WO2024143711A1 - 아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDF

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WO2024143711A1
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조재열
윤지혜
장원영
박상희
심윤영
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성균관대학교산학협력단
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본 발명은 아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아마씨 유래 고리형 펩타이드 또는 이들의 조합은 천연물에서 유래된 것이므로, 인체 독성이 적고 안전하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 아마씨 유래 고리형 펩타이드 또는 이들의 조합은 멜라닌 생성 억제 효과가 매우 우수한 바, 이를 포함하는 과색소침착 질환 치료제 및 미백 기능성화장품으로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2020H1D3A2A02110965에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "인재활용확산지원", 연구과제명은 "펩타이드 혼합물을 활용한 장건강용 기능성 식품 및 기능성 화장품을 위한 소재 개발", 주관기관은 성균관대학교, 연구기간은 2022.01.01-2022.12.31 이다.
본 발명은 또한 대한민국 교육부의 지원 하에서 과제번호 2017R1A6A1A03015642에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "이공학학술연구기반구축", 연구과제명은 "생체분자제어연구소", 주관기관은 성균관대학교, 연구기간은 2022.03.01-2023.02.28 이다.
본 특허출원은 2022년 12월 28일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0187927호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아마씨 유래 고리형 펩타이드인 Linusorb를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌 (melanin)은 피부색을 결정짓는 색소로, 피부뿐만 아니라 털, 눈 등에도 존재한다. 멜라닌은 표피의 기저층에 위치한 멜라닌 세포 (melanocytes)에서 생성되며, 일정량 이상의 자외선을 흡수하여 유해한 자외선으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다. 티로시나아제 (tyrosinase)에 의한 촉매작용에 의해 멜라닌 생합성이 진행되며, 검은색을 띄는 유멜라닌 (eumelanin)과 황갈색 및 적색을 띄는 페오멜라닌 (pheomelanin)이 합성된다. 하지만 피부 내에 멜라닌 합성이 과도하게 일어나면, 멜라닌이 필요 이상으로 생성되어 기미, 주근깨 등 과색소침착증이 발생한다.
따라서, 멜라닌의 과도한 생성을 억제하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 현재 국내외적으로 천연물로부터 멜라닌 생성 억제 기능성 성분의 소재를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
아마 (Flax, Linum usitatissimum L.)는 아마과 (Linaceae)의 한해살이풀로, 식품, 섬유 및 오일의 원재료로 사용되는 식물이다. 껍질은 섬유자원으로서 리넨, 종이 등을 만드는데 사용되며, 아마 종자에서 짠 기름은 인쇄잉크, 수채화 페인트 및 약재 등으로 이용된다. 아마씨 (Flax seed)는 오메가-3 (Omega-3) 지방산인 알파-리놀렌산 (alpha-linolenic acid) 및 리그난 (lignan) 성분의 일종인 secoisolariciresinol diglucoside (SDG)와 같은 생리활성물질이 다량 함유되어 있어, 항암, 항염증, 심혈관계 질환 예방 및 갱년기 증상 완화 효과가 있다고 보고되어 있다.
아마씨로부터 얻어진 cyclic peptide 복합체인 LOMIX (Linusorb mixture) 및 그 성분인 Linusorb의 경우, 항암 및 항염증 효과가 입증되었으나, 멜라닌 생합성 및 분비 조절 기능에 대한 연구에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
따라서, 아마씨로부터 얻어진 LOMIX 및 Linusorb를 유효성분으로 하는 멜라닌 생성 억제 조성물을 개발한다면, 미백 효능이 우수하고 부작용이 거의 없는 천연 성분으로서 과색소침착 치료제 및 미백기능성 화장품의 원료로 사용될 것으로 기대된다.
