CN103374625B - 先天性心脏病相关基因dlc1及其应用 - Google Patents
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- CN103374625B CN103374625B CN201210129603.2A CN201210129603A CN103374625B CN 103374625 B CN103374625 B CN 103374625B CN 201210129603 A CN201210129603 A CN 201210129603A CN 103374625 B CN103374625 B CN 103374625B
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Abstract
本发明公开了先天性心脏病相关基因DLC1及其应用。具体地,本发明提供了一种检测先天性心脏病易感性的方法,它包括检测个体的DLC1基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异,存在变异就表明该个体患先天性心脏病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒,尤其是产前诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及先天性心脏病相关基因DLC1(英文:deletedinlivercancer1,,简称DLC1)的单核苷酸变异(singlenucleotidevariation,SNV)及其与先天性心脏病的相关性。本发明还涉及检测这些SNV的方法和试剂盒。
背景技术
先天性心脏病(CongenitalHeartDefeats,CHD)是胎儿期心脏及大血管发育异常引起的先天畸形,是最为常见的先天畸形之一。由于病情严重,合并症多,治疗复杂,也是导致新生儿死亡最常见的缺陷之一。CHD在胎儿中的发病率高达50‰。我国1岁以下婴儿和1-5岁幼儿的死因分析结果表示,先天性心脏病的死亡率在城市和农村地区均居前两位。大多数CHD的病因十分复杂,现有病因学证据十分有限。而CHD早发现、早治疗,可显著提高儿童的生存率和生活质量。建立新生儿CHD的有效筛查、随诊机制,可以使越来越多的CHD得以及时发现,尽早得到专业防治。因此,探索先天性心脏病的致病根源以及发病机制,及早诊断并有效干预治疗,同时针对性开展药物研发,对于优生优育,提高国民综合素质具有重大意义。
目前普遍认为,由遗传因素和环境因素共同导致,并具有遗传异质性。研究表明,除了外界因素如酒精、维甲酸、抗痉挛药以及母体疾病会导致CHD的发生,遗传因素也发挥了相当大的作用[McBride,K.L.andV.Garg,ImpactofMendelianinheritanceincardiovasculardisease.AnnNYAcadSci,2010.1214:p.122-37;Jenkins,K.J.,etal.,Noninheritedriskfactorsandcongenitalcardiovasculardefects:currentknowledge:ascientificstatementfromtheAmericanHeartAssociationCouncilonCardiovascularDiseaseintheYoung:endorsedbytheAmericanAcademyofPediatrics.Circulation,2007.115(23):p.2995-3014.]。导致CHD的遗传因素包括染色体畸变、单基因突变以及拷贝数变异等[Richards,A.A.andV.Garg,Geneticsofcongenitalheartdisease.CurrCardiolRev,2010.6(2):p.91-7.]。过去的几十年中,随着分子遗传学技术的发展以及家系样本的运用,多个可能导致CHD或者其他综合症并发CHD的基因已经被发现,如NKX2-5,GATA4,PTPN11,JAG1以及TBX5等[Schott,J.J.,etal.,CongenitalheartdiseasecausedbymutationsinthetranscriptionfactorNKX2-5.Science,1998.281(5373):p.108-111;Garg,V.,etal.,GATA4mutationscausehumancongenitalheartdefectsandrevealaninteractionwithTBX5.Nature,2003.424(6947):p.443-7;Tartaglia,M.,etal.,MutationsinPTPN11,encodingtheproteintyrosinephosphataseSHP-2,causeNoonansyndrome.NatureGenetics,2001.29(4):p.465-468;Li,L.H.,etal.,AlagillesyndromeiscausedbymutationsinhumanJagged1,whichencodesaligandforNotch1.NatureGenetics,1997.16(3):p.243-251;Oda,T.,etal.,MutationsinthehumanJagged1geneareresponsibleforAlagillesyndrome.NatureGenetics,1997.16(3):p.235-42.;Basson,C.T.,etal.,MutationsinhumanTBX5causelimbandcardiacmalformationinHolt-Oramsyndrome(vol15,pg30,1997).NatureGenetics,1997.15(4):p.411-411.]。这些遗传因子在导致CHD中都呈现出单基因遗传模式[Wessels,M.W.andP.J.Willems,Geneticfactorsinnon-syndromiccongenitalheartmalformations.ClinicalGenetics,2010.78(2):p.103-23.]。
