CN102858375B - 载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

含有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用。还提供包括含有干扰核糖核酸的药物组合和试剂盒。含有干扰核糖核酸的细胞微粒子以及包括该细胞微粒子的药物组合和试剂盒可用于研究干扰核糖核酸对受体细胞的影响作用。由于含有干扰核糖核酸的细胞微粒子能够稳定、高效、特异性地输送干扰核糖核酸，因而可用于治疗相关疾病。

Description

载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用
发明领域
本发明涉及载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、制备方法及其应用。具体地，本发明涉及提供载有干扰核糖核酸的细胞微粒子，将干扰核糖核酸负载于细胞微粒子的方法，以及此方法在生物医学实验技术改良及疾病预防/治疗中的作用。
背景技术
细胞微粒子(microvesicles)是一类大小在10-500nm之间，具有脂质双层膜的生物囊泡结构。早在1967年就有报道，当时被称为“platelet dust”，其来源于血小板，包含囊泡，具有促进凝结的作用。体外研究发现内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、白细胞、淋巴细胞、红细胞等都能释放微粒子。根据微粒子产生的途径，又可以将微粒子区分为exosomes和shedding vesicles。Exosomes是细胞在被刺激的情况下，通过多囊泡小体(Multivesicular bodies，MVBs)胞吐到细胞外的，而shedding vesicles则是直接从细胞表面以出芽的方式分泌出来的。目前，不同细胞分泌的shedding vesicles被命名为不同的名称，比如中性粒细胞和单核细胞分泌的被称为ectosomes，而血小板分泌的则被称为microparticles。
细胞微粒子的膜成分取决于其来源的细胞，主要由脂质和蛋白质组成，但细胞微粒子的内部成分尚不清楚。细胞微粒子的质膜含有来源细胞的特征，即来源细胞表面特异性的分子标记以及细胞受体/配体。细胞微粒子明确的生理功能至今尚未研究清楚。
干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)是一类由20多个核苷酸组成的双链RNA分子，可以通过特异性降解靶基因的信使核糖核酸(messager RNA，mRNA)起到沉默基因表达的作用。这一过程被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。
RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。通过siRNA介导的识别，并靶向切割同源性靶mRNA的方式，特异性高效抑制基因表达。RNA干扰具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。
近几年来RNA干扰研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于生物医学实验研究及各种疾病的基因治疗领域。
在RNA干扰技术出现以前，基因敲除(gene knockout)是主要的反向遗传学(reverse genetics)研究手段，但其技术难度高，操作复杂，周期长。由于RNA干扰可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的同时又具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或减低突变序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。在功能基因组研究中，需要对特定基因功能丧失或减低突变，以确定其功能，因此RNA干扰可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得RNA干扰技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路，发现新的药物作用靶点有重要意义。
RNA干扰技术也被广泛应用与治疗疾病领域。在利用RNA干扰技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子，引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNA干扰机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达，尤其针对引起一些对人类健康严重危害的核酸病毒。
目前，研究已经证明，siRNA能有效地抑制HIV病毒在体外培养细胞中的复制。siRNA可以通过抑制HIV病毒自身基因(如ple，gag，rev，tat和env)或宿主基因(如HIV的主要受体CD4)达到阻止HIV感染的目的。同时研究发现，在两种自身免疫性肝炎的小鼠模型中静脉注射抑制Fas的siRNA进入小鼠，肝细胞中的Fas mRNA及蛋白质水平均降低，故保护了肝细胞免受自身免疫肝炎引起的细胞凋亡的伤害。更有研究发现：利用RNA干扰去沉默P53基因，可以抑制肿瘤细胞从良性到恶性的转化。
虽然RNA干扰已广泛应用于生物医学研究各个方面，但目前该技术仍有一些难以解决的问题。例如，应用现有的脂质体转染方法，siRNA进入某些细胞，如免疫细胞的效率非常低。这就影响其在这一领域的进一步应用。