본 발명자들은 아마씨 유래 고리형 펩타이드 및 이들의 복합체를 유효성분으로 하는 미백 기능성화장품 소재 및 과색소침착 치료제 소재를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 아마씨 유래 고리형 펩타이드인 Linusorb 및 이들의 복합체인 LOMIX가 α-MSH로 유도된 마우스 흑색종 세포 B16F10 cell에서 멜라닌 생성 및 분비를 억제함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 과색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 아마씨 유래 고리형 펩타이드 및 이들의 복합체를 유효성분으로 하는 미백 기능성화장품 소재 및 과색소침착 치료제 소재를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 아마씨 유래 고리형 펩타이드인 Linusorb 및 이들의 복합체인 LOMIX가 α-MSH로 유도된 마우스 흑색종 세포 B16F10 cell에서 멜라닌 생성 및 분비를 억제함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLA라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (2개의 아이소류신 (isoleucine, Ile), 2개의 류신 (leucine, Leu), 1개의 발린 (valine, Val) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 2개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 노나펩타이드 (nonapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 1에 나타내었다.
본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLB라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (1개의 메티오닌 (methionine, Met), 1개의 류신 (leucine, Leu), 2개의 아이소류신 (isoleucine, Ile), 1개의 발린 (valine, Val) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 2개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 노나펩타이드 (nonapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 2에 나타내었다.
본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLD라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (1개의 메티오닌 설폭사이드 (methionine sulfoxide, MetO), 2개의 류신 (leucine, Leu), 1개의 아이소류신 (isoleucine, Ile), 1개의 트립토판 (tryptophan, Trp) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 1개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 옥타펩타이드 (octapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 3에 나타내었다.
본 발명의 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLE라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (1개의 메티오닌 설폭사이드 (methionine sulfoxide, MetO), 2개의 류신 (leucine, Leu), 1개의 아이소류신 (isoleucine, Ile), 1개의 발린 (valine, Val) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 1개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 옥타펩타이드 (octapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 4에 나타내었다.
본 발명의 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLF라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (2개의 메티오닌 설폭사이드 (methionine sulfoxide, MetO), 1개의 류신 (leucine, Leu), 1개의 발린 (valine, Val), 1개의 트립토판 (tryptophan, Trp) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 1개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 옥타펩타이드 (octapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 5에 나타내었다.
본 발명의 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (이하, CLG라고 함)는 7개의 소수성 아미노산 (2개의 메티오닌 설폭사이드 (methionine sulfoxide, MetO), 1개의 아이소류신 (isoleucine, Ile), 1개의 류신 (leucine, Leu), 1개의 트립토판 (tryptophan, Trp) 및 2개의 페닐알라닌 (phenylalanine, Phe))과 1개의 프롤린 (proline, Pro)으로 이루어진 고리형 옥타펩타이드 (octapeptide)로서, 구체적인 화학구조는 도 6에 나타내었다.
본 발명의 용어인 "펩타이드 (peptide)"란, 아미노산 단위체들이 인공적으로 혹은 자연 발생적으로 연결된 중합체로, 아미노산의 조합에 따라 펩타이드의 기능이 달라지며, 각각의 아미노산은 펩타이드 결합이라는 공유결합으로 연결되어 있다. 펩타이드는 아미노산이 2 ~ 50개 정도 결합된 물질이며, 아미노산 잔기의 수가 2개인 것을 다이펩타이드 (dipeptide), 3개인 것을 트라이펩타이드 (tripeptide), 2 ~ 10개인 것을 올리고펩타이드 (oligopeptide), 약 10 ~ 50개인 것을 폴리펩타이드 (polypeptide)라 한다.
본 발명의 용어인 "고리형 펩타이드 (cyclic peptide)"란, 고리 구조의 결합 서열을 포함하는 펩타이드 사슬을 의미하며, 펩타이드의 아미노 말단 (N-terminal)과 카복실 말단 (C-terminal) 사이의 연결, 아미노 말단과 곁사슬 사이의 연결, 카복실 말단과 곁사슬 사이의 연결 및 두 개의 곁사슬 사이의 연결을 통해 형성될 수 있다.
본 발명의 "미백"활성은 피부의 색소 침착을 예방, 개선 또는 치료하는 모든 활성을 포함하며, 구체적으로 예를 들면, 기미, 주근깨, 검버섯 또는 피부의 멜라닌 색소 침착에 의한 모든 잡티에 대한 예방, 개선 또는 치료 활성을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 것으로 공지되어 사용되며, 유효 성분의 주된 효능을 유의하게 감쇄시키거나, 인체에 대한 부작용을 나타내지 않으면서, 유효 성분의 피부에 대한 적용, 사용자의 사용 편의성 및 선호도를 개선시킬 수 있는 부가 성분을 의미한다.