虽然已有40多个基因被证实可能与CHD发病有关,但散发病例以及非综合症病例的病因依旧不明朗。例如一个CHD致病明星基因NKX2-5,在家族性先天性心脏病病人中(ASD,VSD,TOF等),已有40多个高外显率的突变被报道,而在散发病人,仅发现了6个低外显率突变[Garg,V.,etal.,GATA4mutationscausehumancongenitalheartdefectsandrevealaninteractionwithTBX5.Nature,2003.424(6947):p.443-7.]。这种强烈对比表明,由于胎儿心脏发育是一个复杂而又精密的过程,此间数千个分子协同作用且任何一个变异均可能导致心脏发育异常,所以散发病例中,CHD的发生可能是多个遗传因素导致的。因此,寻找CHD治病基因的难点可能存在于如何采用高效的手段对于散发CHD人群进行全基因组扫描。
越来越多的证据表明,罕见突变往往是一些常见疾病的元凶[Cirulli,E.T.andD.B.Goldstein,Uncoveringtherolesofrarevariantsincommondiseasethroughwhole-genomesequencing.NatureReviewsGenetics,2010.11(6):p.415-425.]。此外,大约98%人类基因组由重复序列、基因间序列和非编码序列组成。全基因组测序,基因组变异丰富、分析复杂,真正突变往往淹没在大量变异和序列匹配错误中,并且成本依然很高。因此,基因组测序寻找致病基因突变集中于基因编码区效率更高。事实上,对遗传性疾病和一些散发的疾病而言,已经发现的疾病基因突变多集中于编码区。因此,目前阶段外显子测序是寻找遗传性疾病致病基因更为有效的方法。
先天性心脏病作为一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病,寻找其相关基因进而阐明先天性心脏病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。
虽然已有许多关于各种基因变异与先天性心脏病的研究,但没有证实DLC1基因与先天性心脏病相关性的报道,更没有证实DLC1基因的SNV与先天性心脏病相关性的报道。
综上所述,为了尽早诊断先天性心脏病,本领域迫切需要寻找先天性心脏病易感基因,并开发检测先天性心脏病的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)先天性心脏病的方法及检测试剂盒。
在本发明的第一方面,提供了一种DLC1基因或其单核苷酸变异在制备检测先天性心脏病的试剂或试剂盒中的用途,其中所述的单核苷酸变异SNV是:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在另一优选例中,所述的SNV是第1661位A→T且第1662位T→C。
在另一优选例中,所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
在另一优选例中,所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂:
(a)DLC1基因的特异性引物;
(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针;
(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片;
(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
在另一优选例中,所述的特异性引物具有SEQIDNO.:3-44中所示的序列,较佳地SEQIDNO:13和14所示的序列。
在另一优选例中,所述的试剂盒是产前诊断试剂盒。
在本发明的第二方面,提供了一种检测先天性心脏病的试剂盒,它包括特异性扩增DLC1基因或转录本的引物,并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在另一优选例中,所述的试剂盒还含有选自下组的试剂:
(a)与所述SNV位点的结合的探针;
(b)识别所述SNV位点的限制性内切酶。
在另一优选例中,所述的引物具有SEQIDNO.:3-44中所示的序列,较佳地SEQIDNO:13和14所示的序列。
在本发明的第三方面,提供了一种体外检测样品是否存在DLC1的单核苷酸变异的方法,包括步骤:
(a)用DLC1基因特异性引物扩增样品的DLC1基因,得到扩增产物;和
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在另一优选例中,所述的引物具有SEQIDNO.:3-44中所示的序列,较佳地SEQIDNO:13和14所示的序列。
在另一优选例中,所述的扩增产物的长度为100-2000bp,且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在本发明的第四方面,提供了一种对个体的先天性心脏病易感性进行诊断的方法,它包括步骤:
(i)检测该个体的DLC1基因、转录本和/或蛋白,并与正常的DLC1基因、转录本和/或蛋白相比较,
存在差异就表明该个体患先天性心脏病的可能性高于正常人群。
在另一优选例中,在步骤(i)中检测DLC1的基因或转录本,并与正常DLC1核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中,所述的差异是选自下组的单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在另一优选例中,所述的个体是人。
在本发明的第五方面,提供了一种试剂在制备检测检测先天性心脏病的试剂盒的用途,其中所述试剂选自下组:
(a)DLC1基因的特异性引物;
(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针;
(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片;或
