CN117092354B - 一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的蛋白标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的蛋白标志物,其特征在于,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。本发明还提供了所述蛋白标志物的筛选方法和应用。本发明筛选得到蛋白标志物具有高度特异性,只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达,在其他来源的细胞外囊泡中基本不表达,因此能够区分脑源性细胞的细胞外囊泡与其他组织来源的细胞外囊泡。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断领域,特别是涉及一种用于识别脑源性细胞细胞的外囊泡的蛋白标志物。
背景技术
临床早期阿尔茨海默病(AD)的确诊十分困难,因此漏诊误诊率很高。由于AD的患者认知功能呈不可逆的下降趋势且非症状期常持续10~20年,多数患者确诊时已属中晚期,此时的临床干预已经收效甚微,平均生存期较短仅5.5年。因此在临床症状的基础上急需新的诊断方法进行辅助筛查,早期的诊断及干预对于患者的预后非常重要。
现阶段AD的诊断手段包括脑内的病理性蛋白——淀粉样蛋白Aβ、tau蛋白的PET-CT检测,灵敏度及准确度高,但目前国内具有该检测能力的医疗机构有限,检测费用昂贵,难以普及。脑脊液中Aβ及磷酸化tau蛋白(p-tau)水平检测也是较为准确的诊断方法,但脑脊液取样的病人依从性低,难以作为前期广谱筛查的手段。此外,也有临床研究验证了血浆Aβ及p-tau水平检测作为AD早期诊断手段的潜力,但血浆p-tau水平改变在散发性AD患者中出现较晚,而血浆Aβ水平变化远低于CSF中Aβ水平变化,且轻度AD痴呆的临床试验表明,约25%符合AD临床标准的患者不表现出Aβ病理。此外,目前AD的诊断标志物主要基于神经元的研究,忽略了各类神经胶质细胞在AD早期的变化。因此,亟需开发适用性更广、有效性更高的早期诊断方法。
脑源性细胞的细胞外囊泡(BDEV)内部包含了蛋白质、核酸和脂质等细胞胞质组分,可反映其来源细胞的动态变化,具备AD早期诊断的潜力。同时,BDEV可穿过血脑屏障进入外周血液循环系统,由于受到细胞膜的包裹,BDEV内含物更为稳定,不易受到外界干扰,其中的组分比体液中的生物分子更能够代表其来源细胞的真实状态,并且可早期、反复取样,这使得BDEV具有液体活检的独特优势,是作为AD早期诊断标志物研究的绝佳载体。近些年来,以EV为靶点的生物学检测如雨后春笋般出现。由于研究者可提取到神经系统来源的EV,将其分离纯化后可进行进一步分析,EV对于阿尔茨海默病的诊断价值在被逐渐开发出来。
然而,由于几乎所有细胞都可以分泌细胞外囊泡,人体液中的EV是来自各个器官的EV混合池,如果不加以区分,那么一些特异性高但丰度却很低的信号会被淹没在复杂的背景信号中,这对标志物的发掘是不利的。尽管一些报道显示血浆中的总EV也能一定程度上区分正常人和AD早期患者,但目前为止仍没有临床可用的EV诊断标志物。因此,如何在体液中特异性富集BDEV对于AD诊断标志物研究尤为重要。遗憾的是,现有技术对于BDEV的特异性蛋白标记物研究报道较少,对于蛋白组学尚没有报道。因此,本领域迫切需要一种高特异性BDEV表面蛋白标志物,用以开发从血液中富集BDEV的方法,为AD液体活检奠定基础。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术存在的上述问题,本发明的目的是提供具有高特异性的BDEV表面蛋白标志物,所述蛋白标志物只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的蛋白标志物,其特征在于,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
优选地,所述NSG2蛋白、LINGO1蛋白和GABRA3蛋白在神经元细胞外囊泡中特异性表达。
优选地,所述BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白和EPHX4蛋白在星形胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达。
优选地,所述SYT2蛋白和SLITRK1蛋白在小胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物的筛选方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)分离纯化脑源性细胞的细胞外囊泡和组织来源的细胞外囊泡;
(2)对步骤(1)得到的细胞外囊泡进行蛋白组学检测;
(3)基于步骤(2)得到的数据筛选在神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞的细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白;
(4)将步骤(3)的结果与单细胞数据库比对,进一步确认所得标志膜蛋白的表达特异性。
优选地,步骤(1)所述脑源性细胞包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的一种或多种,所述组织包括血浆、脑脊液、脑组织、骨骼肌、肾脏和肝脏中的一种或多种。
优选地,步骤(2)所述蛋白组学检测包括对蛋白表达水平的检测。
优选地,步骤(3)所述特异性表达或步骤(4)所述表达特异性是指所述标志膜蛋白只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物在制备用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的产品中的应用。
