JP6862182B2 - ルテリアル、並びにその分離および培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、体液由来のミトコンドリア類似微細物質であるルテリアル、並びにその分離および培養方法に関する。
血液中の微小胞などの微細物質は、かつては、特別な機能を持っていない物質として認識されてきた。しかし、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）も様々な生物活性を有するということが、種々の実験データにより明らかになっている。例えば、血小板由来の微小胞は、小胞状の表面タンパク質を介して特定細胞を刺激する機能をするということが明らかになっており（ＣＤ１５４，ＲＡＮＴＥＳ ａｎｄ／ｏｒ ＰＦ‐４；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９）８２：７９４；Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：７５４５）、血小板の微小胞における生理活性脂質（例えば、ＨＴＥＴまたはアラキドン酸）が特定の標的細胞に対して特定効果を示すことが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６；１９６７２；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（２００１）４９（５）：８８）。このように、生物学的試料中に存在する小嚢などの物質の特徴（例えば、サイズ、表面抗原、起源細胞の決定、ペイロッド）は、疾病の診断、予後または治療診断に関する情報を提供することができるため、疾患を探索して治療するのに用いられることができる生物学的指標を確認することに対する必要性が求められている。そこで、小嚢に関わるＲＮＡおよび他の生物学的指標と小嚢の特徴を、診断、予後、または治療診断に提供しようとする試みもあった（ＷＯ２０１１／１２７２１９参照）。
一方、癌（ｃａｎｃｅｒ）は、細胞が無限に増殖して正常の細胞の機能を妨害する疾病であり、肺癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ、ＧＣ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ、ＢＲＣ）、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）などが代表的であるが、実質には何れの組織でも発生し得る。初期の癌の診断は、癌細胞の成長による生体組織の外的変化に基づいて行われたが、近年、血液、糖鎖（ｇｌｙｃｏ ｃｈａｉｎ）、ＤＮＡなどの生物の組織または細胞に存在する微量の生体分子を用いた診断および検出が試されている。しかし、最も一般的に用いられる癌の診断方法は、生体組織検査により得られた組織サンプルを用いるか、映像を用いた診断である。このうち生体組織検査は、患者に大きい苦痛を与え、費用が高いだけでなく、診断まで長時間がかかるという欠点がある。また、患者が実際に癌にかかった場合、生体組織検査の過程中に癌の転移が誘発される恐れがあり、生体組織検査により組織サンプルが得られない部位の場合、疑われる組織を外科的な手術により摘出しないと、疾病の診断が不可能であるという欠点がある。また、映像を用いた診断では、エックス線（Ｘ‐ｒａｙ）映像、疾病標的物質が付着された造影剤を用いて得た核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＮＭＲ）映像などに基づいて癌を判定していた。しかし、かかる映像による診断は、臨床医または読影医の熟練度によって誤診の可能性があり、映像を得る機器の精度に大きく依存するという欠点がある。さらに、最も高精度の機器であるとしても、数ｍｍ以下の腫瘍は検出が不可能であり、発病初期段階では検出が難しいという欠点がある。また、映像を得るためには、患者または疾病保有可能者が、遺伝子の突然変異が誘発し得る高エネルギーの電磁気波に露出されるため、さらに他の疾病を引き起こす恐れがあるだけでなく、映像を用いた診断の回数が制限されるという欠点がある。
すなわち、癌の診断のための生体組織検査は、多くの時間、費用、不便さ、苦痛などが伴われるため、不要な生体組織検査の対象者数を著しく減少させることができる方法、癌を早期に診断できる方法が求められている。
このような背景下で、本発明者らは、患者から既に排出された体液中に存在する微細物質の特性を観察することで、疾病を診断および予測することができることを見出し、その内容を２０１３年７月１２日付けで特許出願している（韓国特許出願第１０‐２０１３‐００８２０６０号）。本発明者らは、上記の微細物質を「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」と命名した。
しかし、上記の微細物質を臨床に適用することができるように、ルテリアルを効率的に分離および培養する技術は未だに知られていない。
そこで、本発明者らは、患者または健常人から既に排出された体液中に存在する微細物質であるルテリアルを効果的に分離することができる方法を開発し、その方法により分離されたルテリアルの特性を調べることにより本発明を成すに至った。
本発明の目的は、患者または健常人から既に排出された体液中に存在するルテリアルの分離および培養方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ）と真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）の中間段階の融合特性を有し、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）試験でヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ）、ミトトラッカーレッド（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の免疫化学蛍光染色反応を示し、運動性を有するとともに、ＡＴＰ生産などの特徴を有するルテリアルを提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、血液から血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離する第１の分離ステップと、前記血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離させた血液を遠心分離する第２の分離ステップと、前記遠心分離により得られた上清からルテリアルを分離する第３の分離ステップと、前記分離されたルテリアルを洗浄するステップと、を含む、ルテリアルの分離方法を提供する。
本発明は、また、体液を１次遠心分離した後、上清を２〜５μｍのフィルタで濾過するステップと、前記濾過された溶液を２次遠心分離した後、上清を０．５〜２μｍのフィルタで濾過するステップと、を含む、ルテリアルの分離方法を提供する。
本発明は、また、次の特性の一つ以上を有する体液由来ルテリアルを提供する：
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発現し、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似体である；
（ｆ）定常状態では円形乃至楕円形であり、患者由来の場合は、定常状態に比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有しており、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）および／またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の調節機能を有する。
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発現し、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似体である；
（ｆ）定常状態では円形乃至楕円形であり、患者由来の場合は、定常状態に比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有しており、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）および／またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の調節機能を有する。
本発明は、また、前記分離された体液由来ルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下、１８〜３０℃で培養することを特徴とするルテリアルの培養方法を提供する。
本発明は、また、ルテリアルを有効成分として含有する抗癌組成物を提供する。
他に定義されない限り、この明細書において用いられた全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した当業者により通常的に理解されるものと同一の意味を有する。通常、この明細書において用いられた命名法及び以下に記載の実験方法は、本技術分野において公知の、通常的に用いられるものである。
本発明で用いる用語「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」は、動物に存在する生命因子（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）であって、ウイルスに近似な程度から約８００ｎｍまで（正常フィッションステップ５０〜８００ｎｍ／非正常フュージョンステップ８００ｎｍ以上）のサイズを有する微細物質を本発明者が命名したものである。ルテリアルは、（１）原核細胞と真核細胞の中間段階の融合特性を有する細胞または細胞類似体であり；（２）血液、精液、腸液、唾液、細胞液などの体液に存在し；（３）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示し；（４）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有しており；（５）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞由来遺伝子の発現特性を示すが、主にストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発現し、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上までサイズが大きくなり；（６）正常条件でＡＴＰ生成に関与し；および（７）ミトコンドリアとは異なって、エキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似体である。ルテリアルは、ヒトを含む動物の場合、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、骨髓に存在する。その他に、角を有する動物の場合、角中にもルテリアルが存在する。
正常のルテリアルのサイズは５０〜８００ｎｍであり、変異ルテリアルは融合して変異体を形成し、数十マイクロメータのサイズを有する。ルテリアルは、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡだけでなく、ＤＮＡも含む未成熟ミトコンドリア段階のものを指すことができる。ルテリアルは、消化液に溶解せず、血液に流入される特徴を有する。
