WO2024106809A1 - 발모 촉진 및 손상모 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

발모 촉진 및 손상모 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024106809A1
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peptide
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glu
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정용지
김은미
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Definitions

  • This application relates to a peptide having hair growth promoting and damaged hair improvement activities and its use.
  • a human hair consists of approximately 150,000 hairs, and each hair goes through a different hair cycle, repeating the process of hair growth and loss.
  • the hair growth cycle is largely divided into three stages: anagen, in which the hair grows, maintenance stage, in which the hair is maintained after growth (catagen), and telogen, in which the dermal papilla shrinks and hair follicles gradually shrink, causing hair loss. Repeat step 3 periodically.
  • the hair growth cycle varies depending on internal factors such as family history, genetics, constitution, and hormonal regulation, and external factors such as nutritional status, aging, surrounding environment, and stress.
  • the ends of the hair are exposed to the external environment for a longer period of time than the scalp area, so hair damage due to the external environment is more severe.
  • Weathering due to exposure to the external environment causes loss of the hair cuticle, causing the ends of the hair to split and eventually break.
  • a representative example of such damage is a phenomenon in which hair tension decreases and becomes weaker when high heat is continuously applied to hair using a hair dryer, etc.
  • various physical, chemical, or environmental factors such as frequent perming and dyeing cause proteins and lipids inside the hair to elute, thereby promoting hair porousness.
  • the hair becomes rough and loses luster, and friction increases, making hair loss difficult and causing hair to be easily cut or split ends.
  • this porosity of the mimic causes the hair to lose its elasticity, causing problems such as loss of volume or thinning of the hair as it sags.
  • One aspect is to provide a peptide consisting of an amino acid sequence designated as Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E).
  • Another aspect is the improvement of damaged hair, which includes a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • a cosmetic composition for use includes a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • Another aspect is hair loss improvement using a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • a cosmetic composition for promoting hair growth is provided.
  • hair loss prevention comprising a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient. Or to provide a pharmaceutical composition for treatment.
  • One aspect provides a peptide consisting of an amino acid sequence designated as Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E).
  • peptide may refer to a linear molecule formed by combining amino acid residues with each other through peptide bonds.
  • the peptide may be synthesized by chemical synthesis methods known in the art, particularly solid-phase synthesis techniques (Merryfield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd., Pierce Chem Co.: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).
  • the present inventors have made diligent efforts to develop peptides with biologically effective activity, and as a result, amino acids expressed as Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E)
  • the peptide consisting of the sequence was identified.
  • the biologically effective activity includes (a) promoting proliferation or activation of hair follicle dermal papilla cells; (b) promoting activation of outer root sheath cells; (c) promoting activation of hair cells; and (d) inhibition of expression of DKK-1 (Dickkopf-related protein 1).
  • the biologically effective activities include (aa) enhancing phosphorylation of ERK and AKT, factors associated with proliferation of hair follicle dermal papilla cells; (bb) Activation of beta-catenin, lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF-1), c-Myc, and cyclin D1 in hair follicle dermal papilla cells; (cc) Ha3-II (type I cuticular Ha3-enhanced expression of Keratin 5, Keratin 14, and Keratin 19 in hair root sheath cells; (dd) HOXC13 (Homeobox protein Hox-C13), MSX2 (Msh homeobox 2) in hair hair cells and FOXN1 (Forkhead box protein N1) expression. Therefore, the peptide can be used to improve hair loss or promote hair growth, to prevent or treat hair loss, and to improve damaged hair.
  • the peptides may be added to N- or C- groups of the peptides to obtain chemical stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorption, potency, potency, etc.), altered specificity (e.g., broad spectrum of biological activity), and reduced antigenicity.
  • a protecting group may be attached to the terminal. Therefore, the peptide can be used as containing both the peptide itself or a protected derivative thereof into which a protecting group has been introduced.
  • the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluoreonylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, and a myristyl group.
  • the C-terminus of the peptide may be bonded to any one protecting group selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), a tertiary alkyl group, and azide (-NHNH 2 ). You can. Additionally, the peptide may optionally additionally include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, and an amino acid sequence prepared for the specific purpose of increasing half-life or peptide stability.
  • the peptide is artificially synthesized, or non-naturally occurring or engineered, and the term “non-naturally occurring or engineered” refers to not being in its natural state. , refers to a state created by applying artificial transformation.
  • the artificial modification includes artificially synthesizing an amino acid sequence by mimicking a plurality of amino acid structures or engineering it to obtain chemical stability, enhanced pharmacological properties, altered specificity, or reduced antigenicity as described above. can do.
  • the term “stability” may mean not only in vivo stability, which protects the peptide from attack by protein cleavage enzymes in vivo, but also storage stability (e.g., room temperature storage stability).
  • Another aspect is the improvement of damaged hair, which includes a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • a cosmetic composition for use includes a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • the term “improvement” may mean any action that reduces at least the severity of a parameter, such as a symptom, related to the alleviation or treatment of a condition.