优选地,所述产品所检测的样本来自受试者的血液;优选地,所述受试者为人类。
本发明还提供了一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物。
优选地,所述试剂盒包括特异性识别所述蛋白标志物的抗体或抗体片段,及核酸适配体。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物在制备诊断阿尔茨海默病的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物。
发明的效果
本发明所筛选得到的3个神经元细胞外囊泡标志膜蛋白(NSG2, LINGO1,GABRA3)、3个星形胶质细胞外囊泡标志膜蛋白(BMPR1A, EFR3B, EPHX4)和2个小胶质细胞外囊泡标志膜蛋白(SYT2, SLITRK1)具有非常高的特异性,只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达,在其他来源的EV中基本不表达,因此能够将BDEV与其他组织来源的EV区分开来。
在此基础上,本领域技术人员还可以利用相应的抗体或核酸适配体在体液中特异性富集BDEV,并将其用于阿尔茨海默病的检测。
附图说明
图1显示了筛选细胞特异性表明标志物的操作步骤。
图2为iPSC诱导分化成神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞的显微镜照片。(a)神经元诱导流程及标志膜蛋白染色图片;(b)星形胶质细胞诱导流程及标志膜蛋白染色图片;(c)小胶质细胞诱导流程及标志膜蛋白染色图片。
图3显示了脑源性细胞的细胞外囊泡的鉴定。(a)纳米流式粒径分布图;(b)透射电镜图;(c)western blot蛋白标志物鉴定。
图4显示了组织来源的细胞外囊泡的鉴定。(a)纳米流式粒径分布图;(b)透射电镜图;(c)western blot蛋白标志物鉴定。
图5为不同来源的细胞外囊泡蛋白组学韦恩图。
图6为神经元细胞外囊泡特异性蛋白与单细胞数据库对比结果。
图7为星形胶质细胞外囊泡特异性蛋白与单细胞数据库对比结果。
图8为小胶质细胞外囊泡特异性蛋白与单细胞数据库对比结果。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂,下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中,附图不一定是按比例绘制的,局部特征可以被放大或缩小,以更加清楚的显示局部特征的细节;除非另有定义,本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
除非另有说明,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另有说明,本发明所使用的各种材料和试剂,可以使用本领域常规的方法获得,也可以通过商业渠道获得。
本发明所使用的术语“包含”或“包括”是指包括所述的要素、整数或步骤,但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本发明中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
本发明所使用的术语“多潜能诱导干细胞”或“iPSC”通过表达或诱导表达细胞因子而从体细胞生成的、具有分化成各种胚层的潜能的细胞。
本发明所使用的术语“分化”是指将较低分化程度的细胞转化为较高分化程度的细胞,特别是有丝分裂后组织特异性细胞类型的一个或多个步骤,例如将iPSC分化为神经元。可以例如通过向细胞培养基中加入分化因子,诱导iPSC向神经元分化。
本发明所使用的术语“细胞外囊泡”或“EV”是细胞间通信的成熟介质,是由不同类型的激活或凋亡细胞释放的小膜囊泡,包括白细胞、血小板、红细胞和内皮细胞,可在人类体液中检测到。在中枢神经系统中,神经元、胶质细胞均可分泌细胞外囊泡,且分泌的细胞外囊泡有细胞特异性。
本发明所使用的术语“脑源性细胞的细胞外囊泡”或“BDEV”是大脑细胞广泛分泌细胞外囊泡,含细胞浆成分,可反映细胞动态变化,具备AD早期诊断潜力,所述脑源性细胞的细胞外囊泡包括神经元细胞外囊泡、小胶质细胞细胞外囊泡和星形胶质细胞细胞外囊泡中的一种或多种。
本发明所使用的术语“标志物”是指由细胞进行的天然发生的可鉴定的表达,其可以与该细胞的某些特性相关并且用来鉴定、预测或表征细胞或细胞群体。
本发明所使用的术语“脑源性”是指来源于分化神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞。
本发明所使用的术语“组织来源”是指来源于人血浆、人脑脊液、人脑组织、骨骼肌、肾脏或肝脏。
本发明所使用的术语“NSG2蛋白”是指神经元囊泡运输相关蛋白2。
本发明所使用的术语“LINGO1蛋白”是指富亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域含nogo受体相互作用蛋白1。
本发明所使用的术语“GABRA3蛋白”是指γ-氨基丁酸受体亚基α3。
本发明所使用的术语“BMPR1A蛋白”是指骨形态发生蛋白受体1A型蛋白。
本发明所使用的术语“EFR3B蛋白”是指EFR3蛋白同源蛋白B。
本发明所使用的术语“EPHX4蛋白”是指环氧水解酶4。
本发明所使用的术语“SYT2蛋白”是指突触结合蛋白相关基因2。
本发明所使用的术语“SLITRK1蛋白”是指SLIT和NTRK样蛋白1。
