CN113789388B - 一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用,涉及癌症诊断技术领域。本发明提出了一种新的具有食管癌特异性的DNA甲基化分子标志物,通过检测OTOP2基因的甲基化水平,可以对食管癌进行特异性诊断。对于提高食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及癌症诊断技术领域,具体而言,涉及一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用。
背景技术
食管癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤,每年导致超过 40万人死亡。食管癌分为两种主要的组织病理学亚型:食管鳞状细胞癌(鳞癌)和食管腺癌,二者具有不同的起源细胞、流行病学和肿瘤分子生物学。食管鳞状细胞癌主要来源于食道的鳞状上皮细胞,食管腺癌起源于胃食管交界处的腺细胞,并与食管下段胃酸反流有关。二者的流行病学特征也不同,全球约有 79% 的食管鳞状细胞癌病例发生在东南亚和中亚,也存在于非洲东南部和南美洲,食管腺癌主要流行与欧洲、北美和大洋洲。食管鳞状上皮内瘤变与食管鳞癌的发生密切相关,属于鳞癌的癌前病变,Barrett食管相关异性增生则是腺癌的癌前病变。
目前,超过90%的食管癌患者确诊时已发展至中晚期,总体5年生存率不到20%,而仅累及粘膜层和粘膜下浅层的早期食管癌通常可经内镜下微创治疗根治,患者的5年生存率可>95%。因此,癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率、提高生存率的主要策略。
内镜和活检病理检查是目前诊断早期食管癌的金标准,但内镜检查需要做镜前准备,且操作复杂,需要专业的技术人员,有侵入性,可能会使用到麻醉剂,因此不适合大规模人群筛查,食管癌检测亟需无创检测方法。
人体血液中存在循环游离 DNA (cfDNA),血液中cfDNA来源于凋亡、坏死的细胞或外泌体分泌等,研究发现,癌症患者血液样本中的cfDNA 含量高于健康个体的血液样本,肿瘤来源的cfDNA,称为循环肿瘤 DNA(ctDNA),ctDNA中含有肿瘤特异性的遗传改变和表观遗传学改变,可以用作癌症检测的标志物。其中,DNA甲基化水平异常是癌症发生的早期事件,可以用于早期食管癌检测。由于cfDNA在血液中具有含量少、提取困难、存在周期短等缺点,且血液中的cfDNA 来源于全身各个组织,很多标记物在多种类型的癌症中均会出现甲基化异常,因此寻求肿瘤特异性的甲基化标记物充满挑战,目前尚缺乏可用于食管癌检测的血液甲基化标志物。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用以解决上述技术问题。
DNA甲基化是基因上重要的一种化学修饰,影响着基因转录的调控过程和细胞核结构。DNA甲基化的改变是癌症发展的早期事件和伴随事件,主要体现在肿瘤组织上抑癌基因的高甲基化和原癌基因的低甲基化等。而且DNA甲基化较稳定,如果可以发现肿瘤特异的血液DNA甲基化分子标志物则有巨大的临床应用价值。
基于此,本发明特提出了一种新的具有食管癌特异性的DNA甲基化分子标志物,通过检测OTOP2基因的甲基化水平,可以对食管癌进行特异性诊断。对于提高食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种用于检测OTOP2基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用,产品的用途为如下中的至少一种:
诊断或辅助诊断食管癌或癌前病变;
区分食管癌样本和非癌样本。
OTOP2基因编码Otopetrin-2蛋白,目前关于OTOP2基因CpG岛甲基化与食管癌的关系尚未被现有技术报道。仅有研究表明Otopetrin-2蛋白在结直肠癌组织中的表达下调。
发明人研究发现:OTOP2基因CpG岛区域的甲基化水平在食管癌样本/食管癌前病变中的甲基化水平显著高于正常样本,用OTOP2基因CpG岛区域的甲基化作为检测标记物,能在待测样本中有效区分癌症/癌前病变样本和正常样本,对癌症的检测灵敏性超过50%,对癌前病变的检测灵敏性超过30%,特异性高于95%。而且用OTOP2基因CpG岛区域的甲基化作为检测标记物能够有效的区分食管癌样本和癌旁样本(非癌样本)。本发明为食管癌的无创检测提供了新思路。
食管癌包括但不限于食管鳞癌和食管腺癌,癌前病变包括不限于食管鳞状上皮内瘤变、Barrett食管相关异性增生、慢性食管炎、食管上皮增生、食管息肉、食管溃疡、食管白斑。
在本发明应用较佳的实施方式中,OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中Chr17:74922901-74924924 CpG岛区域中的全长区域或部分区域的甲基化水平。
在一种可选的实施方式中,OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域中的全长区域或部分区域的甲基化水平:区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6。
部分区域为区域1-6中至少一个CpG二核苷酸位点中胞嘧啶的甲基化水平。
其中,区域1选自Chr17:74923881-74924015正链,区域2选自Chr17:74924159-74924335正链,区域3选自Chr17:74924422-74924581正链,区域4选自Chr17:74924603-74924449负链,区域5选自Chr17:74924425-74924297负链,区域6选自Chr17:74924080-74923981负链。
OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域中的全长区域或部分区域的甲基化水平:区域2和区域4。发明人发现区域2和区域4对于样本的检测灵敏度和特异性要优于其他区域对于样本的检测灵敏度和特异性。
本发明种,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态,“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断,不作为唯一确定指标。
本发明所指甲基化水平的高低既可以指定性的概念,也可以是指定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。可选的一种实施方式中,可根据样本检测的Ct值进行比较,在一些情况下,可计算出样本中标记物的甲基化比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较。在一种实施方式中,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述物质为用于检测OTOP2基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合。
OTOP2基因的CpG岛包括Chr17:74922901-74924924区域,具体序列(5’-3’):