  • the term “damaged hair” may refer to hair that has been deformed or weakened by physical, chemical, or environmental factors.
  • the damaged hair may be hair in which the gap between the cuticles constituting the hair is widened or a part of the cuticle has fallen off.
  • the damaged hair may mean hair with reduced tensile strength and gloss compared to normal hair, while increased roughness and friction, resulting in a rough overall hair texture and reduced hair elasticity and volume.
  • the damaged hair may refer to hair in which cysteine bonds within the hair are broken due to external physical or chemical stimulation.
  • the term "improving damaged hair” may refer to restoring the condition of the above-mentioned damaged hair to that of normal hair.
  • the improvement of damaged hair may mean, for example, improvement of hair elasticity (tensile strength) and gloss, reduction of hair roughness and friction, recovery of cuticles in hair, etc.
  • improving damaged hair may mean reconnecting or restoring inter-cysteine bonds that have been broken by external stimuli. Additionally, the term may be used interchangeably with terms such as “promoting damaged hair regeneration” and “improving hair protection function.”
  • the cosmetic composition according to one embodiment contains a peptide consisting of 10 or less amino acids as an active ingredient, and accordingly, the penetration rate of the active ingredient into the skin or hair is very excellent, for example, locally specific When applied to an area, the condition of damaged hair can be improved.
  • the peptide showed effects such as promoting proliferation or activation of hair follicle dermal papilla cells, promoting activation of outer root sheath cells, and promoting activation of hair hair cells.
  • the above The peptide showed an effect of improving tensile strength, gloss, roughness, and friction on damaged hair, and was confirmed to have excellent skin safety.
  • the above-mentioned efficacy demonstrates the effect of improving/promoting regeneration of damaged hair and improving hair protection function, and the peptide can be used as an active ingredient in a cosmetic composition for improving damaged hair.
  • the active ingredient of the cosmetic composition for example, a functional cosmetic composition
  • the active ingredient of the cosmetic composition is the peptide itself having the above-mentioned biological activity, a derivative thereof into which a protective group is introduced, or a terminal compound using the amino acid sequence of the peptide as a basic skeleton.
  • Peptides with extended regions e.g., 10-mer, 9-mer, 8-mer, 7-mer, 6-mer, 5-mer peptides may be included.
  • the cosmetic composition contains a cosmetically effective amount of the peptide; and/or may include a cosmetically acceptable carrier, but are not limited thereto.
  • cosmetically effective amount used herein may mean an amount sufficient to achieve the hair loss improvement or hair growth promotion effect of the cosmetic composition.
  • the weight ratio between the peptide and the cosmetically acceptable carrier may be, for example, 500:1 to 1:500, and as examples, the weight ratio is 450:1 to 1:450, 400:1 to 1:400, and 350:1. :1 to 1:350, 300:1 to 1:300, 250:1 to 1:250, 200:1 to 1:200, 150:1 to 1:150, 100:1 to 1:100, 80:1 to 1:80, 60:1 to 1:60, 40:1 to 1:40, 20:1 to 1:20, 10:1 to 1:10, 8:1 to 1:8, 6:1 to 1 :6, 4:1 to 1:4, or 2:1 to 1:2, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, emulsion, lotion, mist, powder, soap, oil, powder. It can be formulated as foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, etc., but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition includes, for example, scalp clinic agent, scalp scaling agent, scalp massage agent, scalp care agent, detergent, shampoo, hair tonic, hair conditioner, hair lotion, hair gel, hair pack, hair mask, hair essence, ointment, It may be commercialized as any one selected from the group consisting of hair styling agent, hair dye, and perm agent, but is not limited thereto.
  • the formulation of the cosmetic composition is paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier ingredients. It can be.
  • the formulation of the cosmetic composition is a powder or spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as the carrier ingredient.
  • chlorofluoro may be additionally used. May contain propellants such as hydrocarbons, propane/butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent, or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, It may include 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, or fatty acid ester of sorbitan.
  • the carrier ingredients include water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester, and miso.
  • a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • miso Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracant may be used.
  • the peptide may be contained in nanosomes or nanoparticles to further improve skin penetration or stability problems.
  • the nanosomes can be manufactured with a microfluidizer using lecithin as a raw material and can be contained in lecithin particles. Any method for producing the nanosomes can be used as long as it is known.
  • the size of the nanosome particles is preferably 30 to 200 nm. If the size of the nanosome particles is less than 30 nm, skin penetration proceeds very quickly and skin side effects may occur, and if it exceeds 200 nm, skin penetration is not easy, making it difficult to obtain the effect of using the nanosome structure.
  • Ingredients included in the cosmetic composition include, in addition to peptides as active ingredients and carrier components, ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances. May contain phosphorus supplements.
  • the content of the peptide as an active ingredient contained in the cosmetic composition can be appropriately selected without limitation depending on the form of the product, desired use, etc., for example, it can be added at 0.01 to 15% by weight of the total weight of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may include 0.2% by weight, 0.5% by weight, 1.0% by weight to 3.0% by weight, preferably 2.0% by weight to 3.0% by weight, based on the total weight.
