JP2007132792A - 光計測装置と試料との光結合系 - Google Patents

Abstract

【課題】励起光を効率よく試料に照射でき、且つ放出される蛍光を効率よく光ファイバに結合できるようにする。
【解決手段】蛍光計測装置は、光源１０からの励起光を励起光用光ファイバ１２で導いて試料１６に照射し、該試料から放出される蛍光を受光用光ファイバ１８により光検出系２０に導くように構成する。励起光用光ファイバと受光用光ファイバの試料側の前方には結合レンズ１４が装着され、他方、試料を収容する試料容器２２は、筒体の底部に励起光及び蛍光を集光するレンズ部２４が一体化された構造であり、励起光が結合レンズによって平行光又は収束光となり試料容器底部のレンズ部によって試料に集光するようにする。
【選択図】図１

Description

本発明は、光計測装置と試料との光結合系に関し、更に詳しく述べると、光ファイバの先方に結合レンズを設けると共に試料容器の底部にレンズ部を一体的に設けて、光ファイバからの励起光を、結合レンズとレンズ部により試料に効率よく結合させる光結合系、及び試料が発する光をレンズ部と結合レンズにより光ファイバに効率よく結合させる光結合系に関するものである。この技術は、例えば試料に励起光を照射し、励起された試料が発する蛍光の強度を測定するタイプの光計測装置などに適用できる。

材料を物理的にあるいは化学的に調査あるいは分析する技術として、試料に光を照射することで該試料を励起し、励起された試料が発する光を測定することにより試料の様々な情報を入手することができるようにした光計測装置がある。例えば、励起された試料が発する特定波長の蛍光の強度を測定したり、その時間変化を測定することにより、特定物質の検出や濃度変化の監視を行う装置、あるいは試料が発する蛍光のスペクトルを測定することにより定量・定性分析を行う装置などがある。いずれにしても、高感度測定ができ、微量分析に適していることなどから、広く利用されている。試料が液体の場合には、励起光と蛍光に対して透明な試料容器に収容した状態で測定が行われる。

これらの光計測装置においては、光源からの光が照射される位置に試料を設置して励起光を照射し、試料から放出される蛍光が適宜集光して光検出系に入射するように構成すればよいが、近年、光ファイバを用いて励起光を光源から結合レンズを通して試料に導き、試料から放出された蛍光を結合レンズにより別の光ファイバを用いて光検出系に導く構造が提案されている（例えば特許文献１参照）。このように光ファイバを用いると、試料と光源、光検出系との位置関係に自由度が増す利点がある他、検出する蛍光は微弱である場合が多いので、光ファイバを伝搬させることにより光学系に外乱光が混入し難くなり、分析感度が向上する利点がある。

しかしながら、従来技術では試料から蛍光を効率よく取り出せない問題がある。その理由は、試料容器から出射する蛍光が拡散してしまうことによる他、試料と結合レンズとの距離が大きく離れた構成になるために、結合レンズで蛍光を集光し難く、また照射される励起光の照射面積が大きく照射密度が低いために、蛍光が面状の発光となることなどによる。更に、従来技術では試料に効率よく励起光を照射できない問題もある。その理由は、励起光用光ファイバには励起光強度を大きくする目的で比較的口径の大きなものが使用されるために、結合レンズで試料の所定の位置に励起光を絞りきれず、励起光の照射密度が低くなることによる。

その他、従来技術では、励起光や蛍光の光量を可能な限り増大させるため、大口径の光ファイバや多数本の光ファイバを扱う必要があり、それに対応して結合レンズの径が大きくなるし、励起光と蛍光を効率よく結合するためには複数のレンズが必要となるため、光学系が大型化するなどの問題もある。
特開平１１−３２６２１０号公報

