CN102084000B - 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的主题涉及通过检测分离自受试者生物样本的微泡中的生物标志物来辅助诊断、预后、监测和评价该受试者的疾病或其他医学病况的方法。此外，所公开的主题涉及通过确定生物样本内的微泡浓度来诊断、监测疾病的方法；涉及通过给予包含核酸或蛋白质的微泡而将所述核酸或蛋白质都递送到靶标的方法；涉及通过将不含微泡或富含微泡的流体部分引入患者而实施体液输注的方法。

Description

微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年2月1日提交的美国临时申请61/025,536和于2008年9月26日提交的美国临时申请61/100,293的优先权，其中每篇专利申请以其整体通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在由国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)颁发的资助金NCICA86355和NCICA69246的政府支持下形成的。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
本发明涉及医学诊断、患者监控、治疗效力评价、核酸和蛋白质递送以及输血等领域。
背景技术
成胶质细胞瘤是高度恶性的脑肿瘤，尽管进行了大量的研究和临床工作，但是该肿瘤的预后较差(Louisetal.，2007)。这种肿瘤的侵入本性使得不可能完全手术切除，并且平均存活时间仅为约15个月(Stuppetal.，2005)。成胶质细胞瘤细胞以及许多其他肿瘤细胞具有使间质环境转变为对其自身有利的显著能力。肿瘤细胞直接改变周围的正常细胞以有利于肿瘤细胞的生长、侵入、化学抗性、免疫逃避和转移(Mazzoccaetal.，2005；Muerkosteretal.，2004；Singeretal.，2007)。肿瘤细胞还抢夺正常脉管系统并刺激迅速形成新的血管从而向肿瘤提供营养(CarmelietandJain，2000)。尽管免疫系统初始可以抑制肿瘤生长，但是经常通过免疫抑制途径的肿瘤激活而逐步钝化(Gabrilovich，2007)。
细胞脱落的小微泡称为外来体(Theryetal.，2002)。外来体据报道为具有约30-100nm的直径并且在正常和病理学状况下从许多不同细胞类型上脱落(Theryetal.，2002)。这些微泡最开始被描述为从成熟网织红细胞的细胞表面上弃去转铁蛋白-受体的机制(PanandJohnstone，1983)。通过(胞)内体膜向内出芽而形成外来体，从而产生了随后与质膜融合的胞内多泡体(MVB)，并向外部释放外来体(Theryetal.，2002)。然而，现在有证据表明外来体更直接的释放。据称，某些细胞如JurkatT细胞直接通过质膜向外出芽而脱落外来体(Boothetal.，2006)。由细胞脱落的所有膜囊在本文中统称为微泡。
据称，果蝇(Drosophilamelanogaster)中的微泡(所谓的阿尔戈体(argosome))含有诸如无翅蛋白的形态发生素并且通过发育中的果蝇胚胎中的成虫盘上皮在较长的距离上移动(Grecoetal.，2001)。据称，在精液中发现的微泡(称作前列腺小体)具有广泛的功能，包括促进精子运动、稳定顶体(acrosome)反应、辅助免疫抑制和抑制血管生成(Delvesetal.，2007)。另一方面，据称由恶性前列腺细胞释放的前列腺小体促进血管生成。据称，微泡转移蛋白质(Macketal.，2000)并且近期研究表明从不同细胞系分离的微泡也可以含有信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)，并且可以将mRNA转移到其他细胞类型(Baj-Krzyworzekaetal.，2006；Valadietal.，2007)。
据称来源于B细胞和树突细胞的微泡具有有效的体内免疫-刺激和抗肿瘤作用并且已经用作抗肿瘤疫苗(Chaputetal.，2005)。据称树突细胞来源的微泡含有对于T细胞活化所必需的共刺激蛋白，而大多数肿瘤细胞来源的微泡不含有该蛋白(WieckowskiandWhiteside，2006)。从肿瘤细胞分离的微泡可以起到抑制免疫反应和加速肿瘤生长的作用(Claytonetal.，2007；Liuetal.，2006a)。乳腺癌微泡可以刺激血管生成，而血小板来源的微泡可以促进肿瘤发展和肺癌细胞转移(Janowska-Wieczoreketal.，2005；Millimaggietal.，2007)。
通过积累促进无限制细胞生长的遗传改变而引发癌。已表明每个肿瘤平均具有约50-80个在非肿瘤细胞中不存在的突变(Jonesetal.，2008；Parsonsetal.，2008；Woodetal.，2007)。目前检测这些突变谱(曲线，profile)的技术包括活检样本分析和对在体液(如血液)中循环的突变肿瘤DNA片段的非侵入式分析(Diehletal.，2008)。前一种方法是侵入性的、复杂的并且可能对受试者造成伤害。而后一种方法由于体液中突变癌DNA拷贝数极低，因而天生缺乏敏感性(Gormallyetal.，2007)。因此，癌诊断所面临的一个挑战是开发可以通过非侵入性方式检测不同阶段肿瘤细胞的诊断方法，并且该方法具有高灵敏度和特异性。还已表明基因表达谱(编码mRNA或微小RNA)可以区别癌性和非癌性组织(Jonesetal.，2008；Parsonsetal.，2008；Schetteretal.，2008)。然而，目前检测基因表达谱的诊断技术需要组织的侵入性活检。一些活检程序导致高风险并且可能是有害的。此外，在活检程序中，从有限区域获取组织样本并且该组织样品可能产生假阳性或假阴性，特别是在异质肿瘤和/或分散在正常组织内的肿瘤中。因此，高度需要用于检测生物标志物的非侵入性并且灵敏的诊断方法。
发明内容
一般地，本发明是一种用于检测受试者中是否存在包含在微泡中的各种各样的生物标志物的新型方法，借此辅助诊断、监测和评价与微泡生物标志物有关的疾病、其他医学病况(病症，condition)和治疗效力。
本发明的一个方面是用于辅助诊断或监测受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：a)从来自受试者的生物样本中分离微泡部分；和b)检测该微泡部分内是否存在生物标志物，其中生物标志物与疾病或其他医学病况有关。这些方法可以进一步包括将检测步骤的结果与对照进行比较的步骤或多个步骤(例如，将样本中检测的一个或多个生物标志物的量与一个或多个对照水平进行比较)，其中如果检测步骤的结果与对照相比具有可测量的差异，则将该受试者诊断为患有所述疾病或其他医学病况(例如，癌)。
本发明的另一个方面是一种辅助评价在受试者中的治疗效力的方法，其包括以下步骤：a)从受试者的生物样本中分离微泡部分(组分，fraction)；和b)检测该微泡部分内是否存在生物标志物，其中所述生物标志物与疾病或其他医学病况的治疗效力有关。该方法可以进一步包括在一段时间内提供一系列来自受试者的生物样本的步骤。另外，该方法可以进一步包括确定来自所述一系列生物样本每一个中的检测步骤结果的任何可测量变化的步骤或多个步骤(例如，一个或多个检测的生物标志物的量)，从而评价所述疾病或其他医学病况的治疗效力。
在本发明上述方面的某些优选实施方式中，来自受试者的生物样本为体液样本。特别优选的体液为血液和尿液。
在本发明上述方面的某些优选实施方式中，所述方法进一步包括分离来源于特定类型细胞(例如，癌或肿瘤细胞)的选择性微泡部分。另外，选择性微泡部分可以基本由尿液微泡(泌尿微泡，urinarymicrovesicle)组成。
在本发明上述方面的某些实施方式中，与疾病或其他医学病况有关的生物标志物为i)核酸物质；ii)一种或多种核酸的表达水平；iii)核酸变体；或iv)任何前述标志物的组合。这样的生物标志物的优选实施方式包括信使RNA、微小RNA、DNA、单链DNA、互补DNA和非编码DNA。
在本发明上述方面的某些实施方式中，疾病或其他医学病况为肿瘤性疾病或病况(例如，成胶质细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤和结直肠癌)、代谢疾病或病况(例如，糖尿病、炎症、围产期病况或与铁代谢有关的疾病或病况)、移植后病况或胎儿病况。
本发明的另一个方面是一种辅助诊断或监测受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：a)从受试者获得生物样本；和b)确定该生物样本内的微泡的浓度。
本发明的另一个方面是一种用于将核酸或蛋白质递送到个体中的靶细胞的方法，其包括以下步骤：将含有核酸或蛋白质的微泡或将产生这样的微泡的一个或多个细胞给予该个体，以使这些微泡进入所述个体的靶细胞。在本发明这一方面的优选实施方式中，将微泡被递送到脑细胞。
本发明的另一个方面是一种用于实施体液(例如，血液、血清或血浆)输注的方法，其包括以下步骤：获得完全不含或基本完全不含微泡的供体体液的部分，或从特定细胞类型(例如，肿瘤细胞)获得完全不含或基本完全不含微泡的部分，并且将不含微泡的部分引入患者。本发明的一个相关方面是是物质的组合物，所述物质包括完全不含或基本完全不含微泡的供体体液样本(例如，血液、血清或血浆)，或来自特定细胞类型的完全不含或基本完全不含微泡的样本。
本发明的另一个方面是一种用于实施体液(例如，血液、血清或血浆)输注的方法，其包括以下步骤：获得供体体液的富含微泡的部分，和将富含微泡的部分引入患者。在优选的实施方式中，所述部分富含有来源于特定细胞类型的微泡。本发明的一个相关方面是物质的组合物，所述物质包括富含微泡的体液样本(例如，血液、血清或血浆)。
本发明的另一个方面是一种辅助鉴别与疾病或其他医学病况有关的新型生物标志物的方法，其包括以下步骤：从受试者获得生物样本；从该样本分离微泡部分；和检测该微泡部分内的核酸物质、它们各自的表达水平或浓度、核酸变体、或它们的组合。
现在将详细说明本发明的各个方面和实施方式。应理解在不背离本发明范围的前提下可以对细节进行改变。另外，除非本文另外要求，否则单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。
出于描述和公开的目的，所有提到的专利、专利申请和出版物均明确地通过引用并入本文，例如，在可以结合本发明使用的出版物中描述的方法。提供这些出版物仅用于它们在本申请的申请日之前的公开内容。在这方面不应解释为承认本发明的发明人没有权利通过在先发明或出于任何其他原因使本发明提到这样的披露内容之前。所有有关日期的说明或有关这些文献内容的表示均基于申请人可获得的信息并且不构成对这些文献的有关日期或内容的正确性的任何承认。
附图说明
图1：成胶质细胞瘤细胞产生含有RNA的微泡。(a)原代成胶质细胞瘤细胞的扫描电子显微镜图像(图例＝10μm)。(b)高倍放大图显示了细胞表面上的微泡。囊泡的大小不同，其直径在约50nm至约500nm之间(图例＝1μm)。(c)显示了从用RNA酶A处理或未处理的微泡中提取的总RNA的量的曲线。该量用在260nm波长(x轴)的吸光度值(Abs，y轴)表示。实验重复5次，并且示出了代表性曲线。(d)显示了从原代成胶质细胞瘤细胞提取的总RNA的尺寸分布的生化分析仪数据和(e)显示了从分离自原代成胶质细胞瘤细胞的微泡提取的总RNA的尺寸分布的生化分析仪数据。25nt峰代表内标。(d)中的两个主峰(箭头)代表18S(左箭头)和28S(右箭头)核糖体RNA。从微泡提取的RNA中没有核糖体峰(e)。(f)由原代成胶质细胞瘤细胞分泌的微泡的透射电子显微镜图(图例＝100nm)。
图2：微泡RNA的分析。图2(a)和2(b)为在来自两个不同实验的微泡中的mRNA水平和供体成胶质细胞瘤细胞中断mRNA水平的散布图。线性回归显示供体细胞中的mRNA水平相对于微泡的相关性不好。图2(c)和2(d)为在两种不同供体细胞或两种不同微泡制备物中的mRNA水平。与图2(a)和2(b)相比，线性回归显示供体细胞之间(图2(c))或微泡(图2(d))之间的mRNA水平密切相关。
图3：微泡DNA的分析。
a)采用来自在核酸提取前用DNA酶处理的外来体的DNA模板进行GAPDH基因扩增。泳道鉴别如下：
1.100bpMW梯型(ladder)
2.阴性对照
3.来自GBM20/3细胞的基因组DNA对照
4.来自正常血清外来体的DNA(不含肿瘤细胞的对照)
5.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体DNA
6.来自原代髓母细胞瘤细胞(D425)的外来体DNA
b)采用来自未用DNA酶预先处理的外来体的DNA模板进行GAPDH基因扩增。泳道鉴别如下：
1.100bpMW梯型
2.来自原代黑素瘤细胞0105的DNA
3.来自黑素瘤0105的外来体DNA
4.阴性对照
5.来自原代GBM20/3的cDNA(阳性对照)
c)人内源性反转录病毒K基因的扩增。泳道鉴别如下：
1.100bpMW梯型
2.来自髓母细胞瘤(medulloblastoma)D425a的外来体DNA
3.来自髓母细胞瘤D425b的外来体DNA
4.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体DNA
5.来自正常人血清的外来体DNA
6.来自GBM20/3的基因组DNA
7.阴性对照
d)腱糖蛋白(tenascin)C基因的扩增。所列泳道鉴别如下：
1.100bpMW梯型
2.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体
3.来自血清(不含肿瘤细胞的个体A)的外来体
4.来自血清(不含肿瘤细胞的个体B)的外来体
5.来自原代髓母细胞瘤细胞D425的外来体
e)转座细胞系1(transposableLine1)元件的扩增。泳道鉴别如下：
1.100bpMW梯型
2.来自正常人血清的外来体DNA
3.来自正常人成纤维细胞的外来体DNA
4.来自髓母细胞瘤D425a的外来体DNA
5.来自髓母细胞瘤D425b的外来体DNA
f)DNA在来自D425髓母细胞瘤细胞的外来体中存在。泳道鉴别如下：
1.100bp标志物
2.未用DNA酶处理的D425
3.采用DNA酶处理的D425
4.1kb标志物
g)使用RNA皮可芯片(RNApicochip)的单链核酸分析。上图：未用DNA酶处理的纯化的DNA；下图：采用DNA酶处理的纯化的DNA。上图中的箭头指示检测到的核酸。25nt处的峰为内标。
h)来自原代髓母细胞瘤D425的外来体中所包含的核酸的分析。上图：通过RNA皮级芯片检测的单链核酸。下图：通过DNA1000芯片检测的双链核酸。上图中的箭头指示检测到的核酸。两个峰(15和1500bp)为内标。
i)使用RNA皮可芯片对不同来源的外来体DNA的分析。上图：从来自成胶质细胞瘤细胞的外来体提取的DNA。下图：从来自正常人成纤维细胞的外来体提取的DNA。
图4：当包括血清外来体分离步骤时，来自血清的胞外RNA提取更有效。a)来自血清的外来体RNA。b)直接全血清提取。c)空孔。箭头指示样本中检测到的RNA。
图5：微泡和起源细胞之间的基因表达水平的比较。与微泡来源于的细胞相比，发现微泡中有3426个基因，差异分布超过了5倍(p值＜0.01)。
图6：微泡RNA的本体(ontological)分析。(a)饼形图显示了微泡中含量最丰富的500种mRNA物质的生物学过程本体。(b)显示了属于与肿瘤生长相关的本体的微泡RNA的密度的曲线图。x轴代表本体中存在的mRNA转录本的数目。阵列上的平均强度水平为182。
图7：mRNA水平的聚簇图(簇状图，clusteringdiagram)。分析了细胞系中以及从这些细胞系培养基中分离的外来体中mRNA表达谱的微阵列数据并且生成了表达谱的聚簇。RNA物质的标记如下：
20/3C-1：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复(arrayreplicate)1
20/3C-2：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复2
11/5C：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA
0105C：黑素瘤0105细胞RNA
0664C：黑素瘤0664细胞RNA
0664E-1：黑素瘤0664外来体RNA，阵列重复1
0664E-2：黑素瘤0664外来体RNA，阵列重复2
0105E：黑素瘤0105外来体RNA
20/3E：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA
11/5E-1：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复1
11/5E-2：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复2
GBM：成胶质细胞瘤。刻度表示聚簇之间的距离。
图8：来自血清的微泡含有微小RNA。使用定量miRNART-PCR分析了从两位不同患者的微泡和成胶质细胞瘤细胞(GBM1和GBM2)中提取的成熟miRNA的水平。循环阈值(Ct)用平均值±SEM表示(n＝4)。
