JP2009002694A - 蛍光測定用プローブ - Google Patents
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Abstract
【課題】励起光が照射された試料から発生する蛍光を受光光量が最大となる光量で安定して受光することができる蛍光測定用プローブを提供する。
【解決手段】励起光の光路と蛍光の光路が同一である光ファイバと、この光ファイバの端部断面と試料との間に配置されたレンズとを有する蛍光測定用プローブにおいて、光ファイバから出射され、レンズを介して照射された励起光を受けて試料が発生する蛍光をレンズによって集光する際の励起光の集光位置における励起光の照射角度を２θとしたとき、ｓｉｎθで表される励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下とし、ファイバコア径を２００μｍ以上、ファイバＮＡを０．２２以上とする。
【選択図】図７
【解決手段】励起光の光路と蛍光の光路が同一である光ファイバと、この光ファイバの端部断面と試料との間に配置されたレンズとを有する蛍光測定用プローブにおいて、光ファイバから出射され、レンズを介して照射された励起光を受けて試料が発生する蛍光をレンズによって集光する際の励起光の集光位置における励起光の照射角度を２θとしたとき、ｓｉｎθで表される励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下とし、ファイバコア径を２００μｍ以上、ファイバＮＡを０．２２以上とする。
【選択図】図７
Description
本発明は、蛍光測定用プローブに関し、特に、励起光の光路と試料から受けた蛍光の光路が同一である固体導光路を有する光学系を備えた蛍光測定システムに適用される蛍光測定用プローブに関する。
化学反応を微小空間で行うシステムの一例としてマイクロ化学システムがある。マイクロ化学システムは、小さなガラス基板等に形成された微細な流路の中で試料の混合、反応、分離、抽出、検出等を行うものである。
このようなマイクロ化学システムにおいて、例えば、マイクロウエル、マイクロ化学チップ、マイクロキャピラリ等、微小領域にある微量の物質の検出を行うに当たり、光学的に測定する方法が多く採用されている。例えば熱レンズ分光分析や蛍光検出などである。蛍光検出では最近光ファイバを用いて、例えば励起光の光路と試料から受けた蛍光の光路を固体導光路（光ファイバや導波路）にて同一にした蛍光測定システムが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
図１７は、従来の蛍光測定システムの構成を示すブロック図である。
図１７において、この蛍光測定システムは、試料に照射する励起光を発生させる励起光用の光源４１と、光源４１から照射された励起光を反射してプローブ４３を介して蛍光分析用チップ４４に照射させると共に、試料からの蛍光を通過させる合分波器４２と、合分波器４２を通過した蛍光を受光する検出器４５とから主として構成されている。各構成部材は、例えば光ファイバによって接続されている。
プローブ４３は、光源４１から出射された励起光を、固体導光路としての光ファイバの端部断面からレンズを介して試料に照射し、励起光の照射を受けた試料から発生する蛍光を集光するものである。ここで光ファイバの端部断面と試料の間に設置されるレンズは単一のレンズでも組み合わされたレンズでもよい。
プローブ４３のように、試料への励起光の照射と試料から発生する蛍光の集光を同じレンズおよび同じ導光路で行うことにより、励起光照射および蛍光集光におけるプローブと試料の位置あわせを同時にすることができることから、微小領域での測定を容易にすることができるとともに、光ファイバのコアをピンホールとする共焦点光学系とすることができるために空間分解能を高くすることができ、もって微小領域での測定を正確に行うことができる。
特開２００５−０３０８３０号公報
微小領域での測定を行うマイクロ化学システムにおいては、プローブに用いるレンズの種類、試料厚み等によって最適励起光照射角度、蛍光取り込み角度が異なると考えられる。このため、レンズ種類、試料の厚さ等に見合った光学系を有する蛍光測定用プローブを設計することによって蛍光受光効率を向上させ、これによって、検出感度の向上を図ることができると考えられるが、いまだ報告された例はない。
また、マイクロ化学システム用光学系は光路長が短い、すなわち試料の位置ずれに対する信号の変化が大きいため、測定値が安定しないという問題があった。
本発明の目的は、励起光が照射された試料から発生する蛍光を最大受光量で安定して受光することができる蛍光測定用プローブを提供することにある。
上記目的を達成するために、請求項１に係る蛍光測定用プローブは、励起光を出射する光源と、前記励起光が照射された試料から発生する蛍光を受光する検出器とを有する光学系を備えた蛍光測定システムに適用される蛍光測定用プローブであって、前記励起光の光路と前記蛍光の光路が同一である固体導光路と、該固体導光路の端部断面と前記試料との間に配置されたレンズとを有し、前記固体導光路から出射され、前記レンズを介して照射された励起光を受けて前記試料が発生する蛍光を前記レンズによって集光する際の前記励起光の集光位置における前記励起光の照射角度を２θとしたとき、ｓｉｎθで表される励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下としたことを特徴とする。
