JP6129014B2 - 蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、被検出物に励起光を照射して、該被検出物が発生した蛍光を検出する蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。

近年、ライフサイエンスの分野において、蛍光検出装置が多く使われ始めている。蛍光検出装置は簡便でかつ検出感度が高いため、時には増幅工程と併用して、蛍光を発する化学物質により標識されたＤＮＡなどの核酸の定量的な検出をする際に有効である。

例えば特許文献１には、励起光を試料に導光する投光用ファイバと、試料から発生した蛍光を導光する受光用ファイバと、投光用ファイバの出射端と、受光用ファイバの入射端を保持する保持手段とを備える装置が開示されている。

特開２００９−１４３７９号公報

しかしながら、特許文献１のように、励起光を導光するファイバと、蛍光を導光するファイバとを別個にした蛍光検出装置は、以下のような問題点を有する。

図１（ａ）および（ｂ）は、励起光を導光するファイバと、蛍光を導光するファイバとを別個にした蛍光検出装置の問題点を説明するための図である。図１（ａ）は、励起光用ファイバ１０１から出射された励起光が対物レンズ１０３により試料Ｓ上に集光される様子を示す。また、図１（ｂ）は、蛍光用ファイバ１０２から出射された蛍光が対物レンズ１０３により試料Ｓ上に集光される様子を示す。本来であれば、蛍光は試料Ｓで発生し、対物レンズ１０３を通って蛍光用ファイバ１０２に向かって進むが、ここでは説明を分かりやすくするために、蛍光の進行方向を逆向きに考える。

図１（ａ）および（ｂ）に示すように、励起光用ファイバ１０１と蛍光用ファイバ１０２が別個である場合、対物レンズ１０３によって試料Ｓ上に形成される励起光用ファイバ１０１のコア端面の像（以下、「励起光スポット」と呼ぶ）と、対物レンズ１０３によって試料Ｓ上に形成される蛍光用ファイバ１０２のコア端面の像（以下、「蛍光スポット」と呼ぶ）は一致せず、互いにずれた位置にある。たとえば図１（ａ）および（ｂ）の構成において、励起光スポットはＡ点、蛍光スポットはＢ点に結像する。励起光スポットＡ点では励起光の強度が最大となることから、試料Ｓから発生する蛍光の強度も最大である。しかしながら、励起光スポットＡ点で発生した蛍光は蛍光用ファイバ１０２に取り込まれない。また、光線逆進の原理から、蛍光スポットＢ点で発生した光は最大の立体角で蛍光用ファイバ１０２に取り込まれるが、蛍光スポットＢ点には励起光が照射されていないので、蛍光スポットＢ点から発生する蛍光はそもそも存在しない。この場合、対物レンズ１０３と試料Ｓ間の距離を調整し、励起光や蛍光のスポット以外の領域であって、各光束の重なる部分における蛍光を取り込む必要がある。例えば図１（ａ）および（ｂ）において、試料Ｓを図示の状態から対物レンズ１０３により近づけた状態にする。すなわちデフォーカス状態にする必要がある。しかしながら、デフォーカス状態においては必然的に蛍光を高効率で取り込むことが困難となる。

このように、励起光用ファイバ１０１と蛍光用ファイバ１０２が別個である場合、強い蛍光信号を得るための潜在力に富む励起光スポットＡと、発生した蛍光を最も効果的に蛍光用ファイバ１０２に取り込むことのできる蛍光スポットＢとが全く重なっておらず、高強度の蛍光を検出するのが難しいという問題がある。なお、上記の特許文献１においては対物レンズについては明示されていないが、励起光の照射領域及び蛍光の取り込める領域の不整合が存在する点は同様である。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、蛍光の検出強度を高めることができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の蛍光検出装置は、被検出物に対して励起光を照射し、該照射により被検出物から発生した蛍光を検出する蛍光検出装置であって、励起光を出射する励起光出射端を有する励起光用ファイバと、蛍光を入射する蛍光入射端を有する蛍光用ファイバと、励起光出射端および蛍光入射端と、被検出物との間に配置された対物レンズと、励起光出射端および蛍光入射端と対物レンズとの間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有する反射部材とを備える。反射部材の２つの反射面は、励起光用ファイバの光軸と蛍光用ファイバの光軸との間に位置している。

反射部材の２つの反射面が、励起光用ファイバの光軸および蛍光用ファイバの光軸と平行であってもよい。

２つの反射面間の中央が、励起光用ファイバの光軸と蛍光用ファイバの光軸間の中央に位置していてもよい。

反射部材は、２つの反射面が励起光出射端および蛍光入射端から対物レンズの入射面の直前まで延在するように配置されてもよい。

反射部材は、励起光出射端および蛍光入射端を超えて、励起光用ファイバと蛍光用ファイバとの間に延在してもよい。

反射部材は、表裏両面に反射面を有する反射板であってもよい。

反射部材は、平坦面同士が所定距離離間して配置された２つの直方体プリズムを備えてもよい。

対物レンズと被検出物との間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有する対物反射部材をさらに備えてもよい。

対物レンズは、１枚のレンズまたは複数のレンズの組み合わせから構成されてもよい。

対物レンズは、２つのレンズと、当該２つの前記レンズ間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有するレンズ間反射部材とを備えてもよい。

