KR102382937B1 - 신규 펩타이드 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 타이트닝 또는 윤곽 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드 유도체; 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물; 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물; 및 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H₂O₂에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 또는 회복 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과, L-DOPA 활성 억제 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어, 항산화, 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화방지, 자외선에 의한 피부 손상 회복, 자외선으로부터의 피부 보호 또는 피부 상태 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 펩타이드 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 타이트닝 또는 윤곽 개선용 조성물 {Novel Peptide Derivative and Composition Comprising the Same for Tightening Skin and Improving Face Line}

본 발명은 신규한 펩타이드 유도체; 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물; 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물; 및 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께, 인체 내외의 색소 함유 유무 등 여러 요인들에 의해 결정되며, 특히 멜라노사이트에서 티로시나제(tyrosinase) 등의 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소가 중요하다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 하지만, 과잉생산될 경우 색소침착 및 피부노화를 촉진하고 피부암 유발에도 주요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해, 종래에는 아스코르빈산(ascorbic acid), 코지산, 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hudroquinone), 글루타치온(glutathione), 티로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하였다. 그러나, 이들은 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

또한, 최근 환경오염으로 인한 자외선 양의 증가, 서구화된 생활습관, 스트레스 등 피부건강을 위협하는 요인들이 증가하고 있다. 이들은 피부 오염, 건조, 트러블, 피부면역체계 이상 등을 유발하며, 결국 피부염, 거칠음, 급격한 노화 등을 야기한다.

특히, 체내 활성 산소종의 농도를 증가시키고, 이러한 활성 산소종은 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등을 공격하여 과산화 반응을 일으킴으로써 피부의 노화를 촉진하는 문제가 있다. 이에 따라, 활성 산소종의 생성을 억제하는 항산화 효과, 이를 통한 항노화(피부 노화 방지) 효과를 가지는 화장료 조성물에 대한 개발이 요구되고 있다.

현재, 피부 탄력 증진, 노화 방지 및 주름 개선 화장료로는 레티놀, 아데노신, 클로렐라 추출물 등이 알려져 있다. 레티놀은 콜라겐 합성을 촉진하며 엘라스타제 효소를 저해하는 물질이지만, 불안정하고 피부 적용시 자극, 발진 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 보습 효과가 미미하여 실질적으로 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과를 기대하기가 어렵다고 알려져 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항산화, 항노화, 항주름, 미백 등 피부 상태를 개선시킬 수 있는 신규한 기능성 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 펩타이드를 사용한 신규 유도체를 제조하고, 이렇게 제조된 펩타이드 유도체가 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H₂O₂에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과, L-DOPA 활성 억제 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어, 피부 상태 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0020623호

본 발명의 목적은 신규한 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체를 제공한다.