상기 담체는 본 발명의 조성물의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물 전체 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 담체의 함량은 화장료의 제형, 구체적인 적용 부위 및 바람직한 적용량 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글라이콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아마이드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 아이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-부틸글라이콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글라이콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 검 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세라이드, 지방산 디에탄올아마이드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 하기의 성분 및 함량으로 이루어지는 펩타이드 조합을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.
1% ~ 50%의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 50%의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 30%의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 40%의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 20%의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
1% ~ 40%의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 50%, 1% 내지 45%, 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 15% 내지 50%, 15% 내지 45%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 45%, 20% 내지 40%, 20% 내지 35%, 20% 내지 30%, 또는 20% 내지 25%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 50%, 1% 내지 45%, 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 15% 내지 50%, 15% 내지 45%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 20% 내지 50%, 20% 내지 45%, 20% 내지 40%, 20% 내지 35%, 20% 내지 30%, 25% 내지 50%, 25% 내지 45%, 25% 내지 40%, 25% 내지 35%, 또는 25% 내지 30%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 1% 내지 10%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 또는 5% 내지 10%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 10% 내지 20%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 또는 15% 내지 20%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 1% 내지 10% 또는 1% 내지 5%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 linusorb 혼합체 총 함량을 기준으로 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 10% 내지 20%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 또는 15% 내지 20%인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 아마씨에서 유래된 펩타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌 생성 및 멜라닌 분비를 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "멜라닌 (melanin)"이란, 흑갈색 알갱이의 색소로서, 피부, 털, 눈 등에 존재하며, 멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정된다. 멜라닌은 멜라닌 세포 속의 멜라노솜 (melanosome)이라는 작은 자루 모양의 세포소기관에서 만들어지며, 멜라닌세포는 멜라노솜이 들어있는 수상돌기를 뻗어서 각질세포 등 주변의 다른 세포에 멜라닌을 전달한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Tyrosinase, Tyrp-1 (tyrosinase related protein-1) 및 Tyrp-2 (tyrosinase related protein-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 멜라닌 합성 관련 유전자의 발현을 억제한다.
본 발명에서 "MITF (microphthalmia-associated transcription factor)"는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 류신 지퍼 (basic helix-loop-helix leucine zipper) 구조를 가진 전사인자로, E-box (Enhancer box)라는 특정 염기서열을 인식하고 결합함으로써 멜라닌 형성에 관여하는 여러 유전자들의 발현을 조절한다.
본 발명에서 "tyrosinase"는 타이로신 (tyrosine) 및 페놀류 (phenol)의 산화반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 멜라노솜 내의 L-tyrosine을 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 및 L-dopaquinone으로 산화시켜, 멜라닌 합성에 관여하는 속도제한효소로 작용한다.
본 발명에서 "Tyrp-1 (tyrosinase-related protein 1)"은 TYRP-1 유전자에 의해 암호화되는 막간 효소로, tyrosinase 단백질의 안정화 및 촉매 활성 조절에 관여한다. 또한, Tyrp-1은 멜라노솜 구조의 유지에 관여하며 멜라닌 세포 증식 및 멜라닌 세포 사멸에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "Tyrp-2 (tyrosinase-related protein 2)"는 DCT (dopachrome tauromerase)라고도 불리며, DOPAchrome의 자연적인 대사산물인 DHI (5,6-dihydroxyindole)가 아닌 DHICA (5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)로 이성화 (isomerization)하는 효소를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Tyrosinase, Tyrp-1 (tyrosinase related protein-1) 및 Tyrp-2 (tyrosinase related protein-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현을 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 피부조직 유래 세포에서 CREB 또는 PKA의 인산화를 억제한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 과색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제공되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 상기 부형제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형 형태를 갖는다. 상기 피부 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.