本発明が解決しようとする課題は、励起光を効率よく試料に照射でき、且つ試料から放出される光を効率よく光ファイバに結合できるようにすることである。

本発明は、光源からの励起光を励起光用光ファイバで導いて試料を照射し、それによって励起された試料が発する光を受光用光ファイバにより光検出系に導くようにした光計測装置における試料との光結合系であって、前記励起光用光ファイバと受光用光ファイバの試料側の前方に結合レンズが装着され、他方、前記試料を収容する試料容器は、円筒体の底部に励起光及び試料が発する光を集光するレンズ部が一体化された構造であり、励起光が前記結合レンズによって平行光又は収束光となり前記試料容器底部のレンズ部によって試料に集光するようにした光計測装置と試料との光結合系である。なお本発明は、蛍光の測定のみならず、燐光その他の光を含め、励起光を照射することによって試料から発するあらゆる光の測定に適用できる。

光計測装置における光学系としては、例えば、中心に位置する１本の励起光用光ファイバと周辺を取り囲む複数本の受光用光ファイバとが１つの光ファイバ束となり、該光ファイバ束の先端部にキャピラリが取り付けられ、該キャピラリの内部に励起光・受光共用の結合レンズが挿入され位置決め固定されている構造とする。あるいは、１本の励起光用光ファイバと１本の受光用光ファイバとが隣接した状態でフェルールを通して固定され、その先端部にキャピラリが取り付けられ、該キャピラリの内部に励起光・受光共用の結合レンズが挿入され位置決め固定されている構造でもよい。光ファイバ束の外径は結合レンズの直径よりも小さくし、且つ励起光用光ファイバの直径を受光用光ファイバの直径以下とすることが好ましい。結合レンズと試料容器底部のレンズ部とは、互いに離間し且つそれらの間に集光点が形成されないように配置する。

試料容器は、通常、円筒状であるが、角筒状などでもよい。筒状体の底部に設けるレンズ部は、典型的には半球状である。

本発明に係る光計測装置と試料との光結合系では、試料を収容する試料容器の底部に励起光及び蛍光等を集光するレンズ部が一体化されており、結合レンズによる平行光又は収束光が前記レンズ部によって試料に集光するように構成されているので、励起光を効率よく照射でき、蛍光等を効率よく取り出せるようになる。即ち、本発明ではレンズ部によって励起光をより絞って試料に照射できるため、励起光の照射密度を大きくできるので、試料から放出される光量が増大すること、照射される励起光の集光状態に伴って、蛍光等を点光源に近い状態にできるため、光を検出し易くなること、試料に最も近い位置にレンズ部を配置できるため、拡散する光を絞ることができるため、光を取り出し易くなること、などの効果があり、それによって装置の高感度化を図ることができる。また、レンズ部が試料容器の底部に一体化されていることも光学系の小型化に寄与している。

本発明に係る蛍光計測装置と試料との光結合系の一例を図１に示す。図１のＡに示すように、蛍光計測装置は、光源１０からの励起光を励起光用光ファイバ１２で導き結合レンズ１４を通して試料１６に照射し、該試料１６から放出される蛍光を結合レンズ１４を通して受光用光ファイバ１８により光検出系２０に導くように構成されている。ここで試料１６を収容する試料容器２２は、透明な円筒体の底部に励起光及び蛍光を集光する半球状のレンズ部２４が一体的に形成されている構造である。励起光は、前記結合レンズ１４によって平行光又は収束光となり、前記レンズ部２４によって試料中で集光するようになっている。

この例では、中心に位置する１本の励起光用光ファイバ１２と、該励起光用光ファイバ１２の周辺を取り囲むように隣接する６本の受光用光ファイバ１８とが１つの束にまとめられた光ファイバ束（バンドルファイバ）２６を用いている（図１のＢ参照）。この光ファイバ束２６の先端部にキャピラリ３０が装着され、該キャピラリ３０の内部に結合レンズ１４が挿入され位置決め固定されている。

このような筒状体にレンズ部２４が一体化された試料容器２２は、次のような方法により作製できる。例えば、予め底部を厚くした筒状体を用意し、これをパイプ状の保持具に挿入して、そのままの状態で球面砥石で半球状に研削し、仕上げの研磨を行う方法、あるいは半球状のレンズ部を別途作製し、そのレンズ部を筒状体の底部に貼り付ける方法などでもよい。