图9：微小RNA水平的聚簇图。分析了细胞系中以及从这些细胞系培养基中分离的外来体中微小RNA表达谱的微阵列数据并且生成了表达谱的聚簇。RNA种类的标记如下：
0664C-1：黑素瘤0664细胞RNA，阵列重复1
0664C-2：黑素瘤0664细胞RNA，阵列重复2
0105C-1：黑素瘤0105细胞RNA，阵列重复1
0105C-2：黑素瘤0105细胞RNA，阵列重复2
20/3C-1：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复1
20/3C-2：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复2
11/5C-1：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA，阵列重复1
11/5C-2：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA，阵列重复2
11/5E-1：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复1
11/5E-2：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复2
20/3E-1：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA，阵列重复1
20/3E-2：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA，阵列重复2
0664E：黑素瘤0664外来体RNA
0105E-1：黑素瘤0105外来体RNA，阵列重复1
0105E-2：黑素瘤0105外来体RNA，阵列重复2
GBM：成胶质细胞瘤。刻度表示聚簇之间的距离。
图10：血清微泡中微小RNA-21的表达水平与神经胶质瘤有关。示出了柱状图，其中左侧为正常对照血清，右侧为神经胶质瘤血清。使用定量RT-PCR测量来自成胶质细胞瘤患者血清和正常患者对照血清的外来体中的微小RNA-21(miR-21)的水平。成胶质细胞瘤血清显示Ct值减小了5.4，相当于miR21增加了约40倍(2ΔCt)。将每个样本的miR21水平归一化为GAPDH(n＝3)。
图11：使用巢式RT-PCR检测肿瘤样本和相应血清外来体中的EGFRvIIImRNA。野生型EGFRPCR产物在1153bp处显现为条带，而EGFRvIIIPCR产物在352bp处显现为条带。包括GAPDHmRNA的RT-PCR作为阳性对照(226bp)。用星号表示认为是EGFRvIII阳性的样本。患者11、12和14在肿瘤样本中仅显示出EGFRvIII的弱扩增，但当加载更多样本时其变得明显。
图12：在来自52个正常对照血清的微泡上实施EGFRvIII的巢式RT-PCR。在正常对照血清中从未发现EGFRvIII(352bp)。包括GAPDH(226bp)的PCR作为对照。
图13：可以在来自人血清的外来体内检测海帕西啶(肝抗菌肽，hepcidin)mRNA。A)通过Agilent生化分析仪(AgilentBioanalyzer)产生的假凝胶。B)Agilent生化分析仪对阳性对照(样本1)产生的原始图。C)Agilent生化分析仪对阴性对照(样本2)产生的原始图。D)Agilent生化分析仪对外来体(样本3)产生的原始图。
图14：尿液外来体的分离和尿液外来体内的核酸的鉴别。(a)肾小管细胞中含有许多小“外来体”的多泡体(MVB)的电子显微镜图像。(b)分离的尿液外来体的电子显微镜图像。(c)通过Agilent生化分析仪对尿液外来体中所含的RNA转录本的分析。鉴别出大量的RNA物质，但是没有18S和28S核糖体RNA。(d)通过PCR对尿液外来体中各种RNA转录本的鉴别。由此鉴别的转录本为：水通道蛋白1(Aquaporin1)(AQP1)；水通道蛋白2(AQP2)；Cubulin(CUBN)；兆蛋白(Megalin)(LRP2)；精氨酸血管加压素受体2(argininevasopressinreceptor2)(AVPR2)；钠/氢交换器3(SLC9A3)；V-腺苷三磷酸酶B1亚基(ATP6V1B1)；去氧肾上腺素(Nephrin)(NPHS1)；肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)(NPHS2)；和氯离子通道3(CLCN3)。自上而下，分子量(MW)泳道中的五个条带对应于1000、850、650、500、400、300个碱基对片段。(e)来自尿液样本的外来体核酸的生化分析仪图。数字表示人个体的编号。(f)显示使用(e)中的核酸提取物，用不同引物对产生的PCR产物的假凝胶。House(框)表示肌动蛋白基因，而肌动蛋白引物来自Ambion(TX，USA)。+ve对照表示使用来自Ambion(TX，USA)的人肾cDNA作为模板的PCR，而-ve对照表示不使用核酸模板的PCR。(g)假凝胶照片，其显示了在核酸提取前经由使用和不使用DNA酶处理的外来体的PCR对肌动蛋白基因cDNA进行的阳性鉴别。(h)显示从人尿液外来体分离的核酸量的生化分析仪图。
图15：尿液外来体中前列腺癌生物标志物的分析。(a)凝胶照片，其显示了TMPRSS2-ERG基因的PCR产物以及该PCR产物的消化片段。P1和P2分别表示来自患者1和患者2的尿液样本。对于每个样品，未消化的产物在左侧泳道而消化的产物在右侧泳道。MWM表示具有MW标志物的泳道。在图的右侧指出了条带的大小(未消化和消化的)。(b)凝胶照片，其显示了PCA3基因的PCR产物和该PCR产物的消化片段。P1、P2、P3和P4分别表示来自患者1、患者2、患者3和患者4的尿液样品。对于每个样品，未消化的产物在左侧泳道而消化的产物在右侧泳道。MWM表示具有MW标志物的泳道。在图的右侧指出了条带的大小(未消化和消化的)。(c)在(a)和(b)中出现的患者信息和数据的总结。TMERG表示TMPRSS2-ERG融合基因。
图16：BRAFmRNA包含在由黑素瘤细胞脱落的微泡内。(a)电泳凝胶照片，其显示BRAF基因扩增的RT-PCR产物。(b)电泳凝胶照片，其显示GAPDH基因扩增的RT-PCR产物。泳道以及它们所对应的样本为如下：泳道#1-100bp分子量标志物；泳道#2-YUMEL-01-06exo；泳道#3-YUMEL-01-06细胞；泳道#4-YUMEL-06-64exo；泳道#5.YUMEL-06-64细胞；泳道#6.M34exo；泳道#7-M34细胞；泳道#8-成纤维细胞；泳道#9-阴性对照。参考术语“exo”意思是RNA是从培养基中的外来体提取的。参考术语“细胞”意思是RNA是从培养的细胞提取的。YUMEL后的数字表示特定批次YUMEL细胞系的鉴别。(c)来自YUMEL-01-06exo的PCR产物的测序结果。来自YUMEL-01-06细胞、YUMEL-06-64exo和YUMEL-06-64细胞的结果与来自YUMEL-01-06exo的结果相同。(d)来自M34exo的PCR产物的测序结果。来自M34细胞的结果与来自M34exo的结果相同。
图17：成胶质细胞瘤微泡可以将功能性RNA递送到HBMVEC。(a)纯化的微泡用膜染料PKH67(绿色)标记并将其加入HBMVEC。在1小时内，将微泡内化到内含体-样结构中。(b)从稳定表达Gluc的成胶质细胞瘤细胞分离微泡。RNA提取以及Gluc和GAPDHmRNA的RT-PCR表明两者均整合到微泡中。(c)然后，将微泡加入HBMVEC并培育24小时。在微泡加入后，在0、15和24小时测量培养基中的Gluc活力，并将其归一化为微泡中的Gluc活力。结果表示为平均值±SEM(n＝4)。
图18：成胶质细胞瘤微泡刺激体外血管生成并且含有血管生成蛋白。(a)在仅基础培养基(EBM)和添加了GBM微泡(EBM+MV)或血管生产因子(EGM)的基础培养基中的MatrigelTM上培养HBMVEC。16小时后测量小管生成，表示为以与EBM中生长的细胞相比较的平均小管长度±SEM(n＝6)。(b)在人血管生成抗体阵列上分析了来自原代成胶质细胞瘤细胞中的总蛋白以及来自这些细胞的微泡(MV)。(c)扫描该阵列并用图像J软件(ImageJsoftware)分析强度(n＝4)。
图19：从原代成胶质细胞瘤细胞中分离的微泡促进U87成胶质细胞瘤细胞系的增殖。将100,000个U87细胞接种到24孔板的孔中，并允许在(a)正常生长培养基(DMEM-5％FBS)或(b)添加了125μg微泡的正常生长培养基中，生长三天。(c)3天后，未添加微泡的细胞扩大到480,000个，而添加微泡的细胞扩大到810,000个。NC表示在正常对照培养基中生长的细胞，而MV表示在添加了微泡的培养基上生长的细胞。结果表示为平均值±SEM(n＝6)。
具体实施方式
微泡是由真核细胞脱落到或由质膜出芽到细胞外部的。这些膜囊的尺寸是不均匀的，其直径范围在约10nm至约5000nm。在本领域中，将通过胞内多泡体的胞吐作用释放的小微泡(直径为约10至1000nm，并且更经常为30至200nm)称为“外来体”。本文中所描述的方法和组合物同等地可适用于所有大小的微泡；优选30至800nm；并且更优选30至200nm。
在一些文献中，术语“外来体”还表示含有核糖核酸外切酶的蛋白质复合体，该核糖核酸外切酶参与mRNA降解以及小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)的加工处理(Liuetal.，2006b；vanDijketal.，2007)。这样的蛋白质复合体不具有膜并且不是如本文所使用那些术语的“微泡”或“外来体”。
作为诊断和/或预后工具的外来体
本发明的某些方面是基于以下惊人的发现，即可以从成胶质细胞瘤患者的血清中分离成胶质细胞瘤来源的微泡。这来源于脑中细胞的微泡存在于受试者的体液中的首次发现。在该发现之前，还不知道成胶质细胞瘤细胞是否产生微泡或这样的微泡是否可以穿过血脑屏障而进入到身体的其他部分。发现这些微泡含有与肿瘤细胞有关的突变mRNA。这些微泡还含有微小RNA(miRNA)，其被发现在成胶质细胞瘤中含量丰富。还发现成胶质细胞瘤来源的微泡有效地促进了培养基中的原代人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)的血管生成特征。这种血管生成作用至少部分是通过存在于微泡中的血管生成蛋白介导的。这些微泡中发现的核酸以及微泡的其他内含物如管生成蛋白，通过提供遗传谱而可以用作用于肿瘤诊断、表征和预后的有价值的生物标志物。通过分析在肿瘤发展期间是否获得其他突变以及某些突变的水平是否随时间或随治疗过程而提高或降低，这些微泡内的内含物还可以用于监测肿瘤随时间的发展。
本发明的某些方面基于微泡是由肿瘤细胞分泌并在体液中循环的发现。微泡的数目随肿瘤生长而增加。体液中微泡的浓度与相应肿瘤负荷成比例。肿瘤负荷越大，则体液中微泡的浓度越高。
本发明的某些方面基于另一惊人的发现，即受试者体液中的大多数胞外RNA包含在微泡中并且因此被保护而不受核糖核酸酶的降解。如实施例3中所证实的，可以从微泡中回收总血清中超过90％的胞外RNA。
本发明的一个方面涉及通过确定生物样本中的微泡浓度而用于检测、诊断、监测、治疗或评价受试者的疾病或其他医学病况的方法。可以使用未首先分离微泡的生物样本或通过首先分离微泡的生物样本来实施该确定。
本发明的另一个方面涉及用于检测、诊断、监测、治疗或评价受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：从受试者体液中分离外来体，和分析在该外来体中包含的一种或多种核酸。核酸定性和/或定量地进行分析，并将结果与从患有或未患有该疾病或其他医学病况的一位或多位其他受试者预期或获得的结果相比较。如与一位或多位其他个体相比，存在受试者的微泡核酸含量差异，可以指示该受试者中是否存在该疾病或其他医学病况，指示该疾病或其他医学病况的发展(例如，肿瘤尺寸和肿瘤恶性程度的变化)或指示对该疾病或其他医学病况的易患性。
事实上，本文所描述的分离方法和技术提供了以下至今未实现的优势：1)选择性分析疾病或肿瘤-特异性核酸的机会，这可以通过将疾病或肿瘤-特异性微泡与液体样本内其他微泡分离开得以实现；2)与通过直接从液体样本中提取核酸所获得的得率/完整性相比，核酸物质的得率显著较高，并且序列完整性也较高；3)可量测性，例如，检测表达水平低的核酸，可以通过从大量血清中使更多微泡成颗粒而提高灵敏度；4)更纯的核酸，因为在核酸提取步骤前从微泡颗粒中排除了蛋白质和脂质、死细胞碎片以及其他可能的污染物和PCR抑制剂；和5)由于微泡颗粒的体积比初始血清要小得多，因此核酸提取方法的选择更多，从而有可能使用小体积柱过滤器从这些微泡颗粒中提取核酸。
优选从采自受试者体液的样本分离微泡。如本文所使用的，“体液”表示从受试者身体的任何位置，优选地为外周位置分离的液体样本，其包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、胸膜液、乳头吸出物(nippleaspirate)、淋巴液、呼吸液、肠道液和泌尿生殖道液、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统的液体、精液、脑脊髓液、器官内系统液、腹水液、肿瘤囊肿液、羊水和它们的组合。
术语“受试者”旨在包括表现或预计具有微泡的所有动物。在具体实施方式中，受试者为哺乳动物、人类或非人类的灵长类动物、狗、猫、马、牛、其他家畜或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠等)。术语“受试者”和“个体”在本文中可以互换使用。
在本领域中，从生物样本中分离微泡的方法是已知的。例如，在Raposo等人(Raposoetal.，1996)的论文中说明了差速离心的方法，并且在本文的实施例部分中详细说明了类似的方法。美国专利No.6899863和6812023中描述了阴离子交换色谱和/或凝胶渗透色谱的方法。美国专利No.7198923中描述了蔗糖密度梯度电泳或细胞器电泳的方法。在(TaylorandGercel-Taylor，2008)中描述了磁力活化细胞分选(MACS)的方法。在(Cheruvankyetal.，2007)中描述了纳米膜超滤浓缩器的方法。优选地，可以通过新近开发的使用独特微流体平台的微芯片技术从受试者体液中鉴别和分离微泡，从而有效并且选择性地分离肿瘤来源的微泡。如在Nagrath等人(Nagrathetal.，2007)的论文中所描述的，可以使用该论文中所教导的捕获和分离的类似原理调整该技术以适于鉴别和分离微泡。以上每篇参考文献对其这些方法的教导通过引用并入本文。
在一种实施方式中，针对来源于特定细胞类型例如：肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝、胎盘、胎儿细胞的微泡富集从体液分离的微泡。由于微泡经常携带来自其供体细胞的表面分子，如抗原，因此可以使用表面分子来鉴别、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的微泡(Al-Nedawietal.，2008；TaylorandGercel-Taylor，2008)。以这种方式，可以分析来源于不同细胞群体的微泡的核酸内含物。例如，肿瘤(恶性和非恶性)微泡携带肿瘤相关表面抗原并且可以经由这些特异性肿瘤相关表面抗原进行检测、分离和/或富集。在一个实施例中，所述表面抗原为上皮细胞粘附分子(EpCAM)，它对来自肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌以及肝起源癌的微泡具有特异性，但是对血液细胞起源的癌症不具有特异性。(Balzaretal.，1999；Wentetal.，2004)。在另一个实施例中，表面抗原为CD24，它是对尿液微泡特异的糖蛋白(Kelleretal.，2007)。在另一个实施例中，表面抗原选自CD70分子、癌胚抗原(CEA)、EGFR、EGFRvIII及其他变体、Fas配基、TRAIL、转铁蛋白受体、p38.5、p97和HSP72的组。另外，肿瘤特异性微泡可以以缺少表面标志物(如CD80和CD86)为特征。
可以通过例如，使用对所期望表面抗原特异的抗体、适体、适体类似物或分子印迹聚合物实现对来自特定细胞类型的微泡的分离。在一种实施方式中，所述表面抗原对癌类型特异。在另一种实施方式中，所述表面抗原对不必需是癌性的细胞类型特异。在美国专利No.7198923中提供了基于细胞表面抗原的微泡分离方法的一个实例。例如，如在美国专利No.5840867和5582981、WO/2003/050290以及Johnson等人的出版物(Johnsonetal.，2008)中所描述的，适体以及它们的类似物特异地结合表面分子并且可以用作用于收集细胞类型特异性微泡的分离工具。例如，如在美国专利No.6525154、7332553和7384589以及Bossi等人的出版物(Bossietal.，2007)中所描述的，分子印迹聚合物还特异地识别表面分子并且是用于回收和分离细胞类型特异性微泡的工具。以上每篇参考文献以对这些方法的教导通过引用并入本文。