本发明提供了一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的蛋白标志物,其特征在于,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的两种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的三种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的四种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的五种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的六种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的七种。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的八种。
在某些实施方案中,所述NSG2蛋白、LINGO1蛋白和GABRA3蛋白在神经元细胞外囊泡中特异性表达。
在某些实施方案中,所述BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白和EPHX4蛋白在星形胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达。
在某些实施方案中,所述SYT2蛋白和SLITRK1蛋白在小胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物的筛选方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)分离纯化脑源性细胞的细胞外囊泡和组织来源的细胞外囊泡;
(2)对步骤(1)得到的细胞外囊泡进行蛋白组学检测;
(3)基于步骤(2)得到的数据筛选在神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞的细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白;
(4)将步骤(3)的结果与单细胞数据库比对,进一步确认所得标志膜蛋白的表达特异性。
在某些实施方案中,步骤(1)所述脑源性细胞包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的一种或多种,所述组织包括血浆、脑脊液、脑组织、骨骼肌、肾脏和肝脏中的一种或多种。
在某些实施方案中,使用MARCKS-ED外泌体提取试剂盒进行细胞外囊泡的提取。
在某些实施方案中,步骤(2)所述蛋白组学检测包括对蛋白表达水平的检测。
在某些实施方案中,步骤(2)所述蛋白组学检测包括对细胞外囊泡蛋白进行提取和酶解,并基于DIA质谱进行上机检测。
在某些实施方案中,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行数据采集。
在某些实施方案中,步骤(3)所述特异性表达或步骤(4)所述表达特异性是指所述标志膜蛋白只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达。
在某些实施方案中,所述脑源性细胞的细胞外囊泡包括神经元细胞外囊泡、星形胶质细胞细胞外囊泡和小胶质细胞细胞外囊泡。
在某些实施方案中,所述特异性表达是指仅在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物在制备用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的产品中的应用。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
在某些实施方案中,所述产品所检测的样本来自受试者的血液。
在某些实施方案中,所述受试者为人类。
本发明还提供了一种用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
在某些实施方案中,所述试剂盒包括特异性识别所述蛋白标志物的抗体或抗体片段,及核酸适配体。
本发明还提供了一种所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物在制备诊断阿尔茨海默病的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括所述蛋白标志物或根据所述方法筛选得到的蛋白标志物。
在某些实施方案中,所述蛋白标志物选自NSG2蛋白、LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
实施例
利用多潜能诱导干细胞(iPSC)技术,分别将iPSC诱导分化为神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞进行培养。收集培养液上清进行细胞外囊泡的分离纯化,通过液相色谱-质谱联用(LC/MS)鉴定细胞外囊泡蛋白质,利用蛋白质组学分析找到神经细胞特异性表达的蛋白标志物。具体步骤参见图1。
材料
N2B27培养基:50% DMEM/F12、1% Pen/Strep、50% Neurobassal、0.5X N2、0.5XB27、1% Glutamax、1% NEAA、5μg/mL胰岛素和1μg/mL肝素。
神经分化培养基(NM培养基):DMEM/F12、1% Pen/Strep、1% NEAA、1% N2、20ug/ml肝素。
MCM培养基:DMEM/F12、2X胰岛素-转铁蛋白-硒、2X B27、0.5X N2、1X GlutaMax、1XNEAA、400μM 硫代甘油、5μg/mL胰岛素。
RPMI:Roswell Park Memorial Institute研发的细胞基础培养基。
