JP2016192906A - 乳がんに関する情報の取得方法、ならびに乳がんに関する情報を取得するためのマーカー及び乳がん検出用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】乳がんに特異的な新規マーカーを用いて、被験者の生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて被験者の乳がんに関する情報を取得する方法の提供。
【解決手段】被験者の生体試料から抽出したDNAに含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析し、その解析結果に基づいて被験者の乳がんに関する情報を取得する方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験者の生体試料から抽出したDNAに含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析し、その解析結果に基づいて被験者の乳がんに関する情報を取得する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、被験者の乳がんに関する情報の取得方法に関する。また、本発明は、乳がんに関する情報を取得するためのマーカー及び乳がん検出用キットに関する。
乳がんは、乳管及び乳腺から発生する悪性腫瘍であり、女性が罹患するがんの中では死亡率の高いがんとして知られている。乳がんのスクリーニング検査では、乳房のしこりを確認する視触診と、乳房をＸ線撮影するマンモグラフィーが行われる。また、しこりが発見された場合は、超音波検査などの画像検査や穿刺吸引細胞診が行われる。しかし、これらの検査は、被験者に不快感や苦痛を与える場合がある。
乳がんの検査では、CEA(がん胎児性抗原)、CA15-3などの腫瘍マーカーの測定も行われている。しかし、これらの腫瘍マーカーは、検出感度が十分でない場合があり、また、乳がんとは異なる種類のがんにも利用されている。
近年、新たながんの診断方法として、遺伝子情報に基づく方法が研究されている。そのような方法としては、例えば、DNAのメチル化に関する情報に基づく方法が挙げられる。この方法では、所定の遺伝子の塩基配列中のCpG部位(5'-(CG)-3')をマーカーとして用いる。そして、該マーカーのメチル化状態の解析結果に基づいてがん細胞の存否などの情報を取得し、これを指標にしてがんの診断が行われる。例えば、非特許文献１には、乳がん患者の血清においてRASSF1A、APC及びDAP-キナーゼ遺伝子のプロモータが高度にメチル化しており、これらのメチル化解析により乳がんのスクリーニングに有用である旨が開示されている。
Dulaimi E.ら, Tumor Suppressor Gene Promoter Hypermethylation in Serum of Breast Cancer Patients, Clin Cancer Res, vol.10, p.6189-6193 (2004)
しかし、乳がんを検出するためのマーカーとして用いることができる遺伝子は少数に過ぎない。また、本発明者らは、非特許文献１に開示されるマーカーのうち、RASSF1A及びAPCは、乳がんだけでなく、他の種々のがん組織においても高度にメチル化していることを確認している。それゆえ、遺伝子のメチル化解析を利用した乳がんの検出のための新規マーカーのさらなる開発が望まれている。
本発明によれば、乳がんに関する情報の取得方法が提供される。この方法は、被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、このDNA試料に含まれるregulatory subunit of type II PKA R-subunit (RIIa) domain containing 1 (RIIAD1)遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する工程と、判定工程において、メチル化が存在すると判定された場合は、上記生体試料が乳がん細胞を含むとの情報を取得する工程とを含む。
本発明によれば、乳がんに関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる核酸が提供される。この核酸は、被験者から単離した核酸に由来する核酸であって、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の全部又はその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有し、上記プロモータ領域は、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含む。
本発明によれば、プライマーを含む乳がん検出用試薬キットが提供される。このキットに含まれるプライマーは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズするプライマーである。
本発明は、乳がんに関する情報の取得を可能にする方法を提供できる。また、本発明は、乳がんに関する情報を取得するためのマーカー及び乳がん検出用キットを提供できる。
本実施形態の乳がんに関する情報の取得方法(以下、単に「方法」ともいう)では、まず、被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する。
本実施形態において、生体試料は、被験者のDNAを含む生体由来の試料であれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体である。臨床検体としては、例えば、体液、尿、穿刺吸引により採取した細胞、手術又は生検により採取した組織などが挙げられる。体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、乳頭分泌液などが挙げられる。また、被験者から採取した細胞又は組織を培養して得られた培養物を生体試料として用いることもできる。さらに、被験者から採取した組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を生体試料として用いてもよい。
DNA試料の調製は、生体試料からDNAを抽出することにより行うことができる。生体試料からのDNAの抽出方法は当該技術において公知である。例えば、生体試料と、細胞又は組織を可溶化する界面活性剤(例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど)を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって、DNAを抽出できる。この場合、混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させ、遊離したDNAを含む上清を後述の解析工程に用いることが好ましい。また、得られた上清を当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出及び精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
