RU2709651C1 - Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк - Google Patents

Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк Download PDF

Info

Publication number
RU2709651C1
RU2709651C1 RU2018142345A RU2018142345A RU2709651C1 RU 2709651 C1 RU2709651 C1 RU 2709651C1 RU 2018142345 A RU2018142345 A RU 2018142345A RU 2018142345 A RU2018142345 A RU 2018142345A RU 2709651 C1 RU2709651 C1 RU 2709651C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hsa
mir
micro
rna
msi1
Prior art date
Application number
RU2018142345A
Other languages
English (en)
Inventor
Олег Иванович Кит
Наталья Николаевна Тимошкина
Антон Андреевич Пушкин
Денис Сергеевич Кутилин
Эдуард Евгеньевич Росторгуев
Наталья Сергеевна Кузнецова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2018142345A priority Critical patent/RU2709651C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2709651C1 publication Critical patent/RU2709651C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК, включающий выделение тотальной РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны, обратную транскрипцию, с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO, и микро-РНК hsa-miR-92-1-5р, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех высокоспецифичных референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микро-РНК: hsa-miR-126-5р, hsa-miR-7-5p, сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными и при значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSI1<0,5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности. Изобретение позволяет эффективно дифференцировать глиомы в медицине. 2 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно, к молекулярной биологии, онкологии, и может найти применение для оперативного определения степени злокачественности глиальной опухоли головного мозга.
Глиомы - инвазивные опухоли мозга, характеризующиеся высокими уровнями рецидивирования и смертности. Морфологически глиомы подразделяют на астроцитомы, олигодендроглиомы и смешанные олиго-астроцитомы. Приблизительно 70% всех глиом относятся к злокачественным; на этом фоне лишь 20% пациентов с данным заболеванием преодолевают 5-летний рубеж выживаемости (Wen P.Y., Kesari S. Malignant gliomas in adults. N. Engl. J. Med. 2008; 359: 492-507). Согласно классификации ВОЗ, по степени злокачественности (I-IV) глиомы дифференцируют на следующие группы: I (пилоцитарные астроцитомы), II (глиомы низкой степени злокачественности), III (глиомы высокой степени степени злокачественности), IV (глиобластомы).
Классификация глиом базируется на данных цитологического и гистологического исследования биоптата опухоли, полученного после хирургического удаления или стереотаксической биопсии. В целом диагностика достаточно трудоемкая, требующая высокого профессионализма врача-патогистолога и занимает продолжительное время (6-7 суток). Во многих случаях в силу труднодоступной локализации и разнородности структуры глиом затруднительно точно установить степень злокачественности опухоли. В последние десятилетия достижения молекулярной генетики широко внедряются в онкологическую практику, в том числе для диагностических и прогностических целей. Вводимая в широкую клиническую практику молекулярная классификация глиом, также как разрабатываемые панели биомаркеров повышают прогностическую и предиктивную способность традиционной гистопатологической шкалы. Учитывая быстро меняющийся ландшафт омиксных технологий, следует ожидать транслирование полногеномных данных в улучшенные виды терапии и прогностических средств для пациентов со злокачественными опухолями мозга (см. Кит ОИ., Водолажский Д.И., Расторгуев Э.Е., Франциянц Е.М., Поркшеян Д.Х., Панина С.Б. Мультиформная глиобластома: патогенез и молекулярные маркеры // Вопросы онкологии. 2017. Т. 63. №5. С. 694-701).
Одним из значимых сигнальных путей в развитии глиобластом является путь EGFR - рецептора эпидермального фактора роста из семейства рецепторных тирозинкиназ. Аберрантная экспрессия гена EGFR приводит к конститутивной активации одноименного каскада, что, в последствии, инициирует процессы злокачественнной трансформации в большинстве опухолей (Afif S.H., Pandith А.А., Bhat A.R. et al. EGFR and PTEN gene mutation status in glioblastoma patients and their prognostic impact on patient's survival // J. Carcinog. Mutagen. - 2015. - Vol. 6. - P. 218.). Это позволяет использовать показатель изменения экспрессии гена EGFR как молекулярный маркер степени злокачественности опухоли. MSI1 - это маркер нейрональных стволовых клеток, регулирующий баланс между самообновлением и терминальной дифференцировкой клеток. Изменение экспрессии этого гена ассоциируется с развитием опухолей головного мозга (Glazer RI, Vo DT, Penalva LO (2012). Musashil: an RBP with versatile functions in normal and cancer stem cells. Frontiers in Bioscience. 17: 54-64.). Hsa-miR-92a-1-5p - микроРНК, регулирующая экспрессию гена MSI1 на посттранскрипционном этапе (targetscan.com).
