KR20090078202A

KR20090078202A - 트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제

Info

Publication number: KR20090078202A
Application number: KR1020080004027A
Authority: KR
Inventors: 강윤아; 권선방; 김경민; 변장웅; 유선종; 최혜령
Original assignee: 주식회사 웰스킨; 주식회사 비드테크
Priority date: 2008-01-14
Filing date: 2008-01-14
Publication date: 2009-07-17

Abstract

본 발명은 트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 피부 기저막 재생효과가 있고 피부 표피세포의 증식능력을 지속시키는 피부 노화방지제 및 이를 포함하는 피부 노화방지 화장품 조성물과 인공피부 배양액 첨가제에 대한 것이다.

트리펩티드

Description

트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제{Skin Antiaging Agent Comprising Tripeptide}

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 구성되어 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평 상피로서 내측으로부터 기저층(basal layer), 유극층(spinous layer), 과립층(granular layer), 각질층(horny layer) 순의 4개 층으로 구분된다. 즉, 각질형성세포가 기저층에서 분열한 후 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계로 분화함에 따라 형태가 변하게 된다.

또한 표피와 진피의 경계부를 기저막대(basement membrane zone) 라고 하며 기저세포의 원형질막과 반교소체(hemidesmosome), 원형질막 아래의 투명판(lamina lucida), 그 아래의 기저판(lamina densa, basement membrane), 기저세포 원형질막과 기저판을 연결하는 고정 세섬유(anchoring filament) 및 기저판과 연결되는 섬 유 성분으로 구성된다. 이 섬유 성분들은 기저막의 구조를 이루면서 표피와 진피를 연결하는 역할을 한다.

인티그린(integrin)은 반교소체를 구성하는 막단백질로서 기저세포와 기저막을 연결하는 매듭 역할을 함으로써 표피와 진피 사이의 결합을 조절한다.

현재 개발되어 있는 인공피부 모델 배양방법 가운데 대표적인 예는 섬유모세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)이다(Bell E et al, J Invest Dermatol.　1983;81:2s-10s).

인공피부 배양방법이 발전함에 따라 인공피부는 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부와 상당히 유사해 졌으며(Asselineau D et al, J Invest Dermatol.　 1986;86:181-186; Ponec M.　 Toxicol in Vitro.　 1991;5:597-606; Ponec M et al, J Invest Dermatol.　1997;109:348-355), 이를 이용하여 동물실험을 대체하려는 시도가 진행되고 있다.

구리-트리펩티드 특히, Cu-GHK는 오래전부터 콜라겐 생성 효능이 알려져 왔다. 이미 20여 년 전 Cu-GHK는 섬유모세포의 의한 콜라겐 생산을 증가시킨다고 보고되었으며(Maquart FX, Pickart L, Laurent M et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu²⁺. FEBS Letter 238:2;343-46, 1988), 또한 섬유모세포에 의 한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 합성과 분비도 촉진시킨다고 보고되었다(Wegrowski Y, Maquart FX, Borel JP. Stimulation of sulfated glycosaminoglycan synthesis by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu² ⁺. Life Sci, 1992:51:1049-56).

이러한 효능에 근거하여 구리-트리펩티드는 피부재생 제품에 사용 해왔으며 최근에는 양모효과도 있는 것으로 알려지고 있다(Pyo HK, Yoo HG, Won CH et al. The effect of tripeptide-copper complex on human hair growth in vitrol. Arch Pharm Res, 2007:30(7):834-39). 근래에도 구리-GHK 펩티드에 대한 연구는 계속되고 있는데 최근 LED와의 복합사용에 의해 콜라겐 생산이 증가된다는 보고(Huang PJ, Huang YC, Su MF et al. In vitro observations on the influence of copper peptide aids for the LED photoirradiation of fibroblasts collagen synthesis. Photomed Laser Surg 2007:25:183-190) 등은 구리-GHK 펩티드가 더욱 다양하게 사용될 가능성이 있음을 제시하고 있다.

이러한 효능에 근거하여 구리-펩티드(GHK, AHK, VHK) 는 다양한 목적으로 효능이 제기되고 있는데 콜라겐 생성효과와 연조직 충전물을 조합하여 조직 결함부을 메워주는 효과를 기대할 수 있을 것이며(10-2004-7021717, 펩티드 구리 착화합물 및 연조직 충전제를 함유하는 조성물, 프로사이트 코포레이션), 메탈로프로테이나제 억제제와 조합하면 단백질 생성을 촉진하여 상처와 뼈 치유를 촉진시키는 효과도 기대할 수 있을 것이다(10-2005-7008121, 펩타이드 구리 착화물 및 메탈로프로 테이나제 억제제를 포함하는 조성물 및 이와 관련된 방법, 프로사이트 코포레이션).