請求項２に係る蛍光測定用プローブは、請求項１に係る蛍光測定用プローブにおいて、前記固体導光路は光ファイバであり、ファイバコア径は２００μｍ以上であることを特徴とする。
請求項３に係る蛍光測定用プローブは、請求項２に係る蛍光測定用プローブにおいて、ファイバＮＡは０．２２以上であることを特徴とする。
請求項１に係る蛍光測定用プローブによれば、レンズを介して励起光を照射された試料が発生する蛍光を前記レンズによって集光する際の前記励起光の集光位置における前記励起光の照射角度を２θとしたとき、ｓｉｎθで表される励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下としたので、最大受光量を安定して受光することができ、測定感度が向上する。
請求項２に係る蛍光測定用プローブによれば、ファイバコア径を２００μｍ以上としたので、上記発明の効果に加え、繰り返し測定時の位置ずれに起因する受光光量のばらつきを抑えて繰り返しの測定精度が向上する。
請求項３に係る蛍光測定用プローブによれば、ファイバＮＡを０．２２以上としたので、上記発明の効果に加え、繰り返し測定時の位置ずれに起因する受光光量のばらつきをより確実に抑えて測定精度を向上させることができる。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して詳述する。
励起光が照射された試料から発生する蛍光を検出する蛍光測定用プローブにおいて、試料から発生する蛍光を最大受光量で受光するための条件を設定するパラメータは多数あるために、一義的に決定することは非常に困難である。
そこで、本願出願人は、ファイバＮＡに対応する励起光ビームＮＡという新しい概念を導入し、これを０．１４以上０．３１以下とすることによって、最大受光量を安定して受光することができる蛍光測定用プローブが得られることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明においては、励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下とする。
図１は、励起光ビームＮＡを説明するための図である。本発明においては、励起光ビームＮＡを以下のように定義する（図１（ａ）参照）。励起光が固体導光路としての光ファイバから出射され、レンズを介して試料に照射されたときの励起光の照射角度を２θとする。このとき、ｓｉｎθで表される値のことを励起光ビームＮＡとする。ここで励起光の照射角度２θは以下のように定義する。焦点付近の屈折率は１とする（空気中に試料が存在すると仮定する。試料または溶媒の屈折率が１と異なる場合は、その分補正する）。また、励起光の集光点付近の強度分布をガウス分布で近似し、中心の最大強度の１／ｅ２となったところを励起光ビームの端ときめ（図１（ｂ）参照）、角度２θを求める。
本発明者は、蛍光測定用プローブにおいて、各種設計条件と最大受光量との関係について鋭意研究した結果、レンズとして、一般的なボールレンズ、屈折率分布型レンズを使用し、固体導光路としての光ファイバ端とレンズとの間隔、光ファイバのＮＡを変化させることによって励起光のビームＮＡを所定範囲で変化させ、試料の厚さに対して受光光量が最大となる光学系を光学シミュレーションして求めたところ、受光光量が最大となる励起光ビームＮＡは０．１４以上０．３１以下の範囲内に収まることを見出した。
以下、励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下とする理由について詳細に説明する。
蛍光測定用プローブにおいて、励起光の照射を受けた試料から発生する蛍光を受光する受光光量を決定するためのパラメータとして、（１）ファイバコア径、（２）ファイバＮＡ、（３）レンズの種類、及び（４）試料厚さが挙げられる。
実験例１
そこで、（１）ファイバコア径を、実用上代表的な値である６２．５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍとし、
（２）ファイバＮＡを、一般的な値である０．１、０．２２、０．４とし、
（３）レンズとして代表的な球面レンズであるボールレンズφ４ｍｍ、屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐ（日本板硝子株式会社製セルフォックマイクロレンズ）、及び屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐ（日本板硝子株式会社製セルフォックマイクロレンズ）を用い、
全ての条件の組み合わせにおいて
（４）試料の厚さを、実用上現実的な値である５０〜２０００μｍの範囲で変化させた場合の蛍光受光量の変化を光学シミュレーションによって求めて図２及び図３に示した。
そこで、（１）ファイバコア径を、実用上代表的な値である６２．５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍとし、
（２）ファイバＮＡを、一般的な値である０．１、０．２２、０．４とし、
（３）レンズとして代表的な球面レンズであるボールレンズφ４ｍｍ、屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐ（日本板硝子株式会社製セルフォックマイクロレンズ）、及び屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐ（日本板硝子株式会社製セルフォックマイクロレンズ）を用い、
全ての条件の組み合わせにおいて
