ 蛍光用コリメートレンズ、 ２６ 対物レンズ、 ２８ 光吸収性遮光部材、 ３０ プローブ、 ３２ 固定部材、 ３４ セル、 ５０ 被検出物。

Claims (7)

1. 励起光を発光する励起光源と、
   前記励起光源からの励起光を入射する入射端面と、励起光を出射する出射端面とを有する励起光用ファイバと、
   蛍光を入射する入射端面と、蛍光を出射する出射端面とを有する蛍光用ファイバと、
   前記蛍光用ファイバの出射端面から出射された蛍光を受光する検出器と、
   前記励起光用ファイバの出射端面と、前記蛍光用ファイバの入射端面とが近傍に位置するように、前記励起光用ファイバおよび前記蛍光用ファイバを保持する保持部材と、
   第１透明基材と、前記第１透明基材の一方の面上に形成された第１誘電体多層膜とを備える励起光選択フィルタであって、前記第１誘電体多層膜が前記励起光用ファイバの出射端面に当接するように設けられた励起光選択フィルタと、
   第２透明基材と、前記第２透明基材の一方の面上に形成された第２誘電体多層膜とを備える蛍光選択フィルタであって、前記第２誘電体多層膜が前記蛍光用ファイバの入射端面に当接するように設けられた蛍光選択フィルタと、
   を備え、
   前記励起光用ファイバの出射端面から出射された励起光が前記励起光選択フィルタを介して被検出物に照射され、該励起光の照射により前記被検出物から発生した蛍光が前記蛍光選択フィルタを介して前記蛍光用ファイバの入射端面に入射することを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記励起光選択フィルタは、前記第１透明基材の他方の面上に形成された第１反射防止膜をさらに備え、
   前記蛍光選択フィルタは、前記第２透明基材の他方の面上に形成された第２反射防止膜をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記励起光選択フィルタと前記蛍光選択フィルタとの間に設けられた光吸収性遮光部材をさらに備え、
   前記光吸収性遮光部材は、前記第１透明基材の側面と前記第２透明基材の側面に当接するように設けられることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記励起光選択フィルタおよび前記蛍光選択フィルタと対向するように設けられた対物レンズをさらに備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の蛍光検出装置。
5. 前記対物レンズは、屈折率分布型ロッドレンズであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
6. 前記対物レンズと前記励起光選択フィルタとの間に設けられた励起光用コリメートレンズと、
   前記対物レンズと前記蛍光選択フィルタとの間に設けられた蛍光用コリメートレンズと、
   をさらに備え、
   前記励起光用コリメートレンズおよび前記蛍光用コリメートレンズは、励起光の光束と蛍光の受光可能範囲とが重なり合わないように配置されることを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光検出装置。
7. 前記励起光用ファイバおよび／または前記蛍光用ファイバは、プラスチックファイバであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の蛍光検出装置。

Images