蛍光入射端の前に蛍光選択フィルタをさらに備えてもよい。また、励起光出射端の前に励起光選択フィルタをさらに備えてもよい。

本発明の別の態様もまた、被検出物に対して励起光を照射し、該照射により被検出物から発生した蛍光を検出する蛍光検出装置である。この装置は、励起光を出射する励起光出射端を有する、一または複数の励起光用ファイバと、蛍光を入射する蛍光入射端を有する、一または複数の蛍光用ファイバと、励起光出射端および蛍光入射端と、被検出物との間に配置された対物レンズと、励起光出射端および蛍光入射端と対物レンズとの間に配置された反射部材であって、励起光用ファイバと蛍光用ファイバを合わせた数をｎとしたときに、ｎの２倍の数の反射面を有する反射部材とを備える。励起光用ファイバと蛍光用ファイバは、互いに光軸が平行になるよう配置されている。励起光用ファイバと蛍光用ファイバは、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、ｎ角形の各頂点に一つずつ配置されている。ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、隣接するファイバ間には２つの反射面が配置されている。

本発明のさらに別の態様は、上述の蛍光検出装置を用いて被検出物の蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法である。

上記蛍光検出方法は、蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、対物レンズの作動距離を調整するステップを備えてもよい。

上記蛍光検出方法は、蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、励起光用ファイバおよび／または蛍光用ファイバの光軸と被検出物の表面とのなす角度を調整するステップを備えてもよい。

本発明によれば、蛍光の検出強度を高めることのできる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供できる。

図１（ａ）および（ｂ）は、励起光を導光するファイバと、蛍光を導光するファイバとを別個にした蛍光検出装置の問題点を説明するための図である。 本実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 図３（ａ）および（ｂ）は、励起光用ファイバの励起光出射端から出射された光線を示す図である。 図４（ａ）および（ｂ）は、蛍光用ファイバの蛍光入射端から出射された光線を示す図である。 本発明の第１実施例に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 図５に示す蛍光検出装置における対物レンズの周辺部分の拡大図である。 本発明の第２実施例に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 本発明の別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 図１０（ａ）〜（ｄ）は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。 図１１（ａ）〜（ｅ）は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置を説明するための図である。

以下、本発明の実施形態に係る蛍光検出装置について説明する。

図２は、本実施形態に係る蛍光検出装置１０を説明するための図である。蛍光検出装置１０は、被検出物としての試料Ｓに対して励起光を照射し、該照射により試料Ｓから発生した蛍光を検出するものである。

図２に示すように、蛍光検出装置１０は、励起光を出射する励起光出射端１１ａを有する励起光用ファイバ１１と、蛍光を入射する蛍光入射端１２ａを有する蛍光用ファイバ１２と、励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａと試料Ｓとの間に配置された対物レンズ１３と、励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａと対物レンズ１３との間に配置された反射板１４とを備える。励起光用ファイバ１１および蛍光用ファイバ１２は、図２に示すように、励起光出射端１１ａにおける光軸Ａｘ１と蛍光入射端１２ａにおける光軸Ａｘ２とが平行となるように配置される。ここでは、対物レンズ１３は倒立像を形成する光学系、すなわち像倍率が負の場合の光学系であった場合について記載するが、対物レンズ１３が正立像を形成する場合、すなわち像倍率が正の場合の光学系であっても、同様の作用効果が得られる。なお、図１には対物レンズ１３として便宜上１枚のレンズしか記載されていないが、対物レンズ１３は、収差や作動距離の制約から、複数枚からなるレンズや回折格子などの集束機能を有する光学素子から構成されていてもよい。

反射板１４は、表裏両面に反射面（第１反射面１４ａおよび第２反射面１４ｂ）を有する。第１反射面１４ａおよび第２反射面１４ｂは、平行であり、且つ互いに逆方向を向いている。反射板１４の第１反射面１４ａおよび第２反射面１４ｂは、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａにおける光軸Ａｘ１と蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａにおける光軸Ａｘ２との間に位置している。反射板１４は、第１反射面１４ａが励起光用ファイバ１１側に位置し、第２反射面１４ｂが蛍光用ファイバ１２側に位置するように配置されている。第１反射面１４ａおよび第２反射面１４ｂは、励起光用ファイバ１１の光軸Ａｘ１および蛍光用ファイバ１２の光軸Ａｘ２と平行であることが好ましい。さらに、第１反射面１４ａと第２反射面１４ｂ間の中央は、励起光用ファイバ１１の光軸Ａｘ１と蛍光用ファイバ１２の光軸Ａｘ２間の中央に位置していることが好ましい。

次に図３（ａ）および（ｂ）並びに図４（ａ）および（ｂ）を用いて、本実施形態に係る蛍光検出装置１０の動作について説明する。図３（ａ）および（ｂ）は、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａから出射された光線を示す。図４（ａ）および（ｂ）は、蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａから出射された光線を示す。なお、図４（ａ）および（ｂ）においても、説明を分かりやすくするために、蛍光の進行方向を逆向き、すなわち蛍光用ファイバ１２から蛍光が出射され、対物レンズ１３により試料Ｓ上に蛍光スポットが形成される、と考える。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０においては、図３（ａ）に示すように、励起光用ファイバ１１からの励起光のうち約半分は、反射板１４の第１反射面１４ａで反射した後、対物レンズ１３によって集光され、試料Ｓ上のＢ点に励起光スポットを作る。同時に、図３（ｂ）に示すように、反射板１４の第１反射面１４ａに到達しない約半分の励起光は、対物レンズ１３によって集光され、試料Ｓ上のＡ点に励起光スポットを作る。その結果、Ａ点とＢ点に、ほぼ同じ明るさの励起光スポットを作ることができる。

一方、蛍光用ファイバ１２からの蛍光のうち約半分は、図４（ａ）に示すように、反射板１４の第２反射面１４ｂで反射した後、対物レンズ１３によって集光され、試料Ｓ上のＡ点に蛍光スポットを作る。同時に、図４（ｂ）に示すように、反射板１４の第２反射面１４ｂに到達しない約半分の蛍光は、対物レンズ１３によって集光され、試料Ｓ上のＢ点に蛍光スポットを作る。その結果、Ａ点とＢ点に、ほぼ同じ明るさの蛍光スポットを作ることができる。