在分析前，从外来体提取核酸可能是有益的或是另外所希望的。可以使用本领域中熟知的任何数量的程序从微泡中分离核酸分子，对特定生物样本选择适合的具体分离程序。在本文的实施例部分中提供了提取方法的实例。在一些情况下，使用一些技术也可能在不从微泡进行提取的情况下进行核酸分析。
在一种实施方式中，在不进行扩增步骤下直接分析提取的核酸，包括DNA和/或RNA。可以使用不同的方法进行直接分析，所述方法包括，但不限于，纳米弦技术(nanostringtechnology)。纳米弦技术通过将颜色编码的荧光报告子连接到各个靶分子上从而使得能够鉴别和定量生物样本中的单个靶分子。该方法与通过扫描条型码测量库存量的概念类似。可以用数百个或甚至数千个不同的代码制定报告子从而允许高度复杂的分析。在Geiss等人的出版物(Geissetal.，2008)中描述了该技术，并且该教导的内容通过引用并入本文。
在另一种实施方式中，在分析前对微泡的核酸进行扩增可能是有益的或是另外所希望的。核酸扩增的方法是本领域是常用的并且一般是已知的，在本文中描述了核酸扩增方法的多个实例。如果期望，可以进行扩增从而使其为定量的。定量扩增将允许定量确定各种核酸的相对量以生成如下所描述的谱图。
在一种实施方式中，提取的核酸为RNA。然后，在进一步扩增前优选地将RNA反转录到互补DNA中。这样的反转录可以单独进行或结合扩增步骤进行。结合反转录和扩增步骤的方法的一个实例为反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，它可以进一步修改为定量的，例如，如美国专利No.5639606中所描述的定量RT-PCR，其所教导的内容通过引用并入本文。
核酸扩增方法包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)(美国专利No.5219727)和它的改变形式，如原位聚合酶链反应(美国专利No.5538871)、定量聚合酶链反应(美国专利No.5219727)、巢式聚合酶链反应(美国专利No.5556773)、自主序列复制和它的改变形式(Guatellietal.，1990)、转录扩增系统和它的改变形式(Kwohetal.，1989)、Qb复制酶法和它的改变形式(Mieleetal.，1983)、冷-PCR(Lietal.，2008)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果诸如核酸的分子以极低的数目存在，则设计用于检测核酸分子的那些检测方案是特别有用的。以上参考文献以其对这些方法的教导通过引用并入本文。
微泡中存在的核酸的分析为定量的和/或定性的。对于定量分析，使用本领域已知的方法(如下所述)测量微泡内所关心的特异性核酸的相对或绝对量(表达水平)。对于定性分析，使用本领域已知的方法(如下所述)鉴别微泡内所关心的特异性核酸的种类(野生型或变体)。
在本文中，使用“遗传畸变”表示微泡内的核酸量以及核酸变体。具体地，遗传畸变包括但不限于基因(例如，致癌基因)或一组基因的过表达、基因(例如，肿瘤抑制基因如p53或RB)或一组基因的欠表达(under-expression)、基因或一组基因拼接变体的替代生产、基因拷贝数变体(CNV)(例如，DNA双微体(doubleminutes))(Hahn，1993)、核酸修饰(例如，甲基化、乙酰化和磷酸化)、单核苷酸多态性(SNP)、染色体重排(例如，倒转、缺失和重复)以及基因或一组基因的突变(插入、缺失、重复、错义、无义、同义或任何其他核苷酸变化)，在许多情况下，这些突变最终影响基因产物的活力和功能，导致产生替代性转录拼接变体和/或基因表达水平变化。
可以通过熟练技术人员已知的多种技术确定这些遗传畸变。例如，可以通过微阵列分析(美国专利No.6913879、7364848、7378245、6893837和6004755)和定量PCR确定核酸表达水平、替代性拼接变体、染色体重排和基因拷贝数。尤其是，可以使用IlluminaInfiniumII全基因组基因分型测定或Agilent人类基因组CGH微阵列检测拷贝数变化(Steemersetal.，2006)。可以通过，例如，美国专利No.7186512和专利公开WO/2003/023065中所描述的方法测定核酸修饰。具体地，可以通过IlluminaDNA甲基化OMA003癌板(IlluminaDNAMethylationOMA003CancerPanel)确定甲基化谱。可以通过使用等位基因特异探针的杂交、酶促突变检测、错配异源双链体(heteroduplex)的化学切割(Cottonetal.，1988)、错配碱基的核糖核酸酶切割(Myersetal.，1985)、质谱法(美国专利No.6994960、7074563和7198893)、核酸测序、单链构型多态性(SSCP)(Oritaetal.，1989)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(FischerandLerman，1979a；FischerandLerman，1979b)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)(FischerandLerman，1979a；FischerandLerman，1979b)、限制性片段长度多态性(RFLP)(KanandDozy，1978a；KanandDozy，1978b)、寡核苷酸连接测定(OLA)、等位基因特异性PCR(ASPCR)(美国专利No.5639611)、连接链反应(LCR)及其改变形式(Abravayaetal.，1995；Landegrenetal.，1988；Nakazawaetal.，1994)、流式细胞异源双链分析(WO/2006/113590)以及它们的组合/改变形式来检测SNP和突变。显著地，可以通过基因表达系列分析(SAGE)技术确定基因表达水平(Velculescuetal.，1995)。一般地，在多个出版物中报道了分析遗传畸变的方法，它并不限于本文所引用的那些方法，并且这些方法对熟练专业人员来说是可用的。适当的分析方法将取决于具体的分析目标、患者的病况/病史以及要检测、监测或治疗的特定的癌、疾病或其他医学病况。以上参考文献以其对这些方法的教导通过引用并入本文。
已鉴别出导致和/或有助于癌初始产生或发展的各种各样的遗传畸变。在表4(不同类型的癌)和表6(胰腺癌)中提供了通常在癌中上调(即过表达)的基因的实例。表8中提供了在脑肿瘤中上调的微小RNA的实例。在本发明的一种实施方式中，表4和/或表6中所列的基因以及表8中所列的微小RNA的核酸表达水平提高。表5(不同类型的癌)和表7(胰腺癌)中提供了通常在癌中下调(例如，欠表达)的基因的实例。表9中提供了在脑肿瘤中下调的微小RNA的实例。在本发明的一种实施方式中，表5和/或表7中所列的基因以及表9中所列的微小RNA的核酸表达水平降低。在(Furnarietal.，2007)中综述了通常在脑肿瘤中欠表达或过表达的基因的实例，并且该主题内容作为参考并入本文。对于脑肿瘤的发展，RB和p53通常为下调以降低它们的肿瘤抑制活力。因此，在这些实施方式中，可以使用其失调表达水平对癌类型特异的基因和/或微小RNA的核酸表达水平是否提高或降低，来指示受试者中是否存在该类型的癌。
同样地，还可以在来自受试者体液的微泡内分析核酸变体，例如，DNA或RNA修饰、单核苷酸多态性(SNP)和突变(例如，错义、无义、插入、缺失、重复)，其中的受试者包括怀孕的雌性动物，其中来源于胎儿的微泡可以存在于血清以及羊水中。表3提供了非限制性实例。在另一实施方式中，核苷酸变体位于EGFR基因中。在另一实施方式中，核苷酸变体为EGFRvIII突变/变体。在本领域中，术语“EGFR”、“表皮生长因子受体”和“ErbB1”可互换使用，例如，如在Carpenter的论文(Carpenter，1987)中所描述的。对于脑肿瘤的发展，RB、PTEN、p16、p21和p53经常突变以降低它们的肿瘤抑制活力。在Furnari等人的论文(Furnarietal.，2007)中讨论了特定形式脑肿瘤中的特异性突变的实例，并且该主题内容作为参考并入本文。
另外，最近已在一些正在进行的研究项目中鉴别出与癌有关的更多的遗传畸变。例如，癌症基因组谱(CancerGenomeAtlas，TCGA)计划正在探索与人癌症有关的基因组变化的谱图。该项目以及其他类似研究工作的结果已经发表并且作为参考并入本文(Jonesetal.，2008；McLendonetal.，2008；Parsonsetal.，2008；Woodetal.，2007)。具体地，这些研究项目已鉴别了在人成胶质细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和/或结直肠癌中的遗传畸变，如突变(例如，错义、无义、插入、缺失和重复)、基因表达水平变化(mRNA或微小RNA)、拷贝数变化和核酸修饰(例如，甲基化)。表11和表12(成胶质细胞瘤)、表13(胰腺癌)、表14(乳腺癌)和表15(结直肠癌)中列出了在这些癌中最经常突变的基因。这些基因中的遗传畸变，以及事实上在癌中含有任何遗传畸变的任何基因，均为可以选择用于通过本文所述方法诊断和/或监测癌的靶标。
通过对微泡内的核酸实施核苷酸变体筛选可以实现对一种或多种核苷酸变体的检测。根据熟练专业人员所确定必需或期望的，该筛选可以是宽泛的或狭窄的。它可以是宽泛的筛选(建立该筛选以检测已知与一种或多种癌或疾病状况有关的基因中的所有可能的核苷酸变体)。在怀疑或已知存在一种特定癌或疾病的情况下，则可以将所述筛选特定于该癌或疾病。一个实例为脑肿瘤/脑癌筛选(例如，建立该筛选以检测与脑癌各种临床特定亚型或该癌的已知抗药性或药物敏感性突变有关的基因中的所有可能核苷酸变体)。
在一种实施方式中，分析是微泡中存在的特定核酸的量(水平)的谱图，本文中称为微泡的“定量核酸谱”。在另一实施方式中，该分析是微泡(野生型以及变体)中存在的特定核酸种类的谱，本文中称为“核酸种类谱图”。本文中用于提及这些谱图类型的组合的术语为“遗传谱”，其提及对核苷酸物质、变体是否存在以及核酸水平是否提高或降低的确定。
一旦产生后，将微泡的这些遗传谱与健康正常个体中预期的或来源健康正常个体其他方面的那些遗传谱进行比较。谱图可以是基因组范围的谱图(建立该谱图以检测所有可能的表达基因或DNA序列)。它也可以是较狭窄的，如癌范围的谱图(建立该谱图以检测所有可能的基因或来源于该基因的核酸，或已知与一种或多种癌有关的基因)。在怀疑或已知存在一种特定癌的情况下，可以将谱图特定于该癌(例如，建立该谱图以检测所有可能的基因或来源于该基因并且与该癌的各种临床特定亚型或该癌已知抗药性或敏感性突变有关的核酸)。
可以由熟练专业人员选择要扩增和/或分析的核酸。可以扩增和/或分析外来体的全部核酸内含物或仅扩增和分析特定核酸的亚组，其中的核酸可能或怀疑受到所存在的疾病或其他医学病况(如癌)的影响。对所分析微泡核酸中的核酸畸变的鉴别可以用于诊断受试者是否患有疾病，如与该畸变有关的癌、遗传病或病毒感染。例如，对癌特异性基因的一种或多种核酸变体(例如，EGFRvIII突变)是否存在的分析可以指示该个体中癌的存在性。可替换地或另外地，对核酸针对癌特异性核酸水平的提高或降低的分析可以指示该个体中癌的存在性(例如，EGFR核酸的相对提高，或肿瘤抑制基因如p53的相对降低)。
在一种实施方式中，通过对微泡中核酸的分析检测了与疾病(如癌)有关的基因突变(例如，经由核苷酸变体，过表达或欠表达)，其中的核酸来源于细胞起源中的基因组本身或来源于通过病毒引入的外源基因。由于预期能够产生在疾病诊断和预后中有用的信息，因此该核酸序列可以是完整的或部分的。该序列对实际基因或转录序列可以是正义的或反义的。熟练专业人员将能够根据微泡中可能存在的正义或反义核酸来设计核苷酸差异的检测方法。许多这样的方法包括对核苷酸序列特异性的探针的使用，其中的核苷酸序列为直接侧连或含有核苷酸差异。具有基因序列和该基因内核酸变体位置的知识的熟练专业人员可以设计这样的探针。如本领域和本文中所述的，这样的探针可以用于分离、扩增和/或实际杂交以检测该核酸变体。
可以采用各种各样的方式来确定来自受试者的微泡内的核酸中是否存在特定核苷酸变体或多个变体。各种各样的方法可用于该分析，其包括，但不限于，PCR、用等位基因特异性探针的杂交、酶促突变检测、错配的化学切割、质谱法或DNA测序(包括微测序)。在特定的实施方式中，可以两种形式实施用等位基因特异性探针的杂交：1)结合到固相(玻璃、硅、尼龙膜)的等位基因特异性寡核苷酸和在溶液中的标记样本，如在许多DNA芯片应用中，或2)在溶液中的结合样本(通常为克隆的DNA或PCR扩增的DNA)和标记的寡核苷酸(等位基因特异性或短的以允许通过杂交测序)。诊断性测试可以包括通常在固体载体上的一组差异，其使得能够同时确定多于一个的差异。在另一实施方式中，确定微泡核酸中存在至少一种核酸差异需要单体型分析试验(haplotypingtest)。确定单体型的方法是本领域技术人员已知的，例如在WO00/04194中。
在一种实施方式中，确定是否存在核酸变体涉及通过一些方法确定变体位点或多个位点(序列内的核酸与标准出现差异的确切位置)的序列，其中的方法例如为聚合酶链反应(PCR)、链终止DNA测序(美国专利No.5547859)、微测序(Fiorentinoetal.，2003)、寡核苷酸杂交、焦磷酸测序(pyrosequencing)、Illumina基因组分析仪、深度测序、质谱法或其他核酸序列检测方法。用于检测核酸变体的方法是本领域熟知的并且在WO00/04194中公开，该专利作为参考并入本文。在示例性方法中，诊断测试包括对所期望基因序列中跨过一个或多个已知变体的DNA或RNA(通常在将RNA转换为互补DNA之后)的片段进行扩增。接着，为了鉴别扩增片段中的核苷酸变体，对该扩增片段进行测序和/或进行电泳。
在一种实施方式中，本发明提供了一种对在如本文所述的分离的微泡核酸筛选核苷酸变体的方法。这可以通过例如PCR实现，或可替换地，可以在连接链式反应(LCR)中实现(Abravayaetal.，1995；Landegrenetal.，1988；Nakazawaetal.，1994)。对于所关心基因中的点突变的检测，LCR可以是特别有用的(Abravayaetal.，1995)。LCR方法包括以下步骤：设计用于扩增靶序列的简并引物，该引物对应于与所关心基因对应的核酸的一个或多个保守区，使用从微泡获得的核酸作为模板用所述引物扩增PCR产物并分析该PCR产物。微泡核酸的PCR产物与对照样本(具有或不具有核苷酸变体)的比较指示该微泡核酸中的变体。根据对照，改变可以是微泡核酸中存在或不存在核苷酸变体。
可以使用能够按照扩增产物尺寸对它们进行分离的任何方法实施扩增产物分析，包括自动和手动凝胶电泳、质谱法等。
可替换地，可以使用SSCP、DGGE、TGGE、化学切割、OLA、限制性片段长度多态性以及杂交(例如，核酸微阵列)，基于序列差异性对扩增产物进行分析。
核酸分离、扩增和分析的方法对本领域技术人员来说是常规的，并且可以在，例如MolecularCloning：AlaboratoryManual(3-VolumeSet)Ed.JosephSambrook、DavidW.RusselandJoeSambrook，ColdSpringHarborLaboratory，3rdedition(January15，2001)，ISBN：0879695773中查找到方案的实例。PCR扩增中所使用方法的特别有用的方案来源是PCRBasics：FromBackgroundtoBenchbySpringerVerlag；1stedition(October15，200)，ISBN0387916008。
由于已知肿瘤细胞以及一些正常细胞将微泡脱落到体液中并且如本文所证明的，这些微泡内的遗传畸变反映了肿瘤细胞内的畸变，因此可以利用微泡来实施自肿瘤活检样本上进行的多种诊断方法。此外，使用微泡的诊断方法具有直接在肿瘤活检样本上实施的诊断方法所不具有的特征。例如，与肿瘤/癌核酸采样的其他形式不同，微泡核酸分析的一个具体优势是对来源于个体中肿瘤或遗传学非均匀肿瘤所有病灶的肿瘤/癌核酸进行分析的可利用性。活检样本是受限的，因为它们仅提供关于获得的活组织检查的肿瘤的特定病灶的信息。体内或甚至单个肿瘤内发现的不同肿瘤/癌性病灶经常具有不同的遗传谱并且在标准活组织检查中得不到分析。然而，对来自个体的微泡核酸的分析估计可能提供个体内所有病灶的采样。这提供了有关推荐治疗、治疗有效性、疾病预后和疾病复发分析的重要信息，而简单的活组织检查不能提供这些信息。
通过本文所描述的方法，对与特定疾病和/或医学病况有关的遗传畸变的鉴别也可以用于诊断患有疾病或其他医学病况(如癌)的个体的预后和治疗决定。疾病和/或医学病况的遗传基础的鉴别提供了指导治疗该疾病和/或医学病况的有用信息。例如，已证明化学疗法的多种形式对具有特定遗传异常/畸形的癌更有效。一个实例为使用如激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)的药物靶向治疗EGFR的有效性。已表明这样的治疗对EGFR基因在EGFR蛋白激酶结构域中具有特定核苷酸突变的癌细胞更有效(美国专利公开20060147959)。换言之，在EGFR核酸信息的激酶结构域中存在至少一个鉴别的核苷酸变体，表明患者可能受益于使用EGFR靶向化合物吉非替尼或厄洛替尼的治疗。由于已经证明从体液中的微泡分离出了肿瘤来源的EGFR转录本，因此可以通过本文所述的方法在微泡中存在的核酸中鉴别这样的核苷酸变体。