上記の調製工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。DNAを適当な長さに断片化することにより、後述するメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法及び非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で５〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
本実施形態の方法では、上記の調製工程で得られたDNAに含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する。なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン(C)とグアニン(G)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
当該技術において、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の塩基配列自体は公知であり、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター(National Center for Biotechnology Information：NCBI)により提供されるデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公知のデータベースから知ることができる。RIIAD1遺伝子の各種ID番号を、表１に示す。また、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の塩基配列(chr1:151692000-151696132)を配列番号１として示す。
本実施形態では、CpG部位のメチル化の有無の判定は、上記のプロモータ領域をメチル化解析した結果に基づいて行うことができる。メチル化解析は、例えば、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のうち、少なくとも１つのCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを調べることにより行うことができる。この場合、解析するCpG部位は１つであってもよいが、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。
別の実施形態において、メチル化解析は、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度を調べることにより行ってもよい。ここで、「メチル化の頻度」とは、例えば、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合であり得る。この実施形態では、解析対象は、上記のプロモータ領域の全部であってもよいし、少なくとも１つのCpG部位を含む一部分であってもよい。なお、解析対象は、CpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、複数のCpG部位を含んでいることが好ましい。なお、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置及び数は既知であるので、本実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
上記のメチル化の頻度は、DNA中のCpG部位のメチル化状態を、後述するMassARRAY(登録商標)などの質量分析法で解析することにより得られる「メチル化スコア」であってもよい。MassARRAY(登録商標)では、DNA断片を測定して、メチル化DNA断片に由来するピークと非メチル化DNA断片に由来するピークとの面積比からメチル化スコアが算出される。
本実施形態では、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度は、用手法によって算出してもよいし、コンピュータなどの機械によって算出してもよい。
本実施形態では、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域中のいずれのCpG部位(あるいは該CpG部位を含む所定の範囲)を解析対象とするかについては特に限定されず、当業者が適宜決定できる。なお、これらの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置及び数は既知であるので、解析対象とするCpG部位又は範囲は、後述の公知の解析方法を用いたルーチンの実験により決定できる。
メチル化解析の手段としては、当該技術において種々の解析方法が公知である。本実施形態の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、好ましくは、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNA及び／又は非メチル化DNAを検出する工程とを含む方法である。
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT(in vitro transcription)増幅法、SPIA(商標)増幅法などを行う工程が挙げられる。メチル化DNA及び／又は非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、又はメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本実施形態では、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、得られたメチル化DNAについてメチル化解析を行ってもよい。また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化解析することもできる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン)に変換する処理である。ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン)に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩(バイサルファイト)が好適に用いられる。