  • the cosmetic composition may contain, for example, 0.1 to 1.5% by weight, for example, 0.2 to 1.0% by weight, 0.2 to 0.8% by weight, or 0.2 to 0.5% by weight of peptide, 0.2 to 0.5% by weight, based on the total weight of the cosmetic composition.
  • Another aspect is hair loss improvement or Provided is a cosmetic composition for promoting hair growth.
  • hair loss improvement may comprehensively refer to the process of treating, alleviating, alleviating hair loss conditions, or its effects, for example, promoting the proliferation or activation of hair follicle dermal papilla cells, outer root sheath cells, etc. It can refer to all actions that inhibit the progression of hair loss, such as promoting the activation of hair cells, suppressing the expression of hair loss-causing factors such as DKK-1, etc.
  • the hair follicle dermal papilla cells, outer root sheath cells, and hair cells are cells that make up the hair follicles that affect the thickness and development of hair. Activation of the cells affects the hair cycle, and through this mechanism, the effect of improving hair loss is achieved. It can be induced.
  • the term “hair growth promotion” may mean any action that increases hair growth from hair follicles, for example, proliferation of hair follicle cells, activity of hair follicle cells, or the effect of promoting hair follicle cell growth. It can refer to any action that increases the total amount of hair, such as: Specifically, the hair cycle consists of an anagen phase in which the hair grows, a catagen phase in which growth ends and the hair bulb shrinks, a telogen phase in which the hair papilla ceases activity and the hair stays on the scalp. It can be divided into the active phase, which is the period when the dermal papilla begins to become active or new hair is generated and old hair is shed.
  • dermal papilla cells are connected to capillaries and sensory nerves and play a role in supplying oxygen and nutrients to the hair cells.
  • the hair papilla cells surround the dermal papilla cells and undergo a growth phase through constant cell division and proliferation. It plays a role in determining the speed of.
  • outer root sheath cells are cells located in the area in contact with the basal layer of the epidermis, and play a role in protecting the hair until keratinization is completed.
  • the peptide showed the effect of promoting the proliferation or activation of hair follicle dermal papilla cells, promoting the activation of outer root sheath cells, promoting the activation of hair hair cells, and suppressing the expression of hair loss-inducing factors such as DKK-1. Therefore, the peptide can be used as an active ingredient in a cosmetic composition for improving hair loss or promoting hair growth.
  • Another aspect is a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient. It provides a method for improving damaged hair, a method for improving hair loss, or a method for promoting hair growth, including the step of applying to the skin or hair of an individual.
  • applying As used herein, the terms “applying,” “administering,” and “applying” are used interchangeably and refer to at least partial localization of a composition to a desired area, or route of administration, according to one embodiment. This may mean disposing the composition according to one embodiment into an object.
  • hair loss prevention comprising a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treatment is provided.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease by administering the composition.
  • treatment refers to a treatment for an individual suffering from a disease or at risk of developing a disease, improving the condition of the individual (e.g., one or more symptoms), delaying the progression of the disease, delaying the onset of symptoms, or refers to any form of treatment that provides effects including slowing the progression of symptoms. Accordingly, the terms “treatment” and “prevention” are not intended to imply cure or complete elimination of symptoms.
  • the “subject” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, refers to mammals such as human or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cattle.
  • Hair loss which is a disease to be prevented or treated by the pharmaceutical composition, refers to the absence of hair in areas where hair should normally exist, and can specifically mean the loss of hair (thick, black hair) on the scalp. there is.
  • the causes of hair loss are not limited, but can be caused by various dietary and environmental influences such as genetic causes, hormonal imbalance, mental stress, exposure to air pollution, and consumption of processed foods.
  • hair loss includes hereditary androgenetic alopecia (baldness), alopecia areata, tinea capitis due to fungal infection, telogen effluvium, hair growth barrier, and hair growth disorder diseases, and cicatricial alopecia in which scars are formed are caused by lupus. It can mean alopecia, toxic folliculitis, lichen planus pilaris, hair loss due to burns and trauma.
  • the peptide showed the effect of promoting the proliferation or activation of hair follicle dermal papilla cells, promoting the activation of outer root sheath cells, promoting the activation of hair hair cells, and suppressing the expression of hair loss-inducing factors such as DKK-1. Therefore, the peptide can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss.
  • the active ingredients of the pharmaceutical composition include the peptide itself having the above-described biological activity, a derivative thereof into which a protective group has been introduced, or a peptide with an extended terminal region based on the amino acid sequence of the peptide (e.g., 10-mer , 9-mer, 8-mer, 7-mer, 6-mer, 5-mer peptides) may be included.