还发现其他基因中的遗传畸变影响治疗有效性。如在Furnari等人的出版物(Furnarietal.，2007)中所公开的，在各种各样的基因中的突变影响在治疗脑肿瘤的化学疗法中使用的特定药物的有效性。对微泡内核酸中的这些遗传畸变的鉴别将指导适当治疗计划的选择。
同样地，本发明的多个方面涉及用于监测受试者的疾病(例如，癌)发展的方法，还涉及用于监测个体的疾病复发的方法。这些方法包括以下步骤：如本文所讨论的从个体体液中分离微泡，并且如本文所讨论的分析微泡内的核酸(例如，形成该微泡的遗传谱)。使用某个遗传畸变/谱的存在性/不存在性来指示如本文所讨论的受试者中该疾病(例如，癌)的存在性/不存在性。随时间周期性地实施该过程并检查结果以监测该疾病的发展或消退，或确定该疾病的复发。换句话说，遗传谱的变化表明受试者的疾病状态的变化。从受试者中采集微泡样本以进行微泡分离和分析之间花费的时间段将取决于受试者的情况并且由熟练的专业人员决定。当分析来自与受试者所进行的疗法有关的基因的核酸时，这样的方法将证明是极其有利的。例如，可以监测该疗法所靶向的基因的突变发展，其中的突变使其对疗法产生耐受性，此时可以相应地改变疗法。所监测的基因还可以是指示对特定疗法产生特定反应的基因。
本发明的多个方面还涉及这样的事实，即各种各样的非癌性疾病和/或医学病况也具有遗传联系和/或原因，并且这样的疾病和/或医学病况同样可以通过本文所述的方法进行诊断和/或监测。许多这样的疾病在本质上为代谢性、传染性或退变性的。一种这样的疾病为糖尿病(例如，尿崩症)，其中加压素2型受体(V2R)发生改变。另一种这样的疾病为肾纤维化，其中胶原、纤连蛋白和TGF-β的基因的遗传谱发生改变。通过本文所述的方法同样可以检测由于药物滥用(例如，类固醇或药物使用)、病毒和/或细菌感染以及遗传病状态所造成的遗传谱的变化。
本文所描述的发明可应用的疾病或其他医学病况包括，但不限于，肾病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、肾病性肾小球肾炎、细菌或病毒性肾小球肾炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-SchonleinPurpura)、膜性增生性肾小球肾炎、膜性肾病、干燥综合征(Sjogren′ssyndrome)、肾病综合征微小病变性疾病、局灶性肾小球硬化症及相关病症、急性肾衰竭、急性小管间质性肾炎、肾盂肾炎(pyelonephritis)、泌尿生殖道炎性疾病(GUtractinflammatorydisease)、初期子巅(Pre-clampsia)、肾移植排斥、麻疯病、反流性肾病(refluxnephropathy)、肾石病、遗传性肾病、髓质囊性病(medullarcystic)、髓状海绵病(medullarsponge)、多囊性肾病、常染色体显性多囊性肾病、常染色体隐性多囊性肾病、结节性硬化、希林二氏病(vonHippel-Lindaudisease)、家族性肾小球薄基底膜病、III型胶原肾小球病、纤连蛋白肾小球病、阿尔波特氏综合征(Alport′ssyndrome)、法布里病(Fabry′sdisease)、指甲膝盖综合征(Nail-PatellaSyndrome)、先天性泌尿异常、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、淀粉样变性病和相关病症、热性疾病、家族性地中海热、HIV感染-AIDS、炎性疾病、系统性血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、多动脉炎、坏死性和新月体肾小球肾炎、多肌炎-皮肤肌炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、痛风、血液病症、镰刀细胞病、血栓性血小板减少性紫癜、范科尼综合征(Fanconi′ssyndrome)、移植、急性肾损伤、过敏性肠道综合征、溶血尿毒症综合征、急性肾皮质坏死、肾血栓、创伤和手术、大面积损伤、燃烧、腹部和血管手术、麻醉诱发、药物使用或药物滥用的副作用、循环疾病性心肌梗塞、心力衰竭、周围性血管疾病、高血压、冠心病、非动脉粥样硬化性心血管疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、皮肤病、牛皮癣、系统性硬化病、呼吸道疾病、COPD(慢性阻塞性肺病)、阻塞性睡眠呼吸暂停、高海拔缺氧症或内分泌病、肢端肥大症、糖尿病或尿崩症。
根据对多种因素中的一个或多个的分析，由熟练的专业人员对分离微泡的个体进行选择。所考虑的这些因素为受试者是否具有特定疾病(例如，癌)的家族史、是否对该疾病具有遗传易患性、是否由于家族史、遗传易患性、指示易患性的其他疾病或体征或环境原因而具有高患病风险。环境原因包括生活方式、对造成或有助于该疾病的试剂的暴露，如在空气、土地、水或饮食中暴露。另外，之前已患有该疾病、在治疗前或治疗后诊断为该疾病、目前正在治疗该疾病(正在进行疗法)以及正在从该疾病中缓解或恢复都是选择实施所述方法的个体的原因。
在分析步骤前，可选地利用选择基因或核酸以进行分析的其他额外步骤实施本文所描述的方法。这种选择可以基于受试者的任何易患性(趋向，predisposition)、或任何之前的暴露或诊断或受试者经历的或同时进行的治疗性治疗。
诊断、监测或其他方式测定谱图的癌可以是任何种类的癌。这包括但不限于上皮细胞癌，如肺、卵巢、子宫颈、子宫内膜、乳腺、脑、结肠和前列腺癌。还包括胃肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖泌尿癌和膀胱癌、黑素瘤和白血病。另外，本发明的方法和组合物同样可应用于个体中非恶性肿瘤的检测、诊断和预后(例如，神经纤维瘤、脑脊膜瘤和许旺氏细胞瘤)。
在一种实施方式中，所述癌为脑癌。在本领域中，脑肿瘤和脑癌的类型是熟知的。神经胶质瘤是由脑神经胶质(支持性的)组织引起的肿瘤的通称。神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。星形细胞瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤以及两种或更多种细胞类型混合的肿瘤(称作混合性胶质细胞瘤)是最常见的神经胶质瘤。以下是脑肿瘤的其他常见类型：听神经瘤(神经鞘瘤、许旺氏细胞瘤、神经鞘瘤(Neurinoma))、腺瘤、星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、巨细胞星形细胞瘤、中级和高级星形细胞瘤、再发性肿瘤、脑干神经胶质瘤、脊索瘤、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤(原发性恶性淋巴瘤)、囊肿、皮样囊肿、表皮样囊肿、颅咽管瘤、室管膜瘤、间变性室管膜瘤、神经节细胞瘤(节细胞神经瘤)、神经节神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、恶性星形细胞瘤、神经胶质瘤、成血管细胞瘤、不宜手术的脑肿瘤、淋巴瘤、髓母细胞瘤(MDL)、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、混合性胶质细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质瘤、视神经胶质瘤、松果体区肿瘤、垂体腺瘤、PNET(原始神经外胚层瘤)、脊髓肿瘤、亚室管膜瘤和结节性硬化(布尔讷维氏病(Bourneville′sDisease))。
除鉴别先前已知的核酸畸变(由于与疾病有关)之外，本发明的方法可以用于鉴别先前未鉴别的核酸序列/修饰(例如，转录后修饰)，所述核酸序列/修饰的畸变与某种疾病和/或医学病况有关。这是通过以下步骤完成的，例如，分析来自患有指定疾病/医学病况(例如，癌的临床类型和亚型)的一位或多位受试者体液的微泡内的核酸并且与未患有给定疾病/医学病况的一位或多位受试者的微泡内的核酸进行比较以鉴别它们核酸内含物的差异。该差异可以是任何遗传畸变，其包括但不限于，核酸的表达水平、可替换的拼接变体、基因拷贝数变体(CNV)、核酸的修饰、单核苷酸多态性(SNP)和核酸突变(插入、缺失或单核苷酸改变)。一旦对某种疾病鉴别出了特定核酸遗传参数的差异，则可以进行涉及临床和统计显著数目的受试者的进一步研究以建立该特定核酸遗传畸变与该疾病之间的相关性。如熟练专业人员所确定为适当的，可以通过本文所描述的一种或多种方法进行遗传畸变分析。
作为递送载体的外来体
本发明的多个方面还涉及本文所述的实际微泡。在一种实施方式中，本发明是一种如本文所描述的分离的微泡，其分离自个体。在一种实施方式中，通过个体脑内的细胞(例如，肿瘤或非肿瘤细胞)产生了微泡。在另一实施方式中，如本文所述的，从个体体液分离了微泡。本文描述了分离方法。
本发明的另一个方面涉及以下发现，即从人成胶质细胞瘤细胞中分离的微泡含有mRNA、miRNA和血管生成蛋白。原代人脑内皮细胞经由内吞机制吸收这样的成胶质细胞瘤微泡，并且在那些细胞中翻译掺入到该微泡中的报告蛋白mRNA。这表明微泡所传递的信息可以改变靶细胞(吸收微泡的细胞)的遗传和/或翻译谱。所述微泡还含有已知在成胶质细胞瘤中含量富含的miRNA(Krichevskyetal，manuscriptinpreparation)。因此，来源于成胶质细胞瘤肿瘤的微泡可以作为mRNA、miRNA和蛋白质的递送载体起作用，其可以经由递送特定mRNA物质而改变其他细胞的翻译状态、促进内皮细胞的血管生成并且刺激肿瘤生长。
在一种实施方式中，在将供体受试者体液递送到受体受试者前，将微泡从所述体液中消除。供体受试者可以是具有不可检测的肿瘤的受试者，并且体液中的微泡来源于肿瘤。由于微泡中的遗传材料和蛋白质可以促使受体受试者中细胞无限制的生长，因此如果不除去供体体液中的肿瘤微泡，则它们将是有害的。
同样，本发明的另一个方面为本文所鉴别的微泡将核酸递送到细胞的应用。在一种实施方式中，细胞位于个体的体内。该方法包括将含有核酸的微泡或产生这样的微泡的细胞给予个体以使微泡接触和/或进入该个体的细胞。将核酸递送至其的细胞称为靶细胞。
可以遗传改造微泡以含有其天然不包含的核酸(即，对微泡正常内含物来说是外源的)。这可以通过将核酸物理插入到微泡中来完成。可替换地，可以遗传改造细胞(例如，在培养基中生长的细胞)以将一个或多个特定核酸靶向至外来体中，并且可以从该细胞分离外来体。可替换地，可以将遗传改造的细胞本身给予所述个体。
在一种实施方式中，产生用于给予的外来体的细胞与靶细胞在体内具有相同或类似的来源或位置。也就是说，对于将微泡递送到脑细胞来说，产生微泡的细胞将是脑细胞(例如，在培养基中生长的原代细胞)。在另一实施方式中，产生外来体的细胞与靶细胞相比为不同的细胞类型。在一种实施方式中，产生外来体的细胞为在体内位于靶细胞附近的类型。
可以经由外来体被递送至细胞的核酸序列可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链的，并且可以选自包括以下的组：编码所关心蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如，肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。这些核酸序列包括，例如，但是不局限于，编码蛋白质的核酸序列(例如，作为翻译抑制物的蛋白)、反义分子、核糖酶、小抑制性核酸序列、例如，但是不局限于RNAi、shRNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸和它们的组合。
将从细胞类型中分离的微泡递送到受体受试者。所述微泡可能使受体受试者医学上受益。例如，肿瘤外来体的血管生成和前增殖(pro-proliferation)作用可能有助于受体受试者中受损组织的再生。在一种实施方式中，递送方式为通过体液输注，其中在将来自供体受试者的体液递送到受体受试者前，将微泡加入到所述体液中。
在另一实施方式中，微泡是适合给予给受试者(例如，本文所述方法中的受试者)的成分(例如，药用制剂中的活性成分)。通常，这包括用于活性成分的药用载体。具体载体将取决于多种因素(例如，给药途径)。
“药用载体”是指混合靶向递送组合物和/或将其递送至受试者的任何药学上可接受的方式。这包括药用材料、组合物或载体，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将主题试剂从一个器官或身体部分携带或递送到另一个器官或身体部分。每种载体必须是在与制剂其他成分相容的意义上是“可接受的”并且与对受试者(例如，人)给药是兼容的。
对受试者的给药可以是系统的或局部的。这包括但不限于，通过将活性化合物递送至受试者中所期望位置的任何适合途径，将活性化合物(例如，药物制剂中的)分散、递送或施加至受试者，包括通过肠胃外或口服途径、肌肉注射、皮下/皮内注射、静脉注射、含服给药、透皮递送以及通过直肠、结肠、阴道、鼻内或者呼吸道途径施用等方式给药。
应理解，本发明不局限于本文中所描述的特定方法、方案和试剂，并且同样可以改变。本文中所使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不用于限制本发明的范围，该范围仅由本发明的权利要求限定。
在一个方面，本发明涉及本文中所描述的组合物、方法及其各自的成分，它们对本发明是必要的，但是对未指明元件(组分，element)的包括是开放的，必要或不必要的(“包括”)。在一些实施方式中，要包括在所述组合物、方法或它们各自成分的描述中的其他元件限于不实质性地影响本发明的基本和新颖特征的那些元件(“基本由...组成”)。这同样适用于所描述的方法的步骤以及其中的组合物和成分。在其他实施方式中，本文中所描述的发明、组合物、方法和它们各自的成分用来排除认为不是该成分、组合物或方法的必要要素的任何元件(“由...组成”)。
实施例
实施例1-7：肿瘤细胞脱落的微泡，其含有RNA，包括mRNA和微小RNA，并且这些微泡含有体液中超过90％的胞外RNA。
实施例1：从原代人成胶质细胞瘤细胞脱落的微泡。
通过手术切除术获得成胶质细胞瘤组织，解离肿瘤细胞并进行单层培养。具体地，直接从手术中取得来自由神经病理学家诊断为多形性成胶质细胞瘤的患者的脑肿瘤试样并将其置于冷的无菌神经基础培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。在手术后1小时内使用神经组织解离试剂盒(MiltenyiBiotech，BerischGladbach，Germany)将该试样解离成单细胞并在添加了青霉素-链霉素(分别为10IUmL-1和10μgmL-1，Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)的DMEM5％dFBS上铺板。由于在通常用于培养细胞的胎儿牛血清(FBS)中可以找到微泡并且这些微泡含有相当大量的mRNA和miRNA，因此使肿瘤细胞在含有除去了微泡的FBS(dFBS)的培养基中生长是重要的。发现培养的获自三种成胶质细胞瘤肿瘤的原代细胞在早期传代和晚期传代产生微泡(传代是根据细胞分裂所定义的细胞代，它是常见的细胞培养技术并且是保持细胞存活所必需的)。通过扫描电子显微镜(图1a和1b)以及透射电子显微镜(图1f)能够检测微泡。简要地说，将人成胶质细胞瘤细胞置于鸟氨酸涂敷的盖片上，并用0.5×Karnovskys固定剂固定，然后用PBS清洗2×5分钟(清洗两次，每次5分钟)。细胞在35％EtOH2×10min、50％EtOH2×10min、70％EtOH2×10min、95％EtOH2×10min、以及100％EtOH4×10min中脱水。然后将这些细胞转移到TousimisSAMDR1-795半自动临界点干燥器中进行临界点干燥(criticalpointdrying)，接着在GATAN618型高分辨离子束涂布器中用铬涂覆。如图1a和1b所示，用尺寸在约50-500nm变化的微泡覆盖肿瘤细胞。
实施例2：成胶质细胞瘤微泡含有RNA。
为了分离微泡，将第1-15代的成胶质细胞瘤细胞在不含微泡的培养基(含有5％dFBS的DMEM，其中dFBS是通过在110,000×g超离心16小时以除去牛微泡制备的)中培养。48小时后，收获了来自4000万细胞的条件培养基。通过差速离心纯化微泡。具体地，将成胶质细胞瘤条件培养基在300×g离心10分钟以消除任何细胞污染物。将上清液在16500×g进一步离心20分钟，并通过0.22μm过滤器(或滤膜)过滤。接着，以110,000×g超离心70分钟使微泡成颗粒(或沉淀)。将微泡颗粒在13ml的PBS中清洗，再次成粒并重新悬浮于PBS中。
使用DC蛋白质测定(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量分离的微泡的总蛋白质含量。