CGTACTCACCCGCGGCTCACAATGAGACGCAGCGACTCGAGGTTGCCATGGTAGGCAGCCCAGAGAGTGGGGGTCATGCCATCCTCGTCGGGGGCATTCAGCTCCTTTCGGGTGGCCTCCTTGAGGAGCTCCAGGTAGCCATCCCGGGCTGCCCGGTGGTACTGGTCGTTCATGGCGCCCGAAGTGGACGGGGCGGGCGGGGGACACGGAGAAAGGCCCCCCGCAGGGGAGGGCGGCGGTATTAGGGCTGAGGCATGAGGTTGGAGGACGGGGCCGGGCAGGGGCCGGGGCCGCCAGCCCCCGCTGCCGCAGACGGAGGGTGCGGAGCGCCAGAGCCGCGACTACCAAGACATCTGAAACGCTCACCCGGGGGCGGGGGCGGAGGGGGCGGGGGACGAAATCTCCCGCTGTCCAGGGAGCCGCCCCCGGTCTTCCCCTGGGTCCTAAACACCCTGCATGCACCTCAATACACGAGGGTGACCCACGCAAGGCCCTGTCCTCCTCTTCAAAAGTGCCCACCCCGGGGCCGCGCACTGTGACGCCCAGTCCGGGGACAGTCAGAGATCTGTCCTCACTAGAGCCTGGGGCGCTGTGGCTCCGTATTTCTCCACCTGTCAGTGGAACGAACCGAGAGCTGGGGAGGGGTGCCGGAGGGCGGGGTGGGGGAGCCGTCCTGAGCCCCAGGACAGTGGACCTAAGAAGGGGCACCGTGACCGACCGCGGTTCGGTCAGCGAGTGGGACGGGCCAGGCCGCCGCCGCCTGAACGGAGTCCCTCGACCGCACTCCAGCAGGGGGCGCTGGAGGACTGGCAGCGGCTCCGCGTGCCGCGTGGAACTTCGCACCCAAGCCCCGGAGTCCAACGGAGCGCGGGCCGGCGGCGGGGGCGGGCAGGGCGGTGGGATAGAGGAAAGGGGAGCTTGGATCACTGCGAGGACCGTGGGGGAGAGGGGAACTGGGGTTGCCATCCCAGGCAGGAGCACAGGAGCACAGGATTCAGGGTGCGCCGCGGCTGGAGGGCGTCAGGGTGCCCGCAGGCTTTTTGGACGTCTCTTGAGCTTAGCTCTCGGGGCTCTGGGCGCCTGGAATGCTGCGCGCCAGGGCGCGGTGGGCACCAGGGGCGGGGTGCCCTCTAGGTGCCGCAGTGCGGGGCCGCGCCCGAGCCTGGCCGCACCGGGGTGACGGAGTGGGGTCGCCTCTCAAAGGGTAAATATGAATCTTGCCTTATCTGGCTCCAGCGGGCTCTTCCCTAAATTCACCTTGGAGAAAGATGGATCATGTGAGCGGGACTGAGAGCTTTATGGAGCCAAACTCCCGCAGCTGTAAATCACCCTGTCCTCCTGGGTATAAAGCGCCTGTCCATCTCGGCGTGGGAGAGAGGAGACGCTCGCCGTCCCCTGACCCCCAGCTCAGCGCCGGCTCCAAGCCCAGCCAGGTGGGTGCCCCGGGCCGGAGGGCAGTCGGACTTGGGGAGTGGGGACCTTGGAGGGGTCCAACCGGGTGCTGCCGCTTCTCCTTTCTTCCCATCCAGCGAGAGGGGCAGGTTCCGCATTTTCTCTTCCCCTTTCCCAGCGCTTCCTCCAGCACCCGAAGCCCCAACCCTGCGGGTCAGGAACTCCCTAGTCCCCAAGTCTAGGGATGAGATGGGGGAAGGAGAGCCGTCAGGGTTGACCTGGAGTTTTGTCCGCTCCTCCCCTACAGTGATCCCTCTAGCCTTCTCCAGTCGCCTCCGCCATGTCCGAGGAGCTGGCCCAGGGCCCCAAGGAGAGCCCCCCGGCGCCGCGTGCGGGCCCCAGGGAGGTGTGGAAGAAGGGTGGCCGCCTGCTGTCGGTGCTGCTGGCGGTGAACGTGCTGCTCCTCGCCTGCACGCTCATCAGCGGCGGAGCCTTCAACAAGGTGGCCGTGTACGACACCGACGTGTTCGCGCTGCTCACTGCGATGATGCTGCTGGCAACGCTCTGGATCCTCTTCTACCTCCTCCGAACCGTGCGCTGCCCCTGCGCGGTACCCTACCGGGACGCGCACG。
需要说明的是,上述CpG岛区域还包括与上述序列反向互补的序列。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种:用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域3的核酸组合3、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域5的核酸组合5和用于检测区域6的核酸组合6;
核酸组合1的碱基序列与SEQ ID NO.1-3所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合2的碱基序列与SEQ ID NO.4-6所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合3的碱基序列与SEQ ID NO.7-9所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合4的碱基序列与SEQ ID NO.10-12所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合5的碱基序列与SEQID NO.13-15所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合6的碱基序列与SEQ IDNO.16-18所示的碱基序列具有至少90%的一致性。
例如核酸组合1的碱基序列与SEQ ID NO.1-3所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合2的碱基序列与SEQ ID NO.4-6所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合3的碱基序列与SEQ ID NO.7-9所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合4的碱基序列与SEQ IDNO.10-12所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合5的碱基序列与SEQ ID NO.13-15所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性,核酸组合6的碱基序列与SEQ ID NO.16-18所示的碱基序列具有90%、92%、95%、98%、99%或100%的一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述产品选自如下产品中的至少一种:试剂、试剂盒、芯片和测序文库。