  • the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically effective amount of the peptide; and/or may include a pharmaceutically acceptable carrier, but are not limited thereto.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to achieve the hair loss prevention or treatment effect of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are commonly used in formulations and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Includes, but is not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the weight ratio between the peptide and the pharmaceutically acceptable carrier may be, for example, 500:1 to 1:500, and as examples, the weight ratio is 450:1 to 1:450, 400:1 to 1:400, 350:1 :1 to 1:350, 300:1 to 1:300, 250:1 to 1:250, 200:1 to 1:200, 150:1 to 1:150, 100:1 to 1:100, 80:1 to 1:80, 60:1 to 1:60, 40:1 to 1:40, 20:1 to 1:20, 10:1 to 1:10, 8:1 to 1:8, 6:1 to 1 :6, 4:1 to 1:4, or 2:1 to 1:2, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include, but is not limited to, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. , but is not limited to this.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 0.0001 to 1000 ug (microgram, 0.001 to 1000 ug, 0.01 to 1000 ug, 0.1 to 1000 ug, or 1.0 to 1000 ug per day, but is not limited thereto.
  • Formulation method it can be prescribed in various ways depending on factors such as administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity.
  • the pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the invention pertains. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersant and/or stabilizer.
  • Another aspect is that a therapeutically effective amount of a peptide containing an amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) is used as an active ingredient.
  • a method for preventing or treating hair loss comprising administering to an individual a pharmaceutical composition comprising the pharmaceutical composition.
  • Another aspect is the improvement of damaged hair using a peptide containing the amino acid sequence represented by Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) or Glu(E)-Glu(E) as an active ingredient. , provides a food composition for preventing hair loss, or promoting hair growth.
  • the content of the peptide as an active ingredient contained in the food composition can be appropriately selected without limitation depending on the form of the food, desired use, etc., for example, it can be added at 0.01 to 15% by weight of the total weight of the food. . Also, for example, the health drink composition may be added at a rate of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, based on 100 ml.
  • the peptide improves damaged hair, improves hair loss, and promotes hair growth by promoting the proliferation or activity of dermal papilla cells, hair cells, and outer root sheath cells constituting hair follicles, and inhibiting the expression of DKK-1, a hair loss-related factor. , and hair growth promotion.
  • the peptide can be used as an active ingredient in a composition for improving damaged hair, improving hair loss, or promoting hair growth.
  • Figure 1 shows the results of confirming the level of cell proliferation after adding Peptide-1 to hair follicle dermal papilla cells according to one embodiment.
  • Figure 2 shows the results of confirming the level of cell proliferation after adding Peptide-2 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 3 shows the results of confirming the phosphorylation of ERK and AKT, factors related to the proliferation of hair follicle dermal papilla cells, after adding Peptide-1 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 4 shows the results of confirming the phosphorylation of ERK and AKT, which are factors related to the proliferation of hair follicle dermal papilla cells, after adding Peptide-2 according to one embodiment to the hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 5 shows the results of confirming the movement of beta-catenin, a factor related to the proliferation of hair follicle dermal papilla cells, from the cytoplasm to the nucleus after adding Peptide-1 according to one embodiment to the hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 6 shows the results of confirming the movement of beta-catenin, a factor related to the proliferation of hair follicle dermal papilla cells, from the cytoplasm to the nucleus after adding Peptide-2 according to one embodiment to the hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 7 shows the results of confirming the expression levels of c-Myc, which is a downstream target gene of the beta-catenin activation mechanism, and cyclin D1, after adding Peptide-1 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 8 shows the results of confirming the expression levels of LEF-1, c-Myc, and cyclin D1, which are downstream target genes of the beta-catenin activation mechanism, after adding Peptide-2 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 9 shows the results of confirming the expression level of DKK-1, a hair loss inducing factor, after adding Peptide-1 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 10 shows the results of confirming the expression level of DKK-1, a hair loss inducing factor, after adding Peptide-2 according to one embodiment to hair follicle dermal papilla cells.
  • Figure 11 shows the results of confirming the expression levels of Ha3-II, Keratin 14, and Keratin 19, which are activating factors for outer root sheath cells, after adding Peptide-1 according to one embodiment to outer root sheath cells.
  • Figure 12 shows the results of confirming the expression levels of Ha3-II, Keratin 5, Keratin 14, and Keratin 19, which are activating factors of outer root sheath cells, after adding Peptide-2 according to one embodiment to outer root sheath cells.
  • Figure 13 shows the results of confirming the expression levels of HOXC13, MSX2, and FOXN1, which are activating factors of hair cells, after adding Peptide-1 according to one embodiment to hair cells.
  • Figure 14 shows the results of confirming the expression levels of MSX2 and FOXN1, which are activating factors for hair cells, after adding Peptide-2 according to one embodiment to hair cells.
  • Figure 15 shows the results of measuring hair tensile force over time after applying a composition (Example 1) according to one embodiment to human hair.
  • Figure 16 shows the results of measuring hair tensile force over time after applying a composition (Example 2) according to one embodiment to human hair.