对于RNA从微泡中的提取来说，将最终浓度为100μg/ml的RNA酶A(Fermentas，GlenBurnie，MD，USA)加入微泡悬液并在37℃培育15分钟以除去微泡外部的RNA，从而确保所提取的RNA来自微泡的内部。接着，根据生产商的规程使用MirVanaRNA分离试剂盒(Ambion，AustinTX，USA)从微泡提取总RNA。根据生产商的规程用DNA酶处理后，使用纳滴(nanodrop)ND-1000仪(ThermoFischerScientific，Wilmington，DE，USA)对总RNA进行定量。
发现成胶质细胞瘤微泡含有RNA和蛋白质，其比值为约1∶80(μgRNA∶μg蛋白质)。在培养的48小时时间后，从微泡中分离的蛋白质和RNA的平均得率为约4μg蛋白质和50ngRNA/百万细胞。
为了证实RNA包含在微泡内部，将微泡暴露于RNA酶A或在RNA提取前进行模拟处理(图1c)。用RNA酶处理后，RNA含量的减少从未超过7％。因此，看起来几乎所有来自培养基的胞外RNA都包含在微泡内，并因而通过周围的液胞膜而保护所述RNA不受外部RNA酶的作用。
使用生化分析仪(Bioanalyzer)分析来自微泡及其供体细胞的总RNA，表明微泡包含与各种各样的mRNA和miRNA相一致的宽范围的RNA尺寸，但是缺乏18S和28S(细胞RNA的核糖体RNA特征峰)(图1d和1e)。
实施例3：微泡含有DNA。
为了测试微泡是否还含有DNA，如实施例2所提到的，分离外来体，然后在细胞溶解以释放内含物前用DNA酶进行处理。DNA酶处理步骤是为了除去外来体外部的DNA以使只提取存在于该外来体内部的DNA。具体地，使用购自Ambion的不含DNA的试剂盒按照生产商的建议(产品号#AM1906)进行DNA酶处理。对于DNA纯化步骤，将分离外来体的等分试样在作为MirVanaRNA分离试剂盒(Ambion)一部分的300μl溶胞缓冲液中溶解，并且按照生产商的建议使用DNA纯化试剂盒(Qiagen)从细胞溶解混合物中纯化DNA。
为了检查所提取的DNA中是否含有常见的基因，使用对GAPDH、人内源性反转录病毒K、腱糖蛋白-c和系-1(Line-1)特异的引物对进行PCR。对于GAPDH基因，使用下列引物：正向3GAPDH新(Forw3GAPDHnew)(SEQIDNO：1)和反向3GAPDH新(Rev3GAPDHnew)(SEQIDNO：2)。如果模板为拼接GAPDHcDNA，则该引物对扩增112bp的扩增子，如果模板为未拼接基因组GAPDHDNA，则该引物对扩增216bp的扩增子。在一个实验中，在细胞溶解以进行DNA提取前，用DNA酶处理分离的外来体(图3a)。如所预期的，从来自肿瘤血清(参见图3a中的泳道4)和原代肿瘤细胞(参见图3a中的泳道6)的外来体扩增了所述112bp片段，但是未从来自正常人成纤维细胞的外来体(参见图3a中的泳道5)扩增。不能从所有三种来源的外来体扩增所述216bp片段。但是，当使用从成胶质细胞瘤细胞分离的基因组DNA作为模板时，112bp和216bp片段均得到扩增(参见图3a中的泳道3)。因此，拼接的GAPDHDNA存在于分离自肿瘤细胞的外来体内，但是不存在于分离自正常成纤维细胞的外来体内。
相反，在另一实验中，在细胞溶解以进行DNA提取前，分离的外来体没有用DNA酶处理(图3b)。从分离自原代黑素瘤细胞的外来体不但扩增了所述112bp片段，而且也扩增了所述216bp片段(参见图3b中的泳道3)，表明外来体外部存在已经被反转录的非拼接GAPDHDNA或部分拼接的cDNA。
对于人内源性反转录病毒K(HERV-K)基因，使用下列引物：HERVK_6正向(HERVK_6Forw)(SEQIDNO：3)和HERVK_6反向(HERVK_6Rev)(SEQIDNO：4)。引物对扩增172bp扩增子。从被分离并用DNA酶处理的外来体提取DNA，并将其用作用于PCR扩增的模板。如图3c所示，在所有肿瘤和正常人血清外来体中扩增了172bp片段，但是未在正常人成纤维细胞的外来体中扩增。这些数据表明与来自正常人成纤维细胞的外来体不同，肿瘤和正常人血清外来体含有内源性反转录病毒DNA序列。为了检查肿瘤外来体是否还含有转座元件，使用下列细胞系-1特异性引物进行PCR扩增：细胞系1正向(Line1_Forw)(SEQIDNO：5)和细胞系1_反向(Line1_Rev)(SEQIDNO：6)。由于每种引物含有等量的两种不同的寡核苷酸，因此这两种引物被设计用于检测所有物质中的细胞系-1。对于细胞系1_正向引物，在用“s”表示的位置处，一个寡核苷酸包含C而另一个寡核苷酸包含G。对于细胞系1_反向引物，在用“r”表示的位置处，一个寡核苷酸包含A而另一个寡核苷酸包含G。该引物对扩增290bp扩增子。模板为从用DNA酶(如上所述)处理的外来体中提取的DNA。如图3e所示，可以从来自肿瘤细胞和正常人血清的外来体扩增290bp的细胞系-1片段，但是不能从来自正常人成纤维细胞的外来体中扩增。
为了测试外来体是否还含有腱糖蛋白-CDNA，使用下列引物对进行PCR：腱糖蛋白C正向(Forw)(SEQIDNO：7)和腱糖蛋白C反向(Rev)(SEQIDNO：8)。该引物对扩增197bp扩增子。模板为从被分离并接着在细胞溶解前用DNA酶处理的外来体中提取的DNA。如图3d所示，在来自肿瘤细胞或正常人血清的外来体中扩增了197bp的腱糖蛋白C片段，但是没有在正常人成纤维细胞的外来体中扩增。因此，腱糖蛋白CDNA存在于肿瘤和正常人血清外来体中，而不存在于正常人成纤维细胞外来体中。
为了进一步证实外来体中DNA的存在，使用如上所述的方法从D425髓母细胞瘤细胞提取外来体DNA。具体地，分离外来体，并在细胞溶解前用DNA酶处理。在通过1％琼脂糖凝胶中用溴化乙锭染色进行可视化前，用DNA酶处理或不用DNA酶处理等体积的最终DNA提取物。溴化乙锭是对核酸特异性染色的染料并且可以在紫外光下可视化。如图3f所示，DNA酶处理后溴化乙锭染色消失(参见图3f中的泳道3)，而在未处理等分试样中可以可视化强染色(参见图3f中的泳道2)。还在RNA皮可芯片(AgilentTechnologies)上分析用和未用DNA酶处理的提取物。如图3g所示，可以容易地在未用DNA酶处理的提取物中检测到单链DNA(参 见图3g的上图)，但是在使用DNA酶处理的提取物中几乎不能检测到(参见图3g的下图)。
为了测试所提取的DNA是否为单链，如上一段所述的，从处理的外来体提取核酸并进一步用RNA酶处理以去除任何RNA污染物。接着，在RNA皮可生化分析仪芯片(RNApicoBioanalyzercihp)和DNA1000芯片上分析处理的核酸。RNA皮可芯片仅检测单链核酸。DNA1000芯片检测双链核酸。如图3h所示，检测到单链核酸(参见上图)，但是未检测到双链核酸(参见下图)。因此，包含在肿瘤外来体内的DNA主要为单链DNA。
为了证明单链DNA存在于肿瘤细胞中但不存在于正常人成纤维细胞中，从来自成胶质细胞瘤患者血清或正常人成纤维细胞的外来体中提取核酸。细胞溶解前用DNA酶处理外来体，并在分析前用RNA酶处理纯化的核酸。如图3i所示，通过RNA皮可芯片可以检测从成胶质细胞瘤患者血清提取的外来体核酸。相反，从正常人成纤维细胞中仅提取了极少量的单链DNA。
因此，发现来自肿瘤细胞和正常人血清的外来体含有单链DNA。由于扩增产物不含有内含子，因此所述单链DNA是反转录产物(图3a和图3b)。已经知晓，肿瘤细胞以及正常祖细胞/干细胞具有活性反转录酶(RT)活力，尽管正常祖细胞/干细胞中反转录酶活力相对地低得多。这种RT活力使得以下结论似乎是合理的，即可以反转录细胞中的RNA转录本并将其作为cDNA包装到外来体中。令人感兴趣地，由于肿瘤细胞通常具有上调的反转录酶活力，因此来自肿瘤细胞的外来体含有更多的对应于肿瘤特异性基因转录本的cDNA。因此，外来体中的肿瘤特异cDNA可以用作不同肿瘤类型的诊断或预后的生物标志物。与使用mRNA作为肿瘤生物标志物相比，使用cDNA作为生物标志物将省去反转录步骤。另外，由于血清/血浆含有从要死亡的细胞释放的基因组DNA，因此相对于全血清/血浆DNA的使用，外来体cDNA的使用是有利的。当测试扩增的全血清/血浆DNA时，将有更多背景。
实施例4：人血清中的大多数胞外RNA包含在外来体内。
为了确定在血清中作为“游离RNA”/RNA蛋白复合体循环的RNA量相对于包含在外来体内的RNA量，我们从健康人受试者中分离了血清，并将该血清均匀分成体积相等的两个样本。对于样本1，对该血清超离心以除去大部分微泡。然后，收集血清上清液并使用TrizolLS提取该上清液中留下的RNA。对于样本2，不对该血清进行超速离心，而是使用TrizolLS从血清中提取总RNA。测量样本1上清液中和样本2血清中的RNA的量。作为结果，发现样本1上清液中游离RNA的量小于从血清样本2中分离的总RNA量的10％。因此，血清中大部分RNA与外来体有关。
实施例5：通过增加血清外来体分离步骤实现高效的血清胞外核酸提取。
全血清和血浆含有大量循环的DNA并且可能还含有在蛋白质复合体中受到保护的RNA，而血清中游离RNA的半衰期为几分钟。正常和患病哺乳动物血清中的胞外核酸谱不同，因此它们可以作为某些疾病的生物标志物。为了检查该谱，需要提取核酸。然而，从血清和血浆中直接提取核酸是不实际的，特别是对于从大体积的血清/血浆中提取。这种情况下，在提取外来体核酸前，使用大量的TrizolLS(一种RNA提取试剂)使所有血清核酸酶立即失活。随后，污染物沉淀到样本中并影响随后的分析。如实施例4所示，血清中大部分胞外RNA包含在血清外来体中。因此，我们测试了通过在核酸提取前分离血清外来体是否更有效地分离胞外核酸。
将来自患者的4毫升(mL)血清分成2个2ml的等分试样。在RNA提取前分离来自一个等分试样的血清外来体。外来体分离和RNA提取的方法与实施例2中所提到的相同。对于另一等分试样，根据生产商的建议直接使用TrizolLS提取RNA。在生化分析仪RNA芯片(AgilentTechnologies)上分析了来自这两种提取的核酸。如图4所示，使用前一种方法提取的RNA的量显著高于后一种方法所获得的量。另外，后一种方法提取的RNA的质量比前一种方法的质量相对较差。因此，外来体分离步骤有助于有效地从血清提取胞外RNA。
实施例6：mRNA的微阵列分析。
使用Agilent全人类基因组微阵列(4×44k，双色阵列)，通过MiltenyiBiotech(Auburn，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡中的mRNA群体进行微阵列分析。对如实施例1和2中所述制备的来自原代成胶质细胞瘤细胞的两种不同RNA制备物以及它们相应的微泡RNA制备物进行微阵列分析。使用GeneSifter软件(Vizxlabs，Seattle，WA，USA)分析数据。使用Intersector软件(Vizxlabs)提取两种阵列上易于检测的基因。已将微阵列数据存放在NCBI基因表达汇编(GeneExpressionOmnibus)中，并且通过GEO系列登记号GSE13470可访问。
我们发现在两种阵列上在细胞中有约22,000个基因转录本的检测水平大大高于背景水平，而在微泡中有约27,000个基因转录本的检测水平大大高于背景水平(99％置信区间)。在两种阵列上，有约4700个不同的mRNA是仅在微泡中检测到的，这表明了微泡内的选择性富集过程。与此一致的是，相比于来自两种肿瘤细胞制备物的起源细胞，微泡中的mRNA水平存在较差的整体相关性(图2a和2b)。相反，来自一个细胞培养物(A)的mRNA水平对第二细胞培养物(B)具有较好的相关性(图2c)，并且在来自相应微泡(A)和(B)的mRNA水平中也存在类似的相关性(图2d)。因此，肿瘤细胞和微泡内的mRNA分布具有一致性。通过比较微泡中转录本与它们的起源细胞的转录本的比值，我们发现有3426个转录本分布的差异超过了5倍(p值＜0.01)。这些之中，与细胞中的相比，有2238个转录本为富集的(高达380倍)而有1188个转录本的丰度较小(高达90倍)(图5)。记录了所有基因转录本的强度和比值。记录并检查了提高或降低超过10倍的mRNA转录本的本体。
在微泡中高度富集的mRNA转录本并非总是在微泡中最丰富的那些。一旦递送，含量最丰富的转录本更可能会在受体细胞中产生作用，因此，基于它们的本体描述，将微泡中存在的含量最丰富的500个mRNA转录本分成不同的生物学过程(图6a)。在各种本体中，由于代表了可以参与重建肿瘤间质和提高肿瘤生长的特定功能，因此选择血管生成、细胞增殖、免疫反应、细胞迁移和组蛋白修饰进行进一步研究。对属于这五种本体(存在论，ontology)的成胶质细胞瘤微泡mRNA作图以比较它们的水平以及对mRNA谱的贡献(图6b)。与阵列的中间信号强度水平相比，所有五种本体均包含具有极高表达水平的mRNA。
对与供体细胞相比在微泡中富含的mRNA的全面分析，表明可能存在将这些信息定位到微泡中的细胞机制，该机制可能是经由如对在特定细胞位置中翻译的mRNA(如对β肌动蛋白)所描述的3′UTR中的“区位编码(zipcode)”进行的(Kislauskisetal.，1994)。微泡中mRNA的构象是未知的，但是它们可以作为核糖核酸颗粒(RNP)存在(Mallardoetal.，2003)，该颗粒然后在供体细胞中会防止降解和过早翻译。
使用全基因组cDNA介导的退火、选择、延伸和连接(DASL)测定，通过IlluminaInc.公司(SanDiego，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡进行了mRNA群体微阵列分析。全基因组DASL测定将IlluminaDASL测定的PCR和标记步骤与基于基因的杂交和Illumina的HumanRef-8珠芯片(BeadChip)的全基因组探针组相结合。这种珠芯片覆盖了来源于RefSeq(工作版本36.2(Build36.2，发行号22(Release22))的超过24,000种注释基因。对从原代成胶质细胞瘤细胞、来自成胶质细胞瘤细胞的微泡(用实施例1和2中所述的方法获得)、黑素瘤细胞和来自黑素瘤细胞的微泡(用实施例1和2中所述的方法获得)获得的两种不同RNA制备物进行微阵列分析。
将每种RNA制备物的表达数据收集在一起并用于产生聚簇图(clusterdiagram)。如图7所示，分别将成胶质细胞瘤细胞、来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡的mRNA表达谱聚集。以约0.06的距离将两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的表达谱聚簇。以约0.09的距离将两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的表达谱聚簇。以约0.15的距离将来自两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的外来体的表达谱一起聚簇。以约0.098的距离将来自两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的外来体的表达谱一起聚簇。因此，来自成胶质细胞瘤和黑素瘤的外来体具有独特的mRNA表达标记图(expressionsignature)，并且外来体的基因表达标记图与它们的来源细胞的标记图不同。这些数据证明来自微泡的mRNA表达谱可以在本文所述的癌诊断和预后方法中使用。
实施例7：成胶质细胞瘤微泡含有miRNA
使用定量miRNA反转录PCR检测来自微泡和来自供体细胞的成熟miRNA。具体地，使用mirVanaRNA分离试剂盒(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)从微泡和供体细胞分离总RNA。使用微小RNA测定试剂盒(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)，使用特异性miR-引物将30ng总RNA转化为cDNA并根据生产商的规程进一步扩增。
在已知被上调并且在神经胶质瘤中含量丰富的那些miRNA中，在从两种不同原代成胶质细胞瘤(GBM1和GBM2)纯化的微泡中分析了11种miRNA的子集。该子集含有let-7a、miR-15b、miR-16、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-92、miR-93、miR-320和miR-20。所有这些miRNA在供体细胞和微泡中易于检测(图8)。微泡中每μg总RNA的水平通常比亲本细胞中的低(10％，相当于约3Ct-值)，但是这些水平具有良好的相关性，表明这11种miRNA在微泡中的含量不高。
使用由DASL测定激励的微小RNA表达谱板(MicroRNAExpressionProfilingPanel)，通过IlluminaInc.公司(SanDiego，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡中的微小RNA群组进行了微阵列分析。人微小RNA组包括1146种微小RNA。对来自原代成胶质细胞瘤细胞、来自成胶质细胞瘤细胞的微泡(使用实施例1和2中所述的方法获得)、黑素瘤细胞和来自黑素瘤细胞的微泡(使用实施例1和2中所述的方法获得)的两种不同RNA制备物进行微阵列分析。