본 발명의 용어 "펩타이드"는 단백질 구성 요소인 아미노산이 2개 이상 결합된 단백질 기능을 가진 최소 단위를 말하며, 일반적으로 단백질의 기본 성분인 아미노산이 50개 이하로 결합되어 있는 올리고펩타이드를 일컫으며 단백질처럼 독특한 생물학적 활성을 보이는 생체 유래 물질을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "펩타이드"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 용어 "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO₂, ONOO^-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포 들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다. 또한, 상기　항산화는 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼 (free radical) 또는 활성 산소종 (Reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 기능을 의미하며, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명의 용어 "개선"은 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 사용하여 피부 상태가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 탄력 유지, 자외선으로부터의 피부 손상 예방, 자외선으로부터의 피부 보호, 산화 독성으로부터의 피부 세포 보호를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "피부 재생"은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대해 피부 조직의 회복 과정을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부적 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "피부 미백"은 피부에 멜라닌 세포가 증가하고 그로 인해 피부에 멜라닌 색소가 과도하게 침착되는 것을 방지하거나, 기존에 침착된 멜라닌 색소를 엷게 하는 기능을 일컫는다. 이에 따라, 과도한 멜라닌 색소의 침착으로 생기는 기미나 주근깨의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 용어 "주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하므로, 이를 분비하는 엘라스타아제 및/또는 콜라게나아제 활성의 억제 효과를 가지는 경우 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 노화 방지"는 시간이 흐름에 따라 신체의 생리적 변화가 발생하여 나타나는 자연적 노화인 연대학적 노화(내인성 노화)와 햇빛에 노출되는 부위에서 발생하는 광노화(광인성 노화)를 예방 또는 지연시키는 것 모두를 의미한다. 피부 노화를 억제하기 위해서는 피부를 외부의 유해환경으로부터 보호해야 함은 물론 피부세포를 활성화시켜 콜라겐, 엘라스틴 등의 생체 합성 단백질의 합성을 촉진함으로써 주름의 형성을 최대한 억제시켜야 한다. 특히 피부의 구조 중에서 진피층에는 교원섬유인 콜라겐과 탄력섬유인 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 엘라스틴이 분해효소인 엘라스타아제(elastase)에 의해 분해되면서 피부가 쳐지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 따라서, 피부노화의 주 원인 중 하나인 엘라스틴의 분해를 억제하여 피부노화를 억제할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 햇빛에 포함된 280nm 내지 40nm 파장의 빛에 의하여 피부 세포의 광노화가 진행될 수 있다. 그 중에서도 특히 280nm 내지 320nm 범위의 파장을 갖는 UV-B와 같은 자외선의 조사에 의하여 피부나 섬유의 손상이 발생할 수 있으며 피부가 까맣게 타는 그을음 현상이 발생할 수 있다. UV-B가 조사되면 피부 세포 내의 활성 산소(예: H₂O₂) 및 자유 라디칼의 축적이 촉진되며, 라디칼에 의해 세포 내 신호전달 체계를 자극하여 DNA, 단백질, 지질과 같은 생체 분자에 산화적 스트레스를 유발할 수 있고, 이로 인하여 피부 조직의 손상이 발생될 수 있다. 피부 세포의 산화적 스트레스가 증가하면, 표피의 각질세포나 진피의 섬유아세포에 자극이 발생하고 일련의 세포 내 신호 전달 과정을 거쳐 콜라겐 분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)와 같은 유전자의 발현이 증가될 수 있고, 피부의 주요 구성성분으로 진피의 90%를 차지하며 피부에 강도, 장력을 부여해 외부 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 콜라겐(collagen)의 감소가 유발되어, 이에 따라 피부의 노화나 주름이 형성될 수 있다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 세포증식 촉진 활성에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로 인간 각질형성세포의 증식 촉진 또는 섬유아세포의 증식 촉진일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 활성 산소에 의한 세포 손상의 회복에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로 활성 산소는 과산화수소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 UV-B 자외선에 의한 세포 손상의 회복에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 멜라닌 합성 억제 활성에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 L-DOPA 또는 티로시나제의 활성 저해에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항산화, 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선 효과를 가지는 한, 상기 펩타이드 유도체를 다양한 함량으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 펩타이드 유도체 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 화장료 조성물에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 실험예에서 상기 펩타이드 유도체는 각질형성세포 증식을 유도하고(도 4 및 도 5), 상처를 재생시키며(도 6), H₂O₂에 의한 세포 손상을 회복시키고(도 7), 자외선으로부터 세포를 보호하며(도 8), 섬유아세포 증식을 유도하여(도 9 및 도 10) 피부 재생, 주름 개선 및 피부 노화 방지 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 발명의 실험예에서 상기 펩타이드 유도체는 멜라닌 합성을 억제하고(도 11 및 도 12) L-DOPA 및 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어(도 13 내지 도 15), 미백 효과를 나타냄을 확인하였다. 추가적으로, 본 발명의 실험예에서 상기 펩타이드 유도체는 항산화 활성(도 16)을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 항산화 및 피부 상태 개선용으로 사용할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 의약외품을 제공한다.