同时，尽管siRNA药物的研究开发取得了不少成果，但要将其作为药物真正用于医疗还面临很多问题。虽然可以直接将siRNA注射到动物体内，但是这种没有经过包裹的siRNA的半衰期极短，治疗效果差强人意。目前，siRNA药物运送的载体主要有脂质体、毫微型胶襄(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精包含物(β-cyclodextrininclusionCompound或称β环糊精胶襄)等，虽然可以延长药物在体内的存留时间并一定程度上提高siRNA药物的吸收率，但是其传送药物的靶向性和高效性仍然不足。如何对人进行有效的给药，既能确保药效在靶器官靶组织有效释放，还要具有高度安全性等等问题都尚需进一步研究。
siRNA作为生物、医学研究的重要手段以及潜在的药物，目前还存在一些未解决的问题，递送siRNA的特异性(靶向性)差、稳定性差、效率低是妨碍其应用的主要原因，因此，迫切需要一种更加稳定、高效、特异的运送siRNA的方式，高效地、特异性地传送siRNA。
申请人意外地发现：细胞微粒子是一种在生物体内转运效率高，特异性强的生物囊泡载体。这些细胞微粒子大小不一，分布在10-500纳米范围。原则上不同细胞释放的微粒子的膜表成分(包括特异性表面受体及膜脂结构)与对应细胞的质膜成分相同。因此，细胞微粒子带有来源细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性。如果采用细胞微粒子作为运送siRNA的载体，就可以高效率、选择性地递送siRNA到靶细胞/组织，从而大大提高siRNA调控细胞功能的作用。显然，由于细胞微粒子(包括所有具有细胞微粒子特征的膜脂囊泡结构，比如exosome和shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称)本身具有和特定组织及细胞结合的特异性，其所载siRNA也呈现较强的靶向性、稳定性及高效率，它在疾病机制的研究及治疗方面有重大应用前景。
发明人研究发现：以细胞微粒子作为载体运送干扰核糖核酸(microRAN)进入靶细胞，由于细胞微粒子是细胞自身分泌的物质，具有生物亲和性，不会对生物体本身造成伤害；同时，由于细胞微粒子表面携带了来源细胞特异的表面分子，对其靶细胞具有高亲和性，因此可以高效、特性地进入靶细胞。进入靶细胞的干扰核糖核酸可以发挥其功能，通过与靶基因信使核糖核酸特定序列的结合，阻断靶基因蛋白质翻译过程，从而起到特异性阻断基因表达的作用。
应用细胞微粒子作为载体运送siRNA的优势在于：首先，细胞微粒子来源于细胞，是生物体本身存在的，从而可以克服目前人工合成的药物载体对细胞的毒性以及对身体的损害；其次，将siRNA包裹进入细胞微粒子的过程中所应用的各种技术手段都很容易实现，同时包裹效率很高，这在一定程度上加大了其实际应用的潜力；更重要的是细胞微粒子是具有双层质膜结构的囊泡结构，外膜和细胞质膜结构类似，可以通过和细胞膜融合、胞吞作用进入细胞。同时，由于细胞微粒子膜表面携带有来源细胞的质膜表面的分子标记物，如表面蛋白、各种受体/配体等，可以通过特异性的识别，高效地进入靶细胞。如果应用病人自身组织或细胞的原代培养物分泌的细胞微粒子包裹siRNA还可减少免疫排斥并进一步提高细胞微粒子携带siRNA进入生物体的效率。基于以上优势，细胞微粒子作为载体运送siRNA作为药物将会在药物开发及临床疾病的预防和治疗中起到重要的作用。
发明概述
本发明提供了含有干扰核糖核酸的细胞微粒子。
本发明还提供一种药物组合物，包括含有干扰核糖核酸的细胞微粒子和药物上可用的载体。
本发明进一步提供了一种试剂盒，其中包括含有干扰核糖核酸的细胞微粒子或者含有含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的药物组合物，以及使用说明。
本发明此外还提供了一种制备含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的方法，包括下列步骤：
应用细胞转染技术将干扰核糖核酸转入细胞；或病毒载体法将干扰核糖核酸转入细胞；
分离含有干扰核糖核酸的细胞微粒子。
本发明还提供了一种研究方法，包括：
将siRNA及其对照序列导入供体细胞内，优选通过转染或病毒载体法；
分离含有干扰核糖核酸的细胞微粒子；
将该含有干扰核糖核酸的细胞微粒子加入受体，优选受体细胞；
研究该含有干扰核糖核酸的细胞微粒子进入受体细胞后的影响。
本发明还提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括：将含有干扰核糖核酸的细胞微粒子转入受体。
本发明还提供了含有干扰核糖核酸的细胞微粒子在输送干扰核糖核酸中的用途。
附图说明
图1显示正常人血清/血浆细胞微粒子的透射电镜图。
图2-A Real time-PCR方法检测c-myb基因siRNA干扰效率
图2-B流式细胞仪检测转染效率的结果
图2-C荧光显微镜检测转染效率的结果
图3-A显示流式细胞法检测细胞微粒子
图3-B显示流式细胞法检测含有siRNA的细胞微粒子
图3-C显示siRNA以细胞微粒子作为载体进入靶细胞
图4-A显示siRNA在靶细胞特异性将靶蛋白表达量下调
图4-B显示未含有siRNA的细胞微粒子对靶细胞迁移能力的影响
图4-C含有siRNA的细胞微粒子对靶细胞迁移能力的影响
图4-D显示含有siRNA的细胞微粒子对靶细胞迁移能力影响的统计结果
图5含有siRNA的细胞微粒子对HIV病毒的抑制作用
具体实施方式
含有干扰核糖核酸的细胞微粒子
细胞微粒子包括各种大小在10-500nm之间，由细胞分泌的具有脂质双层膜的天然生物囊泡，包括通过多囊泡小体(Multivesicular bodies，MVBs)分泌的Exosome；细胞以出芽方式分泌的shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称。
细胞微粒子包括来自人或动物的各种细胞产生的细胞微粒子，特别地，包括正常的或者患病的人或动物的细胞，可以是原代培养物、传代培养物(细胞系)，例如内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、白细胞、淋巴细胞和红细胞。
siRNA包括所有针对受体基因设计的通过RNA干扰原理特异性降解靶基因的siRNA序列。