このように、本実施形態に係る蛍光検出装置１０においては、励起光スポットと蛍光スポットがＡ点とＢ点の２箇所で一致する。それぞれのスポット近傍では、試料Ｓ上に照射される励起光の強度が最大となることから、試料Ｓから発生する蛍光の強度も最大となる。また、光線逆進の原理から、それぞれのスポット近傍で発生した蛍光は共に、大きな立体角で蛍光用ファイバ１２に取り込まれる。

すなわち、図３（ａ）に示すように、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａから出射した後、反射板１４の第１反射面１４ａで反射した励起光は、対物レンズ１３を介して試料Ｓ上のＢ点に励起光スポットを作る。この励起光スポットにより試料Ｓ上のＢ点から発生した蛍光は、図４（ｂ）から分かるように、対物レンズ１３を介して、第２反射面１４ｂで反射せずに蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａに入射する。

一方、図３（ｂ）に示すように、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａから出射した後、反射板１４の第１反射面１４ａに到達しない励起光は、対物レンズ１３を介して試料Ｓ上のＡ点に励起光スポットを作る。この励起光スポットにより試料Ｓ上のＡ点から発生した蛍光は、図４（ａ）から分かるように、対物レンズ１３を介して、第２反射面１４ｂで反射して蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａに入射する。

このように、本実施形態に係る蛍光検出装置１０によれば、励起光スポットと蛍光スポットとを一致させることができるため、蛍光の検出強度を高めることができる。なお厳密に考えると、図３（ｂ）において励起光が集まるＡ点と図４（ａ）において蛍光が集まるＡ点は完全には一致せず、反射板１４の厚さに対物レンズ１３の像倍率を乗じた長さだけずれている（Ｂ点についても同様）。しかしながら、反射板１４の厚さが励起光用ファイバ１１および蛍光用ファイバ１２のコア直径と比較して充分に小さければ、ずれの影響は無視することができる。

本実施形態については、対物レンズ１３が倒立像を形成させる光学系であることを前提に記載した。すなわち図３の記載において、励起光出射端１１ａから出射した励起光は、（ａ）励起光出射端１１ａ→第１反射面１４ａ→対物レンズ１３→試料Ｓ上のＢ点に到達するパスと、（ｂ）励起光出射端１１ａ→対物レンズ１３→試料Ｓ上のＡ点に到達するパスを形成している。また図４の記載においては、試料Ｓ上のＡ点又はＢ点から出射される蛍光は、（ａ）試料Ｓ上のＡ点→対物レンズ１３→第２反射面１４ｂ→蛍光入射端１２ａに到達するパスと、（ｂ）試料Ｓ上のＢ点→対物レンズ１３→蛍光入射端１２ａに到達するパスを形成している。

一方で、対物レンズ１３が正立像を形成させる光学系である場合（図示は省略）、励起光出射端１１ａから出射した励起光は、（ａ'）励起光出射端１１ａ→第１反射面１４ａ→対物レンズ１３→試料Ｓ上のＡ点に到達するパスと、（ｂ'）励起光出射端１１ａ→対物レンズ１３→試料Ｓ上のＢ点に到達するパスを形成しうる。また試料Ｓ上のＡ点又はＢ点から出射される蛍光は、（ａ'）試料Ｓ上のＡ点→対物レンズ１３→蛍光入射端１２ａに到達するパスと、（ｂ'）試料Ｓ上のＢ点→対物レンズ１３→第２反射面１４ｂ→蛍光入射端１２ａに到達するパスを形成しうることが理解できる。正立あるいは倒立の光学系のうちいずれかを使うかは、当業者の設計の範囲で任意に決めることができ、いずれの場合においても光出入射端と対物レンズの間に設置した反射板の効果を受けることが可能である。

さらに、本実施形態に係る蛍光検出装置１０は、以下のような利点を有する。図１（ａ）および（ｂ）に示すように、反射板を有さない蛍光検出装置においては、対物レンズ１０３のうちほとんどの部分を励起光の光線が通過し、且つ蛍光の光線も通過する。そのため、励起光により対物レンズ１０３から発生する反射光、散乱光、蛍光が蛍光用ファイバ１０２に混入してノイズ光となり、蛍光の測定精度を低下させるおそれがある。

一方、本実施形態に係る蛍光検出装置１０においては、図２に示すように励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａと対物レンズ１３との間に反射板１４を配置したことにより、励起光の通る領域と蛍光の通る領域がほぼ分離される。すなわち、励起光用ファイバ１１からの励起光は、図３（ａ）および（ｂ）に示すように、主に対物レンズ１３の下半分を透過するが、試料Ｓ上で発生した蛍光は、図４（ａ）および（ｂ）に示すように、主に対物レンズ１３の上半分を通過した光線のみが蛍光用ファイバ１２に入射するため、励起光と蛍光が重なる領域を小さくすることができる。また、光を通さない材料で反射板１４を形成することにより、反射板１４を通してのクロストークも発生しない。従って、励起光が直接照射された対物レンズ１３から微弱な反射光、散乱光、蛍光が発生したとしても、これらは蛍光用ファイバ１２にはほとんど取り込まれないため、ノイズ光が少なくなり、蛍光の測定精度が向上する。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０を用いる際には、蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、対物レンズ１３の作動距離を調整してもよい。さらに、蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、励起光用ファイバ１１および／または蛍光用ファイバ１２の光軸と試料Ｓの表面とのなす角度を調整してもよい。このように角度を調整した実施例を、下記に第２実施例として示す。