상기 "펩타이드", "유효성분", "항산화" 및 "개선"은 전술한 바와 같다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 탄력 유지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "피부 재생", "피부 미백", "주름 개선" 및 "피부 노화 방지"는 전술한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 광노화는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면　의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 발명의　의약외품　조성물은 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 필터충진제의 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 의약외품　첨가물로 사용할 경우, 상기 펩타이드 유도체를 그대로 첨가하거나 다른　의약외품　또는　의약외품　성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 "펩타이드", "유효성분" 및 "항산화"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "피부 상처" 및 "피부 흉터"는 피부조직의 콜라겐 총량 증가로 인하여 치료할 수 있는 모든 질환을 의미한다. 상기　피부　상처 및 피부　흉터의 비제한적인 예로 찰과상, 찰과상에 의해 야기되는 흉터 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 색소 침착"은 멜라닌의 생성 증가로 인한　피부　색소 침착으로 유발되는 모든 질환을 의미한다. 상기　피부　색소 침착 질환의 비제한적인 예로 기미, 주근깨, 반점, 일광 색소반, 약물 사용 후의 색소 침착, 염증 후의 색소 침착, 임신성 색소 침착 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 상기 펩타이드 유도체를 개체에 투여 또는 도포하여 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착의 피부 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 상기 펩타이드 유도체를 개체에 투여 또는 도포하여 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착의 피부 질환이 호전 또는 완화되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실 리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H₂O₂에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 또는 회복 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과, L-DOPA 활성 억제 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어, 항산화, 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화방지 또는 피부 상태 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 펩타이드 유도체를 합성한 후 실시한 HPLC 정제 결과이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드 유도체의 분자량 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드 유도체의 최종 HPLC 정제 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 인간 각질형성세포 증식 효과를 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 인간 각질형성세포의 세포증식률을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 상처재생효과를 확인한 현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 H₂O₂에 의한 세포 손상으로부터의 세포회복률을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 자외선으로부터의 세포회복률을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 섬유아세포 증식 효과를 확인한 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 섬유아세포 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 멜라닌 생합성 억제효과를 육안으로 확인할 수 있는 사진이다.
도 12는 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 멜라닌 합성률을 나타낸 그래프이다.
도 13 및 도 14는 DMAE, TP-1, 알부틴 및 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 L-DOPA 활성 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 15는 DMAE, TP-1 및 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 티로시나제 활성 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 16은 DMAE, TP-1 및 본 발명의 펩타이드 유도체 처리에 따른 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규 펩타이드 유도체 제조

실시예 1-1: 신규 펩타이드 유도체 합성

글리신, 히스티딘 및 리신 3가지 아미노산을 C-term에서 N-term으로 합성하기 위해, 고체상 합성법으로 진행하였다. 먼저 Fmoc으로 아마이드기가 보호된 K(리신)을 레진에 결합시킨 후, 20% 피페리딘으로 Fmoc을 제거하였다. DMF(Dimethylformamide)를 이용하여 충분히 세척한 후, 두 번째 아미노산인 Fmoc-H(히스티딘)을 결합시켰다. 위와 같은 방법으로 20% 피페리딘을 사용해 Fmoc을 제거 한 후, 마지막 세 번째 아미노산인 G(글리신)을 결합시켰다. 세 개의 아미노산을 모두 붙인 펩타이드에 2% TFA(대정화금, Triflouroacetic acid, Cat. No: 8558-4400)를 처리하여, 레진에서 펩타이드를 분리시켰다. 이후 N,N-디메틸에틸렌디아민(Alfa Aesaor,CAS No. 108-00-9)과 합성된 상기 펩타이드를 용액상에서 반응시켜, 최종적으로 하기와 같은 구조의 신규한 펩타이드 유도체(화학식 1)를 합성하였다.