ルテリアルは、シグナリング、細胞分化、細胞死滅だけでなく、細胞サイクルおよび細胞成長の調節にも関連すると予想されるが、本発明者は、中でもルテリアルが癌の診断に密接に関連することを見出した。
正常のルテリアル（ｎｏｒｍａｌ ｌｕｔｅｒｉａｌ）は、癌細胞の成長を抑え、細胞を健康な免疫体系に戻す役割をすると予想されるが、その役割は、遺伝子を正常化させる可能性を有するＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）により行われる。このように、健康な人や動物の血液中において、ルテリアルは、ＲＮＡ中における情報体系が正常軌道を外れて、異常疾患を誘発するタンパク質を生産するように指示する場合、これを人為的に干渉することで癌などの疾病の発生を抑えるように作用し、サイズが２００〜５００ｎｍ以上に成熟した時にはエネルギー代謝にも関与し、特定波長を照射すると、反応発現として光エネルギー増幅機能をし、葉緑体のように反応することが確認される。そのため、かかるルテリアルが正常の役割を行うことができない場合、恒常性およびＡＴＰ生産において決定的障害を誘発し、呼吸およびエネルギー代謝の両方において疾病を招く恐れがある。
このように、役割を正常に果たすことができない突然変異ルテリアルは、正常のルテリアルとは生態および特性が異なって、そのサイズや形態が多様である。具体的に、正常のルテリアルは、二重胞子（ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｐｏｒｅ）を形成した後にはそれ以上増殖しないが、癌患者や晩成疾病を有する患者の血液中で発見される突然変異ルテリアルは、幹細胞と類似に無限に増殖する特性を有するため、６００〜８００ｎｍ以上のサイズを有し、２００μｍ（２００，０００ｎｍ）以上のサイズを有するものもある。また、ウイルスと類似に、赤血球、白血球、血小板などに侵入して生長したり、他のルテリアルと凝集したりする特性を示す。
したがって、ルテリアルの形態学的特性または生化学的特性を観察することで、疾病の診断や治療が可能であり、その用途が無限にあると予想される。しかし、ヒトを含む動物から既に排出された体液から分離されたルテリアルは、生体外では短い時間内に溶解されて消滅されたり、形態が変わったりする特性があるため観察自体が難しく、異常な環境下で放置する場合には、２４時間以内に正常のルテリアルも突然変異ルテリアルに変異され、疾病の正確な診断や治療が困難であるという問題点がある。
本発明では、患者または健常人から既に排出された体液中に存在する微細物質であるルテリアルを２つの方法により分離した。
したがって、一観点による本発明は、体液からルテリアルを分離する方法に関する。
第１の方法は、血液からルテリアルを分離する方法であって、血液から血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離する第１の分離ステップと、前記血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離させた血液を遠心分離する第２の分離ステップと、前記遠心分離により得られた上清からルテリアルを分離する第３の分離ステップと、前記分離されたルテリアルを洗浄するステップと、を含む。
前記第１の分離ステップは、血液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない物質は分離するステップを含むことができる。前記第２の分離ステップは、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離を繰り返すことで、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）のような一般微小胞を除去して上清を得るステップを含むことができる。前記第３の分離ステップは、遠心分離により得られた上清に可視光線を照射して、運動性を有して集まるルテリアル粒子をピペットを用いて分離するステップを含むことができる。前記第１のステップで用いられた血液は、哺乳動物のうちヒト由来のものであることを特徴とする。ルテリアルは、自家蛍光および運動性の特性を有するため、上記のように可視光線を照射すると、上清からルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながら、ピペットを用いて分離することができる。前記第３のステップで分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得ることができる。ルテリアルは、長径５０ｎｍ以上のサイズを有するため、前記過程により、ルテリアル以外の血液由来微細物質は除去することができる。
第２の方法は、血液や精液などの体液からルテリアルを分離する方法であって、体液を１次遠心分離した後、上清を２〜５μｍのフィルタで濾過するステップと、前記濾過された溶液を２次遠心分離した後、上清を０．５〜２μｍのフィルタで濾過するステップと、を含む。
すなわち、体液を２０００〜４０００ｒｐｍで５〜３０分間１次遠心分離した後、上清を２〜５μｍのフィルタで濾過し、濾過された溶液を３０００〜７０００ｒｐｍで５〜２０分間２次遠心分離した後、０．５〜２μｍのフィルタで濾過するステップを含むことができる。
濾過により得られた溶液に可視光線を照射して、運動性を有して集まるルテリアル粒子をピペットを用いて分離するステップをさらに含むことができる。ルテリアルは、自家蛍光および運動性の特性を有するため、上記のように可視光線を照射すると、上清からルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながらピペットを用いて分離することができる。分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得ることができる。ルテリアルは、長径５０ｎｍ以上のサイズを有するため、前記過程によりルテリアル以外の血液由来微細物質を除去することができる。
上記のような２つの方法により分離されたルテリアルは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡により観察可能であり、それぞれ２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、および１０００ｎｍのフィルタを順に用いて、サイズに応じて５０〜２００ｎｍ（発生期）／２００〜４００ｎｍ（成熟期）／４００〜６００ｎｍ（分裂期）／６００〜８００ｎｍ（過分裂期）に区別することができる。
本発明では、前記分離されたルテリアルの特性を調べた。
（１）Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
正常のルテリアルのサイズは５０〜８００ｎｍであって（図２および図１２）、フュージョンがない場合には８００ｎｍまで成熟する。患者由来ルテリアルの場合、正常由来のものに比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生して、フュージョンが発生する場合にはルテリアルのサイズが数千ｎｍまで大きくなることを確認した。
正常のルテリアルのサイズは５０〜８００ｎｍであって（図２および図１２）、フュージョンがない場合には８００ｎｍまで成熟する。患者由来ルテリアルの場合、正常由来のものに比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生して、フュージョンが発生する場合にはルテリアルのサイズが数千ｎｍまで大きくなることを確認した。
尚、ルテリアルは円形乃至楕円形であって、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真でミトコンドリアと類似した二重膜構造を示すが、内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を有していなかった（図１）。
（２）免疫化学蛍光染色
ミトコンドリアは、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、および蛍光染色薬であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびＤＡＰＩにより発色されると知られているが、ルテリアルも、ミトコンドリアと同一の染色薬による発色が確認された。前記ルテリアルがミトコンドリアと類似の免疫化学蛍光染色反応を示したのに対し、エキソソーム（ｅｘｓｏｍｅ）とは相反する反応を示し、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す特徴を蛍光写真から確認した（図２（ａ）、図２（ｂ）、図２（ｆ）、図２（ｊ）、図３〜図６）。
ミトコンドリアは、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、および蛍光染色薬であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）およびＤＡＰＩにより発色されると知られているが、ルテリアルも、ミトコンドリアと同一の染色薬による発色が確認された。前記ルテリアルがミトコンドリアと類似の免疫化学蛍光染色反応を示したのに対し、エキソソーム（ｅｘｓｏｍｅ）とは相反する反応を示し、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す特徴を蛍光写真から確認した（図２（ａ）、図２（ｂ）、図２（ｆ）、図２（ｊ）、図３〜図６）。
（３）生態様式
ルテリアルは、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）および微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは異なって、付着性および運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示した。特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有することを確認し、細胞内または細胞外に存在可能であることを確認した（図８、図９、図１１）。
ルテリアルは、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）および微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは異なって、付着性および運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示した。特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有することを確認し、細胞内または細胞外に存在可能であることを確認した（図８、図９、図１１）。
（４）ＡＴＰ生産
２００〜４００ｎｍのサイズのルテリアルからＡＴＰが生産されることを、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）‐ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）反応とルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて立証した。ルテリアルが添加された群は、ルテリアルが添加されていない群に比べてＡＴＰ濃度が増加した。このことから、ルテリアルがＡＴＰ生産能力を有するという結論を導出することができる。ＳＳＨおよびＳＳＦの添加による差については、ＳＳＦ添加群がＳＳＨ添加群に比べてＡＴＰ濃度が高かった。このことから、ＡＴＰ含量を効率的に増加させることができる培養液を確認した（図１８）。