将每种RNA制备物的表达数据收集在一起并用于产生聚簇图。如图9所示，分别将成胶质细胞瘤细胞、来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡的微小RNA表达谱一起聚簇。以约0.13的距离将两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的表达谱聚簇。以约0.12的距离将两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的表达谱聚簇。以约0.12的距离将来自两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的外来体的表达谱一起聚簇。以约0.17的距离将来自两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的外来体的表达谱一起聚簇。因此，来自成胶质细胞瘤和黑素瘤的外来体具有独特的微小RNA表达标记图，并且外来体的基因表达标记图与它们来源细胞的标记图不同。此外，如本文所证明的，来自微泡的微小RNA表达谱可以在本文所述的癌诊断和预后方法中使用。
微泡中微小RNA的发现表明来源于肿瘤的微泡可以通过改变它们的转录/翻译谱来更改周围的正常细胞。此外，如本文所证明的，来自微泡的miRNA表达谱可以在本文所描述的癌(包括，但不限于，成胶质细胞瘤)诊断和预后方法中使用。
实施例8-15：这些实施例表明来自体液的外来体内的核酸可以用作疾病或其他医学病况的生物标志物。
实施例8：微泡中miRNA的表达谱可以用作成胶质细胞瘤的敏感生物标志物。
为了确定外来体内的微小RNA是否可以用作疾病和/或医学病况的生物标志物，我们检查了微小RNA表达水平与疾病状态之间存在的相关性。由于在成胶质细胞瘤细胞中微小RNA-21以高水平表达并且在从成胶质细胞瘤患者血清中分离的外来体中易于检测，因此我们通过定量RT-PCR定量地测量了来自成胶质细胞瘤患者血清的外来体内微小RNA-21的拷贝数。具体地，从来自9位正常人受试者和9位成胶质细胞瘤患者的4ml血清样本中分离了外来体。RNA提取程序与实施例2中所描述的RNA提取程序类似。使用单重qPCR(AppliedBiosystems)分析miR-21的水平并将其归一化为GAPDH表达水平。
如图10所示，成胶质细胞瘤血清样本中的平均Ct值低了5.98，表明成胶质细胞瘤患者中外来体miRNA-21的表达水平比正常人受试者中的高约63倍。该差异为统计学显著性的，其p值为0.01。因此，微小RNA-21表达水平和成胶质细胞瘤疾病状态之间具有相关性，这证明了本文公开的无创性诊断方法的有效性和适用性。例如，在一个方面，所述方法包括以下步骤：从受试者体液分离外来体，通过测量微小RNA-21的拷贝数分析外来体内的微小RNA-21表达水平，将所述拷贝数与来自正常受试者的外来体内的拷贝数或与通过分析来自一组正常受试者的外来体内的微小RNA-21的含量所产生的标准拷贝数相比较。拷贝数增加表明受试者中存在成胶质细胞瘤；而拷贝数未增加则表明受试者中不存在成胶质细胞瘤。可以将该基本方法推广到与其他种类的微小RNA有关的其他疾病和/或医学病况的诊断/监测。
实施例9：微泡中的mRNA可以用作诊断的敏感生物标志物
由于通过PCR方法能够高灵敏度地检测核酸，因此它们作为生物标志物具有较高的价值。因此，设计并实施了下列测试以确定微泡中的mRNA是否可以用作医学疾病或病况(在这种情况下是成胶质细胞瘤肿瘤)的生物标志物。由于EGFRvIII突变的表达对某些肿瘤是特异的并且限定了神经胶质瘤的不同临床亚型，因此选择了表皮生长因子受体(EGFR)mRNA(Pelloskietal.，2007)。另外，由于EGFRvIII突变为体细胞突变而不是种系突变，因此通常不能使用不同于病变组织以外的组织检测这些突变。因此，检测EGFRvIII突变通常需要对如神经胶质瘤肿瘤的损害组织进行活组织检查。如以下详细说明的，使用巢式RT-PCR鉴别神经胶质瘤肿瘤活检样本中的EGFRvIIImRNA，并将结果与从相同患者血清样本中纯化的微泡中所发现的mRNA种类进行比较。
从原代人成胶质细胞瘤细胞中纯化了微泡，然后从所述微泡和供体细胞(活组织检查)中提取RNA。对样本编码并以蒙眼方式(blindfashion)进行PCR。包括Gli-36EGFRvIII(稳定表达EGFRvIII的人神经胶质瘤细胞)作为阳性对照。如实施例2中所述，使来自0.5-2ml冷冻血清样本的微泡成颗粒，并使用MirVana微泡RNA分离试剂盒提取RNA。然后使用相同的引物组，通过巢式RT-PCR扩增来自微泡和供体细胞的野生型EGFR(1153bp)和EGFRvIII(352bp)转录本。具体地，按照生产商推荐的规程使用OmniscriptRT试剂盒(QiagenInc，Valencia，CA，USA)将RNA转化为cDNA。GAPDH引物为GAPDH正向引物(SEQIDNO：9)和GAPDH反向引物(SEQIDNO：10)。EGFR/EGFRvIIIPCR1引物为SEQIDNO：11和SEQIDNO：12。EGFR/EGFRvIIIPCR2引物为SEQIDNO：13和SEQIDNO：14。PCR循环方案为在94℃保持3分钟；在94℃保持45秒，60℃保持45秒，72℃保持2分钟，进行35个循环；以及最后一步为在72℃保持7分钟。
我们分析了活检样本以确定是否存在EGFRvIIImRNA并将结果与从相同患者冷冻血清样本中纯化的外来体中提取的RNA进行比较。30个肿瘤样本中有14个(47％)含有EGFRvIII转录本，这与在其他研究中所发现的包含该突变的成胶质细胞瘤的百分比一致(Nishikawaetal.，2004)。可以从大约在手术时间抽取血清的25位患者中的7位(28％)的外来体扩增EGFRvII(图11和表1)。当使用新引物对EGFR/EGFRvIIIPCR3：SEQIDNO：15和SEQIDNO：16作为以上巢式PCR扩增的第二引物对时，发现了具有EGFRvIII突变的更多个体(表1)。可以从用旧引物对EGFRvIIIPCR2：SEQIDNO：13和SEQIDNO：14鉴别为阴性的6位患者的外来体中扩增EGFRvIII。值得注意地，活组织检查未显示EGFRvIII突变的个体13的外来体证实含有EGFRvIII突变，这表明使用外来体技术提高了EGFRvIII突变检测的灵敏度。不能从分离自52个正常对照血清样本的外来体扩增EGFRvIII(图12)。令人感兴趣地，具有EGFRvIII阴性肿瘤样本的两位患者在血清外来体中原来为EGFRvIII阳性，这支持神经胶质瘤肿瘤中的EGFRvIII表达是不均匀(不同种类，heterogeneous)的病灶。此外，我们的数据还显示，出乎意料地能够从成胶质细胞瘤患者的冷冻体血清中分离微泡中的完整RNA。来自证实为成胶质细胞瘤患者的这些蒙眼血清样本是从癌症研究中心(VUmedicalcenter，Amsterdam，theNetherlands)获得的，并且将它们保存在-80℃直至使用。血清微泡中的肿瘤特异性RNA的鉴别使得能够检测存在于肿瘤细胞中的体细胞突变。这样的技术应导致诊断和治疗决定的改善。
微泡中发现的RNA含有在给定时间的细胞基因表达谱的基本阵列的“快照(snapshot)”。在来源于成胶质细胞瘤的微泡中发现的mRNA中，由于EGFRvIII拼接变体特异地与成胶质细胞瘤相关，因此EGFRmRNA受到了特别的关注(Nishikawaetal.，2004)。这里证实了脑肿瘤将微泡释放到穿过血脑屏障(BBB)的血流中，这在之前是未被证实的。进一步证实了通过以下方法能够检测mRNA变体如脑肿瘤中EGFRvIII，所述方法包括从少量患者血清中分离外来体并分析所述微泡中的RNA。
在选择最佳治疗方案时，对肿瘤中EGFRvIII突变的认识是重要的。EGFRvIII-阳性神经胶质瘤对使用EGFR-抑制剂如厄洛替尼或吉非替尼进行治疗的响应可能性高了超过50倍(Mellinghoffetal.，2005)。
实施例10：铁代谢紊乱的诊断
如下列实施例所证实的，可以修整外来体诊断方法以适用于其他目的。
海帕西啶(一种抗菌肽)，是铁代谢的主要激素调节剂。这种肽主要在哺乳动物的肝脏中产生，并受骨髓促红细胞生成活性、循环和储存的体内铁含量以及炎症的控制。一旦受到刺激，海帕西啶将会被分泌到循环或尿中，在那里它可以作用于靶膜铁转运蛋白(ferropotin)表达细胞。膜铁转运蛋白是迄今为止鉴定出的唯一铁输出子(ironexporter)，并且当与海帕西啶结合时，它被内化并降解。所得到的膜铁转运蛋白的破坏导致铁保留在如巨噬细胞和肠上皮细胞的膜铁转运蛋白表达细胞中。这种病理生理机制在于慢性疾病的贫血。更具体地，贫血的特征在于海帕西啶不适当的高水平以及网状内皮组织系统内铁含量的升高。的确，贫血可能与多种疾病和/或医学病况有关，如感染(急性和慢性的)、癌、自体免疫、实体器官移植后的慢性排斥以及慢性肾病和炎症(WeissandGoodnough，2005)。另一方面，在如遗传性血色素沉着病的遗传性铁过载疾病中，海帕西啶不适当的低表达水平促使铁从网状内皮组织系统内潜在致命的过量流出。因此，海帕西啶在与慢性病有关的贫血中被上调，而在血色素沉着病中被下调。
目前，除飞行时间质谱法(TOFMS)外，没有定量测量循环或尿中海帕西啶水平的适合测试(Kemnaetal.，2008)，而飞行时间质谱法需要高度专业化的设备，并因此不易使用。最近，已提出使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法定量测量海帕西啶激素水平，但由于与海帕西啶(Kemnaetal.，2005；Kemnaetal.，2007)以及其他铁相关参数(Brookesetal.，2005；Roeetal.，2007)缺乏明确的相关性，因此该方法缺乏一致性。
如下所示，在来自人血清的外来体中检测了海帕西啶mRNA。首先从人血清中分离了外来体，并且在转化为cDNA并进行PCR扩增前提取它们的mRNA内含物。设计PCR引物以扩增人海帕西啶的129个核苷酸片段。引物序列为SEQIDNO：57和SEQIDNO：58。通过生化分析仪容易地检测了129个核苷酸的海帕西啶转录本(图13D的中间峰)。作为阳性对照(图13B)，提取了来自人肝细胞瘤细胞系Huh-7的RNA并将其转化为cDNA。阴性对照(图13C)没有mRNA。在图13A中的假凝胶中还显示了这些生化分析仪数据。
循环的微泡内的海帕西啶mRNA与肝细胞中的海帕西啶mRNA相关联。因此，测量体液样本中微泡内的海帕西啶mRNA将允许人们诊断或监测受试者中的贫血或血色素沉着病。
因此，可以通过从体液分离微泡并将所述微泡中的海帕西啶mRNA与来自正常受试者的mRNA相比较以诊断和/或监测受试者中贫血和血色素沉着病。对于贫血受试者，mRNA的拷贝数比正常的非贫血水平高。在患有血色素沉着病的受试者中，相对于正常受试者中的mRNA，所述拷贝数减少。
实施例11：用于糖尿病肾病诊断的外来体非侵入式转录谱
糖尿病肾病(DN)是目前缺乏特效疗法的危及生命的并发症。因此，需要开发灵敏的诊断方法以鉴别发展DN或具有发展DN风险的患者，从而能够进行早期干预和监测。
尿液分析提供了不必通过活组织检查而进行肾功能检查的方法。迄今为止，该分析限于尿液中蛋白质的研究。本实施例说明了从来自细胞的尿液转录谱获得通常只能通过肾活组织检查获得的结果的方法。具体地，该方法包含以下步骤：分离尿液外来体并分析所述外来体内的RNA以获得转录谱，其可以用于检验糖尿病个体中肾细胞所造成的分子变化并提供肾所产生的任何新蛋白质的“快照”。目前获得外来体转录谱的技术包括，但不限于，同时杂交阵列(contemporaryhybridizationarrays)、基于PCR的技术和下一代测序方法。由于直接测序不需要预设计的引物或点DNA寡核苷酸(spottedDNAoligos)，因此它将为外来体RNA谱提供客观的说明。通过Illumina基因组分析仪提供了下一代测序技术的实例，它利用了大规模平行测序技术，其允许每次运行对相当于1/3人类基因组的量进行测序。从该分析可得到的数据将使得人们能够快速并广泛地检验尿液外来体转录谱并允许与全肾进行比较。使用该方法，人们可以获得与尿液外来体转录谱有关的许多需要的信息。对照中的转录本与糖尿病来源的尿液外来体中转录本的比较还可以向人们提供糖尿病肾病的预测和新型生物标志物的综合列表。
为了证明上述诊断方法的可行性，设计并实施了实验以分离尿液外来体以及确认这些外来体内是否存在肾特异性生物标志物。在该实验中，从28岁健康男性受试者中采集了220mL新鲜的晨尿样本并经由差速离心处理以分离尿液外来体。具体地，先将尿液以300×g旋转离心10分钟以从该样本中除去任何细胞。收集上清液，然后以16,500×g旋转离心20分钟以沉淀任何细胞碎片或蛋白聚集体。然后将该上清液通过0.22μM膜过滤器以除去直径大于0.22μm的碎片。最后，将该样本在100,000×g下超离心1小时以使外来体成颗粒(Theryetal.，2006)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中轻轻冲洗所述颗粒，并按照生产商的说明书使用QiagenRNeasy试剂盒提取RNA。使用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen)将分离的RNA转化为cDNA，然后对肾特异性基因进行PCR扩增。
所考察的肾特异性基因以及表达这些基因的相应肾区域为如下：AQP1-近端小管；AQP2-远端小管(主细胞)；CUBN-近端小管；LRP2-近端小管；AVPR2-近端和远端小管；SLC9A3(NHE-3)-近端小管；ATP6V1B1-远端小管(闰细胞(intercalatedcell))；NPHS1-肾小球(足细胞(podocytecell))；NPHS2-肾小球(足细胞)和CLCN3-集合管(collectingduct)的B型闰细胞。设计用于扩增各个基因的引物序列为AQP1-F(SEQIDNO：17)和AQP1-R(SEQIDNO：18)；AQP2-F(SEQIDNO：19)和AQP2-R(SEQIDNO：20)；CUBN-F(SEQIDNO：21)和CUBN-R(SEQIDNO：22)；LRP2-F(SEQIDNO：23)和LRP2-R(SEQIDNO：24)；AVPR2-F(SEQIDNO：25)和AVPR2-R(SEQIDNO：26)；SLC9A3-F(SEQIDNO：27)和SLC9A3-R(SEQIDNO：28)；ATP6V1B1-F(SEQIDNO：29)和ATP6V1B1-R(SEQIDNO：30)；NPHS1-F(SEQIDNO：31)和NPHS1-R(SEQIDNO：32)；NPHS2-F(SEQIDNO：33)和NPHS2-R(SEQIDNO：34)；CLCN5-F(SEQIDNO：35)和CLCN5-R(SEQIDNO：36)。
对于每个基因的PCR产物的预计尺寸为AQP1-226bp、AQP2-208bp、CUBN-285bp、LRP2-220bp、AVPR2-290bp、SLC9A3-200bp、ATP6V1B1-226bp、NPHS1-201bp、NPHS2-266bp和CLCN5-204bp。PCR循环方案为在95℃保持8分钟；在95℃保持30秒；在60℃保持30秒；在72℃保持45秒，循环30次；最后一步为在72℃保持10分钟。
如图14a所示，肾小管细胞含有多泡体，它是外来体产生过程中的中间步骤。可以通过电子显微镜鉴别从这些细胞分离的外来体(图14b)。对从尿液外来体中提取的总RNA的分析表明存在具有大范围尺寸的RNA种类(图14c)。未发现18S和28S核糖体RNA。PCR分析确认了尿液外来体内存在肾特异性转录本(图14d)。这些数据表明，肾细胞将外来体脱落到尿液中并且这些尿液外来体含有肾起源的转录本，以及所述外来体方法可以检测与某些肾病和/或其他医学病况有关的肾生物标志物。
为了进一步确认尿液外来体中存在肾特异性mRNA转录本，使用来自六位个体的尿液样本进行了一组独立实验。按照如上所提到的程序，从每位个体的200ml晨尿样本中提取了外来体核酸。具体地，以1000×g的离心作用起始对尿液样本进行差速离心以使全细胞和细胞碎片旋转沉降。小心除去上清液，并将其在16,500×g离心20分钟。然后，移出离心后的上清液并通过0.8μm过滤器过滤从而从含有外来体的上清液中除去残留碎片。然后，将最终上清液以100,000×g超离心1小时10分钟。在不含核酸酶的PBS中清洗颗粒，并以100,000×g再次离心1小时10分钟以获得准备用于核酸提取的外来体颗粒。使用ArcturusPicoPureRNA分离试剂盒从成粒的外来体提取核酸，并使用生化分析仪(Agilent)皮可芯片分析核酸浓度和完整性。如图14e所示，不同个体之间从尿液外来体分离的核酸也不相同。为了测试不同个体之间肾生物标志物的存在性是否也不相同，使用一组新引物对对水通道蛋白1(Aquaporin1)、水通道蛋白2和Cubilin基因(或吞饮受体基因)进行PCR扩增，其中所述引物对为：AQP1新引物对：SEQIDNO：37和SEQIDNO：38；AQP2新引物对：SEQIDNO：39和SEQIDNO：40；CUBN新引物对：SEQIDNO：41和SEQIDNO：42。特别地设计了这些引物对以扩增拼接和反转录的cDNA片段。使用QiagenSensiscript试剂盒进行反转录。如图14f所示，在个体1中未发现扩增，这可能是由于核酸提取失败所造成的。仅在个体2中扩增了AQP1。在个体2和3中扩增了CUBN。而在个体2、3、4和5中扩增了AQP2。相比之下，在个体2、3、4、5和6中扩增了肌动蛋白基因(图14f中用“House(方框)”表示)。这些数据提供了更多证据，即尽管在不同个体之间表达水平不同，但是尿液外来体含有肾特异性mRNA转录本。