Анализ патентных источников показал наличие следующих изобретений близких по тематике к заявленному:
1) «Способ диагностики, прогнозирования и лечения глиомы» (см. заявка на изобретение 2008129028/14, опубл. 27.01.2010). Авторами предложено проводить иммуно-гистологическое исследование на послеоперационном опухолевом материале, в результате которого оценивается степень злокачественности глиомы. Согласно классификации глиом 2016 года (см. Louis D.N. et al. WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System. 2016 //IARC: Lyon.) иммуно-гистологическое исследование злокачественных новообразований мозга должно войти в рутинную практику гистологической верификации окончательного диагноза ЗНО мозга. Тем не менее, возможность оперативного, менее дорогого способа G-дифференциации глиом с помощью маркеров экспрессии генов может стать эффективным скрининговым методом, в т.ч. на стадии стереотаксической биопсии. Однако на фоне менее затратного подхода продолжительность заявленного способа занимает 5-7 дней, что не дает преимуществ в оперативности получаемых результатов.
2) «Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека» (см. заявка на изобретение 2015108718/10, опубл. 10.05.2016). Авторами предложено проводить молекулярно-генетическое исследование относительной экспрессии 10-ти микроРНК на послеоперационном опухолевом материале, в результате которого оценивается степень злокачественности глиомы. Отметим, что предложенный авторами показатель относительной экспрессии рассчитывался с использованием Только одного референсного гена, подобранного по литературным данным, без валидации для конкретных условий. Референсные гены - маркеры внутреннего контроля, необходимые для нормализации данных исследуемых локусов с целью нивелирования влияния биологических различий. Во многих исследованиях было продемонстрировано, что не существует единого гена внутреннего контроля, поэтому для нормализации результатов RT-PCR рекомендуется использовать более одного эталонного гена, а обеспечение точных и надежных результатов требует предварительной проверки выбранных референсных генов (см. Hellemans J., Vandesompele J. Selection of Reliable Reference Genes for RT-qPCR Analysis. In: Biassoni R., Raso A. (eds) Quantitative Real-Time PCR. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1160. 2014; см. Humana Press, New York, NY; Wang X., Fu Y., Ban L., Wang Z., Feng G., Li J., Gao H. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time RT-PCR in alfalfa // Genes Genet. Syst., 2015, 90, p. 175-180).
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
- метод основан на сравнении относительной экспрессии экспериментально подобранной комбинации двух генов EGFR, MSI1 и одной микроРНК hsa-miR-92a-1-5p, которая таргетирует уровень мРНК гена MSI1 в клетке, что позволяет удешевить, упростить и значительно ускорить процедуру тестирования, а также провести анализ на небольшом количестве биопсийного материала;
- определение уровня экспрессии в образцах ткани проводят методом RT-PCR в реальном времени с использованием двух референсных микроРНК (hsa-miR-126-5p и hsa-miR-7-5p) и трех референсных генов (PSMC, ТВР, RPLO), подобранных с использованием программного обеспечения «GENorm», genorm.cmgg.be), с последующим геометрическим усреднением, что повышает точность и чувствительность тестирования;
- заключение о типе глиальной опухоли делают на основании тестирования образцов условно нормальной контрольной ткани (перифокальная зона) и опухолевой ткани головного мозга, что позволяет учитывать индивидуальные различия и гетерогенность глиом.
В предварительных исследованиях был выявлен широкий диапазон варьирования уровня экспрессии как онко-ассоциированных генов, так и таргетирующих их микроРНК. Данные относительной экспрессии двух генов и одной микроРНК оптимально дифференцировали глиомы II, III и IV степени злокачественности.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, эффективного, специфичного способа дифференциальной диагностики глиом низкой степени злокачественности II и глиом высокой степени злокачественности III, IV согласно гистологическим критериям.