次に、本発明の実施例について説明する。図５は、本発明の第１実施例に係る蛍光検出装置５０を説明するための図である。図５に示すように、蛍光検出装置５０は、励起光源５１と、励起光用ファイバ１１と、蛍光用ファイバ１２と、集光レンズ５２と、励起光フィルタ５３と、対物レンズ１３と、反射板１４と、蛍光検出器としてのＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）５４と、蛍光フィルタ５５と、蛍光フィルタ６０とを備える。

励起光源５１としては、砲弾型の緑色ＬＥＤ（日亜化学工業（株）製ＮＳＰＧ３００Ｄ（中心波長（カタログ値）＝約５２５ｎｍ））を使用しピーク電流４０ｍＡ、周波数１１０Ｈｚでパルス発光させた。集光レンズ５２としては、合成石英製の平凸レンズ（直径１２ｍｍ、焦点距離１８ｍｍ）を２枚用いた。励起光源５１からの光束を一方の平凸レンズで略平行光束とし、該略平行光束を他方の平凸レンズによって集光した。集光点近傍には、励起光用ファイバ１１の入射端１１ｂを配置した。励起光用ファイバ１１としては、米国ＣｅｒａｍＯｐｔｅｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＩｎＣ．製ＵＶ６００−６６０−７１０Ｐ２８（コアの直径０．６ｍｍ、開口数ＮＡ＝０．３）を用いた。集光レンズ５２と励起光用ファイバ１１の入射端１１ｂとの間には、励起光フィルタ５３としてエドモンド・オプティクス・ジャパン（株）製蛍光用バンドパスフィルタ（透過帯中心波長５３４．５ｎｍ、半値全幅４８ｎｍ）を設置し、所定の波長成分以外の励起光の成分をカットした。

励起光用ファイバ１１を伝播して励起光出射端１１ａから放出される励起光は、対物レンズ１３によって試料Ｓ（蛍光物質を含む水溶液）に集光される。試料Ｓで発生した蛍光は、同じ対物レンズ１３によって蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａに集光される。なお、試料Ｓは、内径６．５ｍｍ、深さ１１ｍｍの黒色樹脂製の円筒状のセル５６に入っている。

蛍光用ファイバ１２は、励起光用ファイバ１１と同じものを用いた。蛍光用ファイバ１２中を伝播した蛍光のエネルギー量は、ＰＭＴ５４によって測定される。ここでは、ＰＭＴ５４として、浜松ホトニクス社製Ｈ９３０６−０４を使用した。蛍光用ファイバ１２の出射端１２ｂとＰＭＴ５４との間には、蛍光フィルタ５５として所定のバンドパスフィルタ（透過波長域６００〜６４０ｎｍ）及びエドモンド・オプティクス・ジャパン（株）製蛍光用バンドパスフィルタ（透過帯中心波長６２４ｎｍ、半値全幅４６ｎｍ）を各１枚ずつ挟み込み、試料Ｓから発生する蛍光成分以外の波長成分をカットした。ＰＭＴ５４が受光した信号のうち、励起光源５１の発光パルスと同じ周期（１１０Ｈｚ）成分のみを選択的に検出し、これを出力値とした。

図６は、図５に示す蛍光検出装置５０における対物レンズ１３の周辺部分の拡大図である。励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａにおける光軸と、蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａにおける光軸との間隔は０．８ｍｍである。反射板１４としては、厚さ０．０５ｍｍのステンレス板である（株）ミスミ製 シムテープＳＦＧＳＭ ０．０５を使用した。反射板１４の幅（図６の紙面に対して垂直な方向の長さ）は、１２ｍｍである。

本第１実施例において、反射板１４は、２つの反射面が励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａから対物レンズ１３の入射面の直前まで延在するように配置されている。これにより、蛍光検出強度の増大効果と、蛍光測定精度の向上効果を高めることができる。さらに、本第１実施例においては、反射板１４は、励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａを超えて、励起光用ファイバ１１と蛍光用ファイバ１２との間に延在している。これにより、蛍光検出強度の増大効果と、蛍光測定精度の向上効果をさらに高めることができる。

本第１実施例においては、対物レンズ１３として、合成石英製の平凸レンズ（直径９ｍｍ、焦点距離１２ｍｍ）２枚（１３ａ，１３ｂ）を、凸面が対向するように配置したものを用いた。さらに、２つの平凸レンズ１３ａ，１３ｂ間には、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有する反射板（「レンズ間反射板」と呼ぶ）６１が配置されている。レンズ間反射板６１は、反射板１４と同様に、蛍光検出強度を増大するとともに、蛍光測定精度を向上させるのに役立つ。

さらに本第１実施例においては、蛍光用ファイバ１２の蛍光入射端１２ａの前に、蛍光を選択的に透過させる蛍光フィルタ６０が配置されている。蛍光フィルタ６０は、透過波長域が６００ｎｍ〜６４０ｎｍのバンドパスフィルタである。さらに、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａの前に、励起光を選択的に透過させる励起光選択フィルタ（図示せず）が配置されてもよい。

図５および図６で説明した第１実施例に係る蛍光検出装置５０を用いて、以下の４条件でＰＭＴ５４の出力値を暗室で測定した。具体的には、測定時間３０秒の間に約３００回の計測を行ない、その数値の平均とばらつき（標準偏差）を算出した。

試料として濃度を１０ｎＭ（１０ナノモル／リットル）のレゾルフィン水溶液３００ｍｍ^３をセルに入れ、ＰＭＴ５４の出力が最大となるようにセルの位置を調整したところ、以下の結果が得られた。