（４）試料の厚さを、実用上現実的な値である５０〜２０００μｍの範囲で変化させた場合の蛍光受光量の変化を光学シミュレーションによって求めて図２及び図３に示した。
図２は、実験例１−１の結果を示すグラフである。図２において、このグラフは、ファイバＮＡを０．２２とし、レンズとして屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐを用い、ファイバコア径を１００μｍとしたときの試料厚さに対する、各励起光ビームＮＡにおける蛍光受光量（以下、単に受光量という）（ａ．ｕ．）の変化を示したものである。
また図３は、実験例１−２の結果を示すグラフである。図３において、このグラフは、実験例１−１の結果に加え、実験例１−１においてファイバコア径を６２．５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、及び３００μｍに変化させた場合の各励起光ビームＮＡにおける受光量の変化を示したものである。
また、レンズをボールレンズ及び屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐに変更した以外は、上記実験例１−１及び１−２と同様の条件で同様にして試料厚さに対する受光量（ａ．ｕ．）の変化を求めると共に、ファイバＮＡを０．１及び０．４としてその他は同様の条件で、同様に試料厚さに対する受光量（ａ．ｕ．）の変化を求め（図示省略）、得られた試料厚さと蛍光の受光量（ａ．ｕ．）との関係から、信号（受光量）が最大となる励起光ビームＮＡが得られる条件を抽出し、図４〜図６に示した。
図４は、実験例１−３の結果を示すグラフである。図４において、このグラフは、レンズとしてそれぞれ屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐ、屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐ及びボールレンズφ４ｍｍを用い、ファイバＮＡを０．１とし、ファイバコア径をそれぞれ６２．５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍと変化させ、試料厚さをそれぞれ５０〜２０００μｍで変化させた場合に各試料厚さにおいて信号が最大となる最適励起光ビームＮＡを抽出してプロットしたものである。
図５は、実験例１−４の結果を示すグラフである。図５において、このグラフは、ファイバＮＡを０．２２とした以外は、実験例１−３と同様の条件で、信号が最大となる最適励起光ビームＮＡを抽出してプロットしたものである。
図６は、実験例１−５の結果を示すグラフである。図６において、このグラフは、ファイバＮＡを０．４とした以外は、実験例１−３と同様の条件で信号が最大となる最適励起光ビームＮＡを抽出してプロットしたものである。
また、図７は、図４〜図６に示した結果をボールレンズφ４ｍｍについてまとめたグラフである。図８は、図４〜図６に示した結果を屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐについてまとめたグラフである。図９は、図４〜図６に示した結果を屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐについてまとめたグラフである。
図７〜９において、励起光ビームＮＡが０．１４以上０．３１以下の範囲であれば、ファイバコア径、ファイバＮＡ、レンズ種及び試料厚さに拘わらず信号が最大となる蛍光測定用プローブが得られていることが分かる。
従って、本発明においては、励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下とする。
実験例２
実験例１で求めた励起光ビームＮＡを満足する場合であっても、レンズの表面から試料の表面までの距離（以下、レンズ−試料間距離という）が変化することによって良好な信号が得られない場合、すなわち試料を取り替えた際の位置ずれによって繰り返しの再現性が低下する場合がある。
実験例１で求めた励起光ビームＮＡを満足する場合であっても、レンズの表面から試料の表面までの距離（以下、レンズ−試料間距離という）が変化することによって良好な信号が得られない場合、すなわち試料を取り替えた際の位置ずれによって繰り返しの再現性が低下する場合がある。
図１０は、実験例２−１の結果を示すグラフである。図１０において、このグラフは、レンズとして屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐを用い、ファイバコア径を２００μｍ、ファイバＮＡを０．２２とし、試料の厚さを１００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ及び２０００μｍとしたときに、レンズ−試料間距離を５０μｍから２ｍｍまで変化させた場合において、受光量（ａ．ｕ．）の変化を示したものである。
一般的に微小領域での計測に用いられる測定器に要求される測定バラツキは±５％以下といわれている。そこで、図１０における試料厚さ２０００μｍの曲線において、最大受光量の±５％の範囲（ａ−ａ’）内の受光量が繰り返し得られれば、測定器としての再現性が満足されると定義し、再現性を満足するための最大受光量±５％の受光光量が得られる試料交換時における位置ずれ幅（位置ずれ許容範囲）と試料厚みとの関係を求めて図１１〜図１３に示した。
