CN101918424A - 用于靶向由Drosha介导的微小RNA加工的致癌ALL-1融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

公开了用于通过靶向的与ALL-1融合蛋白的相互作用来减少ALL癌细胞增殖的组合物和方法。

Description

用于靶向由Drosha介导的微小RNA加工的致癌ALL-1融合蛋白
发明人：Carlo M.Croce
政府资助
本发明全部或部分地受到美国政府基金的资助。政府可以享有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年6月15日提交的美国临时申请号60/934,707和xxxxx提交的国际申请号PCT/US20xx/xxxxxx的权益。这两个申请的公开内容通过援引而完全和明确地合并入本文。
发明领域
本发明提供了用于调节小的非编码RNA(特别是pri-miRNA)的组合物和方法。特别地，本发明涉及化合物，特别是寡聚化合物，其在一些实施方案中与核酸分子杂交或者在空间上干扰核酸分子，所述核酸分子包含或编码小的非编码RNA靶，包括pri-miRNA。
序列表
本专利申请包括“序列表”部分。“序列表”的副本可从USPTO网站(seqdata.uspto.gov/sequence)以电子形式获得。该序列表的纸件副本和该序列表的计算机可读形式通过援引而合并入本文。“序列表”的电子副本还可在请求并缴纳在37 CFR 1.19(b)(3)中所列的费用后从USPTO获得。
发明背景
急性白血病是骨髓和血液的快速进行性恶性疾病，其导致骨髓和血液中被称为母细胞的未成熟的无功能细胞的积累。骨髓中母细胞的积累阻断正常的血细胞发育。结果，没有以足够的数目产生红细胞、白细胞和血小板。当所述疾病起源于骨髓淋巴细胞祖细胞时，它导致急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，而当所述疾病起源于骨髓祖先时，它导致急性髓性白血病(acutemyelogenous leukemia，AML)。
ALL是快速进展的癌症，其由骨髓淋巴细胞的恶性转化开始。ALL是儿童白血病的最常见类型，在所有年龄组中每年有3,000例新病例。经转化的、现在恶性的细胞作为白血病淋巴母细胞在骨髓中进行增殖和积累。所述淋巴母细胞阻断骨髓中正常的血细胞形成，从而导致红细胞、白细胞和血小板的产生不足。
高级淋巴瘤，也称为侵袭性淋巴瘤(aggressive lymphoma)，包括几种亚型的淋巴瘤，它们如果不进行治疗则进展较快。这些亚型包括，例如AIDS相关淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤和小无裂细胞淋巴瘤。与弥漫性大B细胞淋巴瘤相比，高级淋巴瘤的行为更具侵袭性，需要更强的化疗，并且更常常在儿童中发生。因为正在快速分裂的细胞对于抗癌剂更加敏感，并且因为年轻患者通常没有其他健康问题，所以这些淋巴瘤中的一些对于疗法显示出显著的应答。急性淋巴细胞白血病和高级淋巴瘤是儿童中最常见的白血病和淋巴瘤。这些疾病在极大程度上是多克隆的，这暗示了只要少量遗传变化就足以诱发恶性肿瘤。
ALL-1，也称为MLL，已从染色体带11q23中克隆出来，该位点是在与急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性粒细胞白血病(acutemyeloblastic leukemia，AML)两者相关的多种染色体异常中所牵涉的反复出现的位点(1，2)。染色体易位导致ALL1基因与超过50种不同的伙伴基因之一相融合，以及产生致白血病蛋白，所述致白血病蛋白由N-末端的All1序列和伙伴蛋白的部分组成，所述伙伴蛋白的部分由位于断裂点3’端的基因区段编码(同上)。ALL中最普遍的ALL1重排是由t(4；11)染色体易位而引起的ALL1/AF4嵌合基因。该重排与婴儿和成人中非常差的预后相关(3)。引起疾病的侵袭性的由All1融合蛋白解除调节的分子途径在很大程度上仍是未知的。
miRNA是短的具有20-22个核苷酸的RNA，其通过与靶信使RNA的3’非翻译区进行碱基配对而在转录后水平上负向调节基因表达。已在人中鉴定了超过400种miRNA，它们是进化上保守的。已经显示，miRNA调节各种生理学和病理学途径，例如细胞分化、细胞增殖和肿瘤发生(综述在4中)。用于测定人癌症中miRNA的表达谱的广泛研究揭示了在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、乳腺癌、结肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳头状甲状腺癌和内分泌胰腺肿瘤中发现的细胞类型特异性miRNA指纹(综述在5中)。
Calin等人说明，尽管miRNA基因仅代表哺乳动物基因组的1％，但是超过50％的miRNA基因位于与癌症中的扩增、缺失和易位相关的区域之中(6)。miRNA基因的此类体细胞变化明确地造成在癌症中发现的特异的表达模式。引起miRNA的癌症特异性失调的另外的因素是未知的，尽管最明显的候选者是转录调控。其他的可能性是，miRNA成熟为这样的因素。微小RNA(microRNA)的生物发生开始于由RNA聚合酶II产生的称为pri-miRNA的初级转录物(综述在7中)。在pri-miRNA中，miRNA自身被包含在～60-80个核苷酸中，这些核苷酸能在其自身上向后折叠从而形成茎-环发夹结构。这种发夹结构被微加工复合体(microprocessor complex)所识别并且从pri-miRNA中切除，所述微加工复合体由核RNA酶III酶(Drosha)和其结合伙伴DGCR8组成。被切除的miRNA发夹(称为pre-miRNA)与RAN-GTP和核输出蛋白5相联合地被转运至细胞质，在那里其被第二种RNA酶III酶(Dicer)进一步进行加工，所述Dicer释放带有5’磷酸和长度为2个核苷酸的3’突出端的具有22个核苷酸的成熟双链体RNA。反义RNA链被掺入RISC复合体中，所述RISC复合体通过碱基配对将反义RNA链靶向mRNA，并因而干扰mRNA的翻译或切割它。原则上，在该成熟过程中的任何步骤都能够影响miRNA的产生。
因而，对于通过由小的非编码RNA介导的机制来调节基因表达的试剂存在需要。因此，希望鉴定出能够通过调节细胞中miRNA的水平来增加或降低基因表达或活性的寡聚化合物。
因此，本发明提供了可用于调节pri-miRNA的水平、表达或加工的寡聚化合物和方法，包括依赖于诸如RNA干扰和dsRNA酶的作用机制以及反义和非反义机制的那些。一旦了解了本公开内容，本领域技术人员将无需过多的实验就能够鉴定出用于这些用途的化合物、组合物和方法。
发明概述
本发明基于如下发现：All1融合蛋白介导酶Drosha的募集而靶向编码特定miRNA的基因。这种募集现在被认为是相关miRNA的增强的表达的原因。
在一个方面，提供了这样的试剂，所述试剂通过由小的非编码RNA介导的机制来调节基因表达。因此，希望鉴定出这样的寡聚化合物，所述寡聚化合物能够通过调节细胞中miRNA的水平而增加或降低基因表达或活性。
在特定的方面，提供了可用于调节pri-miRNA的水平、表达或加工的寡聚化合物和方法，包括依赖于诸如RNA干扰和dsRNA酶的作用机制以及反义和非反义机制的那些。一旦了解了本公开内容，本领域技术人员将无需过多的实验就能够鉴定出用于这些用途的化合物、组合物和方法。