（１）レゾルフィン水溶液に関して、ＰＭＴ５４の平均出力６７６．６ｍＶ、標準偏差１．３９３ｍＶが得られた。
（２）ブランクテストとして超純水（和光純薬製液体クロマトグラフ／質量分析用）３００ｍｍ^３をセル５６に入れて測定したところ、ＰＭＴ５４の平均出力３３．６ｍＶ、標準偏差０．３０３ｍＶが得られた。
（３）試料Ｓとセル５６を取り除いた場合は、ＰＭＴ５４の平均出力３．９ｍＶ、標準偏差０．０６９ｍＶであった。
（４）ＰＭＴ５４の受光部に全く光を入れない条件では、平均出力２．５ｍＶ、標準偏差０．０４２ｍＶが得られた。これは、ＰＭＴ５４および検出回路における電気的ノイズである。

以上の結果より、レゾルフィン水溶液からの蛍光量の測定値は（１）と（２）の出力差をとって６４３ｍＶである。（２）と（３）の出力差２９．７ｍＶは、溶媒（超純水）およびセル５６による散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。（３）と（４）の出力差１．４ｍＶは、対物レンズ１３における散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。さらに検出限界濃度は、レゾルフィン水溶液からの蛍光量は試料中のレゾルフィン濃度に比例し、ブランクテストにおける標準偏差をノイズとして、ノイズの３倍値を検出限界と規定すると次式より１４ｐＭ（ピコモル／リットル）と求まる。なお検出限界濃度とは、測定対象の化学物質の存在を高い信頼性で検出できる最小値を云う。
１０ｎＭ×（３×０．３０３／６４３）＝０．０１４ｎＭ＝１４ｐＭ

次に、本第１実施例の測定結果を検証するために比較例について説明する。図５および図６に示す蛍光検出装置５０から反射板１４およびレンズ間反射板６１を取り除いて、第１実施例と同様の測定を実施した。以下に測定結果を示す。

（１'）レゾルフィン水溶液に関して、ＰＭＴ５４の平均出力３０６．５ｍＶ、標準偏差１．０２９ｍＶが得られた。
（２'）ブランクテストでは、ＰＭＴ５４の平均出力２４．３ｍＶ、標準偏差０．２６４ｍＶが得られた。
（３'）試料Ｓとセル５６を取り除いた場合は、ＰＭＴ５４の平均出力１４．４ｍＶ、標準偏差０．１８１ｍＶであった。
（４'）ＰＭＴ５４の受光部に全く光を入れない条件では、平均出力２．５ｍＶ、標準偏差０．０４２ｍＶが得られた。

以上の結果より、レゾルフィン水溶液からの蛍光量の測定値は（１'）と（２'）の出力差をとって２８２．２ｍＶである。（２'）と（３'）の出力差９．９ｍＶは、溶媒（超純水）およびセル５６による散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。（３'）と（４'）の出力差１１．９ｍＶは、対物レンズ１３における散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。さらに検出限界濃度は、次式より２８ｐＭと求まる。
１０ｎＭ×（３×０．２６４／２８２．２）＝０．０２８ｎＭ＝２８ｐＭ

第１実施例と比較例の測定結果を以下にまとめた。
（Ａ）レゾルフィン水溶液からの蛍光検出強度について
本第１実施例は、比較例と比べて約２．３倍の蛍光検出強度が得られる（６４３ｍＶ／２８２．２ｍＶ＝２．２８）。
（Ｂ）検出限界濃度について
本第１実施例は、比較例と比べて約１／２の低濃度のレゾルフィン水溶液について検出能力を持ち得る（１４ｐＭ／２８ｐＭ＝１／２）。
（Ｃ）対物レンズに由来する光学ノイズについて
本第１実施例は、比較例と比べて対物レンズ１３に由来するノイズを約１／１０のレベルに抑制することができる（１．４ｍＶ／１１．９ｍＶ＝０．１２）。

図７は、本発明の第２実施例に係る蛍光検出装置６２を説明するための図である。本実施例では、図７に示すように、対物レンズ１３の光軸を試料Ｓの表面に対して垂直から１５°傾け、試料Ｓの表面に対して励起光が斜めに入射するようにした。これは、試料Ｓの表面で反射した励起光が蛍光用ファイバ１２へ入ることにより発生するノイズ光を低減させるためである。なお図７では、励起光用ファイバ１１の励起光出射端１１ａと蛍光用ファイバ１２の蛍光用ファイバ１２は、紙面に垂直な方向に並べて配置されている。

本第２実施例では、蛍光用ファイバ１２の出射端１２ｂとＰＭＴ５４の間に、蛍光フィルタ５５として所定のバンドパスフィルタ（透過波長域６００〜６４０ｎｍ）、エドモンド・オプティクス・ジャパン（株）製蛍光用バンドパスフィルタ（透過帯中心波長６２４ｎｍ、半値全幅４６ｎｍ）およびエドモンド・オプティクス・ジャパン（株）製ロングパスフィルタＯＧ５９０の３枚をセットしたものを使用した。その他の構成要素の仕様は、図５および図６に示す第１実施例と同一である。

図７に示す蛍光検出装置６２を用いて、以下の４条件によりＰＭＴ５４の出力値を暗室で測定した。具体的には、測定時間３０秒の間に約３００回の計測を行ない、その数値の平均とばらつき（標準偏差）を算出した。

試料として濃度を１０ｎＭ（１０ナノモル／リットル）のレゾルフィン水溶液３００ｍｍ^３をセルに入れ、ＰＭＴ５４の出力が最大となるようにセルの位置を調整したところ、以下の結果が得られた。