本发明还提供了可用于疾病治疗的药物组合物及试剂盒。
根据本发明的一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，包括含有干扰核糖核酸的细胞微粒子以及药物上可用的载体。载体例如包括生理盐水、血清、细胞培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)等。
根据本发明的一个实施方案，本发明提供了一种试剂盒，其中包括含有干扰核糖核酸的细胞微粒子或者含有含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的药物组合物，以及使用说明。
使用含有干扰核糖核酸的细胞微粒子或者含有该含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的药物组合物或试剂盒能够预防和/或治疗的疾病包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等病毒性疾病，例如结核、细菌性肺炎等细菌性疾病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，例如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病。
方法
本发明此外还提供了一种制备含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的方法，包括下列步骤：
应用细胞转染技术将干扰核糖核酸转入细胞；或病毒载体法将干扰核糖核酸转入细胞；
分离含有干扰核糖核酸的细胞微粒子。
制备细胞微粒子的方法包括，例如差速离心法、免疫吸附法和超滤法。
优选采用差速离心法制备细胞微粒子，例如包括下述步骤：先将体液、血液、细胞、组织、体外培养的细胞或组织离心，除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心，取沉淀便是细胞微粒子。
或者优选地，使用免疫吸附法制备细胞微粒子，例如包括以下步骤：(1)先将体液、血液、细胞、组织、体外培养的细胞或组织离心，去除各种细胞及碎片，取上清；(2)将吸附在组织培养皿上的细胞特异性的抗体或免疫磁珠(Invitrogen，美国)与上清温育(例如30～60分钟)，得到被吸附的细胞微粒子。
或者优选地，采用例如包括以下步骤的超滤法：
(1)先将体液、血液、细胞、组织、体外培养的细胞或组织离心去除各种细胞及碎片，取上清；(2)将上清放入带有100KD滤膜的浓缩离心管(Millipore，美国)，于4000转/分钟进行离心，浓缩即得细胞微粒子。
优选地，本发明提供了一种制备负载有siRNA的细胞微粒子的方法，该微粒子可以高效、特异进入受体细胞或生物体，通过siRNA干扰其靶基因的蛋白表达。
根据本发明的一个实施方案，该方法包括：
1)将siRNA包裹进入供体细胞微粒子；
2)分离供体细胞分泌的细胞微粒子；
3)检测细胞微粒子中siRNA的装载效率；
4)将含有siRNA的细胞微粒子引入受体，例如受体细胞，优选注(射)入生物体。
根据本发明的另一个实施方案，制备含有干扰核糖核酸的细胞微粒子的方法包括：
1)设计针对靶基因的siRNA序列；
2)化学合成成熟siRNA或构建siRNA表达载体；
3)应用细胞转染技术将siRNA转入细胞或将siRNA表达载体转入细胞。
优选，靶基因siRNA序列的设计遵守以下原则：
(1)siRNA片段满足AAN19TT，NAN19NN，NARN17YNN和NANN17YNN(N代表任何碱基，R和Y分别代表嘌呤和嘧啶)。
(2)选择无重复序列的互补DNA外显子序列以及具有均衡A、G、C、T含量(或GC含量在30％～70％)的反义链。
(3)避开序列中有成串的单一碱基，尤其是G碱基。
(4)避开3′和5′端未翻译的区域(5′-UTR，3′-UTR)，通常这些位点是mRNA结合蛋白的结合位点。
(5)避开起始密码子或者外显子与外显子的交界区域(exon-exonboundaries)。
将设计的siRNA序列在美国NCBI(National Center for BiotechnologyInfermation)的EST或Unigene数据库进行BLAST检索，以保证siRNA序列对靶基因的特异性。
设计4个以上siRNA序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效果最好的siRNA序列，进行下一步的基因功能研究。
优选，构建siRNA表达载体的方法包括：将长约70bp的含有特定茎环以及终止信号的DNA分子插入到特定载体中。
优选，转染siRNA的方法采用脂质体(Invitrogen公司Lipofectamine2000)法。
细胞微粒子的制备方法选自差速离心法、免疫吸附法和超滤法中的一种或多种。
检测细胞微粒子中siRNA装载效率的方法选自RT-PCR、Realtime-PCR、Northern blot、免疫荧光、流式细胞法中的一种或多种。
RT-PCR方法，例如包括以下步骤：
(1)提取RNA干扰后的细胞/组织总RNA，通过逆转录反应得到cDNA样品；
(2)应用靶基因特异性引物进行PCR反应；
(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
Real-time PCR方法，例如包括以下步骤：
(1)提取RNA干扰后的细胞/组织，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
(2)设计靶基因特异性引物；
(3)加入荧光探针进行PCR反应；
Northern blotting方法，例如包括以下步骤：
(1)收集血清/血浆及细胞、组织样本；
(2)通过Trizol试剂提取总RNA；
(3)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；
(4)制备同位素标记靶基因探针；
(5)进行膜杂交反应；
(6)同位素信号检测如磷屏扫描检测结果。