バイサルファイトを用いるDNAの処理では、該DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い(C及びUの違い)に変換される。なお、このようなバイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量(濃度)は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、DNAを含む溶液中の終濃度として１M以上、好ましくは１〜15 M、より好ましくは３〜10 Mである。また、バイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件(温度及び時間)は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度６Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
DNAに含まれるCpG部位のメチル化は、バイサルファイト処理したDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれている。
また、CpG部位のメチル化は、質量分析法によって解析できる。具体的には、バイサルファイト処理したDNAを鋳型として、解析対象とする塩基配列に特異的なプライマーセットを用いてPCR増幅した後、得られたPCR産物をさらにIVT増幅することにより、メチル化シトシン及びウラシルはそれぞれグアニン(G)及びアデニン(A)となる。得られたIVT増幅産物をRNase Aで切断し、得られた核酸断片間におけるGとAとの質量差(16 Da)をMALDI-TOF(マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置を用いて検出することにより、DNAのメチル化を解析できる。この方法はMassARRAY(登録商標)解析と呼ばれる。
IVT産物においてRNase Aによって切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル(U)又はチミン(T)との間であることが知られている。したがって、RNase Aによって切断されたIVT産物の塩基配列及び質量は、鋳型として用いたDNAの塩基配列から予測することが可能である。したがって、MassARRAY(登録商標)で得られた各ピークについて、鋳型としたDNAの塩基配列のどの部分に由来するかを同定できる。例えば、DNA断片中の１か所のCpG部位がメチル化していた場合、MassARRAY(登録商標)で得られるピークは、高質量側へ16 Daシフトする。複数のCpG部位を有するDNA断片の解析では、例えば、該DNA断片中のCpG部位が２か所メチル化していた場合は32 Daシフトし、３か所メチル化していた場合は48 Daシフトする。
MassARRAY(登録商標)などの質量分析法では、測定したDNA断片のメチル化スコアを算出できる。例えば、所定の配列のDNA断片について、分析で得られたチャートにおける非メチル化DNA断片のピークとメチル化DNA断片のピークとの面積比が１：３であった場合、このDNA断片のメチル化スコアは、３／(１+３)＝0.75より、0.75となる。なお、メチル化スコアは、理論上、DNA断片が有する全てのCpG部位がメチル化している場合は１であり、全てのCpG部位がメチル化していない場合は０である。
CpG部位のメチル化は、メチル化特異的PCR(MSP)法によって解析できる。MSP法とは、バイサルファイト処理したDNAを、後述するプライマーを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによって、CpG部位のメチル化の有無を解析する方法である。MSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている(すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない)塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない(すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている)塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が得られた場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が得られなかった場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
本実施形態では、PCR産物の有無は、例えば、ゲル電気泳動法により確認できる。増幅後の反応液をゲルに電気泳動して、PCR産物に由来するバンドがゲルに存在するか否かを目視で確認してもよい。あるいは、泳動後のゲルの画像を取得して、画像解析により確認してもよい。画像解析は、例えば、ゲルの画像中、PCR産物が存在すると予想される領域の画素の濃淡を示す値(例えば、バンド強度)を取得し、この値と所定の閾値を比較して行うことができる。具体的には、画素の濃淡を示す値が所定の閾値以上である場合、PCR産物が得られたと判定でき、画素の濃淡を示す値が所定の閾値より小さい場合、PCR産物が得られなかったと判定できる。なお、画素の濃淡に関する所定の閾値は特に限定されず、例えば、バックグラウンドの画素の濃淡を示す値であってもよいし、その値の２倍又は３倍の値であってもよい。
MSP法で用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端又はその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
CpG部位のメチル化は、マイクロアレイを用いて解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本実施形態の判定方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor(商標)などが挙げられる。このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip(登録商標) Scanner3000 7G(Affymetrix社)、Illumina(登録商標) BeadArray Reader(Illumina社)などが挙げられる。
本実施形態では、上記のメチル化解析により、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位にメチル化が有ると判定できる。別の実施形態では、メチル化解析で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高いか、又は閾値と同じという結果が得られた場合、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位にメチル化が有ると判定できる。なお、所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定できる。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、乳がんに由来するがん細胞を含まないことが予め確認されている生体試料(正常乳腺の組織又は細胞)、及び、乳がんに由来するがん細胞を含む生体試料のそれぞれから抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、がん細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く且つがん細胞を含む生体試料のメチル化の頻度よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、がん細胞を含まない生体試料とがん細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