본 발명에서 피부외용제형의 겔 기재로는 카보폴 (Carbopol), 카보머(Carbomer), 폴리에틸렌 글라이콜(Polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글라이콜 (Polypropylene glycol), 폴리아크릴산(Polyacrylic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 하이드록시메틸셀룰로오스 (Hydroxymethyl cellulose), 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinyl pyrrolidone), 젤라틴 (Gelatin), 알지네이트 염 (Alginate Salt), 키틴 (Chitin) 또는 키토산 (Chitosan) 유도체, 히알루론산 (hyaluronic acid), 콜라겐 (collagen) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 유효 성분의 함량, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이고, 상술한 투여량의 약제학적 조성물을 적용을 원하는 부위에 대해, 적용 목적에 따라 국소적으로 또는 광범위하게 피부외용 제형의 형태로 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 하기의 성분 및 함량으로 이루어지는 펩타이드 조합을 유효성분으로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
1% ~ 50%의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 50%의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 30%의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 40%의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
1% ~ 20%의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
1% ~ 40%의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 과색소침착 질환은 기미, 주근깨, 피부잡티, 노인성 색소반, 일광 색소반, 임신성 갈색반, 멜라닌 피부증, 점, 반점, 검버섯, 모반, 유전성대측성색소이상증, 망상지단색소침착증, 간반, 약물에 의한 색소침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소침착으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 화장료 조성물을 대상체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 피부의 미백방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 과색소침착질환의 치료방법을 제공한다.
상기 피부의 미백방법 또는 과색소침착질환의 치료방법은 상기 화장료 조성물 또는 상기 약제학적 조성물을 적용하거나 투여하는 단계를 포함하므로, 양 발명간에 공통되는 내용은 미백방법 또는 과색소침착질환 치료방법에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 "대상체"는 포유동물을 의미한다. 상기 포유동물은 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 페렛, 기니피그, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 또는 인간을 제외한 영장류일수 있고, 가장 구체적으로는 인간이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 과색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(iii) 본 발명은 상기 화장료 조성물을 대상체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 피부의 미백방법을 제공한다.
(iv) 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 과색소침착 질환의 치료방법을 제공한다.
(v) 본 발명의 아마씨 유래 고리형 펩타이드 또는 이들의 조합은 천연물에서 유래된 것이므로, 인체 독성이 적고 안전하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 아마씨 유래 고리형 펩타이드 또는 이들의 조합은 멜라닌 생성 억제 효과가 매우 우수한 바, 이를 포함하는 과색소침착 질환 치료제 및 미백 기능성화장품으로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 4는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 5는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 6은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 화학구조를 나타낸다.
도 7은 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 LOMIX 처리에 따른 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 8은 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 LOMIX를 농도별로 처리하였을 때, 멜라닌 분비량 및 멜라닌 함량 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 LOMIX를 농도별로 처리하였을 때, 멜라닌 합성 관련 유전자인 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 발현량을 나타낸다.
도 10은 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 LOMIX를 구성하는 Linusorb인 CLA, CLB, CLD, CLE 및 CLF&G를 농도별로 처리했을 경우, 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLA 및 CLB를 농도별로 처리했을 경우, 멜라닌 분비량 및 멜라닌 함량 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLD, CLE 및 CLF&G를 농도별로 처리했을 경우, 멜라닌 분비량 및 멜라닌 함량 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLA를 농도별로 처리하였을 때, MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 발현량을 나타낸다.
도 14는 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLB를 농도별로 처리하였을 때, MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 발현량을 나타낸다.
도 15는 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLA 처리에 따른 멜라닌 합성 관련 상위인자인, MITF, PKA 및 CREB의 발현량 측정 결과를 나타낸다.
도 16은 α-MSH로 유도된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 CLB 처리에 따른 멜라닌 합성 관련 상위인자인, MITF, PKA 및 CREB의 발현량 측정 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
실시예 1: 세포 배양
마우스 흑색종 세포주 (murine melanoma cell)인 B16F10 세포는 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Penicillin/Streptomycin, P/S)이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실시예 2: HPLC를 통한 LOMIX 내 linusorb 구성성분 분석
아마씨 유래 고리형 펩타이드 혼합물 LOMIX (linusorb mixture)는 Prairie Tide Diversified Inc. (Saskatchewan, SK, Canada)에서 제공되었으며, LOMIX내 linusorb 조성은 HPLC를 통해 분석되었다.