Технический результат достигается тем, что на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК, включающий выделение тотальной РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны, обратную транскрипцию с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO и микроРНК hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, -hsa-miR-7-5p, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е для генов EGFR, MSI1 и микроРНК hsa-miR-92-1-5p с использованием трех высокоспецифичных референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микроРНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p и при значениях EEGFR<0.5 или EEGFR>1.5, EMSI1<0.5 или EMSI1>1.5, Ehsa.miR-92a-1-5p<0.5 или Ehsa.miR-92a-1-5p>1.5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности; коэффициент Е рассчитывают по формуле:
Figure 00000001
где ΔCt (опухоль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани глиом, где ΔCt(контроль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани перифокальной зоны; при этом относительную экспрессию генетических локусов рассчитывают по формуле ΔCt = 2-(Ct целевого гена-Ct референсных генов), где Сtцелевого гена - среднее по трем повторам для целевых локусов EGFR или MSI1 и где Сtреференсных генов - среднее геометрическое значение референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO; относительную экспрессию микро-РНК рассчитывают по формуле ΔCt = 2-(Ct целевой микроРНК-Ct референсных микроРНК), где Ct целевой микроРНК - среднее по трем повторам для микроРНК hsa-miR-92-1-5р и где Сtреференсных микроРНК - среднее геометрическое значение референсных микроРНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p.
Способ основан на патогенетическом факторе канцерогенеза - аберрантной экспрессии генов, ассоциированных с инициацией и развитием злокачественного процесса, что приводит к прогрессированию опухоли.
Заявленный способ включает следующие этапы: отбор биоматериала интраоперационно, выделение тотальной РНК из тканевых проб; проведение обратной транскрипции для наработки кДНК, RT-PCR полученной кДНК в присутствии специфичных праймеров; обработку данных для оценки изменения относительной экспрессии в опухолевых образцах, относительно контрольных.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
У пациента производят отбор биоматериала интраоперационно. Образцы опухолевой ткани и перифокальной зоны замораживают в жидком азоте или фиксируют в РНК-среде для транспортировки в лабораторию и дальнейшего хранения.
Выделение тотальной РНК из ткани проводят подходящим методом экстракции. Выделенную РНК подвергают обратной транскрипции. Обратная транскрипция микроРНК проводится одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров. Последовательности RT-праймеров микроРНК, подобранные по литературным источникам (Balcells I., Cirera S., Busk P.K. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers //BMC biotechnology. - 2011. - Т. 11. - №.1. - C. 70; MirBase (http://www.mirbase.org/)), указаны в таблице 1.
Figure 00000002
Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1х PCR-буфер, 0,25 mM dNTPs, 2 мМ MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров. Оптимизированные условия амплификации и последовательности PCR-праймеров собственного дизайна, подобранные с использованием баз данных MirBase, NCBI GenBank и программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, приведены в таблице
2. Постановку RT-PCR каждого образца проводят в трех повторах.
Figure 00000003
Для оценки изменения относительной экспрессии в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной контрольной тканью для каждого локуса рассчитывают коэффициент Е по формуле
Figure 00000001
где ΔCt(опухоль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани глиом, где ΔCt(контроль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани перифокальной зоны; при этом относительную экспрессию генетических локусов рассчитывают по формуле ΔCt=2-(Сtцелевого гена-Ct референсных генов) - где Сtцелевого гена - среднее по трем повторам для целевых локусов EGFR или MSI1 и где Сtреференсных генов - среднее геометрическое значение референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO; относительную экспрессию микро-РНК рассчитывают по формуле ΔCt = 2-(Сtцелевой микроРНК-Сtреференсных микроРНК), где Сtцелевой микроРНК - среднее по трем повторам для микроРНК hsa-miR-92-1-5р и где Сtреференсных микроРНК - среднее геометрическое значение референсных микроРНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p.
При значениях EEGFR<0.5 или EEGFR>1.5, EMSI1<0.5 или EMSI1>1.5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0.5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1.5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности.