図１１は、実験例２−２の結果を示すグラフである。図１１において、このグラフは、ファイバＮＡを０．１とし、ファイバコア径を６２．５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍに変化させた際の、試料厚さに対する位置ずれ許容範囲を各レンズごとにプロットしたものである。
また、図１２は、実験例２−３の結果を示すグラフである。図１２において、このグラフは、ファイバＮＡを０．２２とした以外は、実験例２−２と同様の条件で、試料厚さに対する位置ずれ許容範囲を各レンズごとにプロットしたものである。
また、図１３は、実験例２−４の結果を示すグラフである。図１３において、このグラフは、ファイバＮＡを０．４とした以外は、実験例２−２と同様の条件で、試料厚さに対する位置ずれ許容範囲を各レンズごとにプロットしたものである。
ここで、試料交換のために繰り返しセッティングする際における位置ずれ範囲を（ＪＩＳ−Ｂ０４０５：普通公差を参考に）実用上１００μｍとし、測定器の再現性を満足するための位置ずれ許容範囲が１００μｍ以下のものを除く場合、ファイバＮＡを０．１とした図１１（実験例２−２）においては、全てのファイバコア径において位置ずれ許容量を満足しないものがある。従って、本発明において、繰り返しの再現性を確保する観点から、ファイバＮＡは、０．２２以上であることが好ましい。
図１４は、図１２及び図１３の結果をボールレンズφ４ｍｍについてまとめたものであって、試料厚さの範囲を２０００μｍまで広げたデータを追加したグラフである。ここでは、ボールレンズを用いて計算を実施したが、ボールレンズの側面を研磨したドラムレンズを用いても同じ結果が得られる。また、図１５は、図１２及び図１３の結果を屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐについてまとめたものであって、試料厚さの範囲を２０００μｍまで広げたデータを追加したグラフである。また、図１６は、図１２及び図１３の結果を屈折率分布型レンズＳＬＨ１８＿０．２５Ｐについてまとめたものであって、試料厚さの範囲を２０００μｍまで広げたデータを追加したグラフである。
図１４〜図１６において、ファイバコア径を２００μｍ以上とすることによって、全ての場合に、位置ずれ許容範囲１００μｍを満足することが分かる。従って、本発明においては、繰り返しの再現性を確保するためファイバコア径を２００μｍ以上とし、また、ファイバＮＡを０．２２以上とすることが好ましい。
実施例１
レンズとして代表的な曲面レンズであるボールレンズφ４ｍｍを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５とし、ファイバＮＡを０．２２とすることによって、検出感度が良好で、繰り返し精度の高い蛍光測定用プローブが得られた。
レンズとして代表的な曲面レンズであるボールレンズφ４ｍｍを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５とし、ファイバＮＡを０．２２とすることによって、検出感度が良好で、繰り返し精度の高い蛍光測定用プローブが得られた。
実施例２
レンズとして屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５とし、ファイバＮＡを０．２２とし、ファイバコア径を２００μｍとすることによって、検出感度が良好で、繰り返し精度の高い蛍光測定用プローブが得られた。
レンズとして屈折率分布型レンズＳＬＷ１８＿０．２５Ｐを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５とし、ファイバＮＡを０．２２とし、ファイバコア径を２００μｍとすることによって、検出感度が良好で、繰り返し精度の高い蛍光測定用プローブが得られた。
実施例３
レンズとして代表的な曲面レンズであるボールレンズφ４ｍｍを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５としたところ、検出感度が良好な蛍光測定用プローブが得られた。
レンズとして代表的な曲面レンズであるボールレンズφ４ｍｍを用い、励起光ビームＮＡを０．１５〜０．２５としたところ、検出感度が良好な蛍光測定用プローブが得られた。
４１ 光源
４２ 合分波器
４３ プローブ
４４ 蛍光分析用チップ（試料）
４５ 検出器
４２ 合分波器
４３ プローブ
４４ 蛍光分析用チップ（試料）
４５ 検出器
Claims (3)
- 励起光を出射する光源と、前記励起光が照射された試料から発生する蛍光を受光する検出器とを有する光学系を備えた蛍光測定システムに適用される蛍光測定用プローブであって、
前記励起光の光路と前記蛍光の光路が同一である固体導光路と、該固体導光路の端部断面と前記試料との間に配置されたレンズとを有し、
前記固体導光路から出射され、前記レンズを介して照射された励起光を受けて前記試料が発生する蛍光を前記レンズによって集光する際の前記励起光の集光位置における前記励起光の照射角度を２θとしたとき、ｓｉｎθで表される励起光ビームＮＡを０．１４以上０．３１以下としたことを特徴とする蛍光測定用プローブ。 - 前記固体導光路は光ファイバであり、ファイバコア径は２００μｍ以上であることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定用プローブ。
- ファイバＮＡは０．２２以上であることを特徴とする請求項２記載の蛍光測定用プローブ。
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