본 발명의 LOMIX 내의 포함된 linusorb의 서열은 표 1에 나타내었으며, HPLC 분석을 통한 LOMIX내 linusorb의 조성은 표 2에 나타내었다.
Linusorb 서열번호 아미노산 서열
CLA 1 Ile-Leu-Val-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile
CLB 2 Met-Leu-Ile-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile
CLD 3 [(Rs,Ss)-MetO]-Leu-Leu-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile
CLE 4 [(Rs,Ss)-MetO]-Leu-Val-Phe-Pro-Leu-Phe-Ile
CLF 5 [(Rs,Ss)-MetO]-Leu-[(Rs,Ss)-MetO]-Pro-Phe-Phe-Trp-Val
CLG 6 [(Rs,Ss)-MetO]-Leu-[(Rs,Ss)-MetO]-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile
Linusorb MW Quantity Amount (μg/mL)
CLA 1040.34 0.14 mg (22.95%) 45.9
CLB 1074.37 0.16 mg (26.23%) 52.5
CLD 1064.34 0.05 mg (8.20%) 16.4
CLE 977.26 0.12 mg (19.67%) 39.3
CLF 1084.35 0.03 mg (4.92%) 45.9
CLG 1098.38 0.11 mg (18.03%)
실시예 3: LOMIX 처리에 따른 B16F10 cell의 세포생존율 확인
본 발명자들은 LOMIX 처리에 따른 B16F10 cell의 세포생존율을 확인하기 위하여 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 세포독성평가를 진행하였다.
구체적으로, B16F10 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/mL의 농도로 분주하고, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL의 농도로 LOMIX를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포에 10 μL의 5 mg/mL MTT 용액을 첨가하고 3시간 동안 추가 반응을 유도하였다. 반응 종료 및 포르마잔 결정 (formazan crystal) 용해를 위해 각 well에 100 μL MTT 정치 용액 (stopping solution, 10% sodium dodecyl sulfate in 0.01 M HCl)을 추가로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 포르마잔으로 환원된 양을 570 nm의 파장대에서 측정한 OD (Optical density)값을 통해 산출하였다.
LOMIX 처리에 따른 세포 생존율 측정 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 100 μg/mL까지의 농도로 처리한 LOMIX 군에서 세포 생존율이 80% 이상으로 나타났고, 200 및 400 μg/mL의 농도에서 세포 생존율이 80% 미만으로 측정됨을 확인하였다.
이러한 결과는, 25, 50 및 100 μg/mL 농도의 LOMIX로 처리할 시, 세포 생존율 80% 이상으로 유지되어 세포독성이 나타나지 않는 것을 보여준다.
실시예 4: α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 LOMIX 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 생성량 확인
본 발명자들은 LOMIX가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 LOMIX 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 생성량을 확인하였다.
먼저, B16F10 cell을 6 well plate에 각각 1.5×105 cells/mL로 분주한 후, 100 nM의 α-MSH로 melanogenesis를 유도하였다. 곧바로 25, 50 및 100 μg/mL의 농도로 LOMIX를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 후, 각 well의 배지 상층액을 100 μL씩 취하여 새로운 96 well plate에 옮겨주었다. 이후, 475 nm의 파장대에서 각각의 배지의 흡광도를 측정하여 얻어진 OD값을 통해 멜라닌 분비량을 산출하였다.
6 well plate에 남아있는 B16F10 세포의 경우, PBS로 세척한 후, scraper로 긁어내어 모아주었다. 세포 안의 멜라닌은 60℃ 조건에서 10% DMSO가 용해되어 있는 1M NaOH 용액으로 녹인 후, 이를 50 μL씩 새로운 96 well plate에 분주 후 405 nm의 파장대에서 흡광도를 측정하였다. 측정하여 얻어진 OD값을 통해 세포 내의 멜라닌 생성량을 측정하였다.