В целях оценки потенциальной значимости выбранных маркеров была рассчитана их чувствительность и специфичность. Показано, что для дифференциации случаев глиом низкой и высокой степени злокачественности, маркер EGFR имеет чувствительность 85% и специфичность 50%, MSI1 чувствительность 100% и специфичность 45%, микроРНК hsa-miR-92a-1-5p чувствительность 100% и специфичность 40%. В то же время система из трех маркеров обладает чувствительностью 84% и специфичностью 99%. Предложенная система маркеров открыта и возможно увеличить ее чувствительность и/или дифференцирующую специфичность при расширении паттерна генетических локусов для оценки изменения относительной экспрессии в опухолевой ткани.
Для доказательства прогностической ценности предложенного способа приводится 3 выписки из историй болезни.
Пример №1.
Больная Г. обратилась в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России с жалобами на дезориентацию в пространстве.
Считает себя больной с мая 2018 г, когда появились вышеуказанные симптомы. Обратилась за медицинской помощью по месту жительства, где Выполнила МРТ с последующим выявлением объемного образования, направлена в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. По решению врачебной комиссии по отбору пациентов для оказания высокотехнологичной Медицинской помощи больная госпитализирована в отделение нейроонкологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России на хирургическое лечение.
Дата и вид операции: краниоэктомия от 28.06.2018: циторедуктивное удаление глиальной опухоли мозолистого тела с вовлечением лобных долей, поясных извилин с применением интраоперационной навигации.
Выполнение молекулярно-генетического исследования опухолевой и контрольной ткани от 29.06.2018: исследование экспрессии генов EGFR, MSI1 и микроРНК hsa-92a-1-5p не выявило значимых изменений экспрессии исследуемых локусов, что соответствует степени злокачественности G2.
Гистологическое исследование биоптата от 04.07.2018 - G2 олигодендроглиома.
Пример №2
Пациент Г. обратился в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России 24.04.2018 с жалобами на онемения в левой руке, слабость в левой ноге.
Начало заболевания отмечает около двух месяцев назад с онемением в левой руке, слабость в левой ноге. Консультирован неврологом по месту жительства, назначена консервативная терапия, без положительного эффекта. Далее рекомендовано выполнение МРТ головного мозга, где выявлено образование левой теменной доли головного мозга. Направлен в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. По решению врачебной комиссии по отбору пациентов для оказания высокотехнологичной медицинской помощи больной госпитализирован в отделение нейроонкологии РНИОИ на хирургическое лечение.
Дата и вид операции: костно-пластическая краниотомия 25.04.2018, циторедуктивное удаление глйальной опухоли правой лобной и теменной долей головного мозга с применением интраоперационной навигации.
Выполнение молекулярно-генетического исследования опухолевой и контрольной ткани от 26.04.2018: исследование экспрессии генов EGFR, MSI1 и микроРНК hsa-92a-1-5p выявило значимое изменение экспрессии всех исследуемых локусов более чем в 1,5 раза, что соответствует степени злокачественности G3-G4.
Гистологическое исследование биоптата от 04.05.2018 - G4 глиобластома с обширными очагами некроза и кровоизлияний.
Пример №3
Пациентка С., 52 года, обратилась в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России 03.04.2018 с жалобами на легкие нарушения речи, головокружение, головные боли.
Начало заболевания отмечает 25.03.2018, когда впервые возник генерализованный эпилептический приступ, вызвана бригада СМП, доставлена в БМСП №5 г. Таганрога, где после стабилизации состояния, отправлена домой. Далее самостоятельно записалась на МРТ головного мозга с контрастированием, где выявлена опухоль левой лобной доли головного мозга. После этого обратилась в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. Консилиум от 02.04.2018: показано удаление опухоли. Госпитализирована в отделение нейроонкологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России для хирургического лечения.
Дата и вид операции: 06.04.2018 - костно-пластическая краниотомия, циторедуктивное удаление глиальной опухоли левой лобной доли головного мозга с применением интраоперационной навигации.
Участок удаленной опухоли и контрольной ткани был направлен на исследование экспрессии генов EGFR, MSI1 и микроРНК hsa-92a-1-5p. Результат исследования от 09.04.2018 выявил значимое изменение экспрессии MSI1 и микроРНК hsa-92a-1-5p более чем в 2,5 раза, что соответствует степени злокачественности G3-G4.