在特定的方面，提供了寡聚化合物，尤其是核酸和核酸样寡聚化合物，其靶向或者模拟包含或编码小的非编码RNA的核酸，并且起作用以调节小的非编码RNA(特别是pri-miRNA)的水平或者干扰它们的功能。
在特定的方面，提供了寡聚化合物，尤其是核酸和核酸样寡聚化合物，其靶向pri-miRNA，并且起作用以调节pri-miRNA的水平或者干扰它们的加工或功能。
在特定的方面，提供了寡聚化合物，其靶向pri-miRNA中的位于Drosha识别区域侧翼或与之重叠的区域。
另外，提供了寡聚化合物，其靶向位于Drosha切割位点侧翼或与之重叠的区域。还提供了提高pri-miRNA的水平的寡聚化合物。例如，本发明提供了靶向多顺反子pri-miRNA转录物中的Drosha识别区域的长度为15至30个核碱基的寡聚化合物。所述多顺反子pri-miRNA转录物可以为从中衍生出表1中所列的miRNA的多顺反子pri-miRNA转录物。
在特定的实施方案中，Drosha识别区域可以为表1中所列的一种或多种miRNA。此类寡聚化合物可以是反义寡核苷酸，并且可以包含一种或多种化学修饰。此外，此类寡聚化合物能够提高pri-miRNA水平。
还提供了用于调节细胞、组织或动物中的小的非编码RNA，特别是pri-miRNA的水平的方法，所述方法包括将所述细胞、组织或动物与本发明的一种或多种化合物或组合物相接触。
进一步提供了用于调节细胞中的衍生自多顺反子pri-miR转录物的miR的水平的方法，所述方法包括选择多顺反子pri-miR转录物；选择衍生自所选多顺反子pri-miR转录物的单种miRNA的Drosha识别区域；选择靶向所选Drosha识别区域或与所选Drosha识别区域充分互补的长度为15至30个核苷酸的寡聚化合物；以及将所述细胞与所述寡聚化合物相接触。
此类方法包括调节衍生自所选多顺反子pri-miRNA的单种成熟miRNA的水平，或者备选地调节衍生自所选多顺反子pri-miRNA的两种或更多种成熟miRNA的水平。
还提供了用于调节来自表1中所列的那些的pri-miRNA的水平的方法，所述方法包括将细胞与靶向此类pri-miRNA上的Drosha识别区域或与之充分互补的寡聚化合物相接触。
在此还提供了用于选择性地调节细胞中的miR家族的单个成员的方法，所述方法包括选择衍生自pri-miR转录物的miR家族的成员；鉴定靶向所选pri-miR转录物的Drosha识别区域或与之充分互补的一种或多种寡聚化合物，其中所鉴定出的寡聚化合物与从中衍生出该miR家族的其他成员的pri-miR转录物的Drosha识别区域缺乏充分的互补性；以及将所述细胞与此类所鉴定出的寡聚化合物相接触。
在此还提供了寡聚化合物，其包含第一链和第二链，其中至少一条链包含修饰，并且其中所述寡聚化合物链之一的部分能够与小的非编码RNA靶核酸杂交。
在此还提供了寡聚化合物，其包含第一区域和第二区域以及任选的第三区域，其中至少一个区域包含修饰，并且其中所述寡聚化合物的一部分能够与小的非编码RNA靶核酸杂交。
在此还提供了用于鉴定能够调节pri-miRNA水平的寡聚化合物的方法。选择pri-miRNA，并且如此地设计寡聚化合物，即使得它们靶向pri-miRNA序列中的各种靶区段或与之充分互补，所述寡聚化合物包括靶向所述pri-miRNA中的成熟miRNA序列和与之重叠的寡聚化合物。相比于未与所述寡聚化合物相接触的细胞而言与所述寡聚化合物相接触的细胞中pri-miRNA水平的提高表明，所述寡聚化合物调节所述pri-miRNA水平。
在此还提供了用于鉴定能够调节pri-miRNA水平的小分子的方法。选择pri-miRNA，以及就它们调节pri-miRNA水平的能力来对小分子进行评估。所述小分子可以结合至包含成熟miRNA序列或与成熟miRNA序列重叠的pri-miR的区域，或者Drosha识别区域。相比于未与所述小分子相接触的细胞而言与所述小分子相接触的细胞中pri-miRNA水平的提高表明，所述小分子调节所述pri-miRNA水平。
在此还提供了用于治疗和/或预防ALL和ALL相关疾病的诱饵(decoy)。
从下面的详细描述中，本发明的这些方面以及其他重要方面将会变得更加明显。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一张以彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本在请求并缴纳必要的费用后将由专利局提供。
图1.用于在具有ALL-1重排的白血病细胞系中检测miR-191和miR-155的RNA酶保护测定法。将20μg总RNA与体外转录的miR-191或miR-155的反义探针于43℃杂交过夜，随后用RNA酶进行处理。在含有8M尿素的15％聚丙烯酰胺凝胶上对经保护的探针片段进行解析。将经末端标记的φX174/Hinf I用作分子量标准参照物。由于大小大于200个核苷酸的标准参照物的密集排列，因而仅显示了151nt及以下的片段。作为上样对照，也使10μg总RNA经历与亲环蛋白探针的杂交。
图2A和2B.通过用抗Drosha抗体(Ab)进行免疫沉淀来从经ALL-1重排的白血病细胞中纯化Drosha蛋白。
图2A)免疫沉淀出的蛋白质的Western印迹检测。与All1 N-末端表位反应的Ab 169用于检测All1/Af4和All1/Af9。为了Drosha的明确鉴定，通过IP来纯化在用pCK-Drosha-Flag质粒转染的K562细胞中外源表达的重组Drosha(Drosha：FLAG)。在该分析中使用20μg的白血病细胞的核提取物或约2.5μg的经免疫纯化的Drosha。需注意，外源Drosha是从核提取物中纯化出的，而Drosha：FLAG来自全细胞裂解物。
图2B)用抗Drosha抗体从用RNA酶或DNA酶处理的SEMK2核提取物中免疫沉淀出的蛋白质的Western印迹检测。
图3.从经质粒转染的细胞中和从ALL1相关白血病细胞系中免疫纯化出的Drosha的体外切割测定法。在所有反应中使用相等量的通过Western分析(图2A)确定的Drosha；相应体积的未稀释的样品为10μl Drosha：FLAG、5μl SEMK2 Drosha和20μl PER377 Drosha。在9％变性聚丙烯酰胺凝胶上对miR-191和miR-155的切割产物进行解析(左边)。从凝胶上切出所述切割产物，进行电洗脱，并经历使用重组Dicer酶的进一步切割。将15％变性凝胶用于解析和鉴定长度为22个核苷酸的成熟产物(右边)。
图4A-E.在miR-191和miR-23a基因组基因座中Drosha的All1/Af4依赖性定位，以及All1/Af4敲低(knockdown)对于Drosha募集的影响。
图4a)从用SEMJ siRNA处理的SEMK2细胞中去除大多数的All1/Af4蛋白。
图4B-4D)用于测定正常All1、All1/Af4和drosha蛋白向编码miR-191、miR-155、miR-23a和miR-27a的基因组基因座的募集的ChIP分析。所测试的染色质来自用非功能性siRNA MVJ处理的SEMK2细胞，或者来自用敲低大多数All1/Af4的SEMJ siRNA处理的细胞。