免疫荧光方法，例如包括以下步骤：
(1)将细胞附着在支持物上；
(2)应用细胞固定剂如多聚甲醛等，将细胞固定；
(3)应用脱脂牛奶或牛血清白蛋白对细胞进行封闭；
(4)应用荧光标记抗体标记特异性靶基因蛋白；
(5)荧光显微镜下观测细胞荧光强度。
受体细胞包括现有所有细胞系、细胞株、以及正常人或疾病患者自身组织/细胞的原代培养物。
细胞微粒子能够进入的生物体包括人类、各种动物及各种致病微生物。动物包括软骨鱼、硬骨鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类及哺乳类，致病微生物包括细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体和放线菌。特别的，所述致病微生物包括各DNA及RNA病毒，如乙肝病毒、天花病毒、艾滋病病毒、SARS病毒、流感病毒等。
本发明还提供了一种研究方法，包括：
通过转染将siRNA及其对照序列导入供体细胞内；
分离含有siRNA的细胞微粒子；
将该含有siRNA的细胞微粒子加入受体细胞；
研究该含有siRNA的细胞微粒子进入受体细胞后的影响。
根据本发明的一个实施方案，应用携带siRNA的细胞微粒子进行基因功能研究的方法包括：
(1)通过转染将siRNA及其对照序列导入供体细胞内；
(2)分离制备含有siRNA的供体细胞微粒子；
(3)将细胞微粒子加入受体细胞；
(4)研究细胞微粒子携带siRNA进入受体细胞后对受体细胞功能的影响，从而研究其靶基因对细胞功能的影响；
研究含有siRNA的细胞微粒子进入受体后对受体细胞功能的影响的方法包括共聚焦荧光显微镜法、Western bloting方法、细胞迁移方法的一种或几种。
例如，Western blot方法包括以下步骤：
(1)应用蛋白质裂解液提取细胞或组织总蛋白；
(2)进行SDS-PAGE电泳和膜转移实验；
(3)应用脱脂牛奶或牛血清白蛋白对膜进行封闭；
(4)应用HRP标记过的特异性抗体，对膜上的特异性靶基因蛋白进行标记；
(5)加HRP底物，产生发光反应；
(6)放射自显影。
本发明还提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括：将含有干扰核糖核酸的细胞微粒子转入受体。
根据本发明的一个实施方案，应用携带siRNA的细胞微粒子预防/治疗疾病的方法包括：
1)通过转染将siRNA导入供体细胞内；
2)分离制备含有siRNA的供体细胞微粒子；
3)将细胞微粒子加入受体细胞或注入病人体内。
4)细胞微粒子携带siRNA进入受体细胞或病人组织，通过干扰其靶基因表达，引起靶基因蛋白质含量的改变。
5)通过改变细胞内蛋白质影响细胞功能，从而起到预防/治疗疾病的作用。
疾病包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等病毒性疾病，例如结核、细菌性肺炎等细菌性疾病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，例如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病。
siRNA包括所有针对致病基因设计的通过RNA干扰原理特异性降解靶基因的siRNA序列；
基因包括所有能转录成有功能分子的基因片段，例如蛋白质基因、mciroRNA基因等。致病基因包括人类，各种动物，包括软骨鱼、硬骨鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类及哺乳动物等生物自身参与疾病发生发展的各种基因，以及各种致病微生物基因。
上述致病微生物包括细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体和放线菌。特别的，所述致病微生物包括各种DNA及RNA病毒，如乙肝病毒、天花病毒、艾滋病病毒、SARS病毒、流感病毒等。
本发明还提供了含有干扰核糖核酸的细胞微粒子在输送干扰核糖核酸中的用途。
实施例
可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
实施例1 血清/血浆和细胞培养液中细胞微粒子的分离及检测
本实施例分别采用差速离心法方法分离出血清/血浆和细胞培养液中细胞微粒子：
具体地，先将血清/血浆或培养细胞于300g离心5分钟，取上清；(2)将上清于1500g离心20分钟，取上清；(3)将上清于10000g离心30分钟，取上清。(4)将上清于110000g离心70分钟，取沉淀即为细胞微粒子。
将分离得到的细胞微粒子在透射电镜下观察，包括：细胞微粒子沉淀用2.5％戊二醛固定液在4℃固定过夜，PBS漂洗三遍，每遍10分钟。之后用1％的四氧化锇室温固定60分钟。固定后的样品用10％的明胶包埋，然后在4℃用戊二醛再固定后，将样品切成小块(体积小于1立方毫米)。样品用依次增高浓度的乙醇溶液脱水(30％，50％，70％，90％，95％and100％×3)。用环氧树脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片机切片，最后用FEI Tecnai T20透射电子显微镜在120kV条件下观察。
采用差速离心法分离得到细胞微粒子的透射电镜图如图1所示，显示从正常人血清/血浆中分离到的细胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范围。
实施例2 siRNA转染进入供体细胞
本实施例采用以下步骤将荧光标记的siRNA转染进入细胞，并检测转染效率。
首先针对人c-myb基因序列的不同位点设计siRNA序列：
(正义链+环+反义链)：5’-GGTGGAACAGAATGGAACATTGAAGAAG TGTTCCATTCTGTTCCACC TT-3’；
同时设计一条随机序列作为阴性对照：
(正义链+环+反义链)5’-GACTTCATAAGGCGCATGC TTGAAGAAGGCATGCGCCTTATGAAGTC TT-3’.