この例では、光ファイバ１２，１８、結合レンズ１４、試料容器２２のレンズ部２４によって光計測装置と試料との光結合系が構成されている。光源１０からの励起光は、励起光用光ファイバ１２で導びかれ結合レンズ１４及び半球状のレンズ部２４によって集光して試料容器２２中の試料１６を照射し、該試料１６から放出される蛍光は、レンズ部２４及び結合レンズ１４を通して受光用光ファイバ１８により光検出系２０に導びかれる。

試料容器２２が円筒体の底部に半球状のレンズ部２４を一体的に設けた構造なので、励起光を効率よく試料１６に照射でき、蛍光を効率よく取り出すことができる。結合レンズ１４のみの時に比べて、励起光をより絞って試料１６に照射することができ、励起光の照射密度を大きくできるので、試料１６から出る蛍光光量が増大する。試料１６の最も近くにレンズ部２４を配置できるため、拡散する蛍光を絞ることができ、また照射される励起光の集光状態に伴って、蛍光を点光源に近い状態にできるため、より蛍光を検出し易くできる。また、レンズ部２４が試料容器２２に一体化されているため、系を小型化できる。

最適な光学配置と励起光の伝搬状況を図２に示す。なお、図２では光軸を横向きに描いている。ここで、結合レンズ１４と試料容器２２の底部のレンズ部２４とは、互いに接することなく（即ち離間しており）、且つそれらの間に集光点が形成されないように配置する。この時、光ファイバ束２６を構成している光ファイバ１２，１８、結合レンズ１４、及びレンズ部２４付き試料容器２２は、以下の条件を満たすようにするのが好ましい。まず、励起用光ファイバ１２からの励起光（実線で示す）が試料容器２２のレンズ部２４でけられないことである。試料容器２２のレンズ部２４に照射する励起光は、結合レンズ１４によってほぼ平行光または収束光となっていることが望ましい。次に、レンズ部２４を通して試料容器２２に照射した励起光の焦点位置が、試料容器２２中でその体積によって決まる長さを有する試料１６中に存在し、且つなるべくレンズ部２４に近い位置にあることである。更に、破線で示す蛍光が、光ファイバの端面位置で蛍光受光用光ファイバの存在する範囲内にくるように、光ファイバ端面と同等もしくはそれよりも小さい開口数（ＮＡ）で集光することである。例えば、図１のＢに示すように、複数の蛍光受光用光ファイバを円周上に並べた場合には、各光ファイバ端面に外接する円と等しいかまたはそれより小さい範囲にくるようにすることである。これらによって、励起光の損失が少なくなり、照射密度の高い励起光を試料に照射することができ、且つ試料容器２２のレンズ部２４のＮＡを最大に利用して蛍光を集光できるし、蛍光の結合損失が少なくなる。

図１に示すように、励起光用光ファイバ１２と受光用光ファイバ１８を束ねて光ファイバ束２６として用いる場合、
光ファイバ束２６の外径φＦ＜結合レンズ１４の直径φＬ
であり、
励起光用光ファイバ径≦蛍光受光用光ファイバ径
であって、且つ励起光が内側、蛍光が外側を伝搬するようにするのが好ましい。これによって、結合レンズ１４での励起光のけられがなくなり、効率よく試料を励起できる。励起光用光ファイバ１２の口径が小さくなると、結合レンズ１４による励起光の結像が小さくなるため、励起光の照射密度を高くでき、試料を効率よく励起できる。また、蛍光がより点光源に近い形になるため、蛍光の取出しが容易になる。更に、キャピラリ３０を使った結合レンズ１４と光ファイバ束２６の一体化（組立）が可能になる。

なお、図１のＡに示すように、レンズ部２４付き試料容器２２は、結合レンズ１４の光軸から数度傾けて配置することも可能である。その場合には、レンズ部付き試料容器の傾きに応じた配置のシフトが発生する。

図１に示す光結合系を用いて適切な光学配置と励起光・蛍光の伝搬状態及びビームプロファイルを求めた。光結合系は、前記のように、励起光および蛍光を伝搬する複数の光ファイバからなる光ファイバ束（バンドルファイバ）２６と、該光ファイバ束からの励起光を試料１６へ、また試料１６からの蛍光を光ファイバ束２６へ結合するための結合レンズ１４と、レンズ部２４付きの試料容器２２とからなる。