  • Figure 17 shows the results taken using a digital camera after applying a composition (Example 1) according to one embodiment to a human hair wig.
  • Figure 18 shows the results taken using a digital camera after applying a composition (Example 2) according to one embodiment to a human hair wig.
  • Figure 19 shows the results of observing the roughness (cuticle) of hair over time through an electron microscope after applying a composition (Example 1) according to one embodiment to human hair.
  • Figure 20 shows the results of observing the roughness (cuticle) of hair over time through an electron microscope after applying a composition (Example 2) according to one embodiment to human hair.
  • the peptides listed in Table 1 below were synthesized using an automatic peptide synthesizer (Milligen 9050, Millipore, USA), and these synthesized peptides were purified using C18 reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) (Waters Associates, USA). did.
  • the column used was ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1mm ⁇ 100mm, 1.7 ⁇ m, Waters Co, USA).
  • HFDPC human hair follicle dermal papilla cells
  • the mixture was cultured at 37°C for 72 hours. Afterwards, the culture was washed with PBS, and then 10 ⁇ L of 5 mg/ml MTT solution was dispensed into each well. The culture was cultured in a CO 2 incubator for 4 hours, the medium was removed, 100 ⁇ L of DMSO (Dimethyl sulfoxide) was added, and the mixture was stirred for 10 minutes. Afterwards, the absorbance was measured at a wavelength of 540 nm using a spectrophotometer. Meanwhile, the untreated group was used as the control group, and the group treated with 1 ⁇ M EGF was used as the positive control group.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • human hair follicle dermal papilla cells were seeded in a 6-well plate at a density of 4 ⁇ 10 5 cells/well, and the cells were cultured in mesenchymal stem cell complete media for 24 hours. Afterwards, 500mM, 5 ⁇ M, or 50 ⁇ M of the peptide according to one example was dispensed, and the mixture was cultured at 37°C for 24 hours. Afterwards, the culture was washed with PBS and treated with 100 ⁇ L of lysis buffer to prepare cell lysate.
  • the reaction was washed three times for 15 minutes each with 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS), the secondary antibody was diluted 1:2000 with 5% skim milk, and mixed with the reaction for 1 hour. reacted. Afterwards, the reaction was washed three times for 15 minutes each with 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS), treated with ECL solution (GE Healthcare, USA), and then the protein expression level was confirmed. Meanwhile, the untreated group was used as the control group, and the group treated with 1 ⁇ M Minoxidil was used as the positive control group.
  • human hair follicle dermal papilla cells were cultured in the same manner as Experimental Example 2-2, treated with a peptide according to one embodiment, and then the culture was subjected to nuclear protein extraction kit (Thermo scientific, USA). The nuclear protein was isolated. Afterwards, the protein expression level was confirmed in the same manner as Experimental Example 2-2 using beta-catenin (cell signaling, USA) and HDAC1 (Santa Cruz, USA) antibodies.
  • the untreated group was used as the control group, and the group treated with 10 ng/mL rhWnt-3a (recombinant human Wnt-3a protein) (R&D systems (USA, MN)) was used as the positive control group.
  • rhWnt-3a recombinant human Wnt-3a protein
  • PCR reaction was performed using the primers and PCR premix (enzynomics, Korea) in Table 2 below, followed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel, and the genes at the RNA level were analyzed using the Bio-Rad gel image system. Expression was confirmed.
  • beta-catenin is activated by the Peptide-1 or Peptide-2, and thus its downstream target genes, LEF-1, c-Myc, and/or It was confirmed that the expression of cyclin D1 was increased.
  • Ha3-II type I cuticular Ha3- ⁇ , Keratin 5, Keratin 14, and Keratin 19
  • HHORSC human hair outer root sheath cells
  • HOXC13 Homeobox protein Hox-C13
  • MSX2 Msh homeobox 2
  • FOXN1 Formhead box protein N1
  • HHGMC human hair germinal matrix cells
  • RNA level was confirmed in the same manner as Experimental Example 2-3, using the primers shown in Table 4 below. Meanwhile, the untreated group was used as the control group, and the group treated with 50 nM EGF was used as the positive control group.
  • compositions for improving damaged hair containing peptide (Peptide-1) according to an example as an active ingredient were prepared.
  • the composition of Example 1 of the mist formulation was prepared according to the ingredients and contents shown in Table 5 below using a method known in the art.
  • the composition of Example 2 of the emulsion formulation was prepared according to the ingredients and contents shown in Table 6 below using a method known in the art.
  • Example 1 or Example 2 was evenly applied to the hair, massaged, combed, and washed for 5 minutes. applied. Afterwards, hair was collected from the subject's occipital area and the Break Load (strength of force when the hair breaks, gmf) value was measured over time using MTT175 (Miniature Tensile Tester, Diastron Ltd., UK). did.
  • Example 1 and 2 are shown in Tables 7 and 8, respectively, and the results of Examples 1 and 2 for one of the test subjects are shown in Figures 15 and 16, respectively. As the Break Load value increases, it means that the tensile strength of the hair has improved.
