JP2012037355A - 蛍光検出装置、蛍光測定方法および環境測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】安価且つ小型の蛍光検出装置を提供する。
【解決手段】蛍光検出装置１０は、被検出物５２に対して励起光を照射する照射部と、被検出物５２が発生した蛍光を受光する受光部１６とを備える。励起光を照射する照射部は、励起光を発光する励起用ＬＥＤ１２と、励起光の強度をモニタするモニタＰＤ１５と、モニタＰＤ１５の出力を基に、励起光の強度が一定となるように励起用ＬＥＤ１２をフィードバック制御する制御部１３とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、被検出物に励起光を照射して、該被検出物が発生した蛍光を検出する蛍光検出装置、該蛍光検出装置を用いた蛍光測定方法、および周囲環境を測定する環境測定装置に関する。

近年、ライフサイエンスの分野において、蛍光検出装置が多く使われ始めている。蛍光検出装置は、検出感度が高いため、特にＤＮＡを検出する際に有効である。例えば、特許文献１に記載されたような光ファイバを用いた蛍光検出装置は、外乱光に影響を受けにくく、安価で高感度な蛍光検出が可能である。

ところで、蛍光物質は、一般に、励起光が長く当たると蛍光の発光強度劣化が発生する。従って、長時間の測定や高精度の測定が必要な場合、測定を行わない期間は励起光が被検出物に当たらないようにし、且つできるだけ短時間で測定を行うことが望ましい。

しかしながら、励起光の光源として用いられるＬＥＤは、一般的に、点灯後しばらくの間（数十分間）、自らが発生する熱の影響で出力パワーが低下し、安定なパワーが得られない。このため、安定な測定を行うためには、数十分間のＬＥＤの暖機運転が必要で、その後はじめて安定な測定ができる。従って、暖機運転の間や、測定と測定との間にインターバル（非測定期間）がある場合、ＬＥＤは点灯させたまま、被検出物に当たらないにすることが必要である。

例えば、特許文献２には、励起光が被検出物に照射されないようにするために、光遮断用のシャッタ−を設け、蛍光を測定しようとする時だけ該シャッタ−を開閉して被検出物が常に励起光にさらされないようにする技術が開示されている。

特開２００５−３０８３０号公報 特開平６−３４５４６号公報

しかしながら、特許文献２のように、光遮断用のシャッターを設けた場合、コストアップを招くと共に、装置が大型化する可能性がある。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、安価且つ小型の蛍光検出装置、該蛍光検出装置を用いた蛍光測定方法、および環境測定装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の蛍光検出装置は、被検出物に対して励起光を照射する照射部と、被検出物が発生した蛍光を受光する受光部とを備える蛍光検出装置であって、照射部は、励起光を発光するＬＥＤと、励起光の強度をモニタする受光素子と、受光素子の出力を基に、励起光の強度が一定となるようにＬＥＤをフィードバック制御する制御部とを備える。

この態様によると、フィードバック制御を行う制御部を設けたことにより、瞬時に励起光の強度を一定とすることができる。従って、常にＬＥＤに通電しておく必要はなく、被検出物に励起光を照射したいタイミングに合わせて、ＬＥＤに駆動電流を流せばよい。高価且つ大型のシャッターなどを設ける必要がないので、安価且つ小型の蛍光検出装置を実現できる。

制御部は、受光素子からの出力が所定の基準値と等しくなるようにＬＥＤをフィードバック制御してもよい。

励起光を反射し且つ蛍光を透過する波長選択性部材と、励起光源から出射された励起光を波長選択性部材に伝搬する第１光ファイバと、波長選択性部材で反射した励起光を伝搬する第２光ファイバと、第２光ファイバの先端部と、第２光ファイバの先端部から出射された励起光を集光して被検出物に照射するとともに、励起光が照射された被検出物から発生する蛍光を集光して第２光ファイバの先端部へ導くレンズとを有するプローブと、波長選択性部材を透過した蛍光を受光部に伝搬する第３光ファイバと、をさらに備えてもよい。