２００〜４００ｎｍのサイズのルテリアルからＡＴＰが生産されることを、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）‐ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）反応とルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて立証した。ルテリアルが添加された群は、ルテリアルが添加されていない群に比べてＡＴＰ濃度が増加した。このことから、ルテリアルがＡＴＰ生産能力を有するという結論を導出することができる。ＳＳＨおよびＳＳＦの添加による差については、ＳＳＦ添加群がＳＳＨ添加群に比べてＡＴＰ濃度が高かった。このことから、ＡＴＰ含量を効率的に増加させることができる培養液を確認した（図１８）。
（５）核酸含有
ＤＡＰＩおよびアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色法により、ルテリアル中にＲＮＡだけでなくＤＮＡも含有されていることを確認した。具体的に、ＲＮＡは、アクリジンオレンジ染色薬により、励起４６０ｎｍ、放出６５０ｎｍのレベル（ｌｅｖｅｌ）でオレンジで染色され、ＤＮＡは、励起５０２ｎｍ、放出５２５ｎｍのレベルで緑色で染色されて、ＤＡＰＩ染色法により、ＤＮＡが含有されていることを確認することができる。前記染色法を用いて、本発明のルテリアル中にＲＮＡとＤＮＡが含有されていることを確認した（図５および図６）。また、ルテリアルのＲＮＡおよびＤＮＡをキット（ｋｉｔ）で分離および精製した後、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）ゲル電気泳動によりバンドを確認し、ｑＲＴ‐ＰＣＲ技法によりＧＡＰＤＨ発現程度を確認することで、ルテリアルのサイズによって遺伝子発現において差があることを確認した（図２（ｈ）、図１６および図１７）。
ＤＡＰＩおよびアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色法により、ルテリアル中にＲＮＡだけでなくＤＮＡも含有されていることを確認した。具体的に、ＲＮＡは、アクリジンオレンジ染色薬により、励起４６０ｎｍ、放出６５０ｎｍのレベル（ｌｅｖｅｌ）でオレンジで染色され、ＤＮＡは、励起５０２ｎｍ、放出５２５ｎｍのレベルで緑色で染色されて、ＤＡＰＩ染色法により、ＤＮＡが含有されていることを確認することができる。前記染色法を用いて、本発明のルテリアル中にＲＮＡとＤＮＡが含有されていることを確認した（図５および図６）。また、ルテリアルのＲＮＡおよびＤＮＡをキット（ｋｉｔ）で分離および精製した後、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）ゲル電気泳動によりバンドを確認し、ｑＲＴ‐ＰＣＲ技法によりＧＡＰＤＨ発現程度を確認することで、ルテリアルのサイズによって遺伝子発現において差があることを確認した（図２（ｈ）、図１６および図１７）。
（６）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列分析
ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｃａｔ ６５６０‐２００）を用いてルテリアルのｇＤＮＡを抽出した後、表１および表２の特定プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させた。
ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｃａｔ ６５６０‐２００）を用いてルテリアルのｇＤＮＡを抽出した後、表１および表２の特定プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させた。
尚、前記増幅された１４６１個の断片遺伝子を対象に、ＧｅｎｅＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ）を用いて相同性を分析した結果、血液および精液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列は、β−プロテオバクテリア（β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ−プロテオバクテリア（γ‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、および真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）由来遺伝子と相同性を示し、原核細胞と真核細胞の中間段階の融合特性を有していた（図２４〜図２５）。
最適状態（血液のｐＨ：７．２〜７．４）で、血液由来ルテリアルは、β−プロテオバクテリア（β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ−プロテオバクテリア（γ‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）由来遺伝子と相同性を示し（図２４）、５０〜８００ｎｍのサイズで観察される。
定常状態で、精液由来ルテリアルは、β‐プロテオバクテリア、γ‐プロテオバクテリア、バクテロイデス、および脊索動物（Ｃｈｏｒｄａｔａ）由来遺伝子と相同性を示す。
これに対し、酸性化状態では、定常状態と同様にβ‐プロテオバクテリア（β‐ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびγ‐プロテオバクテリア（γ‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来遺伝子だけでなく、バクテリア由来遺伝子がさらに多様に発現され、真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）由来遺伝子も発現される。主にストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）とプランクトミ（ｐｌａｎｃｔｏｍｙ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ特性を発現し（図２５）、サイズは４００〜２０００ｎｍまで成長する。
（７）エキソソームおよびミトコンドリアとの違い
表３は、エキソソームおよびミトコンドリアとルテリアルとの違いを整理したものである。
表３は、エキソソームおよびミトコンドリアとルテリアルとの違いを整理したものである。
ルテリアルの平均サイズは２００〜８００ｎｍであって、ミトコンドリア（４００〜１，０００ｎｍ）よりは小さく、エキソソーム（２０〜１２０ｎｍ）よりは大きい。また、エキソソームは膜の区分が明確でなく、内部色が比較的薄いのに対し、ルテリアルは、膜の区分が明確であるか、内部が満たされている形態である（図１９）。尚、ルテリアルは、エキソソームおよび微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）とはその形態が全く異なる（図２０）。
免疫化学蛍光染色時に、ルテリアルはミトコンドリアと類似の反応を示すのに対し、エキソソームとは相反する反応を示す。細胞内外に存在するルテリアルと細胞外に存在するエキソソームは、食品を摂取することで得られる物質でもあるのに対し、ミトコンドリアは食品摂取によっては得られない細胞内にのみ存在するという違いがある。
そして、エキソソームおよびミトコンドリアと異なって、ルテリアルは運動性を有し、自然成長が可能であって培養により成長を維持することができ、自家蛍光の特徴を示す。また、ルテリアル、エキソソーム、およびミトコンドリアは何れもフュージョンの生態様式を有するが、エキソソームではｋｉｓｓ‐ａｎｄ‐ｒｕｎフュージョンが起こらず、ＡＴＰ生産も起こらない。また、エキソソームは細胞外に存在し、ミトコンドリアは細胞内に存在するのに対し、ルテリアルは細胞外または内の両方に存在可能である（図１１）。
また、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列分析結果、ミトコンドリアは、α‐プロテオバクテリアと相同性を示すのに対し、ルテリアルは、γ‐プロテオバクテリア（γ‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、β‐プロテオバクテリア（β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、および真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）と相同性を示す。
他の観点による本発明は、次の特性の一つ以上を有する体液由来ルテリアルに関する：
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発現し、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似体である；
（ｆ）定常状態では円形乃至楕円形であり、患者由来の場合、定常状態に比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有し、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）および／またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルがバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；および
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメアの調節機能を有する。
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発現し、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似体である；
（ｆ）定常状態では円形乃至楕円形であり、患者由来の場合、定常状態に比べてサイズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有し、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）および／またはフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルがバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；および
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメアの調節機能を有する。
一方、ルテリアルは、個体の疾病有無に応じて、サイズ（直径）、面積、形態、およびナノトラッキング速度が異なるため、前記特性の１つ以上を用いて、疾病の診断や予後を予測することができる。これは、疾病のない健常人由来のルテリアルと、疾病のあるヒト由来のルテリアルのサイズ、形態、ナノトラッキング速度などが異なることから分かる。