图4E)下列序列的序列列表：编码微小RNA-191的人基因组片段的核苷酸序列[SEQ ID NO.：xx]，其被克隆到pGEM3Z载体(Promega)中，并且在RNA酶保护测定法中用作探针；编码微小RNA-155的人基因组片段的核苷酸序列[SEQ ID NO.：xx]，其被克隆到pGEM3Z载体(Promega)中，并且在RNA酶保护测定法中用作探针；编码微小RNA-23a的人基因组片段的核苷酸序列[SEQ ID NO.：xx]，其被克隆到pGEM3Z载体(Promega)中，并且在RNA酶保护测定法中用作探针；编码微小RNA-27a的人基因组片段的核苷酸序列[SEQ ID NO.：xx]，其被克隆到pGEM3Z载体(Promega)中，并且在RNA酶保护测定法中用作探针。
图5.All1/Af4敲低对于pri miR-191的积累的影响。在用非活性MVJ siRNA处理的，或者敲低了All1/Af4(SEMJ)或Drosha的SEMK2细胞中测试pri miR-191、pri miR-155、pri miR-23a和pri miR-27a这些前体，以及它们的加工产物的丰度。通过RNA酶保护测定法来鉴定RNA(参见正文)。需注意，Drosha的敲低增加了所有初级转录物的丰度。相反地，All1/Af4(SEMJ)的敲低与pri miR-191和primiR-23a的较高的丰度相关。
图6.在具有t(4；11)染色体易位的白血病细胞系中miR-191的上调。来自具有t(4；11)的MV4；11、RS4；11和SEMK2-all pro-B细胞，来自pro-B细胞REH和380，以及来自pre-B细胞系697的RNA(20μg的等分试样)的Northern分析。RNA在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并电印迹至尼龙膜。通过与经末端标记的寡核苷酸杂交来鉴定长度为22个寡核苷酸的miR-191。对于KG1和K562细胞(均没有ALL1重排)所进行的类似的Northern分析表明了与380和697细胞一样的低的表达水平(未显示)。
图7A和7B.通过RNA酶保护测定法(RPA)来鉴定体内产生的(左边的凝胶)或通过用Drosha和Dicer进行体外切割而产生的(右边的凝胶)miR前体和经加工的RNA。显示了通过用T7 RNA聚合酶进行体外转录而合成的miR-191探针的序列[SEQ ID NO：xx](图7A)和miR-155探针的序列[SEQ ID NO：xx](图7B)。成熟的微小RNA和侧翼pGEM 3Z载体序列分别以红色和灰色字母显示。标明了用于产生失控转录物的限制位点。垂直的箭头指明了从参考文献11预测的关于miR-191的Drosha切割位点，或者在参考文献9中报道的关于miR-155的Drosha切割位点。在所述探针序列下方概括了细胞RNA和经均一地标记的探针之间的杂交产物的预测的RNA酶保护片段，以及体外切割产物(通过Drosha或Dicer)的预测的RNA酶保护片段。RPA和体外切割测定法的产物在单个变性凝胶上进行解析。对于体外切割测定法，使用Drosha：FLAG。在从凝胶上切出和纯化之后，用重组的Dicer消化分别衍生自miR-191和miR-155探针的64和61nt的切割产物。在关于miR-155的测定法中，不能在该凝胶中解析53和61nt的RPA保护片段以及体外切割产物，它们的相对位置用箭头标示出。
图8A和8B.在图5中的RNA酶保护测定法之中使用的miR-23a探针[SEQ ID NO：xx](图8A)和miR-27a探针[SEQ ID NO：xx](图8B)。成熟的微小RNA和侧翼pGEM 3Z载体序列分别以红色和灰色字母显示。含有miR-23a发夹和miR-27a发夹的pGEM 3Z重组体分别用NaeI和Bsu36I进行线性化，并用作模板以用于通过使用SP6 RNA聚合酶来产生反义探针。
发明详述
以下是本发明的特定实施方案的描述。
如本文所使用的，pri-miRNA转录物中的“Drosha识别区域”这一术语包括成熟miRNA，以及相对于此类成熟miRNA的5’Drosha切割位点来说在5’方向上直至25个核苷酸，和相对于此类成熟miRNA的3’Drosha切割位点来说在3’方向上直至50个核苷酸。在另外的实施方案中，Drosha识别区域包括成熟miRNA，以及相对于此类成熟miRNA的5’Drosha切割位点来说在5’方向上直至15个核苷酸，和相对于此类成熟miRNA的3’Drosha切割位点来说在3’方向上直至40个核苷酸。在一些方面，Drosha识别区域是受到靶向该区域的寡聚化合物强烈影响的区域，即寡聚化合物向pri-miRNA的该区域的靶向导致pri-miRNA的水平提高至大于3.5倍。在其他方面，pri-miRNA的水平受到靶向该区域的寡聚化合物的适度影响，即寡聚化合物向该Drosha识别区域的靶向导致pri-miRNA的水平提高至1.5至2.5倍。
如本文所使用的，术语“Drosha切割位点”用于指距pri-miRNA的末端发夹环和茎的衔接点大约22个核碱基的位点。通过选择Drosha酶的切割位点来确定miRNA的一个末端。
在具有ALL1重排的白血病细胞系中失调的miRNA的鉴定
通过应用miRNA微阵列分析，我们测定了具有ALL1重排的人白血病细胞系的miRNA表达谱。在具有经重排的ALL1的细胞系(包括具有t(4；11)的SEMK2和RS4；11细胞以及具有t(9；11)的PER377细胞)中，发现总共18种miRNA以统计学显著的方式被上调。无ALL1异常的两种pro-B细胞系380和REH未显示上调，如表1中所显示的。
表1显示了具有和没有ALL1重排的细胞的微小RNA表达谱的比较。通过用总RNA探查微小RNA-芯片以三次重复测定了微小RNA表达谱，所述总RNA来自表达ALL-1融合蛋白的三种细胞系和拥有相似表型但没有ALL-1异常的两种细胞系。粗体miR的基因组基因座先前被鉴定为正常ALL-1的结合位点(14)。
Figure GPA00001027046800111
Figure GPA00001027046800121
*SAM鉴定出具有统计学上显著的得分的基因(即成对t检验)。每种基因基于其相关于该基因的重复测量值的标准偏差而言在基因表达方面的变化而被分派一定的得分。具有大于阈值的得分的基因被认为可能是显著的。
**偶然鉴定出的此类基因的百分比是假发现率(FalseDiscovery Rate)的q值。本文中所研究的miR-155和27a在具有ALL1易位的细胞系中不被上调。
Northern分析支持并扩大了这些发现(见图6)。为了证实和扩展微阵列的一些结果，通过应用RNA酶保护测定法而测定了在该分析中排列首位的miR-191以及在具有ALL1基因重排的品系中未显示差异表达的miR-155的表达(见图1)。
尽管在REH和380细胞中几乎不能检测到miR-191成熟种类，但它在表达All1融合蛋白的品系中是丰富的，所述品系包括ML-2(具有t(6；11)染色体易位)、PER377、SEMK2和RS4；11细胞。相反地，成熟miR-155在380和REH细胞中以相比于其他细胞而言显著更高的水平进行表达。该测定法还显示，pri-miR-191保护(表达)的程度在除了RS4；11之外的所有白血病细胞中是相似的，无论成熟种类的表达水平如何。这说明，在ALL1相关白血病中成熟miR-191的较高丰度不是由于pri-miRNA的过量产生而造成的。
All1融合蛋白，All1/Af4和All1/Af9，在体内与Drosha发生物理相互作用