为了测试尿液外来体中是否存在cDNA，将200ml人尿液样本分成两个100ml的尿液样本。从每个样本中分离尿液外来体。用DNA酶处理来自一个样本的外来体，而对来自另一个样本的外来体进行模拟处理。然后，使用PicoPureRNA分离试剂盒(Acturus)使每个样本中的外来体细胞溶解以进行核酸提取。在事先不进行反转录的情况下，将核酸用作巢式PCR扩增(实施例9中所述的PCR规程)的模板。扩增肌动蛋白基因的引物对为肌动蛋白-正向(Actin-FOR)(SEQIDNO：43)和肌动蛋白-反向(Actin-REV)(SEQIDNO：44)；肌动蛋白-巢式-正向(Actin-nest-FOR)(SEQIDNO：45)和肌动蛋白-巢式-反向(Actin-nest-REV)(SEQIDNO：46)，其中基于肌动蛋白基因cDNA序列预计的最终扩增子为100bp。如图14g所示，该100bp片段存在于阳性对照(以人肾cDNA作为模板)、DNA酶处理的和未处理的外来体中，但在阴性对照泳道中不存在(无模板)。因此，肌动蛋白cDNA存在于DNA酶处理的和未处理的尿液外来体中。
为了测试使用该方法提取的大部分核酸是否存在于外来体内，将从DNA酶处理的和未处理的外来体中提取的核酸以等体积溶解并使用RNA皮可芯片(AgilentTechnologies)分析。如图14h所示，从DNA酶处理的样本中分离的核酸的浓度为1.131pg/ul，而从未处理样本中提取的浓度为1.378pg/ul。因此，使用上述方法从尿液外来体提取的核酸中有超过80％的核酸来自外来体内部。
为了系统地鉴别尿液外来体的内含物，从尿液外来体提取核酸并将其送至博德研究所(BroadInstitute)进行测序。产生了约1400万个序列阅读，每个长度为76个核苷酸。这些序列阅读对应于尿液外来体内存在的DNA/RNA转录本片段。使用极其严格的比对参数(全长序列上100％的同一性)，将约15％的阅读与人基因组进行比对。如果使用不太严格的比对标准，则该百分比可能会提高。这15％的阅读中的大多数未与蛋白质编码基因比对而是与非编码基因组元件比对，如转座子和各种LINE&SINE重复元件。值得注意地，对于未与人基因组比对的那些阅读，许多与病毒序列比对。在包含于尿液外来体中的核酸组合物和水平相对于疾病状态而变化的程度上，根据本发明方法，可以将核酸谱用作疾病诊断的生物标志物。
这个实施例证明分析尿液外来体的外来体方法可以用于确定糖尿病相关肾病中肾的细胞变化而不必采用高风险、侵入式的肾活组织检查。该方法提供了使用外来体进行肾病(如糖尿病肾病)早期检测的新的并且灵敏的诊断工具。这将使得能够立即进行干预和治疗。总而言之，本文所述的外来体诊断方法和技术为糖尿病肾病以及与包含于尿液外来体内核酸的某些谱图有关的其他疾病提供了急需的诊断方法。
实施例12：前列腺癌诊断和尿液外来体
目前，前列腺癌是男性中最常见的癌症。前列腺癌的风险为约16％。2008年，美国诊断出了超过218,000位男性患者。越早期检测出前列腺癌，则成功治疗的机会越大。根据美国癌症学会(AmericanCancerSociety)，如果在前列腺癌处于前列腺本身或附近区域时发现，则五年相对存活率超过98％。
通过测量血液中前列腺特异性抗原(PSA)水平，结合数字直肠检查进行一种已建立的诊断方法。然而，PSA测试的灵敏度和特异性均需要明显改善。该低特异性导致产生了较高数量的假阳性，其造成了很多不必要并且昂贵的活组织检查。通过检测新近鉴别的生物标志物的遗传谱而实施其他诊断方法，其中的生物标志物包括，但不限于，前列腺癌基因3(PCA3)(Groskopfetal.，2006；Nakanishietal.，2008)、跨膜蛋白酶丝氨酸2和ETS相关基因之间的融合基因(TMPRSS2-ERG)(Tomlinsetal.，2005)、谷胱甘肽S-转移酶π(Goessletal.，2000；Gonzalgoetal.，2004)和在体液如血清和尿液中发现的前列腺癌细胞中的α-甲基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)(Groskopfetal.，2006；WrightandLange，2007)(Zehentneretal.，2006；Zielieetal.，2004)。尽管由于这些生物标志物在前列腺癌细胞中过表达(例如，前列腺癌细胞中PCA3表达提高了60至100倍)而可能提高特异性，但是需要数字直肠检查从而在样本采集前将前列腺细胞抽取到尿液中(Nakanishietal.，2008)。这样的直肠检查固有的缺陷如收集易于抽取到尿液中的那些癌细胞的偏差和昂贵并且耗时的医学医生的参与。
本文中，提出了检测这些生物标志物的遗传谱的新方法以克服如上所提到的限制。该方法包括从体液分离外来体并分析来自该外来体的核酸的步骤。所述方法的程序与实施例9中详细说明的类似。在本实施例中，尿液样本来自4位诊断为前列腺癌的患者。如图15c所示，以等级、格里森级(Gleasonstage)和PSA水平表征癌症阶段。另外，通过实施例7中详细说明的巢式RT-PCR分析的核酸为TMPRSS2-ERG和PCA3，它们是两种新近鉴别的前列腺癌生物标志物。对于TMPRSS2-ERG的扩增，第一扩增步骤的引物对为TMPRSS2-ERGF1(SEQIDNO：47)和TMPRSS2-ERGR1(SEQIDNO：48)；而第二扩增步骤的引物对为TMPRSS2-ERGF2(SEQIDNO：49)和TMPRSS2-ERGR2(SEQIDNO：50)。预计的扩增子为122个碱基对(bp)并且在用限制性内切酶HaeII消化后得到两个片段(一个为68bp，另一个为54bp)。对于PCA3的扩增，第一扩增步骤的引物对为PCA3F1(SEQIDNO：51)和PCA3R1(SEQIDNO：52)；而第二扩增步骤的引物对为PCA3F2(SEQIDNO：53)和PCA3R2(SEQIDNO：54)。预计的扩增子长度为152bp并且用限制性内切酶Sca1消化后得到两个片段(一个为90bp，另一个为62bp)。
如图15a所示，在患者1和2中可以检测TMPRSS2-ERG的预计扩增子并且其可以消化成预计尺寸的两个片段，但是在患者3和4中不可以。如图15b所示，在所有4位患者中，可以检测PCA3的预计扩增子并且其可以消化成预计尺寸的两个片段。因此，可以在来自所有4位患者的尿液样本中检测PCA3表达，但是只可以在患者1和2的尿液样本中检测TMPRSS2-ERG表达(图15c)。尽管由于样本量较小而不能得出结论，但是这些数据证明了所述新方法在检测前列腺癌生物标志物中的可应用性。而且，该外来体方法不局限于诊断，而且可以用于前列腺癌相关其他医学病况的预后和/或监测。
实施例13：非侵入式产前诊断中的微泡
目前，产前诊断是全世界已建立的产科实践的一部分。获得用于遗传分析的胎儿组织的常规方法包括羊膜穿刺术和绒膜绒毛采样，这两种方法都是侵入式的并且会对未出生的胎儿造成风险。在临床遗传学中，对开发非侵入式诊断方法有长期的需要。已广泛研究的一种方法是基于母体血浆中循环胎儿细胞的发现。然而，有多种障碍妨碍其在临床环境中应用。这些障碍包括胎儿细胞不足(每毫升母体血液中仅有1.2个细胞)，这需要相对大量的血液样本；以及上次怀孕时残留的胎儿细胞较长的半衰期，这可能导致假阳性。另一种方法是基于母体血浆中胎儿DNA的发现。充足的胎儿DNA量以及较短的清除时间克服了与胎儿细胞方法有关的阻碍。然而，DNA仅提供可遗传的遗传信息和一些后生信息(epigeneticinformation)，两者均不能代表与胎儿医学病况有关的动态基因表达谱。母体血浆中循环胎儿RNA的发现(Ngetal.，2003b；Wongetal.，2005)可能是非侵入式产前诊断的所选方法。
几种研究表明胎儿RNA具有较高的诊断价值。例如，胎儿促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)转录本表达的提高与怀孕期间的先兆子痫(表现为高血压、浮肿和蛋白尿的临床病况)有关(Ngetal.，2003a)。另外，母体血浆中的胎盘特异性4(PLAC4)mRNA已成功用于非整倍体妊娠(如21-三体(trisomy21)、唐氏综合征)的非侵入式测试(Loetal.，2007)。此外，母体血浆中的胎儿人绒毛膜促性腺激素(hCG)转录本可以是妊娠滋养层疾病(GTD)的标志物，该疾病为母体宿主中胎儿组织的肿瘤性生长。循环胎儿RNA主要来源于胎盘(Ngetal.，2003b)。可以早在妊娠第4周检测这些胎儿RNA，并且该RNA在产后快速清除。
尽管如此，使用母体血浆中的循环胎儿RNA的产前诊断具有多种限制。第一种限制是循环的胎儿RNA与循环的母体RNA混合并且未被有效地分离。目前，根据以下假设鉴别了胎儿转录本，即在分娩前的孕妇中以及在她们的婴儿的脐带血中检测到的胎儿转录本在产后24或36小时内在母体血液中显著降低或消失(Maronetal.，2007)。第二种限制是由于仍不了解胎儿RNA的包装和释放，因此未建立富集循环胎儿RNA以提高诊断灵敏度的方法。克服这些限制的方法可能在于微泡的分离以及对其中胎儿RNA的分析。
若干事实表明，真核细胞脱落的微泡是母体血浆中循环胎儿RNA的载体。第一，微泡内的循环RNA受到保护而不受RNA酶的降解作用。第二，已证实循环胎儿RNA保留在母体血浆的非细胞部分中，这与包含这些胎儿RNA的微泡能够通过0.22μm膜过滤的主张一致。第三，与已知脱落微泡的肿瘤组织类似，作为假恶性胎儿组织的胎盘细胞最可能能够脱落微泡。因此，非侵入式产前诊断的新方法由以下步骤组成：从母体血浆中分离胎儿微泡，然后分析所述微泡内核酸的与某些疾病和/或其他医学病况有关的任何遗传性变体。
非侵入式产前诊断的假设情况如下：从孕妇中采集周围血液样本并进行磁力活化细胞分选(MACS)或其他亲和纯化以分离和富集胎儿特异性微泡。将微泡颗粒在PBS中重新悬浮并立即使用或保存在-20℃以备随后处理使用。按照生产商的说明使用QiagenRNA提取试剂盒从分离的微泡中提取RNA。对胎儿人绒毛膜促性腺激素(hCG)转录本的表达水平分析RNA内含物。与标准范围相比hCG表达水平的提高指示了妊娠滋养层疾病(GTD)的发展并且还需要对胎儿中该异常生长进行临床治疗。微泡技术的灵敏度使得有可能在表现出任何症状之前或在通过超声检查可检测结构变化之前的极早阶段检测出GTD。可以通过检查统计学显著个数的正常孕妇中的循环胎儿RNA样本确定hCG转录本水平的标准范围。
通过检查与这些疾病或医学病况有关的那些转录本，可以将产前诊断方法推广到其他疾病或医学病况的产前诊断和/或监测。例如，从来自母体血液的胎儿起源微泡中提取间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)核酸并进行分析是成神经细胞瘤的非侵入式产前诊断，它与激酶结构域内的突变或与ALK表达的提高密切相关(Mosseetal.，2008)。因此，本文所述的微泡方法和技术可以导致开创急需的非侵入式产前遗传诊断的新纪元。
实施例14：黑素瘤诊断
黑素瘤为黑素细胞(色素细胞)的恶性肿瘤，并且主要在皮肤中发现。它是皮肤癌的严重形式，并且占与皮肤癌相关所有死亡的75％。BRAF的体细胞激活突变(例如，V600E)是在人黑素瘤发生中所检测到的最早期和最常见的遗传畸形。激活的BRAF促进黑素瘤的细胞周期发展和/或存活。
目前，黑素瘤的诊断是基于身体检查和切除的活组织检查进行的。然而，活组织检查仅可以采集病变内有限数目的病灶并且可能得到假阳性或假阴性结果。外来体方法提供了诊断黑素瘤的更准确的方法。如上所讨论的，所述方法包括从受试者体液分离外来体并分析来自所述外来体的核酸的步骤。
为了确定黑素瘤脱落的外来体是否含有BRAFmRNA，我们在添加了除去外来体的FBS的DMEM培养基上培养原代黑素瘤细胞并使用实施例2中详细说明的类似程序收获培养基中的外来体。原代细胞系为Yumel和M34。Yumel细胞在BRAF不具有V600E突变，而M34细胞在BRAF具有V600E突变。从外来体提取RNA，然后通过RT-PCR分析是否存在BRAFmRNA。用于PCR扩增的引物为：BRAF正向(SEQIDNO：55)和BRAF反向(SEQIDNO：56)。扩增子的长度为118个碱基对(bp)并且覆盖了V600E突变所在的BRAFcDNA序列部分。如图16a所示，在来自原代黑素瘤细胞(Yumel和M34细胞)的外来体中检测到了118bp的条带，但是在来自人成纤维细胞或阴性对照的外来体中未检测到。由于可以在来自黑素瘤细胞和人成纤维细胞的外来体中检测GAPDH转录本，因此118bpPCR产物条带的阴性检测不是由于错误的RNA提取所造成的(图16b)。还对118bpPCR产物进行测序以检测V600E突变。如图16c和16d所示，如所预计的，来自Yumel细胞的PCR产物含有野生型BRAFmRNA。相反，如所预计的，来自M34细胞的PCR产物含有具有T-A点突变的突变体BRAFmRNA，其使得BRAF蛋白的氨基酸位置600处的氨基酸缬氨酸(V)被谷氨酸(E)代替。此外，在来自正常人成纤维细胞的外来体中不能检测到BRAFmRNA，表明并非所有组织来源的外来体中都含有BRAFmRNA。
这些数据表明，黑素瘤细胞将外来体脱落到血液循环中，因此通过从血清分离这些外来体并分析从其中所获得的核酸在BRAF中是否存在突变(例如，V600E)而可以诊断黑素瘤。还可以使用上述方法诊断与其他BRAF突变以及其他基因中的突变有关的黑素瘤。可以使用该方法诊断与BRAF以及其他核酸表达谱有关的黑素瘤。
实施例15：检测来自外来体的MMP水平以监测移植后病况。
器官移植是器官损坏的常用有效治疗。肾衰竭、心脏病、晚期肺病和肝硬化都是可以通过移植有效治疗的病况。然而，移植后并发症所引起的器官排异是异源移植受体长期存活的主要障碍。例如，在肺移值中，闭塞性细支气管炎综合征是影响存活率的严重并发症。在肾移植中，慢性异源移植肾病仍是肾异源移植失败的主要原因之一。局部缺血-再灌注损伤使心脏移植后的供体心脏受损，还使正位肝移植后的供体肝脏受损。一旦在早期检测到这些移植后并发症，则它们可以得到改善。因此，为了减轻有害并发症，监测移植后病况是至关重要的。
胞外基质中的改变有助于移植后并发症中的间质重塑。基质金属蛋白酶(MMP)参与胞外基质(ECM)蛋白的周转和降解。MMP是蛋白水解、锌依赖性酶的家族，目前已描述的成员有27个，它们表现出多结构域结构和底物特异性，并且在多种可溶性因子的加工、活化和失活中起作用。血清MMP水平可以指示移植后病况的状态。的确，循环MMP-2与血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatinC)、移植后持续时间和肾移植受体中的糖尿病有关(Changetal.，2008)。MMP-9的不均衡表达与肺移植后闭塞性细支气管炎综合征的发展有关(Hubneretal.，2005)。
如实施例4和表10所表明的，在成胶质细胞瘤细胞脱落的外来体中可以检测MMPmRNA(MMP1、8、12、15、20、21、24、26和27)。可以使用本发明的外来体方法监测移植状况，所述方法为从体液分离外来体并分析来自所述外来体的核酸。外来体分离程序与实施例2中详细说明的类似。实施例9中详细说明了分析外来体内所包含的核酸的本发明程序。肾移植后MMP-2表达水平的显著提高将表明移植后并发症的发病和/或恶化。类似地，肺移植后MMP-9水平的显著提高表明闭塞性细支气管炎综合征的发病和/或恶化。
因此，通过确定与移植后并发症有关的MMP蛋白的表达水平，所述外来体方法可以用于监测移植后状况。还预计可以推广该方法从而通过确定其他标志物基因的表达以监测移植后状况以及通过确定与这些医学病况有关的核酸遗传谱而监测其他医学病况。
实施例16-18：微泡可以是治疗剂或治疗剂的递送载体。
实施例16：微泡蛋白质诱导体外血管生成。
设计并实施了研究以证明成胶质细胞瘤微泡有助于血管生成。将脑内皮细胞系HBMVEC(30,000个细胞)(CellSystems，产品号#ACBRI-376，Kirkland，WA，USA)在24孔板的涂覆了Matrigel的孔上在以下培养基中进行培养：仅基础培养基(EBM)(LonzaBiologicsInc.，Portsmouth，NH，USA)、添加了成胶质细胞瘤微泡的基础培养基(EBM+MV)(7μg/孔)或添加了血管生成因子混合物的基础培养基(EGM；氢化可的松、EGF、FGF、VEGF、IGF、抗坏血酸、FBS和肝素；Singlequots(EBM阳性对照)。16小时后测量小管形成并用图像J软件分析。在存在成胶质细胞瘤微泡的情况下培养的HBMVEC表明小管长度在16小时内加倍。该结果相当于在存在血管生成因子的情况下培养的HBMCEC所得到的结果(图18a)。这些结果表明成胶质细胞瘤源微泡在引起脑内皮细胞中血管生成中起作用。