[화학식 1]

실시예 1-2: 합성된 상기 펩타이드 유도체 정제

실시예 1-1에서 합성된 펩타이드 유도체의 다양한 유효성 테스트를 위하여 HPLC로 높은 순도의 정제를 진행하였다. 합성된 펩타이드 유도체를 물에 녹인 후 0.4um의 필터로 필터한 후, RP-HPLC (Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatogrphy)로 분석하여 펩타이드 유도체의 분석 피크를 확인하였다(도 1).

여러 피크 중 합성된 펩타이드 유도체가 어떤 피크인지 확인하기 위하여 각 피크를 프렙하여 분자량을 분석한 결과, 4분대의 피크가 분자량이 411.0으로 나타나 원하는 펩타이드 유도체임을 확인할 수 있었다(도 2).

RP-HPLC로 해당 피크만을 프렙하여 최종 93%의 펩타이드 유도체를 정제하였다(도 3). 정제조건으로는 A상은 0.1% TFA가 함유된 H2O, B상은 0.1%가 함유된 아세토나이트릴을 사용하였으며, B용매 기준으로 5%에서 35%(15분)로 진행하였다

실험예 1: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 각질형성세포 증식 유도 활성 확인

실험예 1-1: 인간 각질형성세포 배양

인간 각질형성 세포인 HaCaT 세포주를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신을 처리하여 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 10³ cells/cm²으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum (FBS), GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark), 세포 독성 시험을 위해 24 웰 플레이트(NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)를 사용하였다.

실험예 1-2: 인간 각질형성세포에 대한 독성 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 장기간 사용 시에도 피부자극 없이 개선 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포에 대한 세포 독성 유무를 관찰하였다.

상기 실험예 1-1에서 배양된 인간 각질형성세포를 hemacytometer를 사용하여 96 well plate에 5 X 10³ cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 인간 각질형성세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 내지 30%만큼 배양되면, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체(1.25uM, 2.5uM, 5uM 및 10uM)가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/ml)을 50 ul 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul씩 처리하여 교반하였다. 각 well에서 100 ul씩 취하여 540 nm에서 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 실시하여 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 하기 수학식 1로 계산하였고, 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

세포증식률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 4, 도 5 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 처리한 경우, 최대 109.78%의 세포증식률을 나타내었고, 무처리군에 비해 각질형성세포의 세포증식률이 증가함을 확인하였다.

펩타이드 유도체(uM)	0	0.625	1.25	2.5	5	10
세포증식률 (%)	100	102.45	105.27	105.67	109.78	105.54

이러한 결과로부터 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 인간 각질형성세포의 증식을 유도하고, 장기간 사용에도 세포독성에 의한 피부자극을 유발하지 않음을 확인하였다.

실험예 2: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 상처 재생 효과 확인

인간 각질형성세포주를 사용하여 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 상처 재생 효과를 조사하였다.

인간 각질형성세포주를 6 well plate에 2 X 10⁵ cells/well 씩 동일하게 hemocytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 90 내지 100%만큼 배양되면, 각 세포에 날카로운 도구를 활용하여 십자형의 상처를 냈다. 그 후, FBS-free DMEM에 20uM의 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 함유된 배양배지로 교체하여 24시간 동안 배양하고, 현미경을 통하여 상처 재생 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 처리한 실험군에서 상처 재생능이 대조군(무처리군)에 비해 현저하게 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 피부 재생 및 피부 상태를 개선할 수 있는 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 3: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 H ₂ O ₂ 에 의한 세포 손상 회복 효과 확인

대표적인 활성산소인 H₂O₂가 유발하는 산화적 스트레스에 의한 세포 손상으로부터 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 세포 회복 효과를 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포 세포주 HaCaT를 사용하여 실험을 실시하였다.