ここで光ファイバ束としては、コア径２００μｍ、ＮＡ＝０．２の石英系のステップインデックス光ファイバを７本束ねたものを使用した。図１のＢに示すように、中心の１本を励起光伝搬のための光ファイバとし、その周りの６本を蛍光伝搬のための光ファイバとした。光ファイバ束の外接円の直径は２．７８mmである。

結合レンズには、φ＝２．４ｍｍ、ｆ＝２．９ｍｍの平凸レンズを使用した。結合レンズの形状は、特に平凸レンズに限定されないが、光ファイバ束の直径より小さな直径を有するだけでなく、コバ厚 （レンズの平板部分の厚み）の厚いものの方が光ファイバ束との一体化の際に組み立てが容易となり望ましい。なお、励起光がレンズ表面で反射してノイズとなるのを防ぎ、また蛍光がレンズ表面で反射して透過損失を生じるのを防ぐため、レンズ表面には両面とも励起波長、蛍光波長に対する減反射コーティングを行った。

図１のＡに示すように、結合レンズと光ファイバ束は、キャピラリを通すことで位置決め固定を行った。その際、結合レンズは、光ファイバ端面側を平面、試料側を凸面とし、レンズ平面と光ファイバ束端面間の距離は光軸方向に約２．１ｍｍとした。

試料としては蛍光標識試薬ＦＩＴＣ（Fluoresceinisothiocyanate ）を用い、直径約１．５ｍｍのガラスの試料容器の中に適当な濃度に調整して約１０μＬ封入した。試料容器の底部には試料容器と同じ直径約１．５ｍｍでｒ＝約０．７ｍｍの半球状のレンズ部を一体的に設けた。なお、試料容器のレンズ部にも励起波長、蛍光波長に対する減反射コーティングを行うことが望ましい。

励起光源には、波長４７０ｎｍ付近に発光のピークを有する発光ダイオード（ＬＥＤ）の光から、波長４７０ｎｍ±１０ｎｍのみを透過する波長選択フィルタによって取り出した光を使用した。この光をレンズによって光ファイバ束の励起光用光ファイバに結合させた。励起光は励起用光ファイバの端面から出射した後、結合レンズを通り、試料容器底部のレンズ部に該レンズ部の大きさとほぼ等しいビーム径で入射して、試料容器の底部から試料中に入った位置で収束する。蛍光は、励起光の焦点位置を主に、励起光が伝搬する範囲全体から発生する。試料容器のレンズ部と結合レンズによって光ファイバに結合した蛍光は、検出したい波長（ここでは５３２ｎｍ）のみを透過する波長フィルタによって波長分離され、光検出器モジュール（光電子増倍管）に入射して電気信号に変換される。

図３は、結合レンズ凸面とレンズ部凸面間の光軸方向距離ｚを種々変えた場合の光線のシミュレーション結果を示している。また図４は、同じく光軸方向距離ｚを種々変えた場合の励起光と蛍光のビームプロファイルを示している。これらの結果から分かるように、レンズ部付き試料容器を、結合レンズ凸面から光軸方向約１．７ｍｍの位置に配置した場合に、励起光のピーク強度は最も高くなり、且つ最もよく集光されている。また、蛍光もｚ＝１．７ｍｍの場合に、強度が最も高く、且つ受光用光ファイバが存在する範囲内（約０．７ｍｍ）に収束されていることが分かった。この場合、励起光は結合レンズを通り、試料容器のレンズ部に該レンズ部の大きさとほぼ等しい直径約１．５ｍｍのビーム径で入射して、試料容器の底から約０．８ｍｍ試料中に入った位置で収束する。

それに対して、結合レンズと試料容器のレンズ部が接している場合（ｚ＝０ｍｍ）及び結合レンズと試料容器のレンズ部が大きく離れていて間に集光点が生じるような場合（例えばｚ＝８ｍｍ）には、励起光のピーク強度は極めて低く、且つ殆ど集光されておらず、蛍光も強度が低く、あるいは大きく広がることが分かった。これらの結果から、結合レンズ凸面とレンズ部凸面間の光軸方向距離ｚは、１ｍｍ〜４ｍｍ（より好ましくは１．７ｍｍを最適として１．７±０．７ｍｍ）の範囲に設定するのがよい。