接下来，商业合成上述设计的siRNA，同时采用绿色荧光染料FITC标记针对c-myb基因的siRNA。
采用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)将siRNA转染进入人单核/巨噬细胞系THP-1细胞(中国科学院上海细胞库)，具体方法如下：
(1)THP-1细胞培养在添加了10％胎牛血清(Gibco，美国)的RPMI 1640培养基(Gibco，美国)中，5％CO2、37℃培养。
(2)将30μl lipofectamine 2000和600pmol的阴性对照siRNA分别与1ml OPTI-MEM(Gibco，美国)混合，形成混合物A和混合物B，室温下放置5min。
(3)将30μl lipofectamine 2000和600pmol的c-myb siRNA分别与1ml OPTI-MEM(Gibco，美国)混合，形成混合物C和混合物D，室温下放置5min。
(4)将混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。
(5)将混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。
(6)将混合物E和F分别加入对照组和实验组细胞中，补足OPTI-MEM到15ml。5％CO2、37℃培养。
(7)6小时后更换成正常培养液。
(8)24h～48h后转染结束，可以收集样品。
采用Real time-PCR方法检测c-myb基因信使RNA水平以检测干扰效率，包括：
(1)收集转染后的THP-1细胞
(2)制备cDNA样品：采用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取总RNA，总RNA逆转即得到cDNA样品。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM each dNTP mixture(Takara，日本)、0.5μl RNase Inhibitor(Takara，日本)、2μl AMV(Takara，日本)以及0.5μl OligodT(Takara，日本)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
(3)Real-time PCR反应：取1μl cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara，日本)，0.5μl 10μM正向和反向引物，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM eachdNTP mixture(Takara，日本)，1μl 20×EVA GREEN，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μlH2O，20μl体系进行PCR。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，反应条件为95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环；
(4)数据处理：数据处理方法为ΔCT法，ΔCT设为反应达到域值时的循环数，则两组样品干扰核糖核酸的比较可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT group1-CT group2。组织和细胞数据处理方法是以U6作为内标，则两组样品mRNA表达量的比较可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝[CT miRNA-CT U6]group1-[CT miRNA-CT U6]group2。
结果如图2-A所示，与转染过随机序列的阴性对照(左柱)相比，转染过c-mybsiRNA的细胞中c-myb基因的m RNA表达量显著降低，说明该实验中采用的转染方法的可靠而高效的。
同时采用流式细胞法检测siRNA进入细胞的效率，结果如图2-B所示。流式细胞法包括下述步骤：收集干扰后的THP-1细胞，将细胞浓度调整到106个/ml；应用流式细胞仪检(BD FACS，Calibur)测细胞荧光强度，检测时前向侧向电压放大模式均为lin，采用FL1-H检测荧光强度，FL-1H通道电压放大模式为log。由结果可以看出，与对照(细线)相比，转染了c-myb siRNA的实验组(粗线)的荧光强度增强，说明siRNA的转染效率高，此种方法是一种检测siRNA转染效率的直观高效的方法。