（１）レゾルフィン水溶液に関して、ＰＭＴ５４の平均出力５４５．９ｍＶ、標準偏差１．２７３ｍＶが得られた。
（２）ブランクテストとして超純水（和光純薬製液体クロマトグラフ／質量分析用）３００ｍｍ^３をセルに入れて測定したところ、ＰＭＴ５４の平均出力１５．７ｍＶ、標準偏差０．１９６ｍＶが得られた。
（３）試料Ｓとセル５６を取り除いた場合の測定値は、ＰＭＴ５４の平均出力３．９ｍＶ、標準偏差０．０７５ｍＶであった。
（４）ＰＭＴ５４の受光部に全く光を入れない条件では、平均出力２．５ｍＶ、標準偏差０．０４２ｍＶが得られた。これは、ＰＭＴ５４および検出回路における電気的ノイズである。

以上の結果より、レゾルフィン水溶液からの蛍光量の測定値は（１）と（２）の出力差をとって５３０．２ｍＶである。（２）と（３）の出力差１１．８ｍＶは、溶媒（超純水）およびセルによる散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。（３）と（４）の出力差１．４ｍＶは、対物レンズ１３における散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。さらに検出限界濃度は、レゾルフィン水溶液からの蛍光量は試料中のレゾルフィン濃度に比例し、ブランクテストにおける標準偏差をノイズとして、ノイズの３倍値を検出限界と規定すると次式より１１ｐＭ（ピコモル／リットル）と求まる。なお検出限界濃度とは、測定対象の化学物質の存在を高い信頼性で検出できる最小値を云う。
１０ｎＭ×（３×０．１９６／５３０．２）＝０．０１１ｎＭ＝１１ｐＭ

次に、本第２実施例の測定結果を検証するために比較例について説明する。図７に示す蛍光検出装置６２から反射板１４およびレンズ間反射板６１を取り除いて、第２実施例と同様の測定を実施した。以下に測定結果を示す。

（１'）レゾルフィン水溶液に関して、ＰＭＴ５４の平均出力３００．８ｍＶ、標準偏差０．９３７ｍＶが得られた。
（２'）ブランクテストでは、ＰＭＴ５４の平均出力２４．４ｍＶ、標準偏差０．２７４ｍＶが得られた。
（３'）試料Ｓとセル５６を取り除いた場合は、ＰＭＴ５４の平均出力１４．４ｍＶ、標準偏差０．１９３ｍＶであった。
（４'）ＰＭＴ５４の受光部に全く光を入れない条件では、平均出力２．５ｍＶ、標準偏差０．０４２ｍＶが得られた。

以上の結果より、レゾルフィン水溶液からの蛍光量の測定値は（１'）と（２'）の出力差をとって２７６．４ｍＶである。（２'）と（３'）の出力差１０ｍＶは、溶媒（超純水）およびセルによる散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。（３'）と（４'）の出力差１１．９ｍＶは、対物レンズ１３における散乱、反射、蛍光に由来する光学ノイズである。さらに検出限界濃度は、次式より３０ｐＭと求まる。
１０ｎＭ×（３×０．２７４／２７６．４）＝０．０３０ｎＭ＝３０ｐＭ

第２実施例と比較例の測定結果を以下にまとめた。
（Ａ）レゾルフィン水溶液からの蛍光検出強度について
本第２実施例は、比較例と比べて約２倍の蛍光検出強度が得られる（５３０．２ｍＶ／２７６．４ｍＶ＝１．９２）。
（Ｂ）検出限界濃度について
本第２実施例は、比較例と比べて約１／３の低濃度のレゾルフィン水溶液について検出能力を持ち得る（１１ｐＭ／３０ｐＭ＝０．３７）。
（Ｃ）対物レンズに由来する光学ノイズについて
本第２実施例は、比較例と比べて対物レンズ１３に由来するノイズが約１／１０のレベルに抑制することができる（１．４ｍＶ／１１．９ｍＶ＝０．１２）。

図８は、本発明の別の実施形態に係る蛍光検出装置７０を説明するための図である。本実施形態に係る蛍光検出装置７０は、反射板１４およびレンズ間反射板６１に加えて、対物レンズ１３と試料Ｓとの間に配置された反射板（「対物反射板」と呼ぶ）７１をさらに備える。この対物反射板７１は、反射板１４およびレンズ間反射板６１と同様に、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有し、対物レンズ１３の出射面から試料Ｓに向けて延在している。本実施形態のように、対物反射板７１を設けることにより、励起光の通る領域と蛍光の通る領域との分離をより確実にできるので、ノイズ光をより小さくすることができ、蛍光の測定精度をより向上することができる。

図９は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置８０を説明するための図である。本実施形態に係る蛍光検出装置８０では、励起光出射端１１ａおよび蛍光入射端１２ａと対物レンズ１３との間に、反射板に代えて、反射部材８１が配置されている。この反射部材８１は、２つの直方体プリズム８２，８３を備える。２つの直方体プリズム８２，８３は、平坦面８２ａ、８３ａ同士がスペーサ８４を介して所定距離離間するように配置されている。このように２つの直方体プリズム８２，８３が間に空気層を挟んで配置されると、平坦面８２ａ、８３ａは、２つの全反射面として機能する。２つの全反射面は、平行であり、且つ互いに逆方向を向いている。

反射部材８１は、２つの全反射面８２ａ、８３ａが励起光用ファイバ１１の光軸Ａｘ１と蛍光用ファイバ１２の光軸Ａｘ２との間に位置するように配置される。２つの全反射面８２ａ、８３ａは、励起光用ファイバ１１の光軸Ａｘ１および蛍光用ファイバ１２の光軸Ａｘ２と平行であることが好ましい。さらに、２つの全反射面８２ａ、８３ａ間の中央は、励起光用ファイバ１１の光軸Ａｘ１と蛍光用ファイバ１２の光軸Ａｘ２間の中央に位置していることが好ましい。