需要说明的是,上述产品可以是任意一种的体外诊断产品形式,并不限于上述的试剂、试剂盒、芯片和测序文库的产品类型,只要能满足食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的需求均在本发明的保护范围内。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述OTOP2基因甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测:甲基化特异性PCR法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap endonuclease 法(参见专利文献US8715937、US8361720)。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述测序法选自甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法或焦磷酸测序法。
本发明还提供了一种试剂,其包括如下至少一种的核酸组合:核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4、核酸组合5和核酸组合6;
核酸组合1的碱基序列与SEQ ID NO.1-3所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合2的碱基序列与SEQ ID NO.4-6所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合3的碱基序列与SEQ ID NO.7-9所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合4的碱基序列与SEQ ID NO.10-12所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合5的碱基序列与SEQID NO.13-15所示的碱基序列具有至少90%的一致性,核酸组合6的碱基序列与SEQ IDNO.16-18所示的碱基序列具有至少90%的一致性。区域所在位置参考的人类基因组的版本号为GRCh38.p13。
在其他实施方式中,上述试剂还包括能差异化修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂(如亚硫酸氢盐等物质)、采用甲基化特异性PCR技术或数字PCR常用的其他常规试剂(包括不限于PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、水)和进行飞行时间质谱所用的其他常规试剂。
上述的试剂可以是粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、液剂、乳剂或悬浮剂。可选的,真空冷冻干燥制备的菌粉或者喷雾干燥制备的粉剂。在使用时,将核酸组合溶解于超纯水或缓冲液中。
本发明还提供了一种试剂盒,其包括上述的试剂。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述试剂盒的检测样本包括不限于组织样本、血液样本、唾液样本或食管来源的细胞样本;
血液样本选自血浆样本、血清样本、全血样本或血细胞样本。
本发明具有以下有益效果:
本发明提出了一种新的具有食管癌特异性的DNA甲基化分子标志物,通过检测OTOP2基因的甲基化水平的增加,可以对食管癌进行特异性诊断或辅助诊断,具有较高的灵敏度和特异性。对于提高食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。本发明为食管癌的无创检测提供了新思路。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合1。
核酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸。该核酸组合1可检测OTOP2基因上Chr17: 74923881-74924015区域正链(目的区域1)的甲基化水平。
区域1甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
TAGGAGTATAGGATTTAGGGTGCGT (SEQ ID NO.1);
区域1甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
TAATACCCACCGCGCCCTAAC (SEQ ID NO.2);
区域1甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
TTGGAGGGCGTTAGGGTGTTCGT (SEQ ID NO.3)。
实施例2
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合2。
核酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸。该核酸组合2可检测OTOP2基因上Chr17: 74924159-74924335区域正链(目的区域2)的甲基化水平。
区域2甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
TTGGAGAAAGATGGATTATGTGAGC (SEQ ID NO.4);
区域2甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
ACCTAACTAAACTTAAAACCGACGC (SEQ ID NO.5);
区域2甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
AAAGCGTTTGTTTATTTCGGCGTGG (SEQ ID NO.6)。
实施例3
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合3。
核酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸。该核酸组合3可检测OTOP2基因上Chr17: 74924422-74924581区域正链(目的区域3)的甲基化水平。
区域3甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
TTATTTAGCGAGAGGGGTAGGTTTC (SEQ ID NO.7);
区域3甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
CAAAACTCCAAATCAACCCTAACGA (SEQ ID NO.8);
区域3甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
CGAAGTTTTAATTTTGCGGGTTAGG (SEQ ID NO.9)。
实施例4
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合4。
核酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸。该核酸组合4可检测OTOP2基因上Chr17: 74924603-74924449区域负链(目的区域4)的甲基化水平。