＜比較結果＞
試料容器にレンズ部を設けた場合（本発明）と試料容器に集光手段を設けていない場合（従来技術）とを比較した。ここで本発明とは、レンズ部付き試料容器を結合レンズ凸面から光軸方向約１．７ｍｍの位置に配置した最適状態の場合である。図５は、励起光と蛍光の光伝搬のシミュレーション結果を示している。それらにおける光伝搬特性を、表１に示す。

なお、本発明の蛍光検出量７６ｍＶは、励起光：９．２μＷ、ＦＩＴＣ濃度：１ｐｍｏｌ／１０μＬ、光電子増倍管で観測した実測値である。また従来技術の蛍光検出量８．６ｍＶは、上記７６ｍＶ×（レンズ部無しの蛍光検出量／レンズ部付きの蛍光検出量）から算出した計算値である。

表１に示すように、本発明の場合（試料容器にレンズ部が付いている場合）と従来技術（試料容器にレンズ部が無い場合）を比較すると、本発明の方が約９倍の蛍光を検出できることが分かる。

図６に励起光の焦点位置でのビームプロファイルと蛍光の受光位置でのビームプロファイルを示す。これらのビームプロファイルから明らかなように、試料容器にレンズ部が無いと（従来技術）、励起光を絞りきれず、十分な励起光強度を得ることができない（弱く広がった励起光しか得られない）。また試料容器にレンズ部が無い（従来技術）と、蛍光の広がり角が大きく、結合レンズで集められる蛍光が少ない。それに対して、試料容器にレンズ部が付いていると（本発明）、励起光を絞り、十分な励起光強度を得ることができるし、蛍光の広がり角が小さく、結合レンズで集められる蛍光が非常に大きいことが分かる。

更に、試料容器にレンズ部が無いと、蛍光を効率よく集めるために、結合レンズ−試料容器間の距離が短く、光ファイバ−結合レンズ間距離が長くなり、光ファイバと結合レンズの位置調整が厳しくなる（励起光が結合レンズのほぼ全面を使うために、少しの位置ずれでけられが発生し易くなる）。それに対して本発明は、光ファイバ−結合レンズ間距離が短くなり、光ファイバと結合レンズの位置調整が容易になる利点が生じる。

上記の実施例では光ファイバ束を用いているが、本発明で受光用光ファイバは必ずしも複数本である必要はなく、１本のみでもよい。そのような実施例を図７に示す。１本の励起光用光ファイバ１２と１本の受光用光ファイバ１８とが隣接した状態でフェルール３２を通して固定され、その先端部にキャピラリ３０が取り付けられ、該キャピラリ３０の内部に励起光・受光共用の結合レンズ１４が挿入され位置決め固定されている構造である。キャピラリ３０とフェルール３２の外側は保護チューブ３４で覆われる。

ここで、励起光用光ファイバには、コア径２００μｍ、クラッド径２５０μｍ、ＮＡ＝０．２の石英系のステップインデックス光ファイバを用いた。受光用光ファイバには、コア径６００μｍ、クラッド径７５０μｍ、ＮＡ＝０．２のグレーテッドインデックス光ファイバを用いた。フェルールは円筒状で、中心貫通孔の直径は１．０ｍｍである。そのため、励起光用光ファイバの中心は、フェルールの中心から０．３７５ｍｍ離れた位置になる。また受光用光ファイバの中心は、励起光用光ファイバの中心からフェルールの中心を挟んで０．５ｍｍ離れた位置になり、つまりフェルールの中心からは０．１２５ｍｍ離れた位置となる。

結合レンズには、前記実施例と同様のφ＝２．４ｍｍ、ｆ＝２．９ｍｍの平凸レンズを使用した。結合レンズの表面には、励起波長及び蛍光波長に対する減反射コーティングを行った。結合レンズと光ファイバはキャピラリに通すことで位置決め固定を行った。その際、結合レンズは、光ファイバ側を平面、試料側を凸面とし、結合レンズと光ファイバ端面との距離は光軸方向に２．１ｍｍとした。