또한 콜라겐 생성효과가 알려진 레티놀과의 조합에 의한 피부노화치료제 (10-2004-7004959, 펩타이드 구리 착물 및 레티놀, 레티놀 유도체 또는 이들의 혼합물을 함유하는 피부 보호 조성물, 프로사이트 코포레이션) 로서의 효능도 기대할 수 있을 것이다.

이와 같이 이들 펩티드들은 섬유모세포에 대한 효과가 잘 알려져 있지만 피부세포인 keratinocyte에 대한 효과는 별로 알려진 바 없다.

본 발명자들은 이렇게 다양한 효능의 구리-GHK 펩티드를 포함한 여러 종류의 펩티드를 사용하여 인공피부 모델을 이용하여 실험을 시행한 결과 구리-GHK를 포함한 GHK, AHK 펩티드 들은 앞서 기술된 효능 외에도 인공피부 배양시 기저막의 형성을 크게 촉진시키고 표피 기저층에 존재하는 표피줄기세포의 증식능도 효과적으로 유지시킨다는 사실을 확인하였으며 또한 이러한 효과는 구리가 없는 펩티드에서도 발견되어 이 발명을 완성하게 되었다.

피부는 노화됨에 따라 여러가지 변화가 일어난다. 기저막은 표피와 진피를 경계하는 구조물로써 나이가 들어감에 따라 기저막의 두께가 얇아진다는 사실이 알려져 있으며(Vazquez F, Palacios S, Aleman N et al. Changes of the basement membrane and type IV collagen in human skin during aging. Maturitas. 25(3):209-215, 1996), 그 결과로 외상에 취약해 진다.

본 발명자들은 구리-GHK 등의 펩티드들은 인공피부 배양시 인티그린 발현을 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 따라서 노화된 피부에 이들 펩티드를 도포하면 얇아지고 취약해진 표피 진피 경계부의 결합력을 강화함으로써 피부의 탄력을 회복시키고 외상에 강하게 하는 효과가 있다.

또한 피부는 계속 분열하는 조직으로 약 3-4주를 한 주기로 반복 재생되는 것으로 알려져 있으며 나이가 들어감에 따라 피부재생능력이 감소한다는 사실은 매우 잘 알려져 있다. 따라서 피부의 성체줄기세포는 활발한 증식능을 유지할 수 있어야 건강하고 상처가 잘 낫는 피부를 유지할 수 있을 것이다.

PCNA는 증식하는 모든 세포에서 발현하는 증식표식자이며, p63는 표피의 줄기세포 표식자로 간주되는 표식자이다. 상기 두 가지 표식자에 대한 연구에서 구리-GHK 등의 펩티드를 처리한 경우 염색되는 세포의 수가 처리하지 않은 군과 비교하여 크게 증가한 결과를 보였다. 따라서 구리-GHK를 포함하는 펩티드 들은 표피세포의 증식능을 유지시켜 건강하고 상처가 잘 치유되는 피부를 유지할 수 있게 해 주리라 기대된다.

또한 최근 연구에 의하면 줄기세포 표식자인 p63은 기저막의 발현을 증가시켜 피부세포사망을 억제해 준다고 보고되어, 본 발명자들이 관찰한 소견과 잘 부합되는 결과를 얻을 수 있었다(Okuyama R, Ogawa E, Nagoshi H et al. p53 homologue, p51/p63, maintains the immaturity of keratinocyte stem cells by inhibiting Notch1 activity. Oncogene. 2007:26:4478-4488).