实施例1:诱导分化神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞
利用多潜能诱导干细胞(iPSC)技术,分别将iPSC诱导分化为神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞进行培养,简要步骤如下。
iPSC达到100%汇合率时使用1mg/ml Dispase消化酶(赛默飞)消化,按1:2传代,第二天,将培养基更换为N2B27培养基,并向培养基中补充5μM SB431542(Selleck)和5μM 多索吗啡(Dorsomorphin,Selleck),诱导细胞向神经细胞谱系分化,细胞隔天换液。诱导8天后仍使用1mg/ml Dispase消化酶消化,将细胞以1:2的比例传代;传代第二天,将培养基改为仅使用N2B27培养基,继续培养,隔天换液。16天后,能观察到典型的神经花环结构的出现,用Accutase消化酶(STEMCELL)将神经花环消化为单细胞,以3×105/ml的细胞密度贴壁培养,在N2B27培养基中继续培养两周即可得到功能性的神经元。
iPSC达到90%汇合率时用1mg/ml Dispase消化酶消化,接种在未经处理的T25培养瓶中以形成胚胎小体(EB)。在第4天,更换为神经分化培养基(NM培养基)进行培养,隔天换液。在第7天,选取20到50个完整的EB直接接种到层粘连蛋白(赛默飞)预处理的6孔中。在第10天,向NM培养基中添加维生素A(5μM,Sigma Aldrich),隔天进行半换液。在第15天能观察到具有花环结构的克隆形成,将这些克隆转移到6孔板中以克隆球的形式继续悬浮培养,每三天进行半换液。在第21天,将培养基更换为NM培养基+EGF(20ng/ml,Peprotech)+FGF2(各20ng/ml,Peprotech),每三天进行75%换液,培养基并维持6个月以得到成熟的星形胶质细胞。
iPSC首先使用商品化培养基(STEMdiff™ Hematopoietic Kit,STEMCELL)培养,令细胞向中胚层、造血谱系分化。第12天时,将非粘附性的CD43+造血祖细胞转移到含有促进稳态小胶质细胞分化的三种关键细胞因子M-CSF(25ng/ml,Peprotech)、IL-34(100ng/ml,Peprotech)和TGFβ-1(50ng/ml,Peprotech)的MCM培养基中进行培养。第25天时,改为含五种关键细胞因子M-CSF(25ng/ml,Peprotech)、IL-34(100ng/ml,Peprotech)、TGFβ-1(50ng/ml,Peprotech)、CX3XL1(100ng/ml,Peprotech)和CD200(100ng/ml,Novoprotein)的MCM培养基中继续培养,培养至第28天可得成熟的小胶质细胞。
诱导分化神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞的流程及诱导成功后的标志膜蛋白染色图片如图2所示,结果表明,诱导所得神经元细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞均表达各自所特异的标志膜蛋白MAP2和NEUN(神经元标志膜蛋白)、GFAP(星形胶质细胞标志膜蛋白)以及IBA1(小胶质细胞标志膜蛋白),且三类细胞诱导效率均高于90%。
实施例2:脑源性细胞的细胞外囊泡的鉴定
三类细胞的培养体系均不含血清成分,直接收集培养液上清。培养液3000g离心10min,去除细胞碎片,上清转移到100kd超滤管中进行超滤浓缩。所得浓缩液使用MARCKS-ED外泌体提取试剂盒(亿航生物)进行细胞外囊泡的提取,按说明书操作,步骤如下:
100μl MARCKS-ED磁珠预清洗后,加入1ml浓缩液,涡旋混匀后放置翻转混匀仪上孵育30min。放入磁力架上进行磁分离,弃浓缩液,用洗涤缓冲液洗涤磁珠三次,磁分离弃洗液。加入100μl洗脱缓冲液,涡旋混匀,磁分离,上清转移到新管中即为纯化的细胞外囊泡。
对脑源性细胞的细胞外囊泡进行粒径表征、形态学鉴定和标志物鉴定,结果如图3所示,(a)脑源性细胞的细胞外囊泡经纳米流式分析仪检测,粒径分布符合细胞外囊泡粒径范围;(b)电镜下可见茶托状囊泡结构;(c)蛋白质免疫印迹实验表明三种细胞外囊泡标志物阳性,一种细胞内质网标志物阴性,符合细胞外囊泡特征。
实施例3:组织来源细胞外囊泡的鉴定
(1)人血浆、人脑脊液中EV的分离
使用MARCKS-ED外泌体提取试剂盒进行细胞外囊泡的提取,按说明书操作,步骤如下:
样本前处理:3000g 4℃离心10min,转移上清到新管,再次10000g 4℃离心20min,取上清待用。
磁珠预清洗后,加入样本翻转混匀30min,磁分离弃上清。加入1ml洗涤缓冲液清洗磁珠三次,磁分离弃上清。加入洗脱缓冲液洗脱细胞外囊泡。
(2)人脑组织、骨骼肌、肾脏、肝脏中EV的分离
分离方法基于Miltenyi人类肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec, cat 130-095-929)。在开始前, 酶H、R和A根据制造商的说明重新悬浮。在使用前立即制备含有2.2 mlRPMI、100μl酶H、50μl酶R和12.5μl酶A的解离混合物。取一小块(约200毫克)组织称重,在干冰上简单切片,然后在37℃的分离混合物中孵育10-15分钟。分离后的组织用70μm过滤器轻轻过滤两次,以去除残留组织。悬液以300g在4℃下离心10 min,上清液转移到新管中,以2000g在4℃下离心10 min。无细胞上清液以10000g在4℃下离心20 min后,用0.22μm过滤器慢速过滤,进一步清除细胞碎片。收集的悬浮液以15万g在4℃下的超速离心(UC)处理2h。将颗粒重悬于1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