本発明の別の態様は、蛍光測定方法である。この方法は、上述の蛍光検出装置を用いた蛍光測定方法であって、被検出物に対して励起光を照射する照射ステップと、被検出物が発生した蛍光を受光する受光ステップとを備え、照射ステップにおいて、実際に蛍光検出を行う時間に合わせて、ＬＥＤを発光させる。

この態様によると、被検出物が長時間の励起光照射により蛍光の発光強度劣化が発生する蛍光物質である場合であっても、蛍光強度劣化を最小限に防ぎながら、被検出物の測定を行うことができる。

本発明のさらに別の態様は、環境測定装置である。この装置は、周辺環境の変化に伴って蛍光発光強度が変化する機能物質と、機能物質に対して励起光を照射する照射部と、機能物質が発生した蛍光を受光する受光部とを備える環境測定装置であって、照射部は、励起光を発光するＬＥＤと、励起光の強度をモニタする受光素子と、受光素子の出力を基に、励起光の強度が一定となるようにＬＥＤをフィードバック制御する制御部とを備える。

この態様によると、フィードバック制御を行う制御部を設けたことにより、瞬時に励起光の強度を一定とすることができる。従って、常にＬＥＤに通電しておく必要はなく、周囲環境を測定したいタイミングに合わせて、ＬＥＤに駆動電流を流せばよい。その結果、仮に機能物質が励起光照射により蛍光の発光強度劣化が発生する蛍光物質であったとしても、周囲環境の測定精度を高めることができる。

制御部は、実際に周囲環境の測定を行う時間に合わせて、ＬＥＤを発光させてもよい。

本発明によれば、安価且つ小型の蛍光検出装置、該蛍光検出装置を用いた蛍光測定方法、および環境測定装置を提供できる。

本実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 分波器の概略構造の一例を示す図である。 本実施形態に係る蛍光検出装置における、通電開始後の励起用ＬＥＤの出力パワーの時間変化を示す図である。 本実施形態に係る蛍光検出装置における、励起用ＬＥＤの出力パワーと周囲温度との関係を示す図である。 比較例に係る蛍光検出装置における、通電開始後の励起用ＬＥＤの出力パワーの時間変化を示す図である。 比較例に係る蛍光検出装置における、励起用ＬＥＤの出力パワーと周囲温度との関係を示す図である。 ＰＣＲで用いられる蛍光物質における蛍光強度劣化の一例を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る環境測定装置を示す図である。

以下、本発明の実施形態に係る蛍光検出装置について説明する。

図１は、本実施形態に係る蛍光検出装置１０を説明するための図である。蛍光検出装置１０は、被検出物５２に対して励起光を照射し、該照射により被検出物５２から発生した蛍光を検出するものである。

図１に示すように、蛍光検出装置１０は、励起用ＬＥＤ１２と、制御部１３と、モニタＰＤ１５と、分波器１４と、受光部１６と、プローブ１８と、励起用ＬＥＤ１２と分波器１４とを接続する第１光ファイバ２０と、分波器１４とプローブ１８とを接続する第２光ファイバ２２と、分波器１４と受光部１６とを接続する第３光ファイバ２４と、励起用ＬＥＤ１２とモニタＰＤ１５とを接続する第４光ファイバ２５とを備える。上述の構成要素のうち、励起用ＬＥＤ１２、制御部１３、モニタＰＤ１５、分波器１４、プローブ１８、第１光ファイバ２０、第２光ファイバ２２が被検出物５２に対して励起光を照射する照射部を構成する。

励起用ＬＥＤ１２は、被検出物５２に照射するための励起光を発光するものであり、例えば、主波長λ_１＝４７０ｎｍの光を発光するＬＥＤを用いることができる。励起用ＬＥＤ１２の出力パワーは、制御部１３およびモニタＰＤ１５を用いて制御される。

励起用ＬＥＤ１２から出射された励起光は、第１光ファイバ２０を通って分波器１４に伝搬される。第１光ファイバ２０としては、主波長λ_１＝４７０ｎｍの励起光を低損失で伝送することができるよう、石英ガラス製の光ファイバが好適に用いられる。