健常人由来の正常のルテリアルは、単に二重胞子（ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｐｏｒｅ）を形成（ｆｉｓｓｉｏｎ）するだけであるが、晩成疾病患者や癌患者由来のルテリアル（突然変異ルテリアル）は、ルテリアル同士が融合（ｆｕｓｓｉｏｎ）または凝集（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）したり爆発（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）して、赤血球や癌細胞などの細胞にも付着し、その形態およびサイズが正常のルテリアルとは異なって異常に大きくなる特徴がある（図８〜図１０）。突然変異ルテリアルは付着性が高いため、上記のようなサイクル（ｃｙｃｌｅ）によって融合（ｆｕｓｉｏｎ）がさらに加速化してそのサイズが約６００〜８００ｎｍ以上に大きくなり、２００μｍ（２００，０００ｎｍ）以上のサイズを有するものもある。本発明者は、癌の種類や進行程度によって、突然変異されたルテリアルの形態に一貫性があることを確認し、これについての内容を特許出願している（韓国特許出願第１０‐２０１３‐００８２０６０号）。
したがって、ルテリアルの形態学的特性または生化学的特性を観察することで、疾病の診断や予後を予測することができ、その用途が無限にある。
ルテリアルの形態は、正常形、鞭毛形、マス（Ｍａｓｓ）形、ロッド（Ｒｏｄ）形、または複合形を示す。正常形とは、別の融合やバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）などの変形を起こすことなく、長径と短径との比が１：１〜３：１の形態であり、円形に近い形状を示すことができる。顕微鏡で観察時には小さい点として示される。
鞭毛形とは、ルテリアルが変形または融合を起こして外部に鞭毛が備えられた形態であることができる。本発明者らは、末期癌に進むに従って鞭毛形が観察される割合が急激に増加し、４期癌では９９．１％と、略大部分の４期癌が診断された患者で鞭毛形のルテリアルが観察されることを確認した（韓国特許出願第２０１３‐００８２０６０号）。ルテリアルの形態が鞭毛形の形態と８０〜１００％一致する場合、末期腫瘍が疑われる腫瘍マーカ（Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ）で表示することができる。前記末期腫瘍が診断された患者の生存期間は略１〜４ヶ月であり、特に、鞭毛形の場合、長期生存が不可能である。
マス形（Ｍ形）とは、ルテリアルがバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）または融合を起こしてサイズおよび形態が正常形から変形されたものであって、長径と短径の差が大きくない不規則的な体積形態である。好ましくは、長径と短径との比が３：１〜５：１であり、多様な形態のマス形が観察される。
ロッド形（Ｒ形）は、ルテリアルがバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）、変形、または融合を起こして棒（Ｒｏｄ）の形態を呈するものである。短径と長径との長さ差がマス形より大きい。好ましくは、長径と短径との比が５：１〜１２：１であることができる。ロッド形は、円形または楕円形の単一鎖からなるロッド１形、および単一鎖が２個以上結合してなるロッド２形を含む。前記ロッド１形は、単一のルテリアルが棒の形態となったものであって、これは、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）および／または変形によるものであることができる。前記ロッド２形は、２個以上のルテリアルが結合して棒の形態となったものであって、これは、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）、変形、および融合の１つ以上によるものであることができる。一方、鞭毛形は、その形状から、大きい範疇でロッド形に含まれることができるが、鞭毛が伸びているという点で異なる点がある。したがって、ロッド形であるかを先に判断した後、鞭毛形であるかを判断することができる。
前記複合形は、ロッド形とマス形の融合形態であることができる。一体に形成された微細物質の一部がロッド形であり、一部がマス形である形態を複合形と称えることができる。
前記ロッド（Ｒｏｄ）形は、円形または楕円形の単一鎖からなるロッド１形、および単一鎖が２個以上結合してなるロッド２形を含む群の一つであることができる。前記複合形は、ロッド形とマス形の融合形態であることができる。
上記のように、疾病の発病と進行によって、生体内のルテリアルの形態が変わるため、ルテリアルの形態学的特性を観察することで疾病の診断や予後を予測することができる。また、前記ルテリアルの形態変化は、ルテリアルが含有している核酸の量と配列変化にも関連するため、ルテリアルの核酸発現パターン（１６Ｓ ｒＲＮＡ）配列を分析することで疾病を診断することができる。
例えば、正常のルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と患者のルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を比較することで、疾病（特に、癌）を診断することができる。特に、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子発現と真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）遺伝子同時発現は、癌の診断予測マーカとして活用可能である。
但し、患者または健常人から既に排出された体液から分離されたルテリアルは、生体外では短い時間内に溶解されて消滅されたり、形態が変わったりする特性があるため観察自体が難しく、異常な環境下で放置する場合には、２４時間以内に正常のルテリアルも突然変異ルテリアルに変異されて、疾病の正確な診断や治療が困難である。しかし、本発明の培養方法によると、特定のサイズ（５００ｎｍ）以上にならないようにルテリアルを培養することができる。
したがって、他の観点による本発明は、ルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下、１８〜３０℃（好ましくは２０〜２５℃）で培養することを特徴とするルテリアルの培養方法に関する。
前記培養時に添加される水分は、食塩水またはＰＢＳ溶液であることができるが、これに制限されない。培養前の体液由来ルテリアルは本発明の分離方法により得ることができ、そのサイズが５０〜２００ｎｍのものを用いることができる。本発明の培養方法により培養された血液由来ルテリアルの培養後のサイズは３００〜８００ｎｍであることができる。この際、顕微鏡で観察しながら、ルテリアルのサイズが５００ｎｍを超えないようにすることができ、培養が終了すると、サイズ毎に分類して零下８０℃に冷却して保存したり、窒素を充填して保存または零度以上で保存することができ、保存時には保存剤を添加することができる。
上記のように培養されたルテリアルは、その特性が変化することなく所定期間保存が可能であり、ルテリアルを用いた疾病の診断および予後の予測に効果的に活用されることができる。本発明において「ルテリアルの特性が変化することなく」とは、ルテリアルの形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）やサイズが培地で培養する前の状態と略類似に維持されることを意味する。また、ナノトラッキング速度のようなルテリアルの運動性などの活性が、培養する前の状態と類似の値を維持することを意味する。
具体的に、本発明の培養方法により培養されたルテリアルは、次の目的のために用いることができる。変異された突然変異ルテリアルは、融合（ｆｕｓｓｉｏｎ）または凝集して、その形態およびサイズが正常のルテリアルとは異なって異常に大きくなったものであり（図８〜図１０）、分離された突然変異ルテリアルの培養時に、ルテリアルの融合または凝集を抑えることができる候補物質や手段を処理して、ルテリアルの融合または凝集の抑制有無を観察することで、ルテリアルの変異を抑制または予防することができる物質をスクリーニングすることができる。
また、分離されたルテリアルの培養時、フィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）を促進する候補物質や手段を処理することで、突然変異ルテリアルのフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）を促進する物質をスクリーニングすることができる。突然変異ルテリアルは融合または凝集する生態様式を有するが（図８、図９および図１１）、フィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生態様式に転換されたり、突然変異されたルテリアルがフィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）されたりして正常のルテリアルのサイズを有するように、フィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）を促進する候補物質を処理することで、ルテリアルが変異されることを抑制するか、変異されたルテリアルが正常のルテリアルの生態様式を有するように転換する物質、窮極的には、変異されたルテリアルにより誘発され得る疾病の予防物質をスクリーニングすることができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例
実施例１：血液由来ルテリアルの分離
非小細胞性肺癌末期患者から血液を５０ｃｃ採取して直径０．８μｍ以上の空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない物質は分離した。濾過された血液を１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返して遠心分離することで、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）のような一般微小胞を除去して上清を得た。前記上清に可視光線を照射して、運動性を有して集まるルテリアル粒子をピペットを用いて分離した。ルテリアルは自家蛍光および運動性の特性を有するため、上記のように可視光線を照射するとルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながらピペットを用いて分離した。分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させて、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得た。前記過程により長径５０〜８００ｎｍのルテリアルが得られ、これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡により観察確認が可能であった。前記得られたルテリアルは、サイズに応じて、５０〜２００ｎｍ（発生期）／２００〜４００ｎｍ（成熟期）／４００〜６００ｎｍ（分裂期）／６００〜８００ｎｍ（過分裂期）に区分した。類似の方法により、図２１のようなルテリアルのサイズ毎のライブラリを構築し、ルテリアルのサイズ毎のｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙを図２に示した。
実施例１：血液由来ルテリアルの分離