对组织来源的细胞外囊泡进行粒径表征、形态学鉴定和标志物鉴定,结果如图4所示,(a)组织来源的细胞外囊泡经纳米流式分析仪检测,粒径分布符合细胞外囊泡粒径范围;(b)电镜下可见茶托状囊泡结构;(c)蛋白质免疫印迹实验表明三种细胞外囊泡标志物阳性,一种细胞内质网标志物阴性,符合细胞外囊泡特征。
实施例4:细胞外囊泡的蛋白组学检测
(1)细胞及组织来源细胞外囊泡蛋白提取和酶解
分别取实施例2至实施例3中分离所得脑源性细胞来源细胞外囊泡及组织来源细胞外囊泡样本,每一类样本分别加至一个PCT管中,在压力循环技术(PCT;pressureBioSciences Inc;30秒45000 psi和10秒环境压力,90个循环)的条件下,用6M尿素(SigmaAldrich)和2M硫脲(Sigma Aldrich),对蛋白质进行变性。然后,在PCT(50秒20000 psi和10秒环境压力,120个循环)的帮助下,用胰蛋白酶(1:20;Hualishi)和Lys-C(1:80;Hualishi)将蛋白质消化成肽。
(2)基于DIA质谱进行上机检测
消化得到肽段样品通过DDA建库、色谱分级,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据采集,原始数据经搜库检索后,进行后续生物信息学分析。
实施例5:筛选特异性细胞外囊泡标志膜蛋白
对实施例4得到的蛋白组检测结果取交集,对结果进行韦恩图分析(图5),筛选到82个神经元细胞外囊泡中特异性表达标志膜蛋白、38个星形胶质细胞外囊泡中特异性表达标志膜蛋白、27个小胶质细胞外囊泡中特异性表达标志膜蛋白。
将筛选到82个神经元细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白、38个星形胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白、27个小胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白(如图5所示)与The Human Protein Altas的单细胞数据库比对,进一步确认筛选所得标志膜蛋白的表达特异性。最终筛选得到3个神经元细胞外囊泡标志膜蛋白(NSG2、LINGO1、GABRA3,如图6所示)、3个星形胶质细胞的细胞外囊泡标志膜蛋白(BMPR1A、EFR3B、EPHX4,如图7所示)和2个小胶质细胞的细胞外囊泡标志膜蛋白(SYT2、SLITRK1,如图8所示)。
应当理解,以上实施例均为示例性的,不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下,还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的,也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合,以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此,上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,不对本发明专利的保护范围进行限制。
Claims (6)
1.一种蛋白标志物在制备用于识别脑源性细胞的细胞外囊泡的产品中的应用,其特征在于,所述蛋白标志物包括NSG2蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述蛋白标志物还包括LINGO1蛋白、GABRA3蛋白、BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白、EPHX4蛋白、SYT2蛋白和SLITRK1蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,
所述NSG2蛋白、LINGO1蛋白和GABRA3蛋白在神经元细胞外囊泡中特异性表达;
所述BMPR1A蛋白、EFR3B蛋白和EPHX4蛋白在星形胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达;
所述SYT2蛋白和SLITRK1蛋白在小胶质细胞细胞外囊泡中特异性表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用,其特征在于,所述蛋白标志物的筛选方法包括以下步骤:
(1)分离纯化脑源性细胞的细胞外囊泡和组织来源的细胞外囊泡;
(2)对步骤(1)得到的细胞外囊泡进行蛋白组学检测;
(3)基于步骤(2)得到的数据筛选在神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞的细胞外囊泡中特异性表达的标志膜蛋白;
(4)将步骤(3)的结果与单细胞数据库比对,进一步确认所得标志膜蛋白的表达特异性。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,
步骤(1)所述脑源性细胞包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的一种或多种,所述组织包括血浆、脑脊液、脑组织、骨骼肌、肾脏和肝脏中的一种或多种;
步骤(2)所述蛋白组学检测包括对蛋白表达水平的检测;
步骤(3)所述特异性表达或步骤(4)所述表达特异性是指所述标志膜蛋白只在脑源性细胞的细胞外囊泡中表达。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品所检测的样本来自受试者的血液;其中,所述受试者为人类。
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