LOMIX 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 멜라닌 생성량 측정 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, α-MSH 유도로 증가한 멜라닌 분비량이 LOMIX 처리에 따라 농도 의존적으로 감소함을 확인하였고, α-MSH 유도로 증가한 멜라닌 생성량 또한, 50 μg/mL 이상의 농도로 처리된 LOMIX 처리군에서 감소함을 확인하였다.
이러한 결과는, 아마씨 유래 cyclic peptide 복합체인 LOMIX가 α-MSH에 의한 멜라닌 생성 및 분비를 저해시켜 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 5: α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 LOMIX 처리에 따른 멜라닌 합성 관련 유전자의 발현량 확인
본 발명자들은 LOMIX의 멜라닌 합성 관련 유전자에 미치는 영향을 확인하기 위하여 α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 LOMIX 처리에 따른 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 발현량을 Quantitative real time PCR을 통해 확인하였다.
구체적으로, 배양한 B16F10에 cell 100 nM의 α-MSH로 melanogenesis를 유도하고, 곧바로 25, 50 및 100 μg/mL의 농도로 LOMIX를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양액을 모두 걷어내고, TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 isopropanol을 첨가하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다. 세포 내 mRNA는 cDNA kit를 이용하여 cDNA로 합성하여, real time PCR을 통해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2 유전자 발현량을 확인하였다. qRT-PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다.
유전자 서열번호 프라이머 서열 (5'→ 3')
MITF 7 F TCCGTTTCTTCTGCGCTCAT
8 R CTGATGGACGATGCCCTCTC
Tyrosinase 9 F GTCCACTCACAGGGATAGCAG
10 R AGAGTCTCTGTTATGGCCGA
Tyrp-1 11 F ATGGAACGGGAGGACAAACC
12 R TCCTGACCTGGCCATTGAAC
Tyrp-2 13 F CAGTTTCCCCGAGTCTGCAT
14 R GTCTAAGGCGCCCAAGAACT
LOMIX 처리에 따른 멜라닌 생성 관련 유전자 발현량 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, α-MSH 유도에 의해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 유전자 발현이 증가하였으며, LOMIX 처리에 의해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2 유전자 발현이 농도 의존적으로 감소한다는 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 결과는, 아마씨 유래 cyclic peptide 복합체인 LOMIX가 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 생성 관련 유전자들의 발현을 억제시켜 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 6: Linusorb 처리에 따른 B16F10 cell의 세포생존율 확인
본 발명자들은 LOMIX를 구성하는 Linusorb 처리에 따른 B16F10 cell의 세포생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포독성평가를 진행하였다.
구체적으로, B16F10 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/mL의 농도로 분주하고, Linusorb CLA, CLB, CLD, CLE 및 CLF&G를 6.25, 12.5, 25 및 50 μM의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포에 10 μL의 5 mg/mL MTT 용액을 첨가하고 3시간 동안 추가 반응을 유도하였다. 반응 종료 및 포르마잔 결정 (formazan crystal) 용해를 위해 각 well에 100 μL MTT 정치 용액 (stopping solution, 10% sodium dodecyl sulfate in 0.01 M HCl)을 추가로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 포르마잔으로 환원된 양을 570 nm의 파장대에서 측정한 OD (Optical density)값을 통해 산출하였다.
Linusorb 처리에 따른 세포 생존율 측정 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, B16F10 cell에 Linusorb CLA 및 CLB를 25 μM이하의 농도에서 세포생존율이 80% 이상으로 측정되었고, 50 μM의 농도에서는 세포 생존율이 80% 미만으로 측정됨을 확인하였다. 또한, Linusorb CLD, CLE 및 CLF&G는 모든 처리군에서, 세포생존율이 80%이상으로 유지되는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, CLA 및 CLB는 최대 25 μM 농도에서 세포 생존율 80% 이상으로 유지되어 세포독성이 나타나지 않는 것을 보여준다. 또한, CLD, CLE 및 CLF&G의 경우, 최대 50 μM의 농도에서 세포 생존율 80% 이상으로 유지되어 세포독성이 나타나지 않는 것을 보여준다.