本実施形態の方法では、上記の判定工程で得られた判定結果に基づいて、被験者の乳がんに関する情報を取得する。ここで、乳がんに関する情報とは、被験者から採取した生体試料が乳がん由来のがん細胞を含むか否かに関する情報である。あるいは、乳がんの診断の指標となり得る情報、又は乳がんの診断を補助する情報であってもよく、好ましくは、被験者における乳がんの発生もしくは状態又はその両方を示す情報である。そのような情報としては、例えば、乳がんが被験者に発生している可能性、乳がんがこれから被験者に発生する危険性などが挙げられる。また、被験者に乳がんが発生している場合は、乳がんに関する情報として、被験者の予後、がんの進行度(ステージ)などが挙げられる。
本実施形態では、判定工程において、メチル化されたCpG部位が有ると判定された場合、生体試料が乳がん由来のがん細胞を含むとの情報を取得する。あるいは、乳がんが発生していることを示唆する情報、又は乳がんの状態が不良である(もしくは、悪い)という情報を取得することもできる。また、被験者が乳がんになる危険性が高いという情報、又は乳がんがすでに発生しているという情報を取得できる。さらに、被験者に乳がんが発生しているならば、被験者の予後が不良である(もしくは、悪い)という情報、又はがんの状態がより進行したステージであるという情報を取得できる。
反対に、判定工程において、メチル化されたCpG部位が無いと判定された場合、生体試料が乳がんに由来するがん細胞を含まないとの情報を取得する。あるいは、乳がんが発生していないことを示唆する情報又は乳がんの状態が良好であるという情報を取得することもできる。また、被験者が乳がんになる危険性が低いという情報、又は乳がんはまだ発生していないという情報を取得できる。さらに、被験者に乳がんが発生しているならば、被験者の予後が良好であるという情報、又はがんの状態がそれほど進行したステージではないという情報を取得できる。
本発明の範囲には、メチル化解析により乳がんに関する情報を取得するためのマーカーも含まれる(以下、単に「マーカー」ともいう)。そのような本実施形態のマーカーは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つを含む、被験者から単離された核酸である。本実施形態では、上記のマーカーについてメチル化状態を解析し、得られた解析結果に基づいて該被験者の乳がんに関する情報を取得できる。なお、メチル化状態の解析及び乳がんの情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
別の実施形態では、乳がんに関する情報を取得するためのマーカーとして、被験者から単離した核酸に由来する核酸が用いられる。そのようなマーカーとして用いられる、被験者から単離した核酸に由来する核酸は、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の全部又はその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有し、且つ、該プロモータ領域が、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含む。ここで、CpG部位を構成しないシトシンとは、CpG部位に含まれるシトシン以外であればよく、例えば、シトシン(C)と、アデニン(A)、チミン(T)又はシトシン(C)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った塩基配列(すなわち、CA、CT又はCC)中のシトシンが挙げられる。上記の核酸は、被験者から単離した核酸をバイサルファイト処理することにより得ることができる。
本実施形態のマーカーとして用いられる核酸においては、上記の単離DNAのバイサルファイト処理により、該単離DNA中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されているが、メチル化シトシンはそのままとなっている。本実施形態では、このようなポリヌクレオチド中のCpG部位のメチル化状態を解析することによって、乳がんに関する情報を取得できる。なお、上記の単離DNAは、これまでに述べたDNA試料の調製と同様にして得ることができる。また、バイサルファイト処理、メチル化状態の解析及び乳がんの情報の取得についても、これまでに述べたことと同様である。
本実施形態のマーカーとして用いられる核酸のサイズは、MSP法、シーケンス法又は質量分析法によるメチル化解析が可能なサイズであれば特に限定されないが、好ましくは50〜200塩基、より好ましくは80〜130塩基である。本実施形態のマーカーとして用いられる核酸としては、例えば、配列番号２の塩基配列からなる核酸が挙げられる。この配列番号２の塩基配列からなる核酸は、MSP法によるメチル化状態の解析に適している。
本発明の範囲には、乳がん検出用キット(以下、単に「キット」ともいう)も含まれる。本実施形態のキットは、バイサルファイト処理された核酸を増幅するためのプライマーを含む。このようなプライマーは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズする。
本実施形態において、キットに含まれるプライマーは、MSP法、バイサルファイトシーケンス法などのPCR増幅を伴う解析方法、又は、MassARRAY(登録商標)などの質量分析法によりCpG部位のメチル化解析するためのプライマーであればよい。好ましくは、MSP法又はMassARRAY(登録商標)などの質量分析法に用いられるプライマーである。なお、プライマーの塩基配列は、上記のプロモータ領域の塩基配列に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、配列番号３及び配列番号４のそれぞれで表される塩基配列のプライマーが挙げられる。
別の実施形態では、上記のキットは、第２のプライマーを含んでいてもよい。このような第２のプライマーは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つ、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズし得る。
本発明には、被験者の乳がんに関する情報の取得をコンピュータに実行させるためのプログラム製品も含まれる。このようなプログラム製品としては、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体などが例示される。
たとえば、以下のステップをコンピュータに実行させるためのプログラムが例示される。