Drosha和All1融合蛋白两者向细胞核的定位表明后者影响由Drosha介导的miR-191加工。为了测试Drosha和All1融合蛋白之间的物理相互作用，我们应用了共免疫沉淀方法。先前已报道了，外源表达的Drosha：FLAG装配成称为微加工复合体的复合体(8，9，10)。此外，发现Drosha：FLAG装配成＞2MDa的第二种且更大的多蛋白复合体，其包含许多RNA结合蛋白，包括EWS(10)。我们使用抗Drosha抗体来使在SEMK2和PER377细胞核中产生的内源Drosha沉淀。
平行地，使用抗Flag单克隆抗体(mAb)从经转染的K562细胞的全细胞裂解物中沉淀出Drosha-Flag。通过添加过量的先前用于产生抗体的合成肽来洗脱在该免疫沉淀物中的Drosha。使洗出物经历Western印迹分析(见图2)，以及经历体外切割测定法以测量miR-191和miR-155探针的加工(见图3)。
Western印迹分析证明了两种已知的Drosha相关蛋白(DGCR8和EWS)的共免疫沉淀(见图2A)。引人注目地，融合蛋白All1/Af4和All1/Af9与Drosha共沉淀(同上)。相反地，正常p300 All1没有共沉淀。通过使用抗Af4 C-末端抗体来进行的针对All1/Af4的相互免疫沉淀(reciprocal immunoprecipitation)没有共免疫沉淀出Drosha，虽然这种抗体有效地使该融合蛋白沉淀(数据未显示)。All1融合蛋白与Drosha的共免疫沉淀不是由于交叉反应，因为抗Drosha抗体不从其中Dro sha蛋白被干扰RNA下调的SEMK2细胞之中沉淀出All1/Af4(见图2B)。
抗Af4抗体没有共沉淀出Drosha表明，仅有小部分的All1/Af4与Drosha相联合，或者所述联合掩蔽了Af4 C-末端区域上的相关表位。我们下一步寻求确定All1/Af4与Drosha之间的联合是否是RNA依赖性的和/或DNA依赖性的。为此，用RNA酶或DNA酶充分处理SEMK2核提取物，并使其经历用抗Drosha抗体进行的IP。Western印迹分析显示在经RNA酶处理的核提取物的免疫沉淀物中存在有All1/Af4、Drosha、DGCR8和EWS蛋白(图2B)。值得注意的是，DNA酶处理取消了Drosha与All1/Af4的联合，而与其他蛋白质的联合得到维持(同上)。这些结果暗示，基因组DNA参与了All1/Af4与Drosha复合体之间的物理相互作用。
体外切割测定法显示，所有的Drosha制备物产生三个种类的miR-191切割产物。其中，具有约66个核苷酸的种类被鉴定为pre-miR-191，因为其被重组Dicer酶切割(见图3，右边)。类似地，据推测由具有55、59和65个核苷酸的三个种类组成的miR-155加工产物的混合物显示被Dicer进一步切割，从而导致产生长度为22个碱基的产物(同上)。这些结果表明，这三种经亲和纯化的Drosha制备物对于miR-191和miR-155模板都是在功能上有活性的。包含All1/Af4的Drosha展示出最强的加工活性，而包含All1/Af9的Drosha具有较少的加工活性，类似于Drosha：FLAG制备物的加工活性。
由All1/Af4介导的向miRNA基因座的Drosha募集
All1/Af4和Drosha之间的物理相互作用对于细胞DNA的依赖性促使我们研究这两种蛋白质在miR-191基因上的占位。我们还发现，正常All1结合至位于miR-191发夹上游3.5和1.5kb处的DNA区域，以及结合至跨越发夹序列本身的区域(11)。在下列细胞上进行了染色质免疫沉淀分析：1)用SEMK2-融合衔接点特异性siRNA转染的SEMK2细胞；所述SEMK2-融合衔接点特异性siRNA以＞90％的效率下调All1/Af4蛋白，2)表达siRNA的SEMK2细胞，所述siRNA靶向不同的ALL1/AF4衔接点，从而不影响细胞中该融合蛋白的水平(这两种siRNA分别称为SEMJ和MVJ siRNA；转染子中All1/Af4蛋白的量显示在图4A中)。
包含MVJ siRNA的细胞以及完整SEMK2细胞(未显示)的染色质的分析显示了正常All1、All1/Af4和Drosha蛋白在miR-191基因座内的三个区域上的共占位(见图4B)。相反地，没有检测到All1/Af4和Drosha在miR-155发夹上的占位(见图4C)。
通过用SEMJ siRNA进行处理而施行的All1/Af4的敲低导致该融合蛋白在miR-191基因内的三个位点上的占位减少，并且同时发生Drosha结合的丧失(见图4B)。这表明了由All1/Af4介导的向miR-191基因座上的Drosha募集。本研究进一步扩展至两种另外的微小RNA基因座。miR-23a和miR-27a基因以5’至3’构型进行排列，并且以84个核苷酸的间距间隔开。表达微阵列分析显示，miR-23a，而非miR-27a，在表达All1融合蛋白的白血病细胞中被上调(见表1)。
正常All1、All1/Af4和Drosha在跨越发夹序列的miR-23a和27a区域内的蛋白质结合谱分别类似于miR-191和miR-155的谱(见图4D)。
All1/Af4和Drosha两者与miR-23a基因的结合在敲除了All1/Af4(SEMJ)的SEMK2细胞中被减少或消除(同上)。
All1/Af4敲低引起特定pri-miRNA的积累。
为了研究与编码miR-191和miR-23a的基因组区域结合的All1/Af4和Drosha的量减少的后果，我们测定了所述基因座的初级RNA产物和经加工的RNA产物的表达水平，与由miR-155和miR-27a基因编码的那些相比较。通过RNA酶保护测定法来分析来自用MVJsiRNA或者SEMJ siRNA或Drosha特异性siRNA处理的SEMK2细胞的产物(见图5)。
All1/Af4和Drosha敲低均导致miR-191和miR-23a的初级转录物的积累，这表明Drosha功能因任一所述操作而受到损害。由Drosha和All1/Af4的敲低而引起的明显的损害反映在长度为22个碱基的成熟miR-23a的丰度减少。相反地，与用惰性的MVJ siRNA处理的细胞相比，在用SEMJ siRNA处理的细胞中All1/Af4的敲低不增加pri-miR-155或pri-miR-27a的丰度(Drosha的敲低引起pri-miR-155和pri-miR-27a的积累)。这表明，All1/Af4的去除损害了pri-miR-191和pri-miR-23a的加工，而不损害pri-miR-155或pri-miR-27a的加工。
讨论
本文提出了已被鉴定为在ALL1相关白血病中被上调的几种微小RNA。进一步地，我们显示，致白血病All1融合蛋白(All1/Af4和All1/Af9)与Drosha(对于微小RNA生物发生来说所必需的核RNA酶III酶)发生物理相互作用。在初级转录物、前体和成熟miRNA种类的水平之间的差异方面，首次注意到由Drosha和其相关蛋白介导的核pri-miRNA加工极大地影响体内miRNA产生这一见解。人胚胎干细胞表达可测量的量的编码let-7a-1的初级转录物，但缺乏成熟种类(12)。类似地，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中miR-155的水平仅显示出与其中包含miR-155的BIC RNA的水平弱相关(13)。