分波器１４に入射した励起光は、分波器１４内において第２光ファイバ２２へ導かれ、第２光ファイバ２２を伝搬して第２光ファイバ２２の先端に取り付けられたプローブ１８から出射される。第２光ファイバ２２としては、第１光ファイバ２０と同様に、石英ガラス製の光ファイバが好適に用いられる。

プローブ１８は、第２光ファイバ２２の先端部を保持するフェルール２６と、第２光ファイバ２２の先端部から出射された励起光を集光して所定の前側焦点に照射するとともに、該前側焦点において発生した光を集光して第２光ファイバ２２へと導くレンズ２８と、フェルール２６とレンズ２８とを固定する筒状の固定部材３０とを備える。レンズ２８としては、例えば、第２光ファイバ２２の端面に等倍像が結像するよう設計されたロッドレンズを用いることができる。レンズ２８は、複数のレンズにより構成されてもよい。レンズ２８から被検出物５２に励起光が照射されると、被検出物５２から蛍光が発生する。この蛍光は、レンズ２８により集光され、レンズ２８の後側焦点に配置された第２光ファイバ２２の先端部に入射する。また、第２光ファイバ２２には、励起光の反射光もレンズ２８によって集光されて入射する。

第２光ファイバ２２に入射した蛍光および反射光は、第２光ファイバ２２を伝搬して分波器１４に入射する。この分波器１４においては、蛍光が第３光ファイバ２４に導かれる。第３光ファイバ２４を伝搬した蛍光は、受光部１６によって受光され、電気信号に変換される。この電気信号を解析することにより、被検出物５２の状態を測定できる。

図２は、分波器１４の概略構造の一例を示す図である。分波器１４は、分波フィルタ４０と、分波フィルタ４０を挟んで配置された第１レンズ４１および第２レンズ４２と、第１光ファイバ２０および第２光ファイバ２２を保持し、第１レンズ４１側に配置された第１キャピラリ４３と、第３光ファイバ２４を保持し、第２レンズ４２側に配置された第２キャピラリ４４とが、筒状の保持部材４５に保持された構造を有している。

第１キャピラリ４３および第２キャピラリ４４としては、例えばホウ珪酸ガラス等からなるガラス製のものを用いることができる。

第１レンズ４１および第２レンズ４２は、中心から外部に向かって屈折率が低下するように屈折率勾配が設けられた屈折率分布型円柱状ロッドレンズを用いることができる。屈折率分布型円柱状ロッドレンズを用いることにより、入射面と出射面の２端面が光軸方向に直角方向の平面となり、レンズの結合等の組立を容易にするできる。また、屈折率分布型円柱状ロッドレンズは円柱状であるため、保持部材４５に容易に格納でき、光軸合わせを容易とすることができる。

分波フィルタ４０は、励起光を反射し且つ蛍光を透過する波長選択性部材として機能する。一般的に、励起光の主波長λ_１と蛍光の主波長λ_２との間には、λ_１＜λ_２という関係が成り立つため、分波フィルタ４０のカットオフ波長λ_ｏｆｆは、λ_１より大きくλ_２より小さいことが必要である。よって、分波フィルタ４０としては、所謂ロングパスフィルタが用いられる。

分波フィルタ４０は、具体的には、屈折率の低いＳｉＯ_２等から成る層と屈折率の高いＴｉＯ_２，ＺｒＯ_２，Ｔａ_２Ｏ_５等から成る層が多層に積層された誘電体多層膜を用いることができる。分波フィルタ４０の透過特性は、カットオフ波長λ_ｏｆｆより短波長の光の透過率が−３０ｄＢ以下（０．１％）であって、λ_ｏｆｆより長波長の光の透過率が−３ｄＢ以上（９７〜５０％）であることが好ましい。