  • the peptide according to one example was effective in improving the tensile strength (elasticity) of damaged hair.
  • Example 1 and 2 are shown in Tables 9 and 10, respectively, indicating that the shine of the hair improved as the Gloss Unit value increased.
  • results of digital camera photography after application of Examples 1 and 2 of one of the human hair wigs are shown in Figures 17 and 18, respectively.
  • Example 1 the composition of Example 1 or the composition of Example 2 was applied to 23 test subjects in the same manner as in Experimental Example 7. Afterwards, hair in the back of the subject's head was photographed using a scanning electron microscope (S-4700, Hitachi, Japan), magnified 700 times, and analyzed over time using an image analysis program (Image J, National Institutes of Health, USA). The variable value Ra ( ⁇ m) representing the roughness of the hair surface was measured.
  • Example 1 The results of Examples 1 and 2 are shown in Tables 11 and 12, respectively. As the Ra value decreases, the hair cuticle and hair roughness are improved. In addition, the electron microscope imaging results of one of the test subjects according to the treatment in Examples 1 and 2 are shown in Figures 19 and 20, respectively.
  • the peptide according to one example was effective in improving the roughness (cuticle) of damaged hair.
  • Example 1 we attempted to determine the effect of a peptide according to an example on the frictional force of damaged hair.
  • the composition of Example 1 or the composition of Example 2 was applied to human hair pieces (bleached hair) in the same manner as Experimental Example 8, except that 20 human hair pieces (bleached hair) were used. . Thereafter, for the human hair piece, the Mean Horizontal Force Out value (gmf/ mm) was measured.
  • the 23 subjects in Experimental Example 7 were observed to see whether adverse skin reactions occurred after applying the composition. As a result, it was confirmed that no adverse reactions to allergic contact dermatitis or irritant contact dermatitis occurred. In addition, the test subject was asked to report erythema (redness), edema (swelling), scaling (scaly skin), itching, stinging (pain), burning, stiffness, and tingling, and as a result, no adverse skin reactions were reported. Confirmed.
  • composition containing the peptide according to one embodiment is suitable for skin application.
  • Example 1 50 mg of the peptide of Example 1 was dissolved in 500 ml of distilled water by sufficiently stirring. After mixing the mixture solution with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol, and a little oil phase, adjust the amount with distilled water so that the total amount is 1 L, and then apply high pressure with a microfluidizer. Peptide nanosomes with a size of about 100 nm were prepared by emulsifying them.
  • a lotion containing a peptide according to an example and having the following composition was prepared using a method known in the art.
  • a nutritional cream containing a peptide according to an example and having the following composition was prepared using a method known in the art.

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Abstract

본 출원은 발모 촉진 및 손상모 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, Arg-Cys-Cys-Gly 또는 Glu-Glu로 표기되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 손상모 개선용 화장료 조성물, 상기 펩타이드를 포함하는 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물, 및 상기 펩타이드를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

발모 촉진 및 손상모 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
본 출원은 발모 촉진 및 손상모 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
사람의 모발은 약 15만 개 전후로 구성되며, 각각의 모발은 서로 다른 모발주기를 거쳐 머리가 자라고 빠지는 과정을 반복하게 된다. 모발의 성장주기는 크게 3단계로 나뉘며, 모발이 성장하는 성장기(anagen), 성장을 마치고 모발을 유지하는 유지기(catagen), 모유두가 수축되고 모낭이 점차 쪼그라들어 탈모가 진행되는 휴지기(telogen)의 3단계를 주기적으로 반복한다. 모발의 성장주기는 가족력, 유전, 체질, 호르몬조절 등의 내적요인과 영양상태, 노화, 주위환경, 스트레스 등의 외적요인에 의해 달라진다.
한편, 모발의 끝부분은 두피쪽 부분에 비해 외부 환경에 노출된 시간이 길므로 외부 환경에 의한 모발 손상이 더욱 심하게 나타나게 된다. 외부 환경으로의 노출에 의한 풍화작용은 모발의 큐티클의 손실을 유발하여 모발 끝이 갈라지고 결국 끊어지는 결과를 초래하게 된다. 모발에 헤어드라이어 등을 통한 고열을 지속적으로 가하는 경우 모발의 장력이 감소하고 약해지는 현상 등이 이러한 손상의 대표적인 예시이다. 또한, 잦은 퍼머와 염색 등에 의한 다양한 물리, 화학적 또는 환경적 요인은 모발 내부의 단백질 및 지질이 용출되어 모발의 다공성화를 촉진시킨다. 이로 인해 모발은 거칠어지고 윤기를 잃으며, 마찰력이 증가하여 모발 손실이 어려워지고 모발이 쉽게 절단되거나 끝이 갈라지는 현상이 발생한다. 또한, 이러한 모방의 다공성화는 모발의 탄력을 상실하게 되어, 모발이 쳐지면서 볼륨감이 없어지거나 모발이 가늘어지는 문제점을 야기한다.