被験者由来のDNA試料に含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の解析結果を測定装置から取得するステップ；
取得した解析結果に基づいて、上記生体試料における乳がん細胞の有無を判定するステップ。
被験者由来のDNA試料に含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の解析結果を測定装置から取得するステップ；
取得した解析結果に基づいて、上記生体試料における乳がん細胞の有無を判定するステップ。
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図５は、被験者の乳がんに関する情報の取得に用いる診断補助装置の一例を示した概略図である。図５に示された診断補助装置１０は、測定装置２０と、この測定装置２０と接続された判定装置３０とを含んでいる。
本実施形態において、MSP法によりメチル化解析を行う場合、測定装置２０は、蛍光イメージスキャナなどのゲルイメージング装置であり得る。この場合、MSP法による核酸増幅を行った反応液をゲル電気泳動し、泳動後のゲルを測定装置２０にセットすると、測定装置２０は増幅産物を検出する。そして、測定装置２０は、増幅産物のゲル画像情報を取得し、得られた情報を判定装置３０に提供する。
なお、測定装置２０は、MALDI-TOF型質量分析装置であってもよい。この場合、測定装置２０は、被験物質の飛行時間や質量電荷比(m/z値)などの質量分析情報を取得する。被験者由来のDNA試料から調製した測定用試料を測定装置２０にセットすると、測定装置２０は、該測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報を取得し、得られた質量分析情報を判定装置３０に提供する。
判定装置３０は、コンピュータ本体３００と、キーボードやマウスからなる入力部３０１と、ＬＣＤやＣＲＴからなり検体情報や判定結果などを表示する表示部３０２とを含む。判定装置３０は、測定装置２０から、増幅産物のゲル画像情報を取得する。そして、判定装置３０は、これらの情報に基づいて、被験者における乳がんに関する情報を提供するプログラムを実行する。なお、判定装置３０は、図５に示されるように測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、判定装置３０は、それ自体で診断補助装置１０であり得る。
図６は、判定装置３０のコンピュータ本体３００のソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図６に示されるように、コンピュータは、取得部３２１と、記憶部３２２と、算出部３２３と、判定部３２４と、出力部３２５とを備える。取得部３２１は、測定装置２０と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。
取得部３２１は、測定装置２０から提供された情報を取得する。記憶部３２２は、判定に必要な閾値及びバンド強度を取得するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３２３は、取得部３２１で取得された情報を用い、記憶された処理プログラムにしたがって、バンド強度を算出する。判定部３２４は、取得部３２１によって取得されたか、又は算出部３２３によって算出されたバンド強度が、記憶部３２２に記憶された閾値以上であるか否かを判定する。出力部３２５は、判定部３２４による判定結果を、被験者の乳がんに関する情報(例えば、被験者から採取した生体試料中の乳がん細胞の有無)として表示部３０２へ出力する。
図７は、図６に示すコンピュータ本体３００のハードウェア構成を示すブロック図である。図７に示されるように、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読出装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読出装置３１５、通信インターフェイス３１６及び画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１に記憶されているプログラム及びＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０がプログラムを実行することにより、図６に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３０が、被験者の乳がんに関する情報を提供するための判定装置として機能する。
ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、前述のようにＣＰＵ３１０によって実行されるプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１及びハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被験者の乳がんに関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのプログラム及び当該プログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラム又はデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、当該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
次に、診断補助装置１０による、被験者の乳がんに関する情報の取得の処理手順を説明する。図８は、乳がんに関する情報の取得のフローチャートの一例である。ここでは、被験者由来の生体試料を用いて得られたゲル画像情報からバンド強度を取得し、得られたバンド強度が閾値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
まず、ステップＳ１−１において、診断補助装置１０の取得部３２１は、測定装置２０からRIIAD1遺伝子についてのゲル画像情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３２３は、得られたゲル画像情報からバンド強度を取得し、記憶部３２２に送信する。
その後、ステップＳ１−３において、判定部３２４は、ステップＳ１−２で取得したバンド強度が、記憶部３２２に記憶された閾値以上であるか否かの判定を行う。ここで、バンド強度が閾値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−４に進行する。そして、判定部３２４は被験者由来の生体試料に乳がん細胞があることを示す判定結果を出力部３２５に送信する。一方、バンド強度が閾値より小さいとき、ルーチンはステップＳ１−５に進行する。そして、判定部３２４は被験者由来の生体試料に乳がん細胞がないことを示す判定結果を出力部３２５に送信する。