(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
在另一优选例中,所述的试剂盒是产前诊断试剂盒。
在本发明的第五方面,提供了一种人DLC1基因的用途,它被用于制备检测先天性心脏病的试剂盒。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括特异性扩增DLC1基因或转录本的引物,并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在另一优选例中,还含有选自下组的试剂:
(a)与所述SNV位点的结合的探针;
(b)识别所述SNV位点的限制性内切酶。
在本发明的第七方面,提供了一种分离的DLC1核苷酸序列,所述的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示,并且具有一个或多个选自下组的突变:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
在本发明的第七方面,提供了一种分离的DLC1氨基酸序列,所述的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示,并且具有一个或多个选自下组的突变:
Gly266Glu、Ala350Thr、Met360Lys、Leu413Met、Glu418Lys、Thr433Asn、Asp554Val、Leu952Val、Val1371Leu;其中,氨基酸位置编号基于SEQIDNO:2。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究,对大量候选基因的SNV进行了测定和分析。首次发现和证明了DLC1的基因组序列与先天性心脏病密切相关,因此可作为辅助性检测先天性心脏病(或其易感性)的特异性SNV。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明人通过全基因组外显子测序技术在66个先天性心脏病患者样本(样本采自河北省三甲医院)组成的4个混合样本中发现该该基因基因在剪切微点处存在变异,通过SequenomMassArrayplatform验证后,采用Sanger测序和二代测序相结合的手段,在217个散发病人样本中共发现11个杂合点突变,并且在900个正常人样本中均未发现上述变异,显著性为P=1.208e-8,这充分证明DLC1是一种先天性心脏病的致病基因。本发明为先天性心脏病的辅助分子诊断、分子分型、产前诊断、药物靶点选择和临床治疗提供了依据。
DLC1基因
DLC1(deletedinlivercancer1)位于人第8号染色体,其序列是已知的。其详细序列和一些相关信息可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。
DLC1的基因组序列全长共431kb,18个外显子。编码蛋白为GTPase活化蛋白,在多种肿瘤中发挥了抑癌基因的功能。另外有研究发现,DLC1可以和张力蛋白家族成员相互作用,并且定位在细胞间粘着斑[Liao,Y.C.,etal.,Thephosphotyrosine-independentinteractionofDLC-1andtheSH2domainofctenregulatesfocaladhesionlocalizationandgrowthsuppressionactivityofDLC-1.JCellBiol,2007.176(1):p.43-9.],这提示DLC1可能在细胞骨架构建和形态生成中发挥重要作用。。人心脏中共有4种DLC1蛋白剪切体,其中最长的一个同型体大量表达[Ko,F.C.,etal.,Deletedinlivercancer1isoformsaredistinctlyexpressedinhumantissues,functionallydifferentandunderdifferentialtranscriptionalregulationinhepatocellularcarcinoma.LiverInt,2010.30(1):p.139-48.]。该最长同型体由1528个氨基酸组成。
为了方便起见,在SEQIDNO:1给出DLC1中与本发明SNV相关的核苷酸序列,其中,起始密码子从第1位atg开始。DLC1的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。
本发明人通过全外显子组测序技术、Sanger测序技术和Sequenom质谱分析技术发现了一种先天性心脏病致病基因DLC1,并揭示和证实了多种与先天性心脏病易感性关联性非常高的SNV。
具体而言,本发明揭示了该基因在217个CHD散发病人中共11个位点发生杂合错意突变,并且在900个正常人中均未发现。如下表1所示:
表1:DLC1在217个散发先天性心脏病病人中突变分析
注:
ASD=房间隔缺损
DORV=右室双出口
PDA=动脉导管未闭
PS=肺动脉狭窄
TOF=法洛氏四联症
VSD=室间隔缺损
VSD&PFO=室间隔缺损合并卵圆孔未闭
DLC1基因的应用
基于本发明的新发现,DLC1基因、蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于):用于辅助性诊断先天性心脏病,或用于筛选促进DLC1蛋白功能的物质,如抗体、多肽或其它配体。
另一方面,本发明还包括对人DLC1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于人DLC1基因产物或片段。较佳地,指那些能与人DLC1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人DLC1蛋白的分子,也包括那些并不影响人DLC1蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的人DLC1基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达人DLC1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人DLC1蛋白功能的抗体以及不影响人DLC1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人DLC1基因产物的片段或功能区,通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人DLC1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生;与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产