为了测定在小鼠胚胎中所有三种分子形式的let-7g表达的最近研究显示，成熟种类可在妊娠10.5天时检测到并且在14.5天时是高的，然而初级转录物在整个发育过程中是高表达的(14)。类似的差异也在已知与小鼠发育相关的几种miRNA中发现。由于没有检测到前体种类的积累，因此在胚胎发育过程中发生的分化事件激活特定miRNA的Drosha加工。在同一研究中，作者通过比较初级转录物和相应miRNA表达的数据集而将他们的发现进一步扩展至原发人类肿瘤，并且显示了支持Drosha加工阻断(其可能引起在癌症中观察到的miRNA的下调)的证据(同上)。显然地，接下来需要探究作为针对特定miRNA的Drosha加工的激活或抑制之基础的分子机制。
通过对表达All1/Af4或者在该表达方面受到损害(由于强制接受针对All1/Af4的siRNA)的白血病细胞应用ChIP分析和RNA酶保护测定法，本发明人现在在此显示了All1/Af4和Drosha两者向特定微小RNA基因组基因座的募集，以及初级转录物的加工的增加。在产生All1融合蛋白的细胞系中成熟微小RNA的产生的明显提高现在被认为是由于Drosha与相应基因座的结合。
在特定的方面，本文提供了通过其可调节微小RNA的新机制，以及All1白血病蛋白的新功能。
miR-191的上调被发现与急性髓性白血病中的差的预后相关(15)。还在6种不同类型的实体瘤(包括结肠癌、乳腺癌和肺癌)的研究中观察到miR-191的上调(16)。
实施例
材料和方法
细胞培养和抗体
人pro-B ALL 380、pre-B ALL 697、具有t(6；11)的ML-2以及具有t(4；11)的SEMK2和MV4；11从DSMZ获得。REH pro-B ALL、具有t(4；11)的RS4；11以及K562从ATCC购买。具有t(9；11)的PER377从Ursulla Kees博士处获得。所有细胞系维持在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。针对Drosha的抗体(ab12286)、针对DGCR8的抗体(ab24162)和针对Drosha合成肽的抗体(ab12307)从Abcam购买。针对EWS的抗体由Bethyl Laboratories制备(A300-308A)。抗FLAG M2单克隆抗体和3×FLAG肽从Sigma获得。描述了针对ALL-1N-末端的Ab169(17)。通过使用跨越AF4残基2323-2886的由细菌合成的多肽在兔中产生针对AF4 C-末端的抗体。
微阵列分析
如先前所描述的来进行微阵列分析(18)。原始数据在GENESPRING7.2软件(zcomSilicon Genetics，Redwood City，CA)中进行正规化和分析。通过使用GENESPRING正规化选项和BIOCONDUCTOR软件包(www.bioconductor.org)的整体中值正规化来对表达数据进行中值中心化(median-centered)。通过使用GENESPRING ANOVA工具和微阵列显著性分析(SAM)软件来进行统计学比较。
miRNA检测
根据制造商的说明书，使用来自Ambion的RPA III试剂盒进行RNA酶保护测定法(RPA)。每个反应使用5-20μg的用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取的总RNA。亲环蛋白反义对照模板从Ambion获得，并通过使用T7 RNA聚合酶来进行标记。关于相应于pri-、pre-和成熟miR-191和miR-155的经保护的种类的鉴定，参见图7。
载体构建和探针制备
跨越miR-191发夹的基因组片段通过下列方式来制备：用Pf1MI-Bsu36I消化BAC克隆RP13-131K19，补平末端，并且以两个方向亚克隆到pGEM-3Z(Promega)的SmaI位点中。这些构建体用BamHI来线性化，并用作模板以用于通过使用具有T7 RNA聚合酶的Riboprobe体外转录试剂盒(Promega)来产生RNA探针。具有有义和反义方向的探针在变性凝胶中进行纯化，并且分别用于体外切割测定法和RNA酶保护测定法。从人IMAGE cDNA克隆5176657中PCR扩增出嵌入到BIC基因的第三个外显子中的miR-155发夹区域。
将分别相应于核苷酸261-281和401-421(参考文献13)的系有EcoRI位点的正向引物ATGCCTCATCCTCTGAGTGCT[SEQ ID NO：xx]和系有HindIII位点的反向引物CTCCCACGGCAGCAATTTGTT[SEQ ID NO：xx]用于扩增。
随后，将PCR产物克隆到pGEM-3Z载体的EcoRI-HindIII位点中。分别通过使用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶来合成有义和反义RNA探针。如图8中所显示的，PCR扩增出跨越miR-23a和miR-27a发夹序列的基因组区域，并克隆到pGEM-3Z载体的HindIII-EcoRI位点中。
抗-*SAM鉴定出具有统计学上显著的得分的基因(即成对t检验)。每种基因基于其相关于该基因的重复测量值的标准偏差而言在基因表达方面的变化而被分派一定的得分。具有大于阈值的得分的基因被认为可能是显著的。
**偶然鉴定出的此类基因的百分比是假发现率(FalseDiscovery Rate)的q值。本文中所研究的miR-155和27a在具有ALL1易位的细胞系中不被上调。
通过分别用NaeI和Bsu36I消化所述重组体来制备miR-23a和miR-27a的探针，随后用Sp6 RNA聚合酶来进行体外转录。
免疫沉淀
根据制造商的说明书(AMAXA)，通过使用Nucleofector仪器，用pCK-droSha-flag转染K562细胞。将2×108个经转染的细胞裂解并经历使用抗Flag M2单克隆抗体的IP，如参考文献11中所描述的。简而言之，将25mg全细胞裂解物在用G蛋白Sepharose(GEHealthcare)预澄清后与500μg单克隆抗体于4℃进行温育，O/N。用G蛋白Sepharose来沉淀出免疫复合物，洗涤，并通过以在缓冲液中0.4mg/ml的浓度添加3×FLAG肽来洗脱在该沉淀物中的Drosha：FLAG，所述缓冲液包含30mM Hepes，pH7.4/100mM KCl/5％甘油/0.2mM EDTA/7.5mM MgCl2/2mM DTT。重复洗脱三次，每次在室温(RT)下进行30分钟，并且将洗出物合并。对于内源Drosha的免疫沉淀，使50mg的通过Dignam等人的方法(19)制备的来自SEMK2或PER377细胞的核提取物经历使用300μg抗Drosha抗体的IP。购自Abcam的抗Drosha抗体通过用源自Drosha的N-末端区域的合成肽进行免疫而在兔中产生，并且所述肽是商购可得的。
采用小规模IP的实例显示，向抗Drosha-免疫沉淀物中添加过量的Drosha肽释放出Drosha；该操作程序使得能够纯化出以天然形式的Drosha复合体。将所述肽以0.4mg/ml的浓度用于洗脱Drosha。在一些IP中，如图2B中所显示的，将250μg SEMK2核提取物与50μL的不含DNA酶的RNA酶(Roche)或者与50U的RQ1 DNA酶(Promega)相混合，并经历用A蛋白Sepharose(GE Healthcare)于室温预澄清60分钟。在这之后用10μg抗Drosha抗体进行IP。