Гистологическое исследование от 10.04.18 г: низкодифференцированная опухоль солидного строения. Рекомендовано ИГХ.
Иммуногистохимическое исследование от 28.04.18 г. - гистологическая картина и иммунофенатип опухоли характерны для анапластической астроцитомы WHO grade III: p53-позитивная ядерная реакция в единичных опухолевых клетках; ki67 маркер пролиферативной активности - положительная экспрессия в 10% ядер опухолевых клеток.
Анализ представленных клинических случаев свидетельствует о возможности проведения дифференциальной диагностики глиомы с использованием исследования экспрессии генов EGFR, MSI1 и микроРНК hsa-miR-92a-1-5р.
Предлагаемым способом было осуществлено определение степени злокачественности глиом у 25 больных, результаты молекулярно-генетических исследований в дальнейшем подтверждены данными гистологического анализа.
«Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК» позволяет диагностировать степень злокачественности глиом, что способствует уточнению диагноза и определению правильной тактики лечения, а также будет способствовать улучшению результатов лечения больных с глиальными опухолями. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения диагноза и дает возможность скорректировать тактику лечения в послеоперационном периоде; обладает высокой чувствительностью (84%) и специфичностью (99%), его осуществление возможно на интраоперационном материале, способ занимает менее 8 часов.

Claims (1)

  1. Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК, включающий выделение тотальной РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны, обратную транскрипцию, с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR - F: AGGACGGGGACCAGACAA, R: CTGCGTACTTCCAGACCAGG, MSI1 - F: GGCTGTGGTTCGAGGGAC, R: CTGGGAGTCGAACCTGGAG, PSMC4 - F: CGCTCACGCATTTCGAGC, R: CAGGTGGGCCATACATGAGG, ТВР - F: GTGCCCGAAACGCCGAA, R: GTGGTTCGTGGCTCTCTTATCC, RPLO - F: GAGGAAACTCTGCATTCTCGC, R: CTGCAGACAGACACTGGCA и микро-РНК hsa-miR-92-1-5р - F: GAGGTTGGGATCGGTTGGAA, R: AGGTCCAGT(15)AGCA, hsa-miR-126-5p - F: CGCAGCATTATTACTTTTGGTAC, R: GTCCAG15(T)GCGTA, hsa-miR-7-5p - F: CGCAGTGGAAGACTAGTGA, R: GTCCAGT(15)CAAC, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех высокоспецифичных референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микро-РНК: hsa-miR-126-5р, hsa-miR-7-5p, сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными и при значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSI1<0,5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности; коэффициент Е рассчитывают по формуле:
    Figure 00000004
    где ΔCt(опухоль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани глиом, где ΔCt(контроль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани перифокальной зоны; при этом относительную экспрессию генетических локусов рассчитывают по формуле ΔCt=2-(Сtцелевого гена-Ctреференсных генов), где Ctцелевого гена - по трем повторам для целевых локусов EGFR или MSI1 и где Сtреференсных генов - среднее геометрическое значение референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO; относительную экспрессию микро-РНК рассчитывают по формуле ΔCt=2-(Сtцелевой микроРНК-Ctреференсных микроРНК), где Ctцелевой микроРНК - среднее по трем повторам для микро-РНК hsa-miR-92-1-5р и где Сtреференсных микроРНК - среднее геометрическое значение референсных микро-РНК hsa-miR-126-5р, hsa-miR-7-5p.