最後に、ステップＳ１−６において、出力部３２５は、判定結果を、被験者の乳がんに関する情報として出力し、表示部３０２に表示させる。これにより、診断補助装置１０は、被験者が乳がんを患っているか否かについて診断することを補助する情報を医師などに提供できる。
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１： 乳がんのがん部組織及び非がん部組織、ならびに正常乳腺組織のメチル化データを利用した新規マーカーの同定
(1)メチル化データの取得
実施例１では、乳がんのがん部組織(548検体)及び非がん部(乳腺)組織(98検体)について、TCGA(The Cancer Genome Atlas：http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)において公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。また、正常乳腺組織(23検体)について、Nazor KL.らの文献(Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634)に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChipのメチル化データを取得した。
(1)メチル化データの取得
実施例１では、乳がんのがん部組織(548検体)及び非がん部(乳腺)組織(98検体)について、TCGA(The Cancer Genome Atlas：http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)において公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。また、正常乳腺組織(23検体)について、Nazor KL.らの文献(Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634)に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChipのメチル化データを取得した。
(2)新規マーカーの同定
Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたデータマイニングの結果、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域が、乳がんのがん部組織に特異的にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図１参照)。以降、これらのマーカーを本実施例のマーカーとも呼ぶ。
Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたデータマイニングの結果、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域が、乳がんのがん部組織に特異的にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図１参照)。以降、これらのマーカーを本実施例のマーカーとも呼ぶ。
実施例２： 複数種類のがん／腫瘍由来のがん／腫瘍組織検体、非がん部組織検体及び正常組織検体におけるメチル化データの比較
(1)メチル化データの取得
実施例２では、15種類のがん／腫瘍組織検体、12種類の非がん部組織検体及び19種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
(1)メチル化データの取得
実施例２では、15種類のがん／腫瘍組織検体、12種類の非がん部組織検体及び19種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
表４において、「RCAST」の欄の検体については、Infinium HumanMethylation450 BeadChip（Illumina社）を用いたInfinium Methylation Assayにより本発明者らがメチル化データを取得した。「論文１」及び「論文２」の欄の検体については、下記の文献に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip（Illumina社）のメチル化データを取得した。
・論文１：Nazor KLら、Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634
・論文２：Reinius LEら、Differential DNA Methylation in Purified Human Blood Cells: Implications for Cell Lineage and Studies on Disease Susceptibility, PLoS One, 7(7) e41361
・論文１：Nazor KLら、Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634
・論文２：Reinius LEら、Differential DNA Methylation in Purified Human Blood Cells: Implications for Cell Lineage and Studies on Disease Susceptibility, PLoS One, 7(7) e41361
なお、ここでいうメチル化データとは、次のようにして得られたRIIAD1のCpG領域のメチル化率(mCpG)である。Infinium HumanMethylation450 BeadChipには、ヒトのゲノム上にあるCpGサイトのうち、482,421ヶ所のCpGサイトごとにメチル化用プローブと非メチル化用プローブを設けている。対象となる遺伝子のCpGサイトのメチル化用プローブのシグナル強度(シグナルM)と非メチル化用プローブのシグナル強度(シグナルU)をBeadArray Readerで検出し、以下の計算式により対象となる遺伝子のCpG領域のメチル化率(mCpG)を算出した。
（mCpG）＝（シグナルM）／｛（シグナルM）＋（シグナルU）｝
（mCpG）＝（シグナルM）／｛（シグナルM）＋（シグナルU）｝
(2)がん／腫瘍組織検体、非がん部組織検体及び正常組織検体におけるメチル化陽性率の比較
得られたメチル化率(mCpG)の値について、腫瘍組織検体と正常組織検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合にメチル化陽性とした。そして、各がん種のメチル化陽性率(％)を算出した。
メチル化陽性率（％）＝（メチル化陽性検体数／総検体数）×100
(例えば、脳腫瘍の場合、メチル化陽性率は「(脳腫瘍検体のうちメチル化陽性検体数／脳腫瘍総検体数＝114）×100」によって算出する。)
得られたメチル化率(mCpG)の値について、腫瘍組織検体と正常組織検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合にメチル化陽性とした。そして、各がん種のメチル化陽性率(％)を算出した。