另外，还可以采用荧光显微镜方法检测siRNA进入受体细胞的效率，具体步骤包括：将转染过c-myb siRNA后的THP-1细胞置于荧光倒置显微镜(OLYMPUS)载物台，激发波长488nm检测。
结果如图2-C所示，转染过的细胞可显示绿色荧光(如图2-C中亮点所示)，说明siRNA进入细胞的效率很高。
实施例3 细胞微粒子携带siRNA进入受体细胞
本实施例通过收集转染过c-myb siRNA的THP-1细胞的细胞微粒子，检测其装载siRNA的效率，并将其加入其靶细胞，检测其进入靶细胞的效率。
选择在炎症反应中起重要作用的人单核细胞/巨噬细胞系THP-1作为研究对象，THP-1细胞培养在添加了10％胎牛血清(Gibco，美国)的RPMI1640培养基(Gibco，美国)中，5％CO2、37℃下培养。首先，应用实施例2中的siRNA转染方法，制备转染过c-myb siRNA的THP-1细胞。
接下来，应用实施例1中细胞微粒子的分离方法，分离转染过c-mybsiRNA的THP-1细胞微粒子。
再通过流式细胞法检测所分离的细胞微粒子装载siRNA的效率。
结果如图3-A所示。检测时前向侧向电压放大模式均为log，采用FL1-H检测荧光强度，FL-1通道电压放大模式为log。从结果可以看出，在THP-1分泌的细胞微粒子中，有一部分(图3-B竖线以右部分)被标记荧光标记。由于c-myb siRNA被荧光标记，因此，应用流式细胞仪检测微粒子的荧光强度，就可以反映微粒子装载siRNA的效率。
最后将携带有c-myb siRNA的THP-1细胞分泌的微粒子加入人微静脉内皮细胞HMEC-1(美国佐治亚州疾控中心)的细胞培养液中。HMCE-1HMEC-1培养在添加了10ng/mL表皮生长因子(Becton-Dickinson，美国)、10ng/mL氢化可的松(Sigma)和10％胎牛血清(Gibco，美国)的MCDB-131培养基中，5％CO2、37℃下培养。
由于在生理状况下，单核/巨噬细胞可以和血管内皮细胞相互作用，单核细胞表面的分子可以特异性地和内皮细胞表面的配体/受体结合，诱发一系列信号传导及细胞生理活动。因此，应用单核/巨噬细胞系THP-1和微静脉内皮细胞系HMEC-1就可以模拟体内这两种细胞的相互作用。
检测加入了携带siRNA的THP-1微粒子进入HMCE-1细胞的效率。由于细胞微粒子被绿色荧光标记，因此，应用荧光显微镜检测HMEC-1荧光结果，就可以反映微粒子进入HMEC-1的效率。结果如图3-C所示。
由结果可以看出，携带siRNA的细胞微粒子可以高效特异性的进入靶细胞HMEC-1(图3-C中亮点)。又由于所有细胞都能够像血细胞一样分泌细胞微粒子；并且所有细胞也可以像内皮细胞一样接受与其特异性作用的细胞分泌的细胞微粒子。因此，THP-1细胞微粒子进入HMEC-1细胞的作用方式也可模拟生物体上所有细胞微粒子进入其靶细胞的作用方式。
通过以上的实验结果不难发现，细胞微粒子是理想的稳定、高效、特异运载siRNA的载体，可以通过细胞微粒子将siRNA传递给其受体细胞。提示可以通过微粒子，将作为药物的siRNA高亲和性、特异性的递送到靶细胞中，通过影响参与疾病发病的靶细胞的功能，达到药物预防/治疗的目的。
实施例4 应用携带siRNA的细胞微粒子研究基因功能
本实施列应用细胞微粒子将针对靶基因的siRNA高效、特异性地转入受体细胞中，通过特异性降低受体细胞中靶基因的表达，模拟病理状况或起到基因敲除的作用，以研究靶基因在细胞中的生理功能。
本实施例选择了c-myb基因作为研究对象，c-myb基因编码一个细胞转录因子，在细胞的分化、增殖、迁移及血细胞的存活中发挥重要作用。c-myb已被证明是一个重要的原癌基因，与多种癌症的发生发展有密切关系。
为了研究c-myb基因在内皮细胞中的功能，设计了如下实验：
1)应用实施例2中的siRNA转染方法，制备转染过c-myb siRNA的THP-1细胞。
2)应用实施例1中细胞微粒子的分离方法，分离转染过c-myb siRNA的THP-1细胞微粒子
3)将携带有c-myb siRNA的细胞微粒子加入到HMEC-1细胞的培养液中，6小时后收集细胞，按照以下步骤进行Western Blot实验。具体步骤包括：
(1)应用蛋白质裂解液提取细胞总蛋白；
(2)在90V恒压条件下进行SDS-PAGE电泳；
(3)在160mA恒流条件下进行膜转移实验；
(4)应用5％脱脂牛奶对膜进行封闭；
(5)分别应用抗c-myb的单克隆抗体(Santa Cluz公司)和抗GAPDH(Santa Cluz公司)的单克隆抗体分别对c-myb和GAPDH进行标记。