上記のような分波フィルタ４０を用いることにより、励起用ＬＥＤ１２から出射された主波長がλ_１である励起光は、分波フィルタ４０に対する透過率が−３０ｄＢ以下となるため、分波フィルタ４０で反射して第２光ファイバ２２に導光される。これにより、分波器１４内を励起光が透過することを確実に防止することができ、蛍光の測定・検出ノイズレベルを効果的に低下させることができる。

一方、プローブ１８および第２光ファイバ２２を介して分波器１４に導光される光は、上述したように、主波長λ_１の励起光の反射光と、主波長λ_２の蛍光である。これらの光のうち、反射光は、励起用ＬＥＤ１２からの励起光と同様に分波フィルタ４０で反射されるが、蛍光は、分波フィルタ４０に対する透過率が−３ｄＢ以上となるため、分波フィルタ４０を透過して第２レンズ４２に入射し、第２レンズ４２により第３光ファイバ２４に導光される。これにより、分波器１４内を透過する蛍光の検出信号強度を確保することができる。

図１に戻るが、上述したように本実施形態において、励起用ＬＥＤ１２の出力パワーは、制御部１３およびモニタＰＤ１５を用いて制御される。

モニタＰＤ１５は、励起用ＬＥＤ１２の出力した励起光の強度をモニタする機能を有する。本実施形態において、モニタＰＤ１５は、第４光ファイバ２５によって伝搬された励起光を受光するように配置される。第４光ファイバ２５は、その一端部に励起用ＬＥＤ１２が出力した励起光の漏れ光の一部が入射するように配置される。「漏れ光」とは、励起用ＬＥＤ１２が出力した励起光のうち、第１光ファイバ２０に入射しない光である。

あるいは、第４光ファイバ２５を用いずに、励起用ＬＥＤ１２が出力した励起光の漏れ光の一部が直接入射するようにモニタＰＤ１５を配置してもよい。モニタＰＤ１５が出力した電気信号は、制御部１３に入力される。

制御部１３は、モニタＰＤ１５の出力を基に、励起光の強度が一定となるように励起用ＬＥＤ１２をフィードバック制御する機能を有する。例えば、制御部１３部は、モニタＰＤ１５からの電気信号が所定の基準値と等しくなるように励起用ＬＥＤ１２に供給する電流を制御する。

図３は、本実施形態に係る蛍光検出装置における、通電開始後の励起用ＬＥＤの出力パワーの時間変化を示す。また、図４は、本実施形態に係る蛍光検出装置における、励起用ＬＥＤの出力パワーと周囲温度との関係を示す。また、図５は、比較例に係る蛍光検出装置における、通電開始後の励起用ＬＥＤの出力パワーの時間変化を示す。また、図６は、比較例に係る蛍光検出装置における、励起用ＬＥＤの出力パワーと周囲温度との関係を示す。ここで、比較例に係る蛍光検出装置とは、フィードバック制御を行う制御部１３を設けず、励起用ＬＥＤを定電流駆動する構成の蛍光検出装置である。

なお、図３および図５において、横軸は、通電開始後の時間（ｓｅｃ）を表し、縦軸は、安定後の出力パワーで規格化した励起用ＬＥＤの出力パワーを表す。また、図４および図６において、横軸は、周囲温度（℃）を表し、縦軸は、周囲温度が２５℃のときの出力パワーで規格化した励起用ＬＥＤの出力パワーを表す。

比較例に係る図５に示すように、励起用ＬＥＤを定電流駆動した場合、出力パワーは、一旦上昇した後、時間とともに徐々に減少する。これは、点灯により励起用ＬＥＤに熱が発生し、この熱でＬＥＤ素子の温度が上昇し、これによって同じ駆動電流を流しても出力パワーが下がるためで、ＬＥＤの温度が一定になるまで出力パワーは下がり続ける。また、比較例に係る図６に示すように、周囲温度が異なると同じ駆動電流を流しても出力パワーが異なるため、励起光に比例する被検出物からの蛍光量も周囲温度が変われば違う値となる。このことから、励起用ＬＥＤの出力パワーが安定してから実際の測定または検出を行う必要があり、その間に被検出物に励起光を当てられない場合は、例えばシャッターなどを設ける必要がある。