メチル化陽性率（％）＝（メチル化陽性検体数／総検体数）×100
(例えば、脳腫瘍の場合、メチル化陽性率は「(脳腫瘍検体のうちメチル化陽性検体数／脳腫瘍総検体数＝114）×100」によって算出する。)
結果を図２に示す。なお、図２において、「正常組織」とは、表４に示される組織のうち、各種の正常血球成分60検体を除く正常組織を表し、「正常血球」とは各種の正常血球成分60検体を表す。図２より、本実施例のマーカーはいずれも、非がん部組織、ならびにヒト正常組織及びヒト正常血球ではメチル化はほとんど認められない。また、本実施例のマーカーはいずれも、他のがんに比べて、乳がんにおいて特に高度にメチル化していることがわかった。よって、本実施例のマーカーは、乳がんの検出に適していることが示された。
実施例３： 健常人及び乳がん患者の組織におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
実施例３では、乳がん患者由来の生体試料として、乳がん患者から採取したがん部組織(３検体)を用いた。また、対照試料として、正常乳腺組織(３検体)を用いた。
(1)生体試料
実施例３では、乳がん患者由来の生体試料として、乳がん患者から採取したがん部組織(３検体)を用いた。また、対照試料として、正常乳腺組織(３検体)を用いた。
(2)測定用試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各組織のサンプルからゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各組織のサンプルからゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(3)メチル化特異的PCR (MSP)
上記(2)で得られた測定用試料及び対照試料を用いて、MSPを行った。用いたPCR試薬
の組成、プライマーセット及びPCR条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DW(滅菌水) 18.8μL
10×PCR Buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
10 mM dNTP mix 0.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料 1.0μL
トータル 25.0μL
上記(2)で得られた測定用試料及び対照試料を用いて、MSPを行った。用いたPCR試薬
の組成、プライマーセット及びPCR条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DW(滅菌水) 18.8μL
10×PCR Buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
10 mM dNTP mix 0.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料 1.0μL
トータル 25.0μL
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表５に示す。このプライマーセットは、増幅対象の領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセット(以下、「メチル化検出用プライマーセット」とも呼ぶ)である。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表６参照)。RIIAD1遺伝子のプロモータ領域において、メチル化検出用プライマーセットで解析される領域の塩基配列を配列番号７で示した。なお、この領域のバイサルファイト変換後の塩基配列は、配列番号２で示される。
上記のMSPで用いたプライマーセットを表５に示す。このプライマーセットは、増幅対象の領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセット(以下、「メチル化検出用プライマーセット」とも呼ぶ)である。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表６参照)。RIIAD1遺伝子のプロモータ領域において、メチル化検出用プライマーセットで解析される領域の塩基配列を配列番号７で示した。なお、この領域のバイサルファイト変換後の塩基配列は、配列番号２で示される。
＜PCR反応条件＞
95℃で６分、
95℃で30秒、60℃で15秒、72℃で30秒をＸサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
95℃で６分、
95℃で30秒、60℃で15秒、72℃で30秒をＸサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記のサイクル数「Ｘ」は、メチル化検出用プライマーセットでは38サイクルであり、精度管理用プライマーセットでは40サイクルである。
(4)結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」及び「100」は、それぞれ０％メチル化対照試料及び１００％メチル化対照試料を表す。
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」及び「100」は、それぞれ０％メチル化対照試料及び１００％メチル化対照試料を表す。
図３より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンド
を検出した。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、正常乳腺組織の試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。これに対して、乳がん組織の試料では、３症例中２症例でバンドを検出した。このように、MSP法による本実施例のマーカーのメチル化解析では、実施例１のInfinium法の結果と同様に、本実施例のマーカーのメチル化と乳がんとが相関することが示された。すなわち、RIIAD1は乳がんで高率にメチル化傾向を示すが、正常乳腺組織では検出されない特異性の高いマーカーであることが示された。
を検出した。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、正常乳腺組織の試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。これに対して、乳がん組織の試料では、３症例中２症例でバンドを検出した。このように、MSP法による本実施例のマーカーのメチル化解析では、実施例１のInfinium法の結果と同様に、本実施例のマーカーのメチル化と乳がんとが相関することが示された。すなわち、RIIAD1は乳がんで高率にメチル化傾向を示すが、正常乳腺組織では検出されない特異性の高いマーカーであることが示された。