또한, 고령화 사회가 발달하면서　탈모로 고민하는 사람들의 수가 증가하고 있으며, 기존에는 중년 남성들의 주된 문제였으나 최근에는 젊은층과 여성층에서도　탈모예방과 양모 등에 대한 관심이 증가하고 있다. 한편,　탈모는 일련의 노화현상으로 인식되어 왔으나 최근에는 유전적 요인과 함께 스트레스, 서구화된 식습관, 영양 불균형, 사회 활동의 변화 등의 다양한 원인으로　탈모가 진행됨이 밝혀지고 있다. 현재 발모효과를 나타내는 약물로서 미국 FDA에서 공인받은 것으로는 미녹시딜 (6-Amino-1,2-dihydro-1-hydroxy-2-imino-4-phenoxypyrimidine)(미국특허 제3,382,247호) 및 피나스테라이드 (finasteride)가 있다(미국특허 제5,215,894 호). 미녹시딜의 경우, 1970년대 초 고혈압 치료를 위한 혈관확장제로서 개발되었으나, 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모촉진제로 사용되고 있으며, 모공이 굵어지고 모발의 지름이 커져 모발의 굵기가 굵어지는 효과를 나타낸다. 또한, 피나스테라이드의 경우 전립선 비대증 치료제로 개발되었다가 현재　탈모　치료제로 사용되고 있으며　탈모의 진행을 늦추고 발모 효과를 나타낸다. 그러나, 미녹시딜의 경우 체중 증가, 부종, 피부염, 심장박동 증가 등의 부작용이 보고된 바 있으며, 피나스테라이드의 경우 지속적인 복용이 요구되고, 남성의 경우 성기능 장애, 임신한 여성의 경우 기형아 출산 등의 부작용이 있어, 부작용이 없는　탈모　치료제의 개발은 여전히 요구되고 있는 실정이다.
이러한 기술적 배경 하에, 호르몬 조절, 대사 조절 등과 같은 기작을 통하여 손상모 개선 및 탈모 방지를 위한 다각적인 연구가 진행되고 있으나 (한국 공개특허 제2002-0005332호), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 손상모 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 규명하였다. 여기서, 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (a) 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진; (b) 외모근초 세포의 활성화 촉진; (c) 모모 세포의 활성화 촉진; 및 (d) DKK-1 (Dickkopf-related protein 1)의 발현 억제와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (aa) 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 ERK 및 AKT의 인산화 증진; (bb) 모낭 모유두 세포의 베타-카테닌, LEF-1 (Lymphoid enhancer-binding factor-1), c-Myc, 및 cyclin D1의 활성화; (cc) 외모근초 세포의 Ha3-II (type I cuticular Ha3-켎eratin 5, Keratin 14, 및 Keratin 19 발현 증진; (dd) 모모 세포의 HOXC13 (Homeobox protein Hox-C13), MSX2 (Msh homeobox 2) 및 FOXN1 (Forkhead box protein N1) 발현 증진일 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 탈모 개선 또는 발모 촉진을 위한 용도, 탈모의 예방 또는 치료를 위한 용도 및 손상모 개선을 위한 용도로 활용될 수 있다.
상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 펩타이드 자체 또는 이의 보호기가 도입된 유도체 (a protected derivative thereof)를 모두 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group, Boc), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group, Alloc) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 인위적으로 합성되거나 (Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작 (Non-naturally occurring or engineered)된 것이며, 상기 “비-천연 발생 또는 조작”은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 복수 개의 아미노산 구조를 모방하여 인위적으로 아미노산 서열을 합성하는 것 또는 전술한 바와 같이 화학적 안정성, 강화된 약리 특성, 변경된 특이성, 또는 감소된 항원성을 획득하기 위하여 조작된 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 손상모 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "손상모"는 물리적, 화학적, 환경적 요인에 의하여, 변형 또는 약화된 모발을 지칭할 수 있다. 상기 손상모는 예를 들어, 모발을 구성하는 큐티클의 간격이 벌어지거나, 큐티클의 일부가 떨어져 나간 상태를 포함하는 모발일 수 있다. 또한, 상기 손상모는 정상적인 모발에 비해 인장력 및 윤기 등이 감소된 반면, 거칠기 및 마찰력 등은 증가함에 따라, 전반적인 모발의 질감이 거칠고, 모발의 탄력과 볼륨감이 저하된 모발을 의미할 수 있다. 또한, 상기 손상모는 물리적 또는 화학적인 외부 자극에 의해 모발 내 시스테인간 결합이 끊어져 있는 상태를 포함하는 모발을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "손상모 개선"은 전술한 손상모의 상태를 정상적인 모발의 상태로 회복시키는 것을 지칭할 수 있다. 상기 손상모 개선은 예를 들어, 모발의 탄력 (인장력) 및 윤기 증진, 모발의 거칠기 및 마찰력 감소, 모발 내 큐티클의 회복 등을 의미할 수 있다. 또한, 상기 손상모 개선은 외부 자극에 의해 끊어져 있는 시스테인간 결합을 다시 연결 또는 회복시키는 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 용어는 "손상모 재생 촉진" 및 "모발 보호 기능 향상"등의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