인간 각질형성세포주를 24 well plate에 3 X 10⁴ cells/well씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 80 내지 90%만큼 배양되면, 2.5uM, 5uM, 10uM 및 20uM의 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 함유된 배양배지와 1.5mM H₂O₂를 처리한 후 12시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 20 μL 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 500 μL 의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well에 처리하여 교반한 후, 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포회복률은 하기 수학식 2를 사용하여, 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 2]

세포회복률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 7 및 표 2에 나타낸 바와 같이, H₂O₂만을 처리하였을 때는 세포회복률이 45% 미만이였으나, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 처리한 실험군에서는 세포회복률이 대조군에 비해 높게 관찰되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 산화 독성으로부터 세포를 보호할 뿐만 아니라, H₂O₂에 의한 세포 손상으로부터 세포 회복을 극대화 시킴을 확인할 수 있었다.

펩타이드 유도체 (uM)	0	2.5	5	10	20
H2O2 처리	+	+	+	+	+
세포회복률 (%)	42.47	46.42	52.48	61.06	64.60

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 산화 독성 또는 산화적 스트레스로 유발되는 세포 손상을 억제 및 회복시키고, 피부 상태를 개선할 수 있는 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 4: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 자외선으로부터의 세포 보호 효과 확인

자외선에 의한 피부 손상으로부터 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 세포 보호 효과를 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포 세포주 HaCaT를 사용하여 실험을 실시하였다.

인간 각질형성세포주를 6 well plate에 2 X 10⁵cells/well씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 인간 각질형성세포주를 20uM의 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 함유된 10% FBS DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 80 내지 90%만큼 배양되면, 20mJ UV-B를 처리하고 12시간을 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 20 μL 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 1 mL 의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well에 처리하여 교반한 후 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포회복율은 수학식 3을 사용하여, 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 3]

UV-B 손상에 의한 세포회복율(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 8 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 처리한 군은 UV-B만을 처리한 군에 비하여 현저히 뛰어난 세포 회복 효과를 나타내었다.

펩타이드 유도체 (uM)	0	20
세포회복율 (%)	0	45.27

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보호 및 손상으로부터의 회복 효과를 갖는 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 5: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 섬유아세포 증식능 확인

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 섬유아세포 증식능을 확인하기 위하여, 섬유아세포주를 이용한 MTT 시험을 실시하였다.

실험예 5-1: 섬유아세포 세포 배양

섬유아세포 CCD986-SK 세포주를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 X 10³ cells/cm²으로 계대배양하였다. 세포 배양에는 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대배양을 위하여 75 T-플라스크(NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)를 사용하였으며, 섬유아세포 증식능 관련 실험을 위해서는 96 well plate (NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)를 사용하였다.

실험예 5-2: 섬유아세포 증식능 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 장기간 사용 시에도 자극 없이 피부 개선 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 섬유아세포에 대한 세포 증식효과를 조사하였다.

실험예 5-1에서 배양된 CCD986-SK 세포를 96 well plate에 5 X 10³ cells/well씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 25 내지 30%만큼 배양되면, 1.25uM, 2.5uM, 5uM, 10uM 및 20uM의 본 발명에 따른 펩타이드 유도체로 교체하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul 처리하여 교반한 후, 100 ul씩 96 well로 취하여 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 수학식 1을 사용하여 계산하였고, 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

세포증식률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 9, 도 10 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리군은 대조군(무처리군)에 비하여 우수한 세포증식률을 나타내었다.

펩타이드 유도체 (uM)	0	1.25	2.5	5	10	20
세포증식률 (%)	100	110.58	116.01	116.68	113.70	110.67

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 섬유아세포 증식을 촉진하는 효과를 확인한바, 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 6: 멜라닌 세포를 이용한 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 피부 미백 효과 확인

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 피부 미백 효과를 확인하기 위하여, 멜라닌 합성에 관한 실험을 실시하였다.