실시예 7: α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 Linusorb 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 생성량 확인
본 발명자들은 LOMIX를 구성하는 Linusorb 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 생성량을 확인하였다.
먼저, B16F10 cell을 6 well plate에 각각 1.5×105 cells/mL로 분주한 후, 100 nM의 α-MSH로 melanogenesis를 유도하였다. 곧바로 tyrosinase inhibitor로 알려진 arbutin 1 mM과 Linusorb CLA, CLB, CLD, CLE 및 CLF&G를 6.25, 12.5, 25 및 50 μM의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 후, 각 well의 배지 상층액을 100 μL씩 취하여 새로운 96 well plate에 옮겨주었다. 이후, 475 nm의 파장대에서 각각의 배지의 흡광도를 측정하여 얻어진 OD값을 통해 멜라닌 분비량을 산출하였다.
6 well plate에 남아있는 B16F10 세포의 경우, PBS로 세척한 후, scraper로 긁어내어 모아주었다. 세포 안의 멜라닌은 60℃ 조건에서 10% DMSO가 용해되어 있는 1M NaOH 용액으로 녹인 후, 이를 50 μL씩 새로운 96 well plate에 분주 후 405 nm의 파장대에서 흡광도를 측정하였다. 측정하여 얻어진 OD값을 통해 세포 내의 멜라닌 생성량을 측정하였다.
Linusorb CLA 및 CLB 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 멜라닌 생성량 측정 결과는 도 11에 나타내었으며, Linusorb CLD, CLE 및 CLF&G 처리에 따른 멜라닌 분비량 및 멜라닌 생성량 측정 결과는 도 12에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, α-MSH 유도로 증가한 멜라닌 분비량 및 생성량은 CLA 및 CLB 처리에 의해 감소함을 확인하였고, 특히 25 μM 농도의 CLA와 CLB는 arbutin 1 mM과 유사하거나 더 높은 멜라닌 생성 및 분비를 억제하는 것으로 나타났다.
도 12에 나타낸 바와 같이 α-MSH 유도된 B16F10에서 CLD와 CLE 처리 시, 멜라닌 분비량이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 반면, α-MSH 유도된 B16F10에서 CLD와 CLE 처리에 따른 멜라닌 생성량은 유의미한 억제 효과가 나타나지 않았다. 또한, CLF&G 처리시, 멜라닌 분비량 및 멜라닌 생성량의 유의미한 저해 효과가 나타나지 않은 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 아마씨 유래 cyclic peptide 복합체인 LOMIX 중 Linusorb인 CLA 및 CLB가 α-MSH에 의한 멜라닌 생성 및 분비를 저해시켜 피부 미백 효과를 나타내며 tyrosinase inhibitor로 알려진 arbutin과 유사한 효과를 가지고 있다는 것을 의미한다.
실시예 8: α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 CLA 및 CLB 처리에 따른 멜라닌 합성 관련 유전자의 발현량 확인
본 발명자들은 CLA 및 CLB의 멜라닌 합성 관련 유전자에 미치는 영향을 확인하기 위하여 α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 CLA 및 CLB 처리에 따른 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 발현량을 Quantitative real time PCR을 통해 확인하였다.
구체적으로, 배양한 B16F10에 cell 100 nM의 α-MSH로 melanogenesis를 유도하고, 곧바로 1 mM의 arbutin 및 12.5 및 25 μM의 농도로 CLA 및 CLB를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양액을 모두 걷어내고, TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 isopropanol을 첨가하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다. 세포 내 mRNA는 cDNA kit를 이용하여 cDNA로 합성하여, real time PCR을 통해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2 유전자 발현량을 확인하였다.