还分析了微泡中血管生成蛋白的水平并与成胶质细胞瘤供体细胞中的水平进行比较。使用人血管生成抗体阵列，我们能够检测参与血管生成的19种蛋白质。具体地，在细胞溶解缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)中使来自原代成胶质细胞瘤细胞的或来自从所述细胞分离的纯化微泡的总蛋白溶解并按照生产商的推荐加入至人血管生成抗体阵列中(Panomics，FremontCA，USA)。扫描阵列并用图像J软件分析。如图18b所示，在微泡中容易地检测到了19种血管生成蛋白中的7种，其中与成胶质细胞瘤细胞相比，基于总蛋白，有6种(血管生成素、IL-6、IL-8、TIMP-I、VEGF和TIMP-2)以较高水平存在(图18c)。与肿瘤细胞相比，微泡中含量最高的三种血管生成蛋白为血管生成素、IL-6和IL-8，其全部与神经胶质瘤血管生成有关，并且肿瘤恶性程度提高，则它们的水平也越高(25-27)。
还发现从原代成胶质细胞瘤细胞分离的微泡促进了人U87神经胶质瘤细胞系的增殖。在这些研究中，将100,000个U87细胞接种到24孔板的孔中，并允许在(DMEM-5％FBS)上或在添加了从原代成胶质细胞瘤细胞分离的125μg微泡的DMEM-5％FBS上生长三天。三天后，发现使用比尔克尔室(Burkerchamber)所确定的未处理U87细胞(图19a)的数目比添加微泡的那些细胞少(图19b)。在这段时间，未添加和添加的U87细胞分别提高了5倍和8倍(图19c)。因此，成胶质细胞瘤微泡看起来刺激了其他神经胶质瘤细胞的增殖。
实施例17：成胶质细胞瘤微泡被HBMVEC吸收。
为了证明成胶质细胞瘤微泡能够被人脑微泡内皮细胞(HBMVEC)吸收，用PKH67绿色荧光标记试剂盒(Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)标记纯化的成胶质细胞瘤微泡。将标记的微泡与HBMVEC在培养基(5μg/50000个细胞)中在4℃培育20分钟。清洗细胞并在37℃培育1小时。30分钟内，PKH67标记的微泡内化到HBMVEC内的内含体样结构中(图17a)。这些结果表明成胶质细胞瘤微泡可以通过脑内皮细胞内化。
当将荧光标记的微泡加入到原代成胶质细胞瘤细胞中时，获得了类似的结果。
实施例18：由成胶质细胞瘤微泡递送的mRNA可以在受体细胞中翻译。
为了确定成胶质细胞瘤来源的微泡mRNA是否可以递送到受体细胞并在其中表达，使用CMV启动子以＞95％的感染效率用表达分泌型长腹水蚤荧光素酶(Gaussialuciferase，Gluc)的自失活慢病毒载体感染原代人成胶质细胞瘤细胞。在此后的传代中，这些细胞稳定转导并产生微泡(分析了2-10个传代)。如上所述，从所述细胞中分离微泡并进行纯化。RT-PCR分析显示Gluc(555bp)和GAPDH(226bp)的mRNA存在于微泡中(图17b)。如使用定量RT-PCR所评价的，GlucmRNA的水平比GAPDH的更高。
将50微克纯化的微泡加入至50,000个HBMVE细胞并培育24个小时。在加入微泡后(0小时)、加入后15小时以及24小时，直接测量上清液中Gluc的活力。将上清液中的Gluc活力归一化为与微泡有关的Gluc蛋白活力。将结果表示为平均值±SEM(n＝4)。具体地，受体HBMVE细胞中的活力表明了微泡GlucmRNA的连续翻译。因此，可以将掺入到肿瘤微泡中的mRNA递送到受体细胞中并产生功能性蛋白。
所有实施例中的统计学分析是使用学生t-检验进行的。
参考文献
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表1：可以将成胶质细胞瘤微泡中的RNA用作敏感生物标志物。
使用巢式RT-PCR监测神经胶质瘤活检组织中以及从相同患者的冷冻血清样本纯化的外来体中的EGFRvIIImRNA。以蒙眼方式分析了来自30位患者的样本并且PCR反应对每个样本至少重复3次。在来自30位正常对照的血清微泡中未发现EGFRvIIImRNA。PP1表示由SEQIDNo：13和14组成的引物对。PP2表示由SEQIDNo：15和16组成的引物对。“-”表示“不可获得”。
*肿瘤移除手术后的天数
表2：表3中使用的缩写
缩写术语
A扩增
AEL急性嗜酸细胞白血病
AL急性白血病
ALCL间变性大细胞淋巴瘤
ALL急性淋巴细胞性白血病
AML急性髓性白血病
AML*急性髓性白血病(主要为治疗相关的)
APL急性早幼粒细胞白血病
B-ALLB-细胞急性淋巴细胞性白血病
B-CLLB-细胞淋巴细胞性白血病
B-NHLB-细胞非霍奇金淋巴瘤
CLL慢性淋巴细胞性白血病
CML慢性粒细胞性白血病
CMML慢性骨髓单核细胞性白血病
CNS中枢神经系统
D大片段缺失
DFSP隆凸性皮肤纤维肉瘤
DLBL弥漫性大B细胞淋巴瘤
DLCL弥漫性大细胞淋巴瘤
Dom显性
E上皮的
F框架
GIST胃肠道间质瘤
JMML幼年型粒单核细胞白血病
L白血病/淋巴瘤
M间充质的
MALT粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤
MDS骨髓发育异常综合征
Mis错义
MLCLS伴硬化的纵隔大细胞淋巴瘤
MM多发性骨髓瘤
MPD骨髓增生殖性疾病
N无义
NHL非霍奇金淋巴瘤
NK/T自然杀伤T细胞
NSCLC非小细胞肺癌
O其他
PMBL原发性纵隔B细胞淋巴瘤
pre-BAll前B细胞急性淋巴细胞白血病
Rec隐性
S拼接位点
T易位
T-ALLT-细胞急性淋巴母细胞性白血病
T-CLLT-细胞慢性淋巴细胞性白血病
TGCT睾丸生殖细胞瘤
T-PLLT细胞前淋巴细胞性白血病
没有研究(癌症类型)对测试基因具有可用的表达数据。
其测试基因的表达被上调或下调的癌症类型的上调#或下调#数。
在大多数癌症类型中，所有这些基因被显著性一致地上调(P＜10)。
doi：10.137/journalpone.0001149.001
在大多数癌类型中，所有这些基因被显著性一致地下调(P＜10-5)。
doi：10.1371/journal.pone.0001149.t002
注意：登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
注意：登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
表8：成胶质细胞瘤细胞中上调的微小RNA。
表9：成胶质细胞瘤细胞中下调的微小RNA。
表10.从成胶质细胞瘤细胞系中分离的微泡内包含的MMP基因。
注：基因符号是EntrzGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)分配的标准符号。
登录号是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
注：Hugo基因符号是HUGO基因命名委员会分配给各个基因的(http://www.genenames.org/)。Entrez_Gene_Ids是EntrzGene分配给各个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.g ov/sites/entrez？db＝gene)。
注：基因符号是EntrzGene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。登录号“CCDSXXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/)。登录号“ENSTXXXXXXXXXXX”是Ensembl唯一地分配给每个基因的(http://www.ensembl.org/index.html)。
基因符号登录号基因符号登录号基因符号登录号
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C2orf29CCDS2050.1CDC42BPACCDS1558.1COL17A1CCDS7554.1
C3NM_000064CDH1CCDS10869.1COL22A1CCDS6376.1
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CACNA1ENM_000721CHD1NM_001270CSS3NM_175856
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CADCCDS1742.1CHI3L1CCDS1435.1CTNNA3CCDS7269.1
CALB1CCDS6251.1CHMP1BNM_020412CTNND2CCDS3881.1
CALCRCCDS5631.1CHPPRCCDS6182.1CUBNCCDS7113.1
CAMSAP1NM_015447CHST1CCDS7913.1CUL4BNM_003588
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CAND2ENST00000295989CIAS1CCDS1632.1CX40.1CCDS7191.1
CAPN12CCDS12519.1CILPCCDS10203.1CXorf9CCDS14614.1
CARD9CCDS6997.1CKLFSF4CCDS10817.1CYFIP1CCDS10009.1
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CATCCDS7891.1CLK1CCDS2331.1DACH2CCDS14455.1
CBFA2T2CCDS13221.1CLSTN2CCDS3112.1DAXXCCDS4776.1
CBLN4CCDS13448.1CLUAP1NM_015041DBTCCDS767.1
CCDC11CCDS11940.1CMASCCDS8696.1DCC1CCDS6330.1
CCDC18NM_206886CMYA1CCDS2683.1DCHS1CCDS7771.1
CCKARCCDS3438.1CMYA3NM_152381DCHS2CCDS3785.1
CCL2CCDS11277.1CMYA5NM_153610DCTCCDS9470.1
CCNB3CCDS14331.1CNGB1NM_001297DDX51NM_175066
CCNYL3ENST00000332505CNGB3CCDS6244.1DDX58CCDS6526.1
CCR1CCDS2737.1CNTN4CCDS2558.1DEPDC2CCDS6201.1
CCT6ACCDS5523.1CNTN5NM_014361DEPDC5NM_014662
CCT6BNM_006584CNTN6CCDS2557.1DET1NM_017996
CD163CCDS8578.1CNTNAP2CCDS5889.1DFNB31CCDS6806.1
CD1ACCDS1174.1CNTNAP4CCDS10924.1DGKACCDS8896.1
CD200R1CCDS2969.1COBLL1CCDS2223.1DGKDCCDS2504.1
CD44CCDS7897.1COCHCCDS9640.1DGKKNM_001013742
CD6CCDS7999.1COH1CCDS6280.1DGKZCCDS7918.1
CD79ACCDS12589.1COL11A1CCDS778.1DHCR24CCDS600.1
基因符号登录号基因符号登录号基因符号登录号
DHX33CCDS11072.1EME2NM_001010865FAM53BCCDS7641.1
DHX8CCDS11464.1EMILIN1CCDS1733.1FAM54BNM_019557
DICER1CCDS9931.1EML1NM_004434FAM55CCCDS2945.1
DIP2BNM_173602ENC1CCDS4021.1FATNM_005245
DKFZp313G1735CCDS4073.1ENST00000294635ENST00000294635FAT3ENST00000298047
DKFZP434B0335NM_015395ENST00000298876ENST00000298876FAT4CCDS3732.1
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DLGAP1CCDS11836.1ENTHNM_014666FKSG44CCDS8102.1
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DNAH8CCDS4838.1EPHB1NM_004441FLJ14011CCDS12944.1
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DNHD2NM_178504EPM2ACCDS5206.1FLJ14640NM_032816
DNM1LCCDS8728.1EPPK1NM_031308FLJ20032CCDS3666.1
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DOT1LNM_032482ERCC2NM_000400FLJ20244CCDS12293.1
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基因符号登录号基因符号登录号基因符号登录号
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FRMPD4NM_014728GTF3C3CCDS2316.1ITGA9CCDS2669.1
FSTL5CCDS3802.1GUCA2ACCDS465.1ITGAENM_002208
FTCDCCDS13731.1GUCY1A2CCDS8335.1ITGB4BPCCDS13249.1
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GABRA1CCDS4357.1HAPLN4CCDS12398.1ITLN1CCDS1211.1
GABRR1CCDS5019.1HAS1CCDS12838.1ITPR1NM_002222
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GFAPCCDS11491.1HIP1NM_005338K6IRS2CCDS8833.1
GFRA1CCDS7593.1HIST1H3ACCDS4570.1KAL1CCDS14130.1
GH2CCDS11648.1HIST1H4ICCDS4620.1KBTBD11NM_014867
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GJA3CCDS9289.1HMGCLL1NM_019036KCNA4NM_002233
GLB1L3ENST00000299136HOXC10CCDS8868.1KCNB1CCDS13418.1
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GLI3CCDS5465.1HOXD4CCDS2269.1KCNC2CCDS9005.1
基因符号登录号基因符号登录号基因符号登录号
KCNC3CCDS12793.1LENG8CCDS12894.1LRRC48NM_031294
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注：基因符号是EntrzGene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
基因符号登录号基因符号登录号基因符号登录号
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基因符号登录号
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ZNHIT1NM_006349.2
ZNRF4NM_181710
ZSCAN5NM_024303.1
ZZZ3NM_015534.3
注：基因符号是EntrzGene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。

Claims (6)

1.检测mRNA中PCA-3和/或TMPRSS2-ERG的存在的试剂在制备用于诊断、预后或监测受试者的前列腺癌的药剂中的应用，所述试剂用于检测来自来源于所述受试者的尿液样本的微泡制备物的非外源核酸的提取物，其中所述尿液样本被处理以排除蛋白质、脂质、死细胞碎片以及其他污染物。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，使所述尿液样本经受尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其中使所述尿液样本经受过滤。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，通过0.8μm过滤器进行过滤。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其中，过滤接着进行超滤浓缩。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其中，过滤接着进行超速离心。
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