本実施形態に係る蛍光検出装置８０において、励起光用ファイバ１１からの励起光は、直方体プリズム８３の励起光用ファイバ１１側の端面８３ｂから直方体プリズム８３内に入射する。直方体プリズム８３内に入射した励起光のうち約半分は、全反射面８３ａで反射した後、励起光用ファイバ１１の側とは逆側の端面８３ｃから出射され、対物レンズ１３によって試料上のある点に励起光スポットを作る。同時に、直方体プリズム８３内に入射した励起光のうち全反射面８３ａに到達しない約半分の励起光は、前記端面８３ｃから出射された後、対物レンズ１３によって試料上の別の点に励起光スポットを作る。

前記試料上の２つの励起光スポットで発生した蛍光は、対物レンズ１３を介して直方体プリズム８２の蛍光用ファイバ１２側とは逆側の端面８２ｂから直方体プリズム８２内に入射する。直方体プリズム８２内に入射した蛍光のうち約半分は、全反射面８２ａで反射した後、蛍光用ファイバ１２側の端面８２ｃから出射され、蛍光入射端１２ａから蛍光用ファイバ１２内に取り込まれる。同時に、直方体プリズム８２内に入射した蛍光のうち全反射面８２ａに到達しない約半分の蛍光は、前記端面８２ｃから出射され、蛍光入射端１２ａから蛍光用ファイバ１２内に取り込まれる。

本実施形態に係る蛍光検出装置８０もまた、図２〜４で説明した蛍光検出装置１０と同様に、蛍光の検出強度を高めることができるとともに、蛍光の測定精度を向上することができる。

図１０（ａ）〜（ｄ）は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置９０を説明するための図である。図１０（ａ）は、蛍光検出装置９０の全体の概略図を示す。図１０（ｂ）〜（ｄ）は、紙面に垂直な面Ｚ１〜Ｚ３（Ｚ３は試料内または試料上の面に相当）における蛍光検出装置９０の断面図を示す。これらの断面図は、搭載される複数のファイバと複数の反射板との相対的な位置関係と、それぞれのファイバによる対物レンズ１３を通じてのスポットの位置について説明するための図である。ここでは、対物レンズ１３は倒立像をなす光学系を想定している。図１０（ｄ）は、試料内または試料上の面に形成されるスポット位置を示す概略図である。

本実施形態に係る蛍光検出装置９０は、４本のファイバＡ〜Ｄと４つの反射板９１とを備える。各反射板９１は、両面に反射面が形成されている。４本のファイバＡ〜Ｄは、互いに光軸が平行になるよう配置されている。また、ファイバＡ〜Ｄは、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、四角形状に並べられている。４つの反射板９１は、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、それぞれ隣接するファイバ間に位置するように配置されている。隣接する２つの反射板９１のなす角は９０°である。

本実施形態では、例えばファイバＡを励起光用ファイバ、ファイバＢ，Ｃ，Ｄをそれぞれ、別個の波長の蛍光を集める蛍光用ファイバとすると、ファイバＡから出射した励起光は、共通の対物レンズ１３によって、いずれの反射板にも１回も反射されないで進む光線は図１０（ｄ）に示すスポットａに、いずれかの反射板に１回だけ反射されて進む光線はスポットｂまたはｃに、いずれの反射板に２回反射して進む光線はスポットｄにそれぞれ結像する。ファイバＢ，Ｃ，Ｄは反射板９１の作用により、それぞれスポットａ，ｂ，ｃ，ｄから発生する蛍光を対物レンズ１３の作用によって集めることができるので、４つの反射板９１を設けない場合よりも強い蛍光検出強度が得られることになる。また本実施形態に係る蛍光検出装置９０によれば、３波長の蛍光の同時計測が可能となる。ここでは倒立像をなす光学系からなる対物レンズ１３を用いた場合のケースを示しているが、正立像をなす光学系からなる対物レンズ１３を用いた場合は、図１０（ｄ）におけるスポットの位置を、ｄ→ａ，ｃ→ｂ，ｂ→ｃ，ａ→ｄと読み替えた場合のスポット位置関係となる。

さらに、本実施形態に係る蛍光検出装置９０によれば、ファイバＡ〜Ｄのうち２本から波長の異なる励起光を出射して任意の２波長の蛍光を測定することや、３本から波長の異なる励起光を出射して任意の１波長の蛍光を測定するといった計測も可能である。

図１１（ａ）〜（ｅ）は、本発明のさらに別の実施形態に係る蛍光検出装置９５を説明するための図である。図１１（ａ）は、蛍光検出装置９５の全体の概略図を示す。図１１（ｂ）〜（ｅ）は、紙面に垂直な面である面Ｚ１〜Ｚ３（Ｚ３は試料内または試料上の面に相当）における蛍光検出装置９５の断面図を示す。これらの断面図は、搭載される複数のファイバと複数の反射板との相対的な位置関係と、それぞれのファイバによる対物レンズ１３を通じてのスポットの位置について説明するための図である。ここでは、図における対物レンズ１３は倒立像をなす光学系を想定している。図１１（ｄ）は、試料内または試料上の面に形成されるスポット位置を示す概略図である。

本実施形態に係る蛍光検出装置９５は、３本のファイバＡ〜Ｃと３つの反射板９６とを備える。各反射板９６は、両面に反射面が形成されている。３本のファイバＡ〜Ｃは、互いに光軸が平行になるよう配置されている。また、ファイバＡ〜Ｃは、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、三角形状に並べられている。３つの反射板９６は、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、それぞれ隣接するファイバ間に位置するように配置されている。隣接する２つの反射板のなす角は１２０°である。