抗人DLC1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的人DLC1蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗DLC1抗体是不识别正常DLC1但识别突变DLC1的抗体,或者识别正常DLC1但不识别突变DLC1的抗体。利用这些抗体,可以方便地进行蛋白质水平的先天性心脏病易感性检测。
利用本发明DLC1蛋白,通过各种常规筛选方法,可筛选出与DLC1蛋白发生相互作用的物质,如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还涉及定量和定位检测人DLC1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括ELISA等。
一种检测检测样品中是否存在DLC1蛋白的方法是利用DLC1蛋白的特异性抗体进行检测,它包括:将样品与DLC1蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在DLC1蛋白。
DLC1蛋白的多聚核苷酸可用于DLC1蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面,DLC1蛋白的多聚核苷酸可用于检测DLC1蛋白的表达与否或在疾病状态下DLC1蛋白的异常表达。如DLC1DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断DLC1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用DLC1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测DLC1蛋白的转录产物。
检测可以针对cDNA,也可针对基因组DNA。DLC1蛋白突变的形式包括与正常野生型DLC1DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
最方便的检测本发明SNV的方法,是通过用DLC1基因特异性引物扩增样品的DLC1基因,得到扩增产物;然后检测扩增产物中是否存在表1所示的单核苷酸变异。例如,可通过测序或特异性探针进行检测。
应理解,在本发明首次揭示了DLC1基因的SNV与先天性心脏病的相关性之后,本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNV位置的扩增产物,然后通过测序等方法确定是否存在本发明所揭示的SNV或突变。通常,引物的长度为15-50bp,较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的,但是本领域技术人员知道,在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下,也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内,只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNV的对应位置。
虽然扩增产物的长度没有特别限制,但是通常扩增产物的长度为100-2000bp,较佳地为150-1500bp,更佳地为200-1000bp。
本发明的主要优点在于:
首次揭示了一种新的先天性心脏病的致病基因DLC1。由于本发明基因突变与先天性心脏病具有非常高的关联性,因此不仅可用于早期辅助性诊断先天性心脏病,而且可以未雨绸缪地在产前进行诊断,指导优生优育,从而提高胎儿存活率,因此具有极其重大的应用价值和社会效益。此外,本发明的有利于阐述CHD的发病机制,对于疾病的研究以及CHD药物研发提供依据。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
1.1样本准备
217个先天性心脏病人血样均采自河北省三甲医院。所有病人都经过资深心脏科医生诊断,临床表型均通过标准超声心电图以及其他测试确定。充分了解并收集患者临床信息以及家族病史。217人中有3人患有唐氏综合症,其他214人均未患有任何综合症。大多数患者接受过心导管手术。
所有患者或其监护人充分知情并同意采集其血样进行遗传学研究,本研究也通过了中科院上海生命科学研究院健康科学研究所伦理委员会批准。
作为对照的样本(500例)采自临床确定不患有先天性心脏病的正常人,知情并且同意采用其血样进行遗传学研究。
采用QIAampDNABlood小抽试剂盒抽提血样基因组DNA,NanoDrop测浓度。
217例先天性心脏病样本,分有多种亚型,其中最常见的是VSD、PDA、TOF、ASD四种亚型,部分患者同时患有两种或者两种以上亚型。
从上述样本中选择了20个VSD病人、19个PDA病人、9个TOF病人以及18个ASD病人的基因组DNA分别混合成4个库。且每个库中每个病人DNA量控制相等。选取标准是1、DNA样本质量比较高2、对应患者只表现其中一种亚型临床性征。
其中,与DLC1基因相关的病人样本信息如下(仅列出该基因发生突变的病人样本)。
表2:病人样本信息
病人编号 | 性别 | 诊断结果 | 染色体组型 | CNVs检测 | 混合样本的外显子组测序 |
28 | M | VSD | 正常 | 是 | / |
42 | F | VSD | 正常 | 是 | / |
67 | M | VSD,PFO | 正常 | 是 | / |
89 | F | PDA | 正常 | / | / |