pri-miRNA的体外加工
基本上如所描述的(8)来进行体外加工测定法。通过用Western印迹分析测量Drosha的含量来确定Drosha：FLAG以及两种Drosha制备物的待添加的量。简而言之，将包含经免疫纯化的Drosha、7.5mMMgCl2、20U的RNA酶抑制剂(RNasin，Promega)、2mM ATP、2mM DTT和1×105cpm的经标记的探针的20μL反应混合物于37℃温育90分钟。通过下列方式来终止所述反应：添加含有20mM Tris，pH8.0/10mMEDTA/1％SDS/2μg蛋白酶K(Roche)的20μL缓冲液，随后于45℃温育30分钟。在用苯酚/氯仿和氯仿进行提取后，对经加工的产物进行乙醇沉淀，并在含有8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶上进行解析。
RNA干扰
使用试剂盒V和程序T-20，通过应用Amaxa Nucleofector，转染靶向SEMK2细胞中的ALL-1/AF4和Drosha mRNA的siRNA双链体。转染后24小时，收获细胞，并经历第二次转染，随后在培养物中再生长48小时。SEMJ siRNA和MVJ siRNA的靶序列分别是5’-AAGAAAAGCAGACCUACUCCA-3’[SEQ ID NO：xx]和5’-AAGAAAAGGAAAUGACCCATT-3’[SEQ ID NO：xx]。
前一种siRNA靶向SEMK2细胞中所产生的ALL-1/AF4mRNA，而后一种靶向MV4；11细胞中所产生的ALL-1/AF4 mRNA。需注意，这两种siRNA中的前8个核苷酸相应于紧在融合点的5’处的ALL-1 mRNA序列并且是相同的，而随后的13个核苷酸相应于AF4序列，其在融合物之间并因此在siRNA之间而变化；因此，MVJ siRNA在SEMK2细胞中将会是无活性的。Drosha siRNA的序列来自参考文献10。siRNA由Dharmacon合成。
染色质免疫沉淀(ChIp)测定法
使用来自Upstate的ChIP测定法试剂盒(具有较小的更改)来进行ChIP测定法。简而言之，在含有50mM Hepes，pH7.4/140mM NaCl/1％Triton X/0.1％脱氧胆酸钠/1×完全蛋白酶抑制剂(Roche)的1mL缓冲液中，裂解5×107个经甲醛处理的SEMK2细胞。处理50μL等份试样的制备物以使交联逆转，用蛋白酶K去除蛋白质，用苯酚/氯仿进行提取，并测定DNA浓度。每ChIP使用包含25μg DNA的染色质制备物等份试样。在逆交联过程中，以200μg/mL的浓度添加不含DNA酶的RNA酶(Roche)。在用蛋白酶K去除蛋白质后，根据制造商的说明书，使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)将DNA纯化在50μL TE中。将1μL等份试样用于PCR。引物序列列于表2中。
表2：在图4中的ChIP分析之中所使用的引物的序列(显示为5’至3’)
经ChIP分析的区域 正向引物 反向引物
miR-191发夹上游3.5kb GTAGCTGCCACTACCACAGAT[SEQ ID NO：xx] AGCCAGAGTCAGATGCTCAGT[SEQ ID NO：xx]
miR-191发夹上游1.5kb TACAAGCTACGTAGCGCGAGA[SEQ ID NO：xx] ACTCGGCCTCCTAAGACTGAGG[SEQ ID NO：xx]
miR-191发夹 GTTCCCTCTAGACTCCGTTTCA[SEQ ID NO：xx] AGTCACTACCATTGCAGCCCTA[SEQ ID NO：xx]
miR-155发夹 TGAGCTCCTTCCTTTCAACAG[SEQ ID NO：xx] GTTGAACATCCCAGTGACCAG[SEQ ID NO：xx]
miR-23a发夹 TCTAGGTATCTCTGCCTCTCCA[SEQ ID NO：xx] AGCATCCTCGGTGGCAGAGCTCA[SEQ ID NO：xx]
miR-27a发夹 TGAGCTCTGCCACCGAGGATGCT[SEQ ID NO：xx] ACAGGCGGCAAGGCCAGAGGA[SEQ ID NO：xx]
诊断学、药物发现和治疗学
另外，本发明的寡聚化合物和组合物可用于研究、药物发现、试剂盒和诊断学、以及治疗学。
关于用于研究，将本发明的寡聚化合物用于干扰它们所靶向的核酸分子的正常功能。将用本发明的一种或多种寡聚化合物或组合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用所述化合物或组合物处理的对照细胞或组织相比较，并且就核酸表达的差异水平来分析所产生的模式，因为它们例如与所检查的基因的疾病关联、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能有关。这些分析可在经刺激的或未刺激的细胞上，以及在其他影响表达模式的化合物存在或不存在下进行。
关于用于药物发现，将本发明的寡聚化合物用于阐明在小的非编码RNA、基因或蛋白与疾病状态、表型或状况之间存在的关系。这些方法包括检测或调节靶，其包括将样品、组织、细胞或生物体与本发明的寡聚化合物和组合物相接触，在处理后某些时间处测量靶的水平和/或下游基因产物(包括mRNA或由其编码的蛋白质)的水平、相关的表型或化学终点，并且任选地将测量值与未处理的样品、阳性对照或阴性对照相比较。这些方法还可以与其他实验平行地或相组合地进行，以测定用于靶确认过程的未知基因的功能，或测定特定基因产物作为疾病治疗或预防的靶的有效性。
关于用于试剂盒和诊断学，单独地或与其他化合物或治疗学相组合地，本发明的寡聚化合物和组合物可以作为工具而用于差异和/或组合分析中，以阐明在细胞和组织内表达的非编码或编码核酸的部分或全部互补物的表达模式。
化合物和组合物的特异性和灵敏度也能由本领域的技术人员针对治疗用途来加以利用。反义寡聚化合物已在动物(包括人)的疾病状态的治疗中用作治疗性部分。反义寡核苷酸药物(包括核酶)已被安全而有效地施用给人，并且许多临床试验目前正在进行中。因此确定，寡聚化合物可以是有用的治疗学形式，其可以被设置成在用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案中有用的。
关于治疗学，通过施用化合物和组合物来治疗怀疑具有疾病或病症的动物(优选地，人)，所述疾病或病症呈现出可以通过调节所选择的小的非编码靶核酸的表达而被治疗、改善或改良的状况。例如，在一个非限制性的实施方案中，所述方法包括下述步骤：对所述动物施用有效量的调节剂或模拟物或者使所述动物与有效量的调节剂或模拟物相接触，以治疗、改善或改良与疾病或病症相关的状况。所述化合物有效地调节所述小的非编码RNA靶的活性或功能，或者抑制所述小的非编码RNA靶的表达或水平。在某些实施方案中，所述小的非编码RNA靶是多顺反子pri-miRNA、单顺反子pri-miRNA、pre-miRNA或miRNA。在另外的实施方案中，所述小的非编码RNA靶是miRNA家族的单个成员。备选地，选择miRNA家族的两个或更多个成员用于调节。在进一步的实施方案中，所述小的非编码RNA靶是经选择性地加工的miRNA。在一个实施方案中，在动物中所述靶的水平、活性或表达被抑制约10％。在另一个实施方案中，在动物中靶的水平、活性或表达被抑制约30％。进一步地，在动物中靶的水平、活性或表达被抑制50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、或者95％或更多。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的化合物在制备用于治疗任何和所有与miRNA和miRNA家族相关的状况的药物中的用途。