(6)加对应的HRP标记二抗；
(7)加HRP底物，产生发光反应；
(8)放射自显影。
由于siRNA通过与其靶基因mRNA结合，招募细胞内的沉默复合物将其靶基因mRNA被降解，从而导致其靶基因蛋白表达水平的下降。因此，通过检测特异性蛋白表达水平的Western blot技术就可以检测siRNA进入受体细胞的效率。
结果如图4-A所示。由结果可见，GAPDH作为内参，证明Western blot过程中加入的总蛋白量在所有条带中都是一样的。同时，与转染阴性对照的细胞(条带2)相比，转染过c-myb siRNA的细胞(条带3)中c-myb蛋白的表达有明显下降。由此，本发明人证明：细胞微粒子携带的c-mybsiRNA进入了HMEC-1细胞，并且对HMEC-1细胞中c-myb蛋白的表达起到了干扰作用。进一步证明了，细胞微粒子可以将siRNA高效、特异性的进入靶细胞，以此作为一种实验手段，研究基因在特定细胞中的功能。
同时本实施例还检测了微粒子携带的siRNA对其靶细胞HMEC-1细胞迁移能力的影响。
c-myb基因作为一个重要的转录因子，对细胞的生长、迁移和分化有重要影响。虽然研究已经证明c-myb对多种细胞的迁移有明显调控作用，然而，其对于内皮细胞迁移是否发挥作用仍然有待研究。
因此本实施例通过应用细胞微粒子所载siRNA作为一种实验方法，特异性地降低内皮细胞系HMEC-1细胞中的c-myb蛋白表达，以检测在这种情况下细胞的迁移功能，以此研究c-myb基因对内皮细胞的迁移功能是否有作用。
具体实验步骤包括：
(1)应用实施例2中的siRNA转染方法，制备转染过c-myb siRNA的THP-1细胞。
(2)应用实施例1中细胞微粒子的分离方法，分离转染过c-mybsiRNA的THP-1细胞的细胞微粒子
(3)携带有c-myb siRNA的THP-1细胞微粒子孵育HMEC-1细胞2小时。
(4)检测HMEC-1细胞迁移情况。
细胞迁移实验检测方法包括：将Transwell Boyden Chamber(6.5mm，Costar，Cambridge，MA，美国)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8-μm孔径)用0.1％的明胶覆盖；HMEC-1细胞用不含血清的培养基悬起，浓度控制在(1-10)×105cells/mL；细胞用或者不用来源于THP-1细胞的包含siRNA的细胞微粒子孵育2小时，然后将HMCE-1细胞加入上面的小室，同时在下面的小室加入0.5mL的含有10％胎牛血清的培养基；5％CO2的细胞培养箱孵育4h；迁移到下层的细胞用90％乙醇在室温下固定15分钟；洗涤；用0.1％的结晶紫室温染色15分钟；将留在滤膜上的细胞小心地刮下；拍照(Olympus，BX51，Japan)；细胞计数。
迁移后的细胞显微图片如图4-B\C\D所示。由结果可见，与阴性对照(图4-B)相比，被携带c-myb siRNA的细胞微粒子处理过的HMCE-1细胞(图4-C)的迁移能力明显增强。细胞计数5个随机视野中的细胞数，结果如图4-D所示，与对照相比，被携带c-myb siRNA的细胞微粒子处理过的HMCE-1细胞迁移过的细胞数显著能加。
由此可见，降低了表达量的c-myb基因能够显著增强HMEC-1细胞的迁移能力，因此，相反的可以说明，c-myb基因对内皮细胞的迁移有抑制作用。
因此，本实施例证明，可以将制备载有siRNA的细胞微粒子及相关方法作为一种医学生物学的研究手段，通过特异性降低细胞内某种基因的表达来研究该基因的功能。
实施例5 应用载有siRNA的细胞微粒子进行疾病的预防/治疗
本实施例应用载有针对艾滋病病毒(HIV)基因的siRNA的细胞微粒子抑制HIV在其宿主细胞中生存及繁殖。
具体包括以下步骤：
1)针对HIV基因组序列设计siRNA序列；
2)将siRNA序列插入到载体中；
3)将携带有HIV siRNA的载体转染进入供体细胞293T细胞中；
4)收集供体细胞分泌的细胞微粒子；
5)将供体细胞分泌的载有HIV siRNA的细胞微粒子加入HIV宿主细胞；
6)检测宿主细胞中病毒含量。
结果如图5所示，纵坐标显示了HIV病毒在宿主细胞中的含量。如果将完全不加病毒的空白细胞作为对照(横轴1代表的柱子)，将其值设为1；那么单加入病毒而不采取任何治疗措施的细胞(横轴2代表的柱子)中的病毒含量将会是对照细胞的16倍多。然而，如果采用载有病毒siRNA的细胞微粒子作为治疗手段，宿主细胞内的病毒含量就会大量减少。从结果可见，加入细胞微粒子所载的siRNA(横轴5、6代表的柱子)后，宿主细胞内的病毒以降低到40％左右(横轴6代表的柱子)。更重要的是，如果增加微粒子所载siRNA的用量(横轴5代表的柱子)，宿主细胞内的HIV病毒甚至可以被完全抑制，HIV病毒的含量可以下降到和不加病毒组(横轴1代表的柱子)相同的水平。