CLA 처리에 따른 멜라닌 생성 관련 유전자 발현량 측정 결과는 도 13에 나타내었으며, CLB 처리에 따른 멜라닌 생성 관련 유전자 발현량 측정 결과는 도 14에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, α-MSH 유도에 의해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 유전자 발현이 증가하였으며, CLA 처리는 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2 유전자 발현을 크게 억제시킨다는 것을 확인하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, α-MSH 유도에 의해 MITF, Tyrosinase, Tyrp-1 및 Tyrp-2의 유전자 발현이 증가하였으며, CLB 처리에 의해 MITF, Tyrosinase 및 Tyrp-1 유전자 발현이 농도 의존적으로 감소한다는 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 결과는, 아마씨 유래 cyclic peptide 복합체인 LOMIX의 구성성분인 CLA 및 CLB가 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 생성 관련 유전자들의 발현을 억제시켜 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 9: α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 CLA 및 CLB 처리에 따른 멜라닌 합성 기전 단백질의 발현량 확인
본 발명자들은 CLA 및 CLB의 멜라닌 합성 기전 단백질에 미치는 영향을 확인하기 위하여 α-MSH로 유도된 B16F10 cell에서 CLA 및 CLB 처리에 따른 MITF, PKA 및 CREB 발현량을 western blotting을 통해 확인하였다.
구체적으로, 배양한 B16F10에 cell 100 nM의 α-MSH로 melanogenesis를 유도하고, 곧바로 1 mM의 arbutin 및 12.5 및 25 μM의 농도로 CLA 및 CLB를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 시약인 RIPA buffer를 각각의 접시에 넣고 스크래퍼를 이용하여 긁어내어 세포 용해물을 모아주었다. BCA assay를 통해 단백질을 정량한 후, SDS-PAGE로 단백질을 크기별로 분리하였고, 크기별로 분리한 SDS-PAGE gel의 단백질을 PVDF membrane으로 옮겨주었다. 그 후, 1차 항체인 MITF 항체, p-PKA 항체, PKA 항체, p-CREB (Ser133) 항체, CREB 항체 및 β-actin 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시켜 면역염색 하였다. 1차 항체와 반응시킨 뒤, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시키고 ECL detection system을 사용하여 단백질을 검출하였다.
CLA 처리에 따른 멜라닌 합성 기전 단백질의 발현량 측정 결과는 도 15에 나타내었으며, CLB 처리에 따른 멜라닌 합성 기전 단백질의 발현량 측정 결과는 도 16에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 25 μM의 CLA 처리시, MITF 단백질의 발현량이 크게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, CLA에 의해 PKA 및 CREB의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 25 μM의 CLB 처리시, MITF 단백질의 발현량이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, CLB에 의해 CREB의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 결과는, CLA가 PKA 상위인자인 cAMP, CLB가 CREB의 상위인자인 PKA를 타겟으로 하여 CREB-pathway를 조절하며, 이를 통해 멜라닌 합성을 억제시켜 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 하기의 성분 및 함량으로 이루어지는 펩타이드 조합을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
    1% ~ 50%의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 50%의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 30%의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 40%의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 20%의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
    1% ~ 40%의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 아마씨에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 피부조직 유래 세포에서 멜라닌 생성 및 멜라닌 분비를 저해하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Tyrosinase, Tyrp-1 (tyrosinase related protein-1) 및 Tyrp-2 (tyrosinase related protein-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 멜라닌 합성 관련 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Tyrosinase, Tyrp-1 (tyrosinase related protein-1) 및 Tyrp-2 (tyrosinase related protein-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 피부조직 유래 세포에서 CREB 또는 PKA의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  9. 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 과색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 하기의 성분 및 함량으로 이루어지는 펩타이드 조합을 유효성분으로 포함하는, 약제학적 조성물.
    1% ~ 50%의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 50%의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 30%의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 40%의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    1% ~ 20%의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
    1% ~ 40%의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  12. 제9항에 있어서, 상기 과색소침착 질환은 기미, 주근깨, 피부잡티, 노인성 색소반, 일광 색소반, 임신성 갈색반, 멜라닌 피부증, 피부잡티, 점, 반점, 검버섯, 모반, 유전성대측성색소이상증, 망상지단색소침착증, 간반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소침착으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약제학적 조성물.
PCT/KR2023/004450 2022-12-28 2023-04-03 아마씨 유래 고리형 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물 WO2024143711A1 (ko)

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