可在已知含有小的非编码RNA或其前体的动物的血清、脂肪组织、肝或者任何其他体液、组织或器官中测量靶水平的降低。此外，在被分析的流体、组织或器官中所包含的细胞含有由所述小的非编码RNA靶本身调控或调节的下游靶的核酸分子。
用于配制药物组合物的组合物和方法
在另一个方面，在此提供了药物组合物和制剂，其包含本发明的寡聚化合物、小的非编码RNA和组合物。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或者待施用的剂量。本领域技术人员完全了解此类考虑。
本发明的寡聚化合物和组合物可以通过向合适的药学上可接受的稀释剂或载体添加有效量的化合物或组合物而在药物组合物中使用。本发明的寡聚化合物和方法的使用还可以是在预防上有用的。
所述寡聚化合物和组合物包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或者任何其他这样的化合物，即它们在施用给动物(包括人)后，能够(直接或间接地)提供其的在生物学上有活性的代谢物或残基。因此，例如，本公开内容还涉及本发明的寡聚化合物的前药和药学上可接受的盐、此类前药的药学上可接受的盐、和其他生物等价物。
术语“前药”是指以无活性形式制备的治疗剂，其通过内源性的酶或其他化学制剂和/或条件的作用而在身体或其细胞中转化为活性形式(即药物)。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物和组合物的在生理学上和在制药学上可接受的盐，即保留了亲本化合物的所需生物学活性且不向其赋予不希望的毒理学效应的盐。合适的实例包括但不限于，钠盐和钾盐。
在一些实施方案中，可经由口服施用途径将寡聚化合物施用给受试者。所述受试者可以是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、犬、豚鼠或非人灵长类。在一些实施方案中，所述受试者可以是人或人患者。在某些实施方案中，所述受试者可能需要调节一种或多种pri-miRNA的水平或表达，如在此更详细地讨论的。在一些实施方案中，用于向受试者施用的组合物将包含具有一种或多种修饰的经修饰的寡核苷酸，如在此所描述的。
细胞培养和寡核苷酸治疗
可以在各种细胞类型中的任一种之中测试寡聚化合物对于靶核酸表达或功能的效应，条件是所述靶核酸以可测量的水平存在。这可以通过本领域的常规方法而容易地测定，例如Northern印迹分析、核糖核酸酶保护测定法或实时PCR。用于此类分析的细胞类型可从商业销售者(例如，美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Manassus，Va.；Zen-Bio，Inc.，Research TrianglePark，N.C.；Clonetics Corporation，Walkersville，Md.)获得，并且根据销售者的说明书，使用商购可得的试剂(例如，InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，Calif.)来培养细胞。
根据被本发明可以使用本领域中可得的用于基因疗法的任何方法。关于基因疗法的方法的一般性综述，可参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488 505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：8795；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573596；Mulligan，1993，Science 260：926 932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191217；May，1993，TIBTECH11(5)：155 215)。可以使用的在重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编者)，1993，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
虽然通过参考各种的和优选的实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可以进行各种改变并且可以用等价物替换其要素，而不背离本发明的基本范围。此外，可以进行许多修饰以使特定的情形或材料适合于本发明的教导，而不背离本发明的基本范围。因此，意图是，本发明并不局限于为了实现本发明而考虑的在本文中所公开的特定实施方案，而本发明将包括落在权利要求书的范围内的所有实施方案。
参考文献
未明确地通过援引而合并入的在本文中所引用的所有出版物的相关教导通过援引而以其整体合并入本文。虽然通过参考其优选的实施方案而具体地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将会理解，可在其中进行在形式和细节方面的各种改变，而不背离由所附的权利要求书所包括的本发明的范围。本文中对参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献是本发明的现有技术。
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Claims (32)

1.寡聚化合物，其靶向pri-miRNA转录物中的Drosha识别区域，从所述pri-miRNA转录物衍生出表1中的至少一种miR。
2.寡聚化合物，其靶向pri-miRNA转录物中的Drosha识别区域，从所述pri-miRNA转录物衍生出miR-191中的至少一种miR。
3.前述权利要求中任一项的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物是反义寡核苷酸。
4.前述权利要求中任一项的寡聚化合物，其中所述Drosha识别区域是miR-191的Drosha识别区域。
5.前述权利要求中任一项的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物能够改变pri-miR-191的水平。
6.调节细胞中的pri-miR-191水平的方法，所述方法包括将所述细胞与前述权利要求中任一项的寡聚化合物相接触。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述调节导致pri-miR-191水平的改变。
8.寡聚化合物，其靶向pri-miRNA中的位于Drosha识别区域侧翼或与之重叠的区域。
9.寡聚化合物，其靶向位于Drosha切割位点侧翼或与之重叠的区域。