一方、本実施形態に係る蛍光検出装置１０においては、フィードバック制御を行う制御部１３を設けたことにより、図３に示すように通電開始後、瞬時に励起用ＬＥＤ１２の出力パワーを一定とすることができる。また、図４に示すように、周囲温度が変わっても、一定の出力パワーを保つことができる。従って、本実施形態においては、常に励起用ＬＥＤ１２に通電しておく必要はなく、被検出物５２に励起光を照射したいタイミングに合わせて、励起用ＬＥＤ１２に駆動電流を流せばよい。本実施形態によれば、高価且つ大型のシャッターなどを設ける必要がないので、安価且つ小型の蛍光検出装置１０を実現できる。

次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１０の適用例について説明する。ここでは、ＤＮＡの測定で用いられるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）と呼ばれるヒートサイクルによる増幅工程に蛍光検出装置１０を適用する場合について説明する。

ＰＣＲでは、温度が下がった状態での蛍光量を各サイクルで測定し、その増え方をもってＤＮＡの判定を行う。このサイクルで実際の測定時間は全サイクルの１／４程度の時間である。一方、ＰＣＲで使用される蛍光物質は、長時間の励起光照射により蛍光の発光強度劣化が発生する。図７は、ＰＣＲで用いられる蛍光物質における蛍光強度劣化の一例を示す。

そこで、本実施形態に係る蛍光検出装置１０を用いたＰＣＲでは、被検出物であるＤＮＡに対して励起光を照射するときに、実際に測定を行う測定時間に合わせて、励起用ＬＥＤ１２を発光させ、ＤＮＡに励起光を照射する。測定を行わないときには、励起用ＬＥＤ１２を消灯しておき、実際に測定を行う測定時間のみ励起用ＬＥＤ１２を発光させるのである。そして、ＤＮＡが発生した蛍光を受光し、蛍光強度を測定することで、ＤＮＡの反応状態を判定する。

このように実際に測定を行う測定時間に合わせて励起用ＬＥＤ１２を発光させることにより、蛍光強度劣化を防ぎながら、ＤＮＡの正確な測定が可能になる。さらに正確な測定を行うためには、測定時間の一部だけ励起光を照射し、蛍光を検出する。これにより、さらに蛍光強度劣化を防ぐことができる。

また、実際に測定を行う測定時間に合わせて励起用ＬＥＤ１２を発光させることにより、励起用ＬＥＤ１２の寿命を延ばすことができるので、蛍光検出装置１０の耐用年数を増加できる。

図８は、本発明の別の実施形態に係る環境測定装置１１０を示す。図８に示す環境測定装置１１０においては、図１に示す蛍光検出装置１０と同一または対応する構成要素については、同様の符号を用い、説明を適宜省略する。環境測定装置１１０は、プローブ１８の構成が、図１に示す蛍光検出装置１０と異なる。

環境測定装置１１０のプローブ１８は、第２光ファイバ２２の先端部を保持するフェルール２６と、第２光ファイバ２２の先端部から出射された励起光を集光して所定の前側焦点に照射するとともに、該前側焦点において発生した光を集光して第２光ファイバ２２へと導くレンズ２８と、レンズ２８の前側焦点に配置された機能膜２９と、フェルール２６、レンズ２８、および機能膜２９を固定する筒状の固定部材３０とを備える。