본 발명의 기본적인 목적은 피부 기저막 재생효과 및 지속적인 피부 표피세포의 증식능력을 나타내는 트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 기저막 재생효과 및 지속적인 피부 표피세포의 증식능력을 나타내는 트리펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 노화방지 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명에서 트리펩티드란 아미노산 3개가 결합된 펩티드로서, 바람직하게는 Cu-GHK, GHK 또는 AHK로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 트리펩티드는 인티그린의 발현 및 PCNA/p63 양성세포를 증가시켜 기저층 세포의 증식을 장시간 활성화시킨다. 따라서 기저막의 형성을 촉진하고 피부 표피세포의 성장과 분열능을 유지시켜 피부의 노화를 방지하고 상처가 잘 낫도록 한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 트리펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화 장품 기제를 포함하는 피부 노화방지 화장품 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 트리펩티드는 바람직하게는 Cu-GHK, GHK 또는 AHK로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 화장품 조성물은 상기 트리펩티드를 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함하며, 화장수, 유액, 크림, 팩 또는 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로서 제조된다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 트리펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 트리펩티드가 인티그린의 발현 및 PCNA/p63 양성세포를 증가시켜 기저층 세포의 증식을 장시간 활성화시키는 작용을 이용하여 상기 트리펩티드를 인공피부 배양액의 첨가제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 트리펩티드는 인티그린 생성을 촉진하여 피부 기저막 재생효과가 있으며 피부 표피세포의 증식능을 지속하여 피부를 젊게 유지할 수 있으며 상처가 잘 낫게 한다.

이하 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그 러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1: 섬유아세포와 각질형성세포의 배양

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하였다. 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거 후 잘게 절개하여 터르모라이신(thermolysin, 열분해소) 용액에서 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하여 각각을 트립신용액에 담아 37℃에서 15분 반응 후 단일 세포로 분리되도록 진탕하였다.　배양은 '레인왈드와 그린(Rheinwald and Green) 방법'(Cell, 1975)을 따라 수행하였다. 분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% 소의 혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유아세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하였다.

실시예 2: 진피 대응물의 제조

진피보형물은 쥐꼬리로부터 분리 채취한 콜라겐 10 g을 4℃의 1/1000 빙초산(glacial acetic acid) 용액 1000 mL에 48시간동안 교반하여 녹인 I형 콜라겐 용 액과 10 × DMEM과 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1 (부피비)로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다.　 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL를 밀리셀(millicell)에 나누어 넣고, 각 밀리셀 당 섬유아세포 5×10⁵개를 첨가하여 혼합하였다.　 그리고 나서, 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀에 3.5 ml씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 굳히는 과정으로 진피 대응물을 제조하였다

실시예 3: 인공피부의 구축

상기 실시예 2에서 제조된 진피 대응물 6 cm² 위에 1×10⁶ 개의 각질형성세포를 접종하고, 1일간 배지 침지시켜 배양한 다음 다시 12일간 공기에 노출시켜 배양하였다. 이 때, 배양 온도는 37℃로 하였다. 상기 배지는 5% FBS, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산 및 5 mg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다.　 1일간 침지 배양시에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen, carlsbad, CA, 1 ng/ml)를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양시에는 고농도 EGF (10 ng/ml)를 첨가하였다.　 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 상기 실험은 동일조건으로 최소 2번 반복 실시하였다. 이러한 기본 조건에 ascorbic acid (100 μM, Sigma, St Louis, USA)가 첨가되었으며 그 외 실험조건에는 AHK, GHK, Cu-GHK 가운데 한가지 종류의 펩티드를 (10 μM, Beadteck, Seoul, Korea) 각각의 조건에 맞도록 첨가하였다. 배양 후, 얻어진 조직을 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/chloroform/acetic acid 6:3:1)으로 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하여, 헤마톡실린 및 에오신 염색하였다(Sigma chemical, St. Louis, USA).　 상기 염색 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 4: 면역조직화학 염색

면역조직화학 염색의 일차항체로서 PCNA, p63, alpha 6 integrin, beta 1 integrin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 이용하였다.　 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (avidin-biotin-peroxidase complex techniques)을 사용하여 수행하였다.　배양 이주 후 시행한 면역조직화학염색에서 PCNA와 p63의 발현양상을 비교해 보았다. 면역조직화학염색에 사용한 PCNA는 증식하는 세포에서 발현하는 특성이 있으며, p63는 표피세포에서 줄기세포 표지자로 알려져 있다.

도 3에 나타난 바와 같이, 대조 모델에 비하여 펩티드를 첨가한 인공피부에서 PCNA와 p63 양성세포가 많이 발견되어 실험에 사용한 펩티드는 기저층 세포의 증식능을 오래 유지시켜 준다는 사실을 알 수 있었다. 또한 기저막의 주성분인 ㅇ알파 6 인티그린(alpha 6 integrin)과 베타 1 인티그린(beta 1 integrin)에 대해서도 염색을 시행해 보았다. 실험결과 역시 대조 모델에 비하여 기저막 부위에 위치하는 인티그린의 발현이 크게 증가한 사실을 보여주었다.