非小細胞性肺癌末期患者から血液を５０ｃｃ採取して直径０．８μｍ以上の空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない物質は分離した。濾過された血液を１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返して遠心分離することで、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）のような一般微小胞を除去して上清を得た。前記上清に可視光線を照射して、運動性を有して集まるルテリアル粒子をピペットを用いて分離した。ルテリアルは自家蛍光および運動性の特性を有するため、上記のように可視光線を照射するとルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながらピペットを用いて分離した。分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させて、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得た。前記過程により長径５０〜８００ｎｍのルテリアルが得られ、これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡により観察確認が可能であった。前記得られたルテリアルは、サイズに応じて、５０〜２００ｎｍ（発生期）／２００〜４００ｎｍ（成熟期）／４００〜６００ｎｍ（分裂期）／６００〜８００ｎｍ（過分裂期）に区分した。類似の方法により、図２１のようなルテリアルのサイズ毎のライブラリを構築し、ルテリアルのサイズ毎のｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙを図２に示した。
実施例２：精液由来ルテリアルの分離
精液を２０００〜４０００ｒｐｍで５〜３０分間１次遠心分離した後、上清を２〜５μｍのフィルタで濾過し、濾過された溶液を３０００〜７０００ｒｐｍで５〜２０分間２次遠心分離した後、０．５〜２μｍのフィルタで濾過した。ルテリアルは自家蛍光および運動性の特性を有するため、濾過した溶液に可視光線を照射するとルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながらピペットを用いて分離した。分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得た。これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡により観察確認が可能であった。
精液を２０００〜４０００ｒｐｍで５〜３０分間１次遠心分離した後、上清を２〜５μｍのフィルタで濾過し、濾過された溶液を３０００〜７０００ｒｐｍで５〜２０分間２次遠心分離した後、０．５〜２μｍのフィルタで濾過した。ルテリアルは自家蛍光および運動性の特性を有するため、濾過した溶液に可視光線を照射するとルテリアル粒子を確認することができる。この際、動くルテリアル粒子を暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で確認しながらピペットを用いて分離した。分離されたルテリアルを直径５０ｎｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾過されていない部分のみをＰＢＳで洗浄することでルテリアルを得た。これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡により観察確認が可能であった。
実施例３：ルテリアルの特性
（１）構造
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜４００ｎｍのサイズを有するルテリアルを、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、および共焦点スキャナ（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ‐ＳＰ８）で撮影した結果、ルテリアルもミトコンドリアと類似に二重膜を有する膜構造であって、内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造が完成されていない状態の構造を有しており、ミトコンドリアと同一のレーザー波長範囲で観察されることを確認した。また、その形態は円形乃至楕円形であることを観察することができた（図１、図（ｅ）、図２（ｈ）、図１３および図１４）。
（１）構造
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜４００ｎｍのサイズを有するルテリアルを、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、および共焦点スキャナ（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ‐ＳＰ８）で撮影した結果、ルテリアルもミトコンドリアと類似に二重膜を有する膜構造であって、内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造が完成されていない状態の構造を有しており、ミトコンドリアと同一のレーザー波長範囲で観察されることを確認した。また、その形態は円形乃至楕円形であることを観察することができた（図１、図（ｅ）、図２（ｈ）、図１３および図１４）。
（２）染色特性
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜８００ｎｍのサイズを有するルテリアルを、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）で染色した後、その発色有無を観察した。その結果、植物由来ルテリアルも、ミトトラッカー、ローダミン１２３、アクリジンオレンジ、およびヤーヌスグリーンＢにより発色されることを確認した（図２（ａ）、図２（ｂ）、図２（ｆ）、図２（ｊ）、図３〜図６）。
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜８００ｎｍのサイズを有するルテリアルを、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）で染色した後、その発色有無を観察した。その結果、植物由来ルテリアルも、ミトトラッカー、ローダミン１２３、アクリジンオレンジ、およびヤーヌスグリーンＢにより発色されることを確認した（図２（ａ）、図２（ｂ）、図２（ｆ）、図２（ｊ）、図３〜図６）。
（３）自家蛍光
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜８００ｎｍのサイズを有するルテリアルが光反応を示すことを蛍光写真から確認した（図５）。
実施例１で得られたルテリアルのうち約５０〜８００ｎｍのサイズを有するルテリアルが光反応を示すことを蛍光写真から確認した（図５）。
（４）運動性
実施例１で得られたルテリアルの運動性を、米国３ｉ社のナノトラッキングにより測定した。具体的に、ルテリアルを明視野顕微鏡で観察した後、ルテリアルの中心にトラッキングを設定してナノトラッキングを作動すると、ルテリアルの移動にしたがってリアルタイム移動軌跡が表示され、その秒当りの速度を計算した（図７）。
実施例１で得られたルテリアルの運動性を、米国３ｉ社のナノトラッキングにより測定した。具体的に、ルテリアルを明視野顕微鏡で観察した後、ルテリアルの中心にトラッキングを設定してナノトラッキングを作動すると、ルテリアルの移動にしたがってリアルタイム移動軌跡が表示され、その秒当りの速度を計算した（図７）。
その結果、本実施例によるルテリアルのナノトラッキング速度は、約１３〜２５μｍ／ｓｅｃと測定された。
（５）ルテリアルにおけるＲＮＡおよびＤＮＡの含有有無の分析
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリアルを原子顕微鏡で撮影した結果、図２（ｈ）、図１５、図１６および図１７に示されたように、ルテリアルにＲＮＡやＤＮＡのような核酸が含有されていると推正することができる。
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリアルを原子顕微鏡で撮影した結果、図２（ｈ）、図１５、図１６および図１７に示されたように、ルテリアルにＲＮＡやＤＮＡのような核酸が含有されていると推正することができる。
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリアルから全ＲＮＡとＤＮＡを分離するために、ＱＩＡＧＥＮキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ：Ｃａｔ ７４００４）を用いて分離した後、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ（ＤＮＡ） ＳｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）チップを用いて定量した。
ルテリアルを遠心分離（８０００ｇ、１時間３０分）して回収した後、キット内の分解緩衝液ＲＬＴ ｐｌｕｓ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃａｎａｔｅ、ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）５０μｌにβメルカプトエタノール３．５μｌを添加し、２０ゲージの針付きの注射器を用いて５〜１０回通過させてルテリアルを溶解させた。サンプル分解緩衝液をＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ ｓｐｉｎカラムに移した後、遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）して、カラムに詰っているＤＮＡとカラムを通過したＲＮＡが含まれたバッファからそれぞれ分離した。
先ず、カラムを通過したバッファに同一体積の３５０μｌの７０％エタノールを入れて均一に混合した後、７００μｌの混合液をＲＮｅａｓｅ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｓｐｉｎカラムに移して遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）し、カラムを通過したバッファは除去した。それぞれの３５０μｌのＲＷ１，５００μｌのＲＰＥバッファと５００μｌの８０％エタノールを用いて、カラム洗浄を段階的に行った。上記で用いられた全ての遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）は同一条件で行った。ＲＮＡを得るために、１４μｌのＲＮｅａｓｙ‐ｆｒｅｅ溶液をカラムに入れた後、遠心分離（≧８０００ｇ、６０秒）してルテリアルＲＮＡを分離した。