機能膜２９は、周辺環境の変化に伴って蛍光発光強度が変化する機能物質で構成される。例えば、酸素量の変化に伴って蛍光発光強度が変化する機能物質を用いることができる。

環境測定装置１１０において、励起用ＬＥＤ１２から出射された励起光は、第１光ファイバ２０、分波器１４、第２光ファイバ２２、レンズ２８を介して、機能膜２９に照射される。機能膜２９が発生した蛍光は、レンズ２８により集光され、第２光ファイバ２２の先端部に入射する。また、第２光ファイバ２２には、励起光の反射光もレンズ２８によって集光されて入射する。第２光ファイバ２２に入射した蛍光および反射光は、第２光ファイバ２２を伝搬して分波器１４に入射する。この分波器１４においては、蛍光が第３光ファイバ２４に導かれる。第３光ファイバ２４を伝搬した蛍光は、受光部１６によって受光され、電気信号に変換される。この電気信号を解析することにより、プローブ１８の周辺環境を測定できる。例えば、機能膜２９を酸素量の変化に伴って蛍光発光強度が変化する機能物質で構成した場合、周囲環境の酸素濃度を測定する酸素センサーを実現できる。

本実施形態においても、励起用ＬＥＤ１２をフィードバック制御しているので、瞬時に励起用ＬＥＤ１２の出力パワーを一定とすることができる。従って、本実施形態に係る環境測定装置１１０においては、常に励起用ＬＥＤ１２に通電しておく必要はなく、制御部１３は、実際に周囲環境を測定する時間に合わせて、励起用ＬＥＤ１２に駆動電流を流し、発光させればよい。その結果、仮に機能膜２９が励起光照射により蛍光の発光強度劣化が発生する蛍光物質であったとしても、周囲環境の測定精度を高めることができる。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

１０ 蛍光検出装置、 １２ 励起用ＬＥＤ、 １３ 制御部、 １４ 分波器、 １５ モニタＰＤ、 １６ 受光部、 １８ プローブ、 ２０ 第１光ファイバ、 ２２ 第２光ファイバ、 ２４ 第３光ファイバ、 ２５ 第４光ファイバ、 ２８ レンズ、 ２９ 機能膜、 ３０ 固定部材、 ５２ 被検出物、 １１０ 環境測定装置。

Claims (6)

1. 被検出物に対して励起光を照射する照射部と、前記被検出物が発生した蛍光を受光する受光部とを備える蛍光検出装置であって、
   前記照射部は、
   励起光を発光するＬＥＤと、
   励起光の強度をモニタする受光素子と、
   前記受光素子の出力を基に、励起光の強度が一定となるように前記ＬＥＤをフィードバック制御する制御部と、
   を備えることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記制御部は、前記受光素子からの出力が所定の基準値と等しくなるように前記ＬＥＤをフィードバック制御することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 励起光を反射し且つ蛍光を透過する波長選択性部材と、
   励起光源から出射された励起光を前記波長選択性部材に伝搬する第１光ファイバと、
   前記波長選択性部材で反射した励起光を伝搬する第２光ファイバと、
   前記第２光ファイバの先端部と、前記第２光ファイバの先端部から出射された励起光を集光して前記被検出物に照射するとともに、励起光が照射された前記被検出物から発生する蛍光を集光して前記第２光ファイバの先端部へ導くレンズとを有するプローブと、
   前記波長選択性部材を透過した蛍光を前記受光部に伝搬する第３光ファイバと、
   をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
4. 請求項１から３のいずれかに記載の蛍光検出装置を用いた蛍光測定方法であって、
   被検出物に対して励起光を照射する照射ステップと、
   前記被検出物が発生した蛍光を受光する受光ステップと、
   を備え、
   前記照射ステップにおいて、実際に蛍光検出を行う時間に合わせて、前記ＬＥＤを発光させることを特徴とする蛍光測定方法。
5. 周辺環境の変化に伴って蛍光発光強度が変化する機能物質と、前記機能物質に対して励起光を照射する照射部と、前記機能物質が発生した蛍光を受光する受光部とを備える環境測定装置であって、
   前記照射部は、
   励起光を発光するＬＥＤと、
   励起光の強度をモニタする受光素子と、
   前記受光素子の出力を基に、励起光の強度が一定となるように前記ＬＥＤをフィードバック制御する制御部と、
   を備えることを特徴とする環境測定装置。
6. 前記制御部は、実際に周囲環境の測定を行う時間に合わせて、前記ＬＥＤを発光させることを特徴とする請求項５に記載の環境測定装置。

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