실험예 6-1: B16F10 멜라닌 세포 배양

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 미백활성을 확인하기 위하여, 멜라닌을 형성하는 피부구성세포인 B16F10 세포주를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 X 10³ cells/cm²으로 계대배양하였다. 세포 배양에는 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, Cat. No.,26140-079, USA), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No.11995-065, USA)을 사용하였다. 계대배양을 위하여 75 T-플라스크(NUNC, Cat. No.156499, Danmark)가 사용되었으며, 미백효능 관련 실험을 위해 6 well plate(NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)가 사용되었다.

실험예 6-2: B16F10 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생합성 억제 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 B16F10 세포주에 처리하고, 세포 배양 중 생성되는 멜라닌의 생합성 양을 측정하였다.

6 well plate에 B16F10 세포주를 1 X 10⁵ cells/well씩 분주하고, 배양액 내 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 7.5mM 처리하였다. 그 후, 멜라닌 생합성을 유도하기 위하여, 10 uM α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone)를 처리하고 72시간 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 각 웰의 배지 제거 후, PBS로 세척하고 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 e-tube에 옮겼다. 4℃, 12000 rpm으로 10분 동안 세포를 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 500ul 첨가하였다. 50℃에서 30분간 배양하여 세포 내에 형성된 멜라노마 세포를 완전히 녹인 후, 150 ul씩 취해 96 웰 플레이트에 분주하고 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수학식 4를 사용하여 멜라닌 합성률을 백분율로 나타내어 미백 활성을 평가하였다.

[수학식 4]

멜라닌 합성률 (%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 처리하였을 때 반응물의 색깔이 가장 밝은색을 띄는바, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 멜라닌의 생합성을 현저히 억제하였음을 육안으로도 확인할 수 있었다.

또한, 도 12및 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 처리군은 α-MSH를 처리하지 않은 대조군과 유사한 멜라닌 합성률인 104.59%를 나타냈고, α-MSH를 처리한 대조군 대비 멜라닌 생합성을 현저히 억제하였다.

펩타이드 유도체 (mM)	0	0	7.5
α-MSH 처리	-	+	+
멜라닌 합성률 (%)	100	251.74	104.59

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 α-MSH에 의한 세포내 멜라닌 생합성을 현저하게 억제하는 것을 확인한바, 피부 미백 활성을 갖는 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 7: 티로시나제를 이용한 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 피부 미백 활성 확인

본 발명에 따른 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 미백 활성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 티로시나제 효소를 미용한 미백 효능 측정 시험을 하였다. 티로시나제는 멜라닌 합성 과정중 티로신을 L-DOPA로 전환하고, 도파퀴논(Dopaquinone)을 형성하도록 L-DOPA를 산화시킨다. 본 발명에 따른 펩타이드 유도체가 멜라닌 합성 과정 중 어떤 단계에서 멜라닌 생합성에 관여하는지 확인하였다.

실험예 7-1: L-도파(L-DOPA)를 이용한 티로시나제 활성 측정 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 미백 활성을 확인하기 위하여, 멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 티로시나제 DOPA 산화반응에 대한 활성 저해능 확인 실험을 실시하였다.

먼저, e-tube에 2000 unit/ml 티로시나제(Tyrosinase from mushroom, sigma T3824, USA) 용액 50ul, 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.8) 800ul, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 농도별(0.46895mM, 0.9375mM, 1.875mM, 3.75mM, 7.5mM, 15mM 및 30mM)로 100 ul을 첨가한 후 37℃에서 6분 동안 전 반응시켰다. 이후, 6mM L-DOPA(기질) 용액을 각각 50 ul 첨가한 후 1분 간 37℃에서 반응시켰다. 반응 종료 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 알부틴을 같은 농도로 사용하였다. 음성 대조군으로는 시료 대신 0.1M 인산염완충액(pH7.0)을 넣었다. L-DOPA 활성 억제능은 수학식 5를 사용하여 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 5]

L-DOPA 활성 억제능(%)={100-(시료의 흡광도/대조군의 흡광도)}×100

그 결과, 도 13 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 L-DOPA 활성 억제율은 상기 펩타이드 유도체의 농도가 높을수록 증가하는 추세로 나타났다.