前記実施例と同じ試薬ＦＩＴＣについて同様の測定を行った。光軸方向距離ｚを約０．５ｍｍとし、励起光を１１．３μＷ照射した場合に、光パワーメータでは８ｐＷの蛍光強度が得られ、極微量の蛍光信号を効率よく測定できることが分かった。この際、励起光用光ファイバの中心及び受光用光ファイバの中心が結合レンズ中心からずれているため、そのずれ量に応じてｚ軸に垂直な方向の配置のずれが生じる。

なお、上記の実施例では、励起光波長４７０ｎｍ±１０ｎｍ、検出する蛍光波長５３２ｎｍ±２０ｎｍの場合についてのみ記載しているが、本発明はこの波長のみに限定されるものではなく、試料の励起スペクトル、発光スペクトルに応じて、光源及び励起光用波長選択フィルタ、蛍光用波長選択フィルタを変更することによって、波長によらず適用できることは言うまでもない。例えば、代表的な蛍光色素であるＰＥ−Ｃｙ５（R-Phycoerythrin/Cy5 タンデム色素）については、励起光波長を４７０ｎｍ±１０ｎｍ、検出光波長を６７０ｎｍ±２０ｎｍとすることで測定が可能であり、またTexas Red については励起光波長を５３２ｎｍ±１０ｎｍ、検出光波長を６４０ｎｍ±２０ｎｍで測定が可能である。

本発明に係る蛍光計測装置と試料との光結合系の説明図。 最適な光学配置と励起光の伝搬状況の説明図。 結合レンズ凸面とレンズ部凸面間の光軸方向距離ｚを種々変えた場合の光線のシミュレーション図。 光軸方向距離ｚを種々変えた場合の励起光と蛍光のビームプロファイル。 励起光と蛍光の光伝搬のシミュレーション図。 励起光の焦点位置でのビームプロファイルと蛍光の受光位置でのビームプロファイル。 本発明に係る蛍光計測装置と試料との光結合系の説明図。

符号の説明

１０ 光源
１２ 励起光用光ファイバ
１４ 結合レンズ
１６ 試料
１８ 受光用光ファイバ
２０ 光検出系
２２ 試料容器
２４ レンズ部
２６ 光ファイバ束
３０ キャピラリ

Claims (5)

1. 光源からの励起光を励起光用光ファイバで導いて試料を照射し、それによって励起された試料が発する光を受光用光ファイバにより光検出系に導くようにした光計測装置における試料との光結合系であって、
   前記励起光用光ファイバと受光用光ファイバの試料側の前方に結合レンズが装着され、他方、前記試料を収容する試料容器は、円筒体の底部に励起光及び試料が発する光を集光するレンズ部が一体化された構造であり、励起光が前記結合レンズによって平行光又は収束光となり前記試料容器底部のレンズ部によって試料に集光するようにしたことを特徴とする光計測装置と試料との光結合系。
2. 中心に位置する励起光用光ファイバとその周辺を取り囲む複数の受光用光ファイバとが１つの光ファイバ束となり、該光ファイバ束の先端部にキャピラリが取り付けられ、該キャピラリの内部に励起光・受光共用の結合レンズが挿入され位置決め固定されている請求項１記載の光計測装置と試料との光結合系。
3. 励起光用光ファイバと受光用光ファイバとが隣接した状態でフェルールを通して固定され、その先端部にキャピラリが取り付けられ、該キャピラリの内部に励起光・受光共用の結合レンズが挿入され位置決め固定されている請求項１記載の光計測装置と試料との光結合系。
4. 励起光用光ファイバの直径を受光用光ファイバの直径以下とする請求項２又は３記載の光計測装置と試料との光結合系。
5. 結合レンズと試料容器底部のレンズ部とは、互いに離間し、且つそれらの間に集光点が形成されないように配置されている請求項１乃至４のいずれかに記載の光計測装置と試料との光結合系。
   

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