124 | F | VSD | 正常 | / | / |
131 | F | PDA | 正常 | / | / |
135 | F | ASD | 正常 | / | Pool4 |
153 | F | VSD | 正常 | / | / |
168 | F | ASD | 正常 | / | / |
169 | F | PS | 正常 | / | / |
190 | F | VSD | 正常 | / | / |
2、全基因组外显子测序
采用NimbleGen2.1Mhumanexomearray捕获基因组DNA样本外显子区,每个样本中180,000个外显子被富集。随后这些富集的DNA样本被随机打断,在片段两端分别连接上接头制备杂交文库。文库经纯化后经过LM-PCR的线性扩增与BiotinylatedDNALibrary进行杂交富集,再经过LM-PCR的线性扩增,文库检测合格后即用IlluminaGenomeAnalyzerII测序。
测序结果平均片段大小为75bp。外显子组测序数据如下:
表3:4个混合样本外显子测序结果
外显子捕获数据 | Pool1 | Pool2 | Pool3 | Pool4 |
混合样本数 | 20 | 19 | 9 | 18 |
全长(bp) | 6667566876 | 6816327380 | 6552956536 | 6358639428 |
原始读序数 | 82214918 | 84305890 | 80384124 | 78573962 |
定位到基因组中的序列 | 80680618 | 81931344 | 79376178 | 77724534 |
可定位到基因上的序列百分比(%) | 98.13 | 97.18 | 98.75 | 98.9210 --> |
定位到靶区域的读序数量 | 47545038 | 51944774 | 54103261 | 54873136 |
定位到靶区域的读序比例(%) | 57.83 | 61.61 | 67.31 | 69.84 |
靶区域的平均深度 | 87.36 | 95.88 | 100.08 | 100.25 |
靶区域的覆盖率(%) | 99.73 | 99.73 | 99.69 | 99.6 |
3、碱基定位和变异分析
通过全基因组外显子测序,本发明人总共获得了266的碱基对,其中98.3%的碱基可以定位到参考基因组上,平均测序深度为95.9。通过MAQ(version0.7.1)将测序获得碱基定位到数据库的参考序列上(UCSChg18)。针对样本数为20,19,18,9的混合样,使用的MAQ参数分别为-N40,38,36,18。过滤掉dbSNP132中的位点以获得新的变异。
基于NCBI和UCSC数据库,使用SeattleSeqAnnotation对新发变异进行注释,最终获得的变异数据如下表所示:
表4:外显子测序变异结果分析
注:1.候选SNV指数据分析过程后共获得的SNV;
2.验证的SNV指用sanger或者质谱的办法验证为阳性的SNV;
4、使用sequenom进行测序结果验证和基因型鉴定
利用MassArrayAssayDesign3.1设计PCR引物以及延伸引物。Sequenom验证失败的位点采用Sanger测序法验证。多重PCR实验,SAP反应以及iPLEX反应采用iPLEX试剂盒,Sequenom过程根据常规操作手册进行,每个反应加入基因组DNA的量为5-10ng。延伸产物利用MassArrayNanodispenser滴加到SpectroCHIPII-G384芯片上,随后芯片装载到MassArrayAnalyzer分析仪获取光谱。光谱数据分析软件用市售的MassArrayTyper4.0。
最终确定编号135患者在chr8:13072284(UCSChg19)处发生SpliceSite的变异,该点位于基因DLC1内。由于剪切位点的突变可以在很大程度上影响蛋白结构和功能,故挑选DLC1作为重点候选基因进一步研究。
5、Sanger测序分析DLC1在217个样本中的突变情况,
利用Sanger测序技术,对217个散发先心患者进行DLC1全基因扫描以寻找是否有更多变异。18个外显子共分成20段进行PCR扩增,扩增使用引物如下:
PCR采用TouchDown法,程序如下:
扩增产物用ExoSAP-IT(USB)进行纯化,BigDyeTerminator(ABI)测序反应,程序如下:
产物用乙醇沉淀法纯化,随后ABI3730GeneticAnalyzer进行测序分析。测序结果Chromas打开分析。发现新变异随后重新PCR、测序以过滤假阳性。
6、统计学分析
针对CHD散发病人中发现的11个突变位点,本发明人在900个正常人中进行筛查(400个未发表外显子测序数据,500个Sequenom数据)均未发现上述突变,以排除单核苷酸多态性(SNP,SingerNucleotidePolymorphism)的可能性。CHD患者和正常人之间差异性分析采用双尾t检验分析(R统计软件)。
7.结果
11个突变位点见表1。在217个CHD散发病人中共11个位点发生杂合错意突变,并且在900个正常人中均未发现。统计学分析具有显著性(P=1.208e-8)。
值得注意的是,在所有11个变异中,6个发生在DLC1蛋白的N端,提示该处可能是突变热点区域。另外,DLC1的两种剪切体1和2的区别在于1具有更长的N端,并且1在人心脏组织中大量表达而2不表达。该结果提示DLC1的N端在心脏发育过程中发挥重要作用。
实施例2
先天性心脏病易感性检测试剂盒
如实施例1所述,SEQIDNO:1中表1中所示的突变与先天性心脏病疾病密切相关。因此,可基于这些突变设计DLC1基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。
制备一试剂盒(100人次),它含有:
随机挑选100个人构成的测试组,其中包括未知是否患先天性心脏病的对象、已知患先天性心脏病病人和经检测无先天性心脏病的正常人。