아울러, 도 14 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 30mM 처리군에서 L-DOPA 활성 억제율은 66.82%로, 미백 기능성 원료로 사용되고 있는 알부틴 30mM 처리군의 L-DOPA 활성 억제율인 61.02%보다 높게 측정되어, 미백 활성이 더욱 우수함을 확인하였다.

펩타이드 유도체	L-DOPA 활성 억제율 (%)
30 mM	66.82
15 mM	53.98
7.5 mM	36.36
3.75 mM	25.11
1.875 mM	14.20
0.9375 mM	7.61
0.46895 mM	3.98

L-DOPA 활성 억제율 (%)	알부틴	펩타이드 유도체
30 mM	61.02	66.82

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 L-DOPA 활성을 억제하여 미백 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 같은 농도의 알부틴보다 뛰어난 L-DOPA 활성 억제 효과를 나타낸바, 현저히 우수한 미백 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 7-2: L-티로신(L-tyrosine)를 이용한 티로시나제 활성 측정 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 미백 활성을 확인하기 위하여, 멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 티로시나제 활성 저해능 확인 실험을 실시하였다.

2000 unit/ml 티로시나제 용액 14ul, 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 140ul, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 20 ul 및 1.5 mM L-티로신(기질) 26ul을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 알부틴을 같은 농도로 사용하였다. 음성 대조군으로는 시료 대신 0.1M 인산염완충액(pH7.0)을 넣었다. 티로시나제 활성 억제능은 수학식 6을 사용하여 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 6]

티로시나제 활성 억제능(%)={100-(시료의 흡광도/대조군의 흡광도)}×100

그 결과, 도 15 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 티로시나제 활성 억제율은 상기 펩타이드 유도체의 농도가 높을수록 증가하는 추세로 나타났다.

펩타이드 유도체	티로시나제 활성 억제율 (%)
30 mM	59.74
15 mM	44.97
7.5 mM	27.41
3.75 mM	14.99
1.875 mM	6.21
0.9375 mM	2.57
0.46895 mM	1.07

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 티로시나제 활성을 억제하여 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 8: 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 DPPH 항산화 활성 확인

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 항산화 활성을 확인하기 위하여, 안정한 자유 라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계로 측정해 간접적으로 시료의 항산화 활성을 측정하였다.

본 발명에 따른 펩타이드 유도체 20ul와 0.1mM DPPH 용액 180ul을 첨가하여 교반한 후, 4℃에서 30분 동안 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료 대신 에탄올을 첨가한 것을 대조군으로 사용하였다. 항산화 활성은 수학식 7을 사용하여 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 7]

항산화 활성(%)={100-(샘플의 흡광도/대조군의 흡광도)}×100

그 결과, 도 16 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 항산화 활성이 관찰되었다.

펩타이드 유도체	항산화 활성(%)
30 mM	59.74
15 mM	44.97
7.5 mM	27.41
0 mM	0

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체는 항산화 활성을 나타내므로, 항산화 또는 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 유도체:
   [화학식 1]
   

   

   .
2. 제1항의 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지, 자외선에 의한 피부 손상 회복, 자외선으로부터의 피부 보호 또는 피부 탄력 유지인, 화장료 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 피부 상태 개선은 멜라닌 합성 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
5. 제2항에 있어서,
   상기 피부 상태 개선은 L-DOPA 또는 티로시나제의 활성 저해에 의한 것인, 화장료 조성물.
6. 제2항에 있어서,
   상기 피부 상태 개선은 활성 산소로 인한 세포 손상 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
7. 제1항의 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약외품 조성물.
8. 삭제
9. 제1항의 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.

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