ゲノムＤＮＡの分離のために、ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用いた。チューブに分離されたルテリアルを入れた後、９７８μｌのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）バッファ、１２２μｌのＭＴバッファを添加した。４０秒間均質化させてから、遠心分離（１４，０００ｇ、１０分）して上清を得た後、２５０μｌのＰＰＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて１０分間混合した。遠心分離（１４０００ｇ、５分）した後、１５ｍｌのチューブに上清を移す過程を２回繰り返し、ＤＮＡ結合（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ）のためにロータ（ｒｏｔｏｒ）に２分間載せた後、シリカマトリックス台に３分間入れて置いた。上清を略６００μｌ程度注意して回収してＳＰＩＮ Ｆｉｌｔｅｒに入れ、遠心分離（１４０００ｇ、１分）した後、上清を捨て、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にＳＥＷＳ‐Ｍを５００μｌ入れて懸濁させた（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ）。１分間遠心分離した後、上清を捨て、如何なるバッファも残らないように遠心分離を繰り返した。５０μｌのＤＥＳ（ＤＮａｓｅ／Ｐｙｒｏｇｅｎ‐Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ）を入れて遠心分離（１４０００ｇ、１分）した後、ゲノムＤＮＡを得た。
Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ（ＤＮＡ）ＳｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）チップを用いて定量した結果、図１６および図１７に示されたように、ルテリアルにそれぞれＲＮＡおよびＤＮＡが含有されていることを確認することができた。
（６）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列分析
１６Ｓ ｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）は、様々なタンパク質と相互作用してリボソーム（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ）を構成するＲＮＡであって、塩基配列変化率が殆どのゲノムにおける他の遺伝子の塩基配列より著しく小さいため、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列類似度の程度が生物間の系統学的距離を反映すると認識されている。
１６Ｓ ｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）は、様々なタンパク質と相互作用してリボソーム（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ）を構成するＲＮＡであって、塩基配列変化率が殆どのゲノムにおける他の遺伝子の塩基配列より著しく小さいため、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列類似度の程度が生物間の系統学的距離を反映すると認識されている。
［１］血液由来ルテリアル
実施例１で得られた血液由来ルテリアルからＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｃａｔ ６５６０‐２００）を用いてｇＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲ‐ｐｒｅｍｉｘ（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ）配列番号１〜２３のブライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅させた。
実施例１で得られた血液由来ルテリアルからＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｃａｔ ６５６０‐２００）を用いてｇＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲ‐ｐｒｅｍｉｘ（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ）配列番号１〜２３のブライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅させた。
増幅されたＰＣＲ産物は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）とａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＩＳＭ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列を分析した。増幅されたＰＣＲ産物は総１４６１個の断片であって、このうち１４０７個の断片はプロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来遺伝子と相同性を示し、２０個の断片はアシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来遺伝子と相同性を示し、１１個の断片はアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来遺伝子と相同性を示した（表４）。
分析した塩基配列の断片をＳｅｑＭａｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）で組み合わせて１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を得た。
図２４は、健常人（血液のｐＨ：７．２〜７．４）の血液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡを塩基配列分析して、相同性を示す類似バクテリアの構成を示したものであって、ルテリアルのサイズ毎に分析した（（ａ）：１００ｎｍ以下、（ｂ）：１００〜２００ｎｍ、（ｃ）２００〜４００ｎｍ、（ｄ）４００〜８００ｎｍ）。サイズ毎に大きい差はなく、何れもプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）由来遺伝子と相同性を示した。
図２５（ｃ）は、疲労・疾病状態（血液のｐＨ：７．０以下）の血液由来のルテリアル（サイズ：２００〜４００ｎｍ）の１６Ｓ ｒＲＮＡを塩基配列分析して、相同性を示す類似バクテリアの構成を示したものである。定常状態とは異なって、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）由来遺伝子と相同性を示す遺伝子がさらに発現された。
図２６（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、血液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列に基づいた系統発生図を示したものである。
血液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ断片は、β‐プロテオバクテリア、γ‐プロテオバクテリア、バクテロイデス、ファーミキューテス、およびストレプトファイタなどの様々なバクテリアと相同性を示すことが確認された。
一般に、微生物分類体系上、ｇＤＮＡ関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）が７０％未満であると、互いに独立した菌株として認められる。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の相同性が９７％未満であると、ｇＤＮＡ関連性が７０％未満であるということが、統計学的な分析により証明された。したがって、ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡ断片と９７．０％以上の相同性を示す配列を有する細胞を分析した結果、表５〜表７に示したように、血液由来ルテリアルはγ‐プロテオバクテリアと１００％の相同性を示し、ファーミキューテスとは９７．５３％、バクテロイデスとは９７％以上の相同性を示した。
一方、異常状態である酸性条件のルテリアルは、表８に示したように、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）と９９％以上の相同性を示した。
［２］精液由来ルテリアル
実施例２で得られた精液由来ルテリアルに対して、上記のような方法によりｇＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、および塩基配列分析を行った。図２５は、疲労・疾病状態（精液のｐＨ：７．０以下）の精液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡを塩基配列分析して、相同性を示す類似バクテリアの構成を示したものであって、ルテリアルのサイズ毎に分析した（（ａ）：１００ｎｍ以下、（ｂ）：１００〜２００ｎｍ、（ｄ）４００〜８００ｎｍ）。
実施例２で得られた精液由来ルテリアルに対して、上記のような方法によりｇＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、および塩基配列分析を行った。図２５は、疲労・疾病状態（精液のｐＨ：７．０以下）の精液由来ルテリアルの１６Ｓ ｒＲＮＡを塩基配列分析して、相同性を示す類似バクテリアの構成を示したものであって、ルテリアルのサイズ毎に分析した（（ａ）：１００ｎｍ以下、（ｂ）：１００〜２００ｎｍ、（ｄ）４００〜８００ｎｍ）。
定常状態の精液由来ルテリアルは、血液由来ルテリアルと同様に、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）由来遺伝子と相同性を示し、特異なことに、脊索動物（Ｃｈｏｒｄａｔａ）由来遺伝子と相同性を示した。
尚、異常状態である酸性条件では、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）由来遺伝子と相同性を有する遺伝子が発現された。
（７）ＡＴＰ含量測定
対照群、ルテリアル、ルテリアル（ＳＳＨ １２ｈ）、およびルテリアル（ＳＳＦ １２ｈ）で構成された４種の培養液１０ｍＬをそれぞれチューブに入れ、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＡＤＰ（１ｍＭ）基質を入れて３７℃の水浴で培養した。培養開始後、３０分間隔で試料１００μｌを採取してチューブに入れ、９００μｌの蒸留水を入れて１０倍希釈した後、１０μｌの試料を新しいチューブに移して、ＡＴＰ ｋｉｔに含まれているルシフェラーゼ試薬を１００μｌ添加し、直ちにルミノメータで５回繰り返して測定した。
対照群、ルテリアル、ルテリアル（ＳＳＨ １２ｈ）、およびルテリアル（ＳＳＦ １２ｈ）で構成された４種の培養液１０ｍＬをそれぞれチューブに入れ、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＡＤＰ（１ｍＭ）基質を入れて３７℃の水浴で培養した。培養開始後、３０分間隔で試料１００μｌを採取してチューブに入れ、９００μｌの蒸留水を入れて１０倍希釈した後、１０μｌの試料を新しいチューブに移して、ＡＴＰ ｋｉｔに含まれているルシフェラーゼ試薬を１００μｌ添加し、直ちにルミノメータで５回繰り返して測定した。
その結果、図１８に示されたように、ルテリアルが添加された群では、ルテリアルが添加されていない群に比べてＡＴＰ濃度が増加していた。この結果から、ルテリアルがＡＴＰ生産能力を有するということを確認することができた。ＳＳＨおよびＳＳＦ添加による差については、ＳＳＦ添加群がＳＳＨ添加群に比べてＡＴＰ濃度が高かった（図１８）。
実施例４：ルテリアルの培養