RU2018142345A 2018-11-29 2018-11-29 Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк RU2709651C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018142345A RU2709651C1 (ru) 2018-11-29 2018-11-29 Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018142345A RU2709651C1 (ru) 2018-11-29 2018-11-29 Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2709651C1 true RU2709651C1 (ru) 2019-12-19

Family

ID=69007020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018142345A RU2709651C1 (ru) 2018-11-29 2018-11-29 Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2709651C1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2742413C1 (ru) * 2020-06-17 2021-02-05 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики глиальных опухолей головного мозга высокой степени злокачественности
RU2769927C2 (ru) * 2020-02-28 2022-04-08 Общество с ограниченной ответственностью "МедФлорина" Способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микроРНК
RU2786007C1 (ru) * 2022-02-25 2022-12-15 Федеральное Государственное Автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Способ оценки злокачественности клеток в культурах глиомы

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101336300A (zh) * 2005-12-16 2008-12-31 健泰科生物技术公司 神经胶质瘤的诊断、预后和治疗方法
AU2009212543B2 (en) * 2008-02-01 2015-07-09 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
RU2583871C1 (ru) * 2015-03-12 2016-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
AU2017272272A1 (en) * 2008-02-01 2018-01-04 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101336300A (zh) * 2005-12-16 2008-12-31 健泰科生物技术公司 神经胶质瘤的诊断、预后和治疗方法
AU2009212543B2 (en) * 2008-02-01 2015-07-09 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
AU2017272272A1 (en) * 2008-02-01 2018-01-04 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
RU2583871C1 (ru) * 2015-03-12 2016-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Г.В. ПАВЛОВА. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЛИОМ. ВОПРОСЫ НЕЙРОХИРУРГИИ 6, 2014 *
Г.В. ПАВЛОВА. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЛИОМ. ВОПРОСЫ НЕЙРОХИРУРГИИ 6, 2014. КИТ О.И. ПРЕДИКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА МЕТАСТАТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ЛИМФОУЗЛОВ У БОЛЬНЫХ АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЖЕЛУДКА. МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК ЮГА РОССИИ. 2018, 9(1) 51-62. *
КИТ О.И. ПРЕДИКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА МЕТАСТАТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ЛИМФОУЗЛОВ У БОЛЬНЫХ АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЖЕЛУДКА. МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК ЮГА РОССИИ. 2018, 9(1) 51-62. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2769927C2 (ru) * 2020-02-28 2022-04-08 Общество с ограниченной ответственностью "МедФлорина" Способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микроРНК
RU2742413C1 (ru) * 2020-06-17 2021-02-05 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики глиальных опухолей головного мозга высокой степени злокачественности
RU2786007C1 (ru) * 2022-02-25 2022-12-15 Федеральное Государственное Автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Способ оценки злокачественности клеток в культурах глиомы
RU2788814C1 (ru) * 2022-06-09 2023-01-24 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии"Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ малоинвазивной диагностики менингиом и опухолей глиального ряда с уточнением степени злокачественности

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hartmann et al. Five-gene model to predict survival in mantle-cell lymphoma using frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue
AU2017213457B2 (en) Micro-RNA biomarkers and methods of using same
CN102876676B (zh) 一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
CN106460053A (zh) 在甲状腺肿瘤分类中的mirna表达特征
WO2016186987A1 (en) Biomarker micrornas and method for determining tumor burden
CA2880198A1 (en) Prediction of treatment response to jak/stat inhibitor
RU2583871C1 (ru) Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека
RU2709651C1 (ru) Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-рнк
CN102892898A (zh) 用于肝细胞癌诊断的含微rna生物标记的诊断试剂盒和方法
EP3390661B1 (en) Use of antisense long non-coding rnas for the diagnosis of prostate cancer
CN107519193A (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN108624693B (zh) miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用
WO2010004562A2 (en) Methods and compositions for detecting colorectal cancer
US20120238617A1 (en) Microrna expression signature in peripheral blood of patients affected by hepatocarcinoma or hepatic cirrhosis and uses thereof
CN102443638B (zh) 一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用
WO2018095933A1 (en) Method of prognosticating, or for determining the efficiency of a compound for treating cancer
CN102770561A (zh) 用于诊断不同亚型肺癌的基于组织的微-rna方法
CN107058579A (zh) 肺腺癌相关的miRNA、组合物及其应用
CN108410977B (zh) 酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒
CN107619869B (zh) 胶质瘤诊断及预后标志物circ16:85633914|85634132及应用
CN109563548B (zh) 用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法
KR101381894B1 (ko) 위암의 림프절 전이 진단 마커로서의 혈청 ｍｉＲＮＡ
CN110820051B (zh) 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
JP2007082433A (ja) 悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途
CN105838804A (zh) MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20201130