결론적으로 실험에 사용한 펩티드 가운데 한 가지를 피부에 도포하면 피부를 튼튼하게 하고 세포를 젊게 오래 유지할 수 있으며 상처가 빨리 낫는 효과를 기대할 수 있다.

실시예 5: Cu-GHK를 포함한 화장품 조성물

본 발명의 조성물이 하기의 제형에 한정되는 것은 아니다.

실시예 5-1. 크림

성분	중량%
트리펩티드	0.1
부틸렌글리콜	6.0
글리세린	3.0
미네랄오일	5.0
소듐히아루로네이트	0.5
폴리소르베이트(Polysorbate)	1.5
스쿠알렌	1.0
비스왁스	1.0
향료	0.1
정제수	to 100

실시예 5-2. 로션

성분	중량%
트리펩티드	0.1
세토스테아릴알코올	2.5
스테아린산	1.7
마이크로크리스탈린납	0.8
부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
에틸렌디아민테트라초산디나트륨	0.01
향료	0.1
이미졸리디닐우레아	0.2
정제수	to 100

실시예 6: 피부탄력개선효과

(시험 1)

50세 이상의 여성 5명을 대상으로 안면의 한쪽에는 실시예 5-1의 크림을 도포하고, 다른 쪽에는 유효성분이 없는 제품을 4주간 아침 및 저녁으로 사용하게 한 후, 피부탄력의 개선효과를 주관적으로 평가하도록 하였다. 효과가 뚜렷하다고 생각하는 경우 3점으로, 효과가 어느 정도 있다는 경우를 2점으로 하여 효과가 미약하게 있다는 경우를 1점, 효과가 없다는 경우를 0점으로 하고 평균을 내었다.　또한 총 10명을 대상으로 사용감을 확인하였다(실시예5-1: 3점 2명, 2점 2명, 1점 1명, 0점 0명/ 비교제품 3점 0명, 2점 1명, 1점 2명, 0점 2명).

[표 1]

시료명	비교제품	실시예 5-1
탄력개선효과 (N=5)	0.8	2.2

[표 2]

구분	보습력	흡수력	유분감	트러블
결과 (N = 10)	7명 좋다 2명 보통 1명 나쁘다	7명 좋다 1명 보통 2명 나쁘다	6명 좋다 4명 보통	9명 없다 1명 있다

이상의 실험결과에서, 본 발명의 트리펩티드를 함유하는 화장품 조성물은 주관적인 탄력개선효과가 있었으며 사용감도 좋은 편이었다.

(시험 2) 기계적 계측에 의한 탄력개선효과

시험 1의 대상자의 얼굴의 일정부분을 CK사의 큐토미터(Cutometer, 음압을 이용한 피부탄력측정장치)로 측정하여 탄력도를 비교하였다. 측정은 온도 24℃, 상대습도 40%의 항온항습실에서 시행하였다. 측정치 가운데 R2를 사용한 계산 결과, 실시예 5-1의 제품을 사용한 부위의 피부탄력은 24±5%(평균±표준편차)의 증가를 보인 반면, 비교제품을 사용한 부위의 피부주름은 4±6%의 증가를 보여 실시예 5-1의 제품이 우수한 피부 탄력개선효과가 있음을 보여 주었다.

도 1은 섬유모세포(Fb)를 포함하는 인공피부(CTL)와 트리펩티드를 추가로 처리한 인공피부(대조군)를 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 사진이다.

도 2는 도 1의 인공피부를 면역조직화학법으로 염색한 결과로서 기저막 단백질인 인티그린의 발현을 비교한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 도 1의 인공피부를 면역조직화학법으로 염색한 결과로서 증식표시자인 p63와 PCNA의 발현을 비교한 결과를 보여주는 사진이다.

Claims

트리펩티드를 포함하는 피부 노화방지제.
제1항의 피부 노화방지제에 있어서, 상기 트리펩티드가 Cu-GHK, GHK 및 AHK로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 피부 노화방지제.
트리펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
제3항의 피부 노화방지 화장품 조성물에 있어서, 상기 트리펩티드가 Cu-GHK, GHK 및 AHK로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
제3항의 피부 노화방지 화장품 조성물에 있어서, 상기 트리펩티드가 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
제3항에 피부 노화방지 화장품 조성물에 있어서, 상기 조성물이 화장수, 유액, 크림, 팩 및 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것임 을 특징으로 하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
트리펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제.
제7항의 인공피부 배양액 조성물에 있어서, 상기 트리펩티드가 Cu-GHK, GHK 및 AHK로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.