（１）実施例１で得られたルテリアルのうちサイズが約５０〜２００ｎｍであるルテリアルにＰＢＳを添加し、ＩＲ光線を照射した後、１８〜３０℃で約３時間培養した。ＩＲ光線を照射した直後から約１時間間隔でルテリアルのサイズを顕微鏡で確認した。約１〜６時間後、培養前のサイズが約２００ｎｍであったルテリアルが、約５００ｎｍに成長したことを確認することができた。これにより、血液由来ルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下で１８〜３０℃で培養する場合、そのサイズを５００ｎｍ程度まで成長させることができた。勿論、追加培養すると数百μｍまで培養されることが確認され、この状態で追加培養するとバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）されることも確認された（図２２）。
（１）実施例１で得られたルテリアルのうちサイズが約５０〜２００ｎｍであるルテリアルにＰＢＳを添加し、ＩＲ光線を照射した後、１８〜３０℃で約３時間培養した。ＩＲ光線を照射した直後から約１時間間隔でルテリアルのサイズを顕微鏡で確認した。約１〜６時間後、培養前のサイズが約２００ｎｍであったルテリアルが、約５００ｎｍに成長したことを確認することができた。これにより、血液由来ルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下で１８〜３０℃で培養する場合、そのサイズを５００ｎｍ程度まで成長させることができた。勿論、追加培養すると数百μｍまで培養されることが確認され、この状態で追加培養するとバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）されることも確認された（図２２）。
（２）実施例１で得られたルテリアルのうちサイズが約４００〜８００ｎｍであるルテリアルにＰＢＳを添加し、ＩＲ光線を照射した後、１８〜３０℃で約３時間培養した。ＩＲ光線を照射した直後から約１時間間隔でルテリアルのサイズと状態を顕微鏡で確認した。約１〜６時間後、培養前のサイズが約４００〜８００ｎｍであったルテリアルが成長せず、フィッション（ｆｉｓｓｉｏｎ）されることを確認した。
尚、８００ｎｍ以上の変異ルテリアルを追加培養する場合、癌患者の血液で示された変異ルテリアルの形態に変わることが観察された（図２３）。
実施例５：ルテリアルの抗癌効果
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３およびＡ２７８０の２種の増殖抑制効果を測定するために、黄色テトラゾリウム ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾリル‐２）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析法を実施した。ＭＴＴ分析法は、生きている細胞の生育を測定する方法であって、生きている細胞のミトコンドリア中の脱水素酵素が黄色水溶性物質であるＭＴＴにより紫色ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成する原理を利用する。紫色ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の生産量は、代謝的活性を有する生きている細胞数と略比例すると知られており、細胞の生育と分化を測定するにおいて非常に効果的に用いられることができる。
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３およびＡ２７８０の２種の増殖抑制効果を測定するために、黄色テトラゾリウム ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾリル‐２）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析法を実施した。ＭＴＴ分析法は、生きている細胞の生育を測定する方法であって、生きている細胞のミトコンドリア中の脱水素酵素が黄色水溶性物質であるＭＴＴにより紫色ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成する原理を利用する。紫色ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の生産量は、代謝的活性を有する生きている細胞数と略比例すると知られており、細胞の生育と分化を測定するにおいて非常に効果的に用いられることができる。
培養されたそれぞれの癌細胞を９６ウェルプレートに５×１０４個／ｍｌになるようにウェル当たりに１００μｌずつ添加し、３７℃、炭素５％および酸素９５％が供給される湿潤インキュベータで２４時間培養した後、サイズ１００〜８００ｎｍのルテリアルを濃度毎に処理した。４８時間培養した後、それぞれのウェルにリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）に溶解したＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）溶液を１５μｌずつ添加して、さらに４時間培養した。ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の形成を確認した後、培地を完全に除去し、ウェルの底に形成されたホルマザンを溶解するために１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。その後、マイクロプレートリーダ（ＧＥＭＩＮＩ、Ｓｔｒａｔｅｃ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用いて５６０ｎｍで吸光度を測定し、対照群細胞を１００％としたときの相対的な細胞増殖抑制率を算出した。
その結果、ＳＫＯＶ３およびＡ２７８０細胞株のルテリアルのＩＣ５０はそれぞれ３０μｇ／ｍｌおよび６０μｇ／ｍｌであり、市販中の抗癌剤ｃｉｓｐｌａｔｉｎのＩＣ５０は１００μＭであった（図２７）。ルテリアルは、卵巣癌細胞株２種に対して陽性対照薬物群よりも強い細胞毒性を示し、卵巣正常細胞に対しては陽性対照薬物群と類似の細胞毒性を示した。
以上、本発明の内容を詳細に記述したが、当業界において通常の知識を有する者において、このような具体的技術は好ましい実施形態にすぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されるといえる。
本発明によると、患者または健常人の体液中に存在する微細物質であるルテリアルを効
果的に分離することができ、前記分離されたルテリアルを所定のサイズに成長するように
培養することができるため、疾病の診断および治療に有用である。特に、ルテリアルは癌
細胞株に対して強い抗癌効果を示すため抗癌剤として有用である。
本発明は一態様において、下記を提供する。
[項目１]
次のステップを含むルテリアルの分離方法：
（ａ）血液から血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離する第１の
分離ステップと、
（ｂ）前記血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離させた血液を遠
心分離する第２の分離ステップと、
（ｃ）前記遠心分離により得られた上清からルテリアルを分離する第３の分離ステップと
、
（ｄ）前記分離されたルテリアルを洗浄するステップ。
[項目２]
前記血液は哺乳動物由来であることを特徴とする、項目１に記載のルテリアルの分離方
法。
[項目３]
前記血液はヒト由来であることを特徴とする、項目２に記載のルテリアルの分離方法。
[項目４]
前記第１の分離ステップは０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾
過されていない物質は分離するステップをさらに含むことを特徴とする、項目１に記載の
ルテリアルの分離方法。
[項目５]
２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、および１０００ｎｍのフィルタを
順に用いて、各々５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００
〜８００ｎｍ及び８００〜１０００ｎｍのサイズのルテリアルに分類することをさらに含
むことを特徴とする、項目４に記載のルテリアルの分離方法。
[項目６]
前記第２の分離ステップは１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離を繰り返
すことにより行うことを特徴とする、項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目７]
前記第２の分離ステップにおいてエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）が除去されることを
特徴とする項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目８]
前記第３の分離ステップは遠心分離により得られた上清に可視光線を照射すること、及
び可視光線が照射された位置に集まる運動性を有するルテリアル粒子をピペットを用いて
分離して行うことを特徴とする項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目９]
前記洗浄するステップは前記第３の分離ステップから得られたルテリアルを直径５０ｎ
ｍの空隙を有するフィルタに通過させること、濾過されていない部分のみを洗浄すること
、それによってルテリアルを得ることにより行われることを特徴とする項目１に記載のル
テリアルの分離方法。
[項目１０]
次の特性の一つ以上を有する体液由来ルテリアル：
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジ
ンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａ
ｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）において、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテ
オバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だ
けでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発
現し、４００ｎｍ〜２０００ｎｍまたはそれ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似構造体であ
る；
（ｆ）定常状態では円形または楕円形であり、患者由来の場合は、定常状態に比べてサイ
ズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有しており、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生
態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティ
ング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメアの調節機能を有する。
[項目１１]
前記体液は哺乳動物由来の血液、精液、腸液、唾液、または細胞液であることを特徴と
する項目１０に記載のルテリアル。
[項目１２]
項目１０に記載のルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下、１８〜３０℃で培養す