本実施形態では、例えばファイバＡを励起光用ファイバ、ファイバＢおよびＣをそれぞれ、別個の波長の蛍光を集める蛍光用ファイバとすると、ファイバＡから出射した励起光は、共通の対物レンズ１３によって、いずれの反射板にも１回も反射されないで進む光線は図１１（ｄ）に示すスポットａに、いずれかの反射板に１回だけ反射されて進む光線はスポットｂまたはｃにそれぞれ結像する。ファイバＢ，Ｃは反射板９１の作用により、それぞれスポットａ，ｂ，ｃから発生する蛍光を対物レンズ１３の作用によって集めることができるので、３つの反射板９６を設けない場合よりも強い蛍光検出強度が得られることになる。また本実施形態に係る蛍光検出装置９５によれば、２波長の蛍光の同時計測が可能となる。ここでは倒立像をなす光学系からなる対物レンズ１３を用いた場合のケースを示しているが、正立像をなす光学系からなる対物レンズ１３を用いた場合は、図１１（ｅ）に示したスポットの位置となる。

図１０（ａ）〜（ｄ）に示す実施形態ではファイバ数を４本、図１１（ａ）〜（ｅ）に示す実施形態ではファイバ数を３本としたが、ファイバ数を５，６，７・・・と増やすことも可能である。ファイバ数をｎ本とするとき、ｎの２倍の数の反射面が必要となる。反射部材として両面に反射面が形成された反射板を用いる場合には、ｎ個の反射板が必要となる。この場合、ｎ本のファイバは、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、ｎ角形の各頂点に一つずつ配置される。そして、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、隣接するファイバ間に２つの反射面が位置するように反射板が配置される。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

１０、５０、６２、７０、８０、９０、９５ 蛍光検出装置、 １１ 励起光用ファイバ、 １２ 蛍光用ファイバ、 １３ 対物レンズ、 １４、９１、９６ 反射板、 ５１ 励起光源、 ５２ 集光レンズ、 ５３ 励起光フィルタ、 ５４ ＰＭＴ、 ５５ 蛍光フィルタ、 ５６ セル、 ６０ 蛍光フィルタ、 ６１ レンズ間反射板、７１ 対物反射板、 ８１ 反射部材、 ８２、８３ 直方体プリズム。

Claims (16)

1. 被検出物に対して励起光を照射し、該照射により前記被検出物から発生した蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
   励起光を出射する励起光出射端を有する励起光用ファイバと、
   蛍光を入射する蛍光入射端を有する蛍光用ファイバと、
   前記励起光出射端および前記蛍光入射端と、前記被検出物との間に配置された対物レンズと、
   前記励起光出射端および前記蛍光入射端と前記対物レンズとの間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有する反射部材と、を備え、
   前記反射部材の２つの反射面が、前記励起光用ファイバの光軸と前記蛍光用ファイバの光軸との間に位置していることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記反射部材の２つの反射面が、前記励起光用ファイバの光軸および前記蛍光用ファイバの光軸と平行であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記２つの反射面間の中央が、前記励起光用ファイバの光軸と前記蛍光用ファイバの光軸間の中央に位置していることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記反射部材は、前記２つの反射面が前記励起光出射端および前記蛍光入射端から前記対物レンズの入射面の直前まで延在するように配置されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の蛍光検出装置。
5. 前記反射部材は、前記励起光出射端および前記蛍光入射端を超えて、励起光用ファイバと蛍光用ファイバとの間に延在することを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
6. 前記反射部材は、表裏両面に反射面を有する反射板であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の蛍光検出装置。
7. 前記反射部材は、平坦面同士が所定距離離間して配置された２つの直方体プリズムを備えることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の蛍光検出装置。
8. 前記対物レンズと前記被検出物との間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有する対物反射部材をさらに備えることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の蛍光検出装置。
9. 前記対物レンズは、１枚のレンズまたは複数のレンズの組み合わせから構成されることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の蛍光検出装置。
10. 前記対物レンズは、２つのレンズと、当該２つの前記レンズ間に配置された、互いに逆方向を向いた２つの反射面を有するレンズ間反射部材とを備えることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の蛍光検出装置。
11. 前記蛍光入射端の前に蛍光選択フィルタをさらに備えることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の蛍光検出装置。
12. 前記励起光出射端の前に励起光選択フィルタをさらに備えることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の蛍光検出装置。
13. 被検出物に対して励起光を照射し、該照射により前記被検出物から発生した蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
    励起光を出射する励起光出射端を有する、一または複数の励起光用ファイバと、
    蛍光を入射する蛍光入射端を有する、一または複数の蛍光用ファイバと、
    前記励起光出射端および前記蛍光入射端と、前記被検出物との間に配置された対物レンズと、
    前記励起光出射端および前記蛍光入射端と前記対物レンズとの間に配置された反射部材であって、前記励起光用ファイバと前記蛍光用ファイバを合わせた数をｎとしたときに、ｎの２倍の数の反射面を有する反射部材と、を備え、
    前記励起光用ファイバと前記蛍光用ファイバは、互いに光軸が平行になるよう配置されており、
    前記励起光用ファイバと前記蛍光用ファイバは、ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、ｎ角形の各頂点に一つずつ配置されており、
    ファイバ端面をファイバの光軸方向から見たときに、隣接するファイバ間には２つの前記反射面が配置されている、
    ことを特徴とする蛍光検出装置。
14. 請求項１から１３のいずれかに記載の蛍光検出装置を用いて被検出物の蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
15. 蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、前記対物レンズの作動距離を調整するステップを備えることを特徴とする請求項１４に記載の蛍光検出方法。
16. 蛍光に基づいて得られる信号が最大になるように、および／または蛍光に基づいて得られる信号のばらつきが最小になるように、前記励起光用ファイバおよび／または前記蛍光用ファイバの光軸と被検出物の表面とのなす角度を調整するステップを備えることを特徴とする請求項１４または１５に記載の蛍光検出方法。

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