実施例４： 種々のがん組織及び正常組織におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、種々のがんの患者から採取した組織試料と、種々の臓器の正常組織とを用いた。各試料の詳細については、表７に示す。なお、表７中、「Ｔ」は腫瘍組織、「Ｎ」は正常組織、「PBL」は末梢血白血球(peripheral blood leukocyte)を表す。
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、種々のがんの患者から採取した組織試料と、種々の臓器の正常組織とを用いた。各試料の詳細については、表７に示す。なお、表７中、「Ｔ」は腫瘍組織、「Ｎ」は正常組織、「PBL」は末梢血白血球(peripheral blood leukocyte)を表す。
(2)測定用試料及び対照試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
実施例３と同様にして、各組織試料からゲノムDNAを抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。実施例３と同様にして、このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAから、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液及びメチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(i)ゲノムDNAの抽出
実施例３と同様にして、各組織試料からゲノムDNAを抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。実施例３と同様にして、このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAから、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液及びメチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(3)MSP
上記(2)で得られた測定用試料及び対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。なお、実施例４のMSPで用いたプライマーセット、PCR試薬の組成及びPCRの反応条件は実施例３と同じである。
上記(2)で得られた測定用試料及び対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。なお、実施例４のMSPで用いたプライマーセット、PCR試薬の組成及びPCRの反応条件は実施例３と同じである。
(4)結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図４に示す。なお、図中の「NC」及び「PC」は、それぞれ０％メチル化対照試料及び100％メチル化対照試料を表す。また、「精度管理」は精度管理用プライマーの増幅産物を示す。
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図４に示す。なお、図中の「NC」及び「PC」は、それぞれ０％メチル化対照試料及び100％メチル化対照試料を表す。また、「精度管理」は精度管理用プライマーの増幅産物を示す。
図４より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出したので、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、いずれのがん組織及び正常組織の試料においてもメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。この結果より、本実施例のマーカーは、乳がんに特異的なマーカーであることが示唆された。
１０ 診断補助装置
２０ 測定装置
３０ 判定装置
４０ 記録媒体
３００ コンピュータ本体
３０１ 入力部
３０２ 表示部
３１０ ＣＰＵ
３１１ ＲＯＭ
３１２ ＲＡＭ
３１３ ハードディスク
３１４ 入出力インターフェイス
３１５ 読出装置
３１６ 通信インターフェイス
３１７ 画像出力インターフェイス
３１８ バス
３２１ 取得部
３２２ 記憶部
３２３ 算出部
３２４ 判定部
３２５ 出力部
２０ 測定装置
３０ 判定装置
４０ 記録媒体
３００ コンピュータ本体
３０１ 入力部
３０２ 表示部
３１０ ＣＰＵ
３１１ ＲＯＭ
３１２ ＲＡＭ
３１３ ハードディスク
３１４ 入出力インターフェイス
３１５ 読出装置
３１６ 通信インターフェイス
３１７ 画像出力インターフェイス
３１８ バス
３２１ 取得部
３２２ 記憶部
３２３ 算出部
３２４ 判定部
３２５ 出力部
Claims (8)
- 被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
前記DNA試料に含まれるRIIAD1遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する工程と、
前記判定工程において、メチル化が存在すると判定された場合は、前記生体試料が乳がん細胞を含むとの情報を取得する工程と
を含む、乳がんに関する情報の取得方法。 - 前記プロモータ領域が、配列番号７の塩基配列を含む請求項１に記載の方法。
- 前記メチル化の有無の判定が、質量分析法及びメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも１つの方法で得られた結果に基づいて行われる請求項１又は２に記載の方法。
- 前記生体試料が、組織、血液又は血清である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 被験者から単離した核酸に由来する核酸であって、
前記由来する核酸は、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域の全部又はその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有し、
前記プロモータ領域は、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含み、
乳がんに関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる、
前記核酸。 - 配列番号２の塩基配列からなる請求項５に記載の核酸。
- プライマーを含む乳がん検出用試薬キットであって、
前記プライマーは、RIIAD1遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズするプライマーである、前記キット。 - 前記プライマーが、配列番号３又は４の塩基配列からなるプライマーである請求項７に記載のキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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