ることを含むルテリアルの培養方法。
[項目１３]
前記培養前及び後において、ルテリアルのサイズは、各々５０〜２００ｎｍ及び３００
〜８００ｎｍであることを特徴とする項目１２に記載のルテリアルの培養方法。
[項目１４]
前記水分は、食塩水またはＰＢＳ溶液であることを特徴とする項目１３に記載のルテリ
アルの培養方法。
[項目１５]
次のステップを含むルテリアルの分離方法：
（ａ）体液を遠心分離して上清を得て、この上清を２〜５μｍの孔のサイズのフィルタで
濾過するステップ；と、
（ｂ）前記濾過された溶液を２次遠心分離して上清を得て、この上清を０．５〜２μｍの
孔のサイズのフィルタで濾過するステップ。
[項目１６]
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて濾過された溶液に可視光線を照射して、そして可視
光線が照射された位置に集まる運動性を有するルテリアル粒子をピペットを用いて分離す
るステップをさらに含むことを特徴とする項目１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１７]
前記体液は哺乳動物由来の血液、精液、腸液、唾液、または細胞液であることを特徴と
する項目１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１８]
前記１次遠心分離は２０００〜４０００ｒｐｍで５〜３０分行うことを特徴とする項目
１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１９]
前記２次遠心分離は３０００〜７０００ｒｐｍで５〜２０分行うことを特徴とする項目
１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目２０]
項目１０に記載のルテリアルを有効成分として含有する抗癌組成物。
果的に分離することができ、前記分離されたルテリアルを所定のサイズに成長するように
培養することができるため、疾病の診断および治療に有用である。特に、ルテリアルは癌
細胞株に対して強い抗癌効果を示すため抗癌剤として有用である。
本発明は一態様において、下記を提供する。
[項目１]
次のステップを含むルテリアルの分離方法：
（ａ）血液から血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離する第１の
分離ステップと、
（ｂ）前記血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離させた血液を遠
心分離する第２の分離ステップと、
（ｃ）前記遠心分離により得られた上清からルテリアルを分離する第３の分離ステップと
、
（ｄ）前記分離されたルテリアルを洗浄するステップ。
[項目２]
前記血液は哺乳動物由来であることを特徴とする、項目１に記載のルテリアルの分離方
法。
[項目３]
前記血液はヒト由来であることを特徴とする、項目２に記載のルテリアルの分離方法。
[項目４]
前記第１の分離ステップは０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルタに通過させ、濾
過されていない物質は分離するステップをさらに含むことを特徴とする、項目１に記載の
ルテリアルの分離方法。
[項目５]
２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、および１０００ｎｍのフィルタを
順に用いて、各々５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００
〜８００ｎｍ及び８００〜１０００ｎｍのサイズのルテリアルに分類することをさらに含
むことを特徴とする、項目４に記載のルテリアルの分離方法。
[項目６]
前記第２の分離ステップは１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離を繰り返
すことにより行うことを特徴とする、項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目７]
前記第２の分離ステップにおいてエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）が除去されることを
特徴とする項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目８]
前記第３の分離ステップは遠心分離により得られた上清に可視光線を照射すること、及
び可視光線が照射された位置に集まる運動性を有するルテリアル粒子をピペットを用いて
分離して行うことを特徴とする項目１に記載のルテリアルの分離方法。
[項目９]
前記洗浄するステップは前記第３の分離ステップから得られたルテリアルを直径５０ｎ
ｍの空隙を有するフィルタに通過させること、濾過されていない部分のみを洗浄すること
、それによってルテリアルを得ることにより行われることを特徴とする項目１に記載のル
テリアルの分離方法。
[項目１０]
次の特性の一つ以上を有する体液由来ルテリアル：
（ａ）免疫蛍光試験で、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジ
ンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａ
ｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示す；
（ｂ）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）において、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテ
オバクテリア由来遺伝子の発現特性を示し、３０〜８００ｎｍのサイズを有する；
（ｃ）酸性化状態では、β‐プロテオバクテリアとγ‐プロテオバクテリア由来遺伝子だ
けでなく、真核細胞であるストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）遺伝子を発
現し、４００ｎｍ〜２０００ｎｍまたはそれ以上までサイズが大きくなる；
（ｄ）正常条件でＡＴＰ生成に関与する；
（ｅ）ミトコンドリアおよびエキソソームとは全く異なる細胞または細胞類似構造体であ
る；
（ｆ）定常状態では円形または楕円形であり、患者由来の場合は、定常状態に比べてサイ
ズ（長径８００ｎｍ以上）が大きく、形態が均一ではない変異ルテリアルが発生する；
（ｇ）二重膜構造を有しており、付着性がある；
（ｈ）細胞内または外の両方に存在可能である；
（ｉ）運動性を有し、融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）の生
態様式を示す；
（ｊ）特定条件で変異ルテリアルはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）し、バースティ
ング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）後には幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する；
（ｋ）ｐ５３遺伝子およびテロメアの調節機能を有する。
[項目１１]
前記体液は哺乳動物由来の血液、精液、腸液、唾液、または細胞液であることを特徴と
する項目１０に記載のルテリアル。
[項目１２]
項目１０に記載のルテリアルに水分を添加し、ＩＲ光線照射下、１８〜３０℃で培養す
ることを含むルテリアルの培養方法。
[項目１３]
前記培養前及び後において、ルテリアルのサイズは、各々５０〜２００ｎｍ及び３００
〜８００ｎｍであることを特徴とする項目１２に記載のルテリアルの培養方法。
[項目１４]
前記水分は、食塩水またはＰＢＳ溶液であることを特徴とする項目１３に記載のルテリ
アルの培養方法。
[項目１５]
次のステップを含むルテリアルの分離方法：
（ａ）体液を遠心分離して上清を得て、この上清を２〜５μｍの孔のサイズのフィルタで
濾過するステップ；と、
（ｂ）前記濾過された溶液を２次遠心分離して上清を得て、この上清を０．５〜２μｍの
孔のサイズのフィルタで濾過するステップ。
[項目１６]
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて濾過された溶液に可視光線を照射して、そして可視
光線が照射された位置に集まる運動性を有するルテリアル粒子をピペットを用いて分離す
るステップをさらに含むことを特徴とする項目１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１７]
前記体液は哺乳動物由来の血液、精液、腸液、唾液、または細胞液であることを特徴と
する項目１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１８]
前記１次遠心分離は２０００〜４０００ｒｐｍで５〜３０分行うことを特徴とする項目
１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目１９]
前記２次遠心分離は３０００〜７０００ｒｐｍで５〜２０分行うことを特徴とする項目
１５に記載のルテリアルの分離方法。
[項目２０]
項目１０に記載のルテリアルを有効成分として含有する抗癌組成物。
Claims (5)
- 次のステップ
（１）血液から血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離し、そして血小板および血小板以上のサイズを有する血液由来物質を分離させた血液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルタに通過させる第１のステップと、
（２）前記濾過された溶液を遠心分離して上清を提供し、エキソソームを含む一般微小胞をペレットに除去し、ミトコンドリア類似ナノサイズ粒子を含む上清を提供する第２のステップと、
（３）前記遠心分離により得られた前記上清に可視光線を照射し、自家蛍光を示し、免疫蛍光試験において陽性の染色反応を示す、運動性を有する粒子を分離する第３のステップ
を含むミトコンドリア類似ナノサイズ粒子の濃縮方法。 - 前記血液は哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記血液はヒト由来であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- ２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、および１０００ｎｍのフィルタを順に用いて、各々５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍ及び８００〜１０００ｎｍのサイズのミトコンドリア類似ナノサイズ粒子に分類することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記ミトコンドリア類似ナノサイズ粒子は、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ‐ｔｒａｃｋｅｒ）、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ＤＡＰＩ、またはアクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）に陽性の染色反応を示す、請求項１に記載の方法。
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