区域4甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
ATTATTGTAGGGGAGGAGCG (SEQ ID NO.10);
区域4甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
ATTTTCTCTTCCCCTTTCCCAACG (SEQ ID NO.11);
区域4甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
TGGGGATTAGGGAGTTTTTGATTCG (SEQ ID NO.12)。
实施例5
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合5。
核酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸。该核酸组合5可检测OTOP2基因上Chr17: 74924425-74924297区域负链(目的区域5)的甲基化水平。
区域5甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
ATGGGAAGAAAGGAGAAGCG (SEQ ID NO.13);
区域5甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
TAACCCCCAACTCAACGCC (SEQ ID NO.14);
区域5甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
TAAGTTCGATTGTTTTTCGGTTCGG (SEQ ID NO.15)。
实施例6
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂,其包括核酸组合6。
核酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸。该核酸组合6可检测OTOP2基因上Chr17: 74924080-74923981区域负链(目的区域6)的甲基化水平。
区域6甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’):
TTATTTCGGTGCGGTTAGGTTC (SEQ ID NO.16);
区域6甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’):
CTAAAATACTACGCGCCAAAACG (SEQ ID NO.17);
区域6甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’):
TTTCGTATTGCGGTATTTAGAGGGT (SEQ ID NO.18)。
实施例7
本实施例采用甲基化特异性PCR的方法,检测OTOP2基因的CpG岛的6段甲基化区域在食管癌样本、食管高级别瘤变样本和正常样本中的甲基化状态,计算灵敏度和特异性。具体步骤包括:
(1)样本DNA 提取
福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本:采用 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 提取组织DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
血浆样本:采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作参见试剂盒说明书。
(2)亚硫酸氢盐转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold Kit,具体实验操作参见试剂盒说明书。在本过程中,未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U),甲基化的胞嘧啶不变,尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对,胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对,以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。
(3)甲基化特异性PCR
对CpG岛内的6个区域进行甲基化检测,各个区域的检测试剂包括一对甲基化序列特异性检测引物和一条特异性taqman探针。6个区域在染色体上的位置及PCR引物、探针序列如表1所示。
表1.OTOP2基因 CpG 岛内6个区域的甲基化引物探针序列表。
将步骤(2)亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化特异性PCR反应以检测OTOP2基因区域1-6的甲基化状态,每个区域单独进行检测,即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针,同时加入内参基因的检测探针。
ACTB作为内参基因,其中ACTB上游引物为:AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG (SEQ IDNO.19);ACTB下游引物为:AATAACACCCCCACCCTGC (SEQ ID NO.20);ACTB探针为:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG (SEQ ID NO.21)。
采用Platinum II Taq 热启动DNA聚合酶(货号14966001)进行PCR扩增,PCR反应液配置体系如表2所示。
表2 PCR反应体系表。
如表3所示,在检测OTOP2 区域1-区域6任一区域在样本中的甲基化状态时,只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。每个样本设置三个复孔。
PCR反应条件如下表3所示。
表3 PCR反应条件表。
(4)质量控制:
在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。
阴性对照为纯化水。
阳性对照的制备方法为:将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即扩增区域中除CG二核苷酸中的C保持不变外,其余位置的C均转换成T,其他三种碱基T、G和A保持不变)进行人工合成,并克隆至载体pUC57上,形成人工合成质粒。将完全甲基化的区域1-6对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即分别将各区域中除CG二核苷酸中的C保持不变外,其余位置的C均转换成T,其他三种碱基T、G和A保持不变)进行人工合成,并克隆至pUC57上,形成人工合成质粒。区域1-6的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1-6的人工合成质粒按体积1:1混合而成,如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1:1混合而成。
阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
(5)PCR数据分析
Ct值读取:PCR 完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,PCR软件会自动给出每个样本的Ct值,读取每个样本待检测目的区域的Ct值和内参基因ACTB的Ct值。
结果分析和判读方法:若一孔中待检区域的Ct值≤40时,则认为该区域在该孔中被检出甲基化,当三个复孔中至少有两孔被检出甲基化时,则判定该区域在该样本中为甲基化阳性,否则为甲基化阴性。计算区域1-6在食管癌前病变样本、食管癌样本中的灵敏性,计算各区域在癌旁样本或正常样本中的特异性。
灵敏性=甲基化阳性个数/(食管癌前病变or食管癌样本总数)
特异性=甲基化阴性个数/(癌旁样本or正常样本总数)
实验例1
于郑州市某医院收集24例食管癌及其癌旁组织样本,所有样本均为福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本,采用实施例2提供的方法依次进行组织样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化和甲基化特异性PCR,然后分别检测区域1-6在24例食管癌组织样本和24例癌旁样本中的甲基化状态,计算灵敏度和特异性,结果如表4所示。
表4 区域1-6在食管癌组织样本和癌旁样本中的检测结果。
如表4所示,区域1-6对食管癌组织样本的检测灵敏度均在80%以上,特异性均大于95%。表明这6个区域均能有效地区分食管癌样本和癌旁样本。其中,区域2和区域4的检测性能最优,二者的灵敏度均在90%以上。
实验例2
于郑州市某医院收集67例食管癌血浆样本、45例食管高级别瘤变血浆样本和54例健康人血浆样本。采用实施例1提供的方法依次进行血浆样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化和甲基化特异性PCR,分别检测区域1-6在食管癌样本、食管高级别瘤变样本和健康样本的甲基化状态,计算灵敏度和特异性,结果如表5所示。
表5 区域1-6在血浆样本中的检测结果。
如表5所示,区域1-6在健康血浆样本中均为甲基化阴性,检测特异性均为100%,在食管癌血浆样本中的检测灵敏性在55%以上,对食管高级别瘤变血浆样本的检测灵敏性在30%以上,其中区域2和区域4的检测灵敏性最优,二者对食管癌样本的检测灵敏性均大于65%,对食管高级别瘤变样本的检测灵敏性均大于40%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州艾米森生物科技有限公司
<120> 一种食管癌基因甲基化水平检测试剂及其应用
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
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<400> 21
ggagtggttt ttgggtttg 19
Claims (7)
1.一种试剂,其特征在于,其包括如下至少一种的核酸组合:核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4、核酸组合5和核酸组合6;
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示,所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示,所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示,所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10-12所示,所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示,所述核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示;区域所在位置参考的人类基因组版本号为GRCh38.p13。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括如下至少一种的核酸组合:核酸组合2和核酸组合4。
3.一种试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1或2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的检测样本为组织样本、血液样本或食管来源的细胞样本;
所述血液样本选自血浆样本、血清样本或全血样本。
5.用于检测OTOP2基因CpG岛甲基化水平的核酸组合在制备产品中的应用,其特征在于,所述产品的用途为如下中的至少一种:
诊断或辅助诊断食管癌或癌前病变;
区分食管癌样本和非癌样本;所述产品选自如下产品中的至少一种:试剂、试剂盒、芯片和测序文库;
所述OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域的甲基化水平:区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6;
其中,所述区域1选自Chr17:74923881-74924015正链,所述区域2选自Chr17:74924159-74924335正链,所述区域3选自Chr17:74924422-74924581正链,所述区域4选自Chr17:74924603-74924449负链,所述区域5选自Chr17:74924425-74924297负链,所述区域6选自Chr17:74924080-74923981负链;区域所在位置参考的人类基因组的版本号为GRCh38.p13。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述OTOP2基因甲基化水平为OTOP2基因中如下至少一种CpG岛区域的甲基化水平:区域2和区域4。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种:用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4、用于检测所述区域5的核酸组合5和用于检测所述区域6的核酸组合6;
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示,所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示,所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示,所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10-12所示,所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示,所述核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示。
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