抽取测试组中待检测对象的外周血3ml,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将先天性心脏病检测试剂盒中的PCR引物稀释到2μmol/μl,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后,用ABI-PRISMTM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序,用Chromas软件进行序列的判读和SNV确认。
或者,将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析,也可检测出表1中所示的突变。
检测结果:
对于DLC1存在表1中所示的突变的对象,进一步通过常规方法检测以确认是否患有先天性心脏病情况。检测结果表明,含突变的检测对象(N端所在区域)的先天性心脏病易感性比例明显高于正常人群(高出至少2倍)。
这表明通过检测DLC1的突变,可进行先天性心脏病的辅助性检测和/或早期诊断。
实施例3
先天性心脏病易感性辅助性检测
制备一试剂盒(300人次),它含有:
重复实施例2的检测,不同点在于随机选取了180个人的样本(检测前不知道是否有先天性心脏病症状)进行检测。其中,部分样本是血液样本(制备方法同实施例1),部分样本是羊水穿刺样本。
羊水样本的制备:利用羊水穿刺手术,采集羊水获得羊水细胞来进行候选基因基因突变分析。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从所述羊水中提取DNA。
将先天性心脏病检测试剂盒中的PCR引物稀释到2μmol/μl,以所提取的各样本的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后,用ABI-PRISMTM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序,用Chromas软件进行序列的判读和SNV确认。
结果检测出5名对象在本发明的SEQIDNO:1的第300-450位存在表1中所示的SNV(纯合),进一步通过常规方法确认,其中有3个样本来自患有先天性心脏病的对象。
应用
本发明方法特别适用于产前诊断。羊水穿刺可用于获取胎儿基因组DNA,用于胎儿疾病预测。由于胎儿基因组DNA有一半来自父本,一半来自母本,因此胎儿父母任一方(或家族中其他成员)患有先天性心脏病,则有必要进行产前诊断。尤其是当胎儿父母任一方(或家族中其他成员)证明携带DLC1的突变时,那么通过羊水穿刺检测胎儿是否有PKD1L1的突变可以预测胎儿患先天性心脏病的几率大小,从而有助于优生优育。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测DLC1基因单核苷酸变异的试剂在制备检测先天性心脏病易感性的试剂或试剂盒中的用途,其中所述的单核苷酸变异SNV是:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1;
所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂:
(a)DLC1基因的特异性引物;
(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针;
(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片;
(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
4.如权利要求2或3所述的用途,其特征在于,所述的引物的序列如SEQIDNO.:3-44中所示。
5.如权利要求2或3所述的用途,其特征在于,所述的引物的序列如SEQIDNO:13和14所示。
6.一种检测先天性心脏病易感性的试剂盒,其特征在于,它包括特异性扩增DLC1基因或转录本的引物,并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp,并且所述扩增产物中含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1;
所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,它还含有选自下组的试剂:
(a)与所述单核苷酸变异位点结合的探针;
(b)识别所述单核苷酸变异位点的限制性内切酶。
8.一种试剂在制备检测先天性心脏病易感性的试剂盒中的用途,其中所述试剂选自下组:
(a)用于检测DLC1基因的一种或多种SNV位点的特异性探针;
(b)用于检测DLC1基因的一种或多种SNV位点的芯片;或
(c)用于检测DLC1基因的一种或多种SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体;
其中所述的SNV位点选自:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1;
所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。
9.一种分离的DLC1核苷酸序列,其特征在于,所述的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示,并且具有一个选自下组的突变:
第797位G→A;
第1048位G→A;
第1079位T→A;
第1237位T→A;
第1252位G→A;
第1298位C→A;
第1661位A→T;
第1662位T→C;
第2854位C→G;
第4111位G→C;
第1349位G→C;
其中,核苷酸位置编号基于SEQIDNO:1。
10.一种分离的DLC1氨基酸序列,其特征在于,所述的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示,并且具有一个选自下组的突变:
Gly266Glu、Ala350Thr、Met360Lys、Leu413Met、Glu418Lys、Thr433Asn、Asp554Val、Leu952Val、Val1371Leu;
其中,氨基酸位置编号基于SEQIDNO:2。
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