10.提高pri-miRNA的水平的寡聚化合物，其包括靶向多顺反子pri-miRNA转录物中的Drosha识别区域的长度为约15至约30个核碱基的寡聚化合物，其中所述多顺反子pri-miRNA转录物可以为从中衍生出表1中所列的miRNA的多顺反子pri-miRNA转录物。
11.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述Drosha识别区域可以为表1中所列的一种或多种miRNA。
12.前述权利要求中任一项的寡聚化合物，其中所述化合物可以是反义寡核苷酸，并且可以包含一种或多种化学修饰。
13.调节细胞、组织或动物中的小的非编码RNA，特别是pri-miRNA的水平的方法，所述方法包括将所述细胞、组织或动物与本发明的一种或多种化合物或组合物相接触。
14.调节细胞中的衍生自多顺反子pri-miR转录物的miR的水平的方法，所述方法包括选择多顺反子pri-miR转录物；选择衍生自所选多顺反子pri-miR转录物的单种miRNA的Drosha识别区域；选择靶向所选Drosha识别区域或与所选Drosha识别区域充分互补的长度为15至30个核苷酸的寡聚化合物；以及将所述细胞与所述寡聚化合物相接触。
15.前述权利要求中任一项的方法，所述方法包括调节衍生自所选多顺反子pri-miRNA的单种成熟miRNA的水平，或者备选地调节衍生自所选多顺反子pri-miRNA的两种或更多种成熟miRNA的水平。
16.调节来自表1中所列的那些的pri-miRNA的水平的方法，所述方法包括将细胞与靶向此类pri-miRNA上的Drosha识别区域或与之充分互补的寡聚化合物相接触。
17.选择性地调节细胞中的miR家族的单个成员的方法，所述方法包括选择衍生自pri-miR转录物的miR家族的成员；鉴定靶向所选pri-miR转录物的Drosha识别区域或与之充分互补的一种或多种寡聚化合物，其中所鉴定出的寡聚化合物与从中衍生出该miR家族的其他成员的pri-miR转录物的Drosha识别区域缺乏充分的互补性；以及将所述细胞与此类所鉴定出的寡聚化合物相接触。
18.寡聚化合物，其包含第一链和第二链，其中至少一条链包含修饰，并且其中所述寡聚化合物链之一的部分能够与小的非编码RNA靶核酸杂交。
19.寡聚化合物，其包含第一区域和第二区域以及任选的第三区域，其中至少一个区域包含修饰，并且其中所述寡聚化合物的一部分能够与小的非编码RNA靶核酸杂交。
20.鉴定能够调节pri-miRNA水平的寡聚化合物的方法，其中选择pri-miRNA，并且如此地设计寡聚化合物，即使得它们靶向pri-miRNA序列中的各种靶区段或与之充分互补，所述寡聚化合物包括靶向所述pri-miRNA中的成熟miRNA序列和与之重叠的寡聚化合物。
21.前一项权利要求的方法，其中相比于未与所述寡聚化合物相接触的细胞而言与所述寡聚化合物相接触的细胞中pri-miRNA水平的提高表明，所述寡聚化合物调节所述pri-miRNA水平。
22.鉴定能够调节pri-miRNA水平的小分子的方法，其中选择pri-miRNA，以及就它们调节pri-miRNA水平的能力来对小分子进行评估，并且其中所述小分子可以结合至包含成熟miRNA序列或与成熟miRNA序列重叠的pri-miR的区域，或者Drosha识别区域。
23.前一项权利要求的方法，其中相比于未与所述小分子相接触的细胞而言与所述小分子相接触的细胞中pri-miRNA水平的提高表明，所述小分子调节所述pri-miRNA水平。
24.诊断受试者是否具有急性淋巴瘤白血病(ALL)或者处于发展出急性淋巴瘤白血病的风险中的方法，所述方法包括：
测量在来自所述受试者的测试样品中选自表1的列表之中的一种或多种miR基因产物的水平，
其中，在测试样品中所述miR基因产物的水平相对于在对照样品中相应miR基因产物的水平而言发生改变指明，所述受试者具有ALL或者处于发展出ALL的风险中。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中在测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平低于在对照样品中相应miR基因产物的水平。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中在测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平高于在对照样品中相应miR基因产物的水平。
27.确定出具有ALL癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：
测量在来自所述受试者的测试样品中表1中所列的一种或多种miR基因产物的水平，
其中，所述miR基因产物与ALL中不利的预后相关；并且
其中，在测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平相对于在对照样品中相应miR基因产物的水平而言发生改变指明了不利的预后。
28.诊断受试者是否具有ALL或者处于发展出ALL的风险中的方法，所述方法包括：
(1)逆转录来自从所述受试者获得的测试样品的RNA，从而提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供所述测试样品的杂交谱；以及
(3)将所述测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较，
其中，至少一种miRNA的信号发生改变指明，所述受试者具有ALL或者处于发展出ALL的风险中。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号而言被下调。
30.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号而言被上调。
31.诊断受试者是否具有在受试者中有不利预后的ALL或者处于发展出在受试者中有不利预后的ALL的风险中的方法，所述方法包括：
(1)逆转录来自从所述受试者获得的测试样品的RNA，从而提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供所述测试样品的杂交谱；以及
(3)将所述测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较，
其中，信号发生改变指明，所述受试者具有有不利预后的ALL或者处于发展出有不利预后的ALL的风险中。
32.在具有ALL的受试者中治疗ALL的方法，在所述ALL中至少一种mi R基因产物在所述受试者的癌细胞中相对于对照细胞而言被下调或上调，所述方法包括：
(1)当所述至少一种miR基因产物在癌细胞中被下调时，向所述受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，或者分离的其变体或生物学活性片段，从而在所述受试者中抑制癌细胞的增殖；或者
(2)当所述至少一种miR基因产物在癌细胞中被上调时，向所述受试者施用有效量的用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的至少一种化合物，从而在所述受试者中抑制癌细胞的增殖。
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