另外，为了排除载有siRNA的细胞微粒子对HIV的抑制作用是由于载体本身，而不是siRNA造成的，我们还向HIV病毒感染的宿主细胞中转入了不含siRNA的空白载体作为另一个对照(横轴3代表的柱子)。从结果可以看出，仅空载体无法对HIV病毒产生抑制作用，也证明了产生病毒抑制作用不是载体而是siRNA本身。
同时，我们还加入了一种短肽类的抗艾滋病药物作为阳性对照(横轴4代表的柱子)。由结果可以看出，这种药物也只能将HIV含量降低到50％左右。因此，可以看出载有HIV siRNA的细胞微粒与常规治疗艾滋病的药物相比，其作用效率更高，抑制病毒的效果更好。也进一步说明应用载有siRNA的细胞微粒子治疗疾病具有巨大的发展潜力。
实施例6 细胞微粒子及其载有的siRNA组成的药物组合物的检定
本实施例通过一系列方法检定细胞微粒子及其载有的siRNA组成的药物组合物的存在。
1)通过实施例2所述方法将荧光标记的siRNA转染入供体细胞。结果如图2-C所示，在荧光显微镜下观察可见荧光标记的siRNA已经转染进入细胞。
2)通过实施例1所述方法分离鉴定转染过荧光标记的siRNA的供体细胞分泌的细胞微粒子。结果如图1所示，可见分离得到的细胞微粒子从形态、大小、膜结构等方面均符合细胞微粒子的特定。
3)根据实施例3的方法，通过流式细胞仪检测分离纯化并鉴定为细胞微粒子的颗粒中是否包裹有siRNA，即是否组成了细胞微粒子和siRNA复合物，结果如图3-B所示。由于siRNA是被荧光标记的，如果细胞微粒子中含有siRNA，那么，细胞微粒子也一定能被荧光标记。因此，我们采用流式细胞术检测细胞微粒子所带的荧光状况。由图3-B可见，有大量细胞微粒子携带有荧光(图3-B竖线以右部分)，证明细胞微粒子中包裹有siRNA，也即证明了细胞微粒子-siRNA药物复合物的存在。
本发明提供了包括：(1)载有干扰核糖核酸的细胞微粒子。(2)应用细胞微粒子所载siRNA进行各种临床疾病(包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，例如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌代谢系统疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病)治疗的研究；(3)应用细胞微粒子高效、特异性递送干扰核糖核，作为实验手段，研究特定基因功能。
通过上述一系列的研究，很清楚本发明提供了一种制备载有干扰核糖核酸的细胞微粒子的方法，该方法具有较高靶向性、稳定性及高效性。
根据上述方法，本发明人证明siRNA可以通过细胞微粒子稳定、高效、特异性的进入靶细胞，通过作用于其靶基因，对靶细胞的功能产生一定影响。由此，载有siRNA的细胞微粒子不仅可以作为一种生物医学研究手段，在基因功能研究中发挥作用；同时还能作为药物，高效特异性地进入生物体，起到改变基因表达，影响细胞功能，从而治疗预防/疾病的作用。

Claims (7)

1.一种含c-myb siRNA的THP-1细胞微粒子，所述含c-myb siRNA的THP-1细胞微粒子来自转染过c-myb siRNA脂质体的THP-1细胞，且作用于受体细胞HMEC-1；其中所述c-myb siRNA的序列为：
正义链+环+反义链：5’-GGTGGAACAGAATGGAACA TTGAAGAAGTGTTCCATTCTGTTCCACC TT-3’。
2.根据权利要求1的细胞微粒子，其中细胞微粒子的平均粒径为10-500纳米。
3.一种试剂盒，包括根据权利要求1-2中任一项所述的细胞微粒子。
4.一种药物组合物，包括权利要求1-2中任一项所述的细胞微粒子。
5.制备权利要求1-2中任一项所述的细胞微粒子的方法，包括下列步骤：
针对人c-myb基因序列的不同位点设计siRNA序列，得到c-myb siRNA；
应用脂质体将c-myb siRNA转入THP-1细胞；
分离含有所述c-myb siRNA的THP-1细胞微粒子。
6.权利要求5的方法，其中通过选自差速离心法、免疫吸附法和超滤法中的一种或多种分离细胞微粒子。
7.一种研究方法，包括：
将权利要求1-2中任一项的细胞微粒子引入受体细胞HMEC-1；
研究该细胞微粒子进入受体后对受体功能的影响。
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