종래의 기능성 펩타이드는 유효한 생물학적 활성에도 불구하고 펩타이드 자체의 크기로 인해, 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 보여 주었다. 반면, 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 10개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 이에 따라, 유효성분의 피부, 또는 모발 침투율 등이 매우 우수하고, 예를 들어, 국소적으로 특정 영역에 도포하는 경우, 손상된 모발 상태를 개선시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진, 외모근초 세포의 활성화 촉진, 모모 세포의 활성화 촉진 등의 효능을 보여주었다, 또한, 인간 모발 또는 인모 위그를 이용한 실험에서, 상기 펩타이드는 손상모에 대한 인장력, 윤기, 거칠기, 및 마찰력 개선 효과를 보여주었고, 우수한 피부 안전성을 나타냄을 확인하였다. 즉, 전술한 효능은 손상모 개선/재생 촉진 및 모발 보호 기능 향상 효과를 입증하는 것으로서, 상기 펩타이드는 손상모 개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물, 예를 들어, 기능성 화장품 조성물의 유효성분으로는 전술한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드 자체, 이의 보호기가 도입된 유도체, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 기본 골격으로 하여 말단 영역이 신장된 펩타이드(예를 들어, 10-mer, 9-mer, 8-mer, 7-mer, 6-mer, 5-mer 펩타이드)가 포함될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량 (cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상기 화장료 조성물의 탈모 개선 또는 발모 촉진 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.
상기 펩타이드 및 화장품학적으로 허용되는 담체간 중량비는 예를 들어, 500:1 내지 1:500일 수 있으며, 일례로서, 상기 중량비는 450:1 내지 1:450, 400:1 내지 1:400, 350:1 내지 1:350, 300:1 내지 1:300, 250:1 내지 1:250, 200:1 내지 1:200, 150:1 내지 1:150, 100:1 내지 1:100, 80:1 내지 1:80, 60:1 내지 1:60, 40:1 내지 1:40, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 8:1 내지 1:8, 6:1 내지 1:6, 4:1 내지 1:4, 또는 2:1 내지 1:2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 에멀젼, 로션, 미스트, 파우더, 비누, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 두피클리닉제, 두피스케일링제, 두피마사지제, 두피케어제, 세정제, 샴푸, 헤어토닉,　헤어컨디셔너,　헤어로션, 헤어젤, 헤어팩, 헤어마스크, 헤어에센스, 연고, 헤어스타일링제, 염모제 및 펌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제품화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 예를 들어, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 펩타이드는 피부 투과 문제 또는 안정성 문제를 보다 개선시키기 위하여 나노좀 또는 나노파티클에 함유될 수 있다. 예를 들어, 상기 나노좀은 레시틴을 원료로 사용하여 마이크로플루다이져로 제조될 수 있고, 레시틴 입자 내에 함유될 수 있다. 상기 나노좀의 제조 방법은 공지의 것이라면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 상기 나노좀 입자의 크기는 30 내지 200nm인 것이 바람직하다. 상기 나노좀 입자의 크기가 30nm 미만인 경우에는 피부 침투가 매우 빨리 진행되어 피부 부작용이 발생할 수 있고, 200nm를 초과하는 경우에는 피부 침투가 용이하지 않아 나노좀 구조를 사용하는 효과를 얻기 어려울 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 함유된 유효성분으로서 펩타이드의 함량은 제품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 비제한적으로 선택될 수 있으며, 예를 들어, 전체 화장료 조성물 중량의 0.01 내지 15 중량%로 첨가할 수 있다. 또한 예를 들어, 화장료 조성물은 전체 중량을 기준으로 0.2 중량%, 0.5 중량%, 1.0 중량% 내지 3.0 중량%, 바람직하게는 2.0 중량% 내지 3.0 중량%로 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 전체 화장료 조성물 중량를 기준으로, 0.1 내지 1.5 중량%, 예를 들어, 0.2 내지 1.0 중량%, 0.2 내지 0.8 중량%, 또는 0.2 내지 0.5 중량%의 펩타이드, 0.2 내지 0.5 중량%의 계면활성제, 0.01 내지 0.1 중량%의 pH 조정제, 및/또는 0.2 내지 0.5 중량%의 보존제, 그리고 선택적으로 4.0 내지 6.0 중량%의 유화제를 포함할 수 있다.
다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "탈모 개선"은 탈모 상태를 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미할 수 있으며, 예를 들어, 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진, 외모근초 세포의 활성화 촉진, 모모 세포의 활성화 촉진, DKK-1 등과 같은 탈모 유발 인자의 발현 억제 등과 같은 탈모의 진행을 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 상기 모낭 모유두 세포, 외모근초 세포, 및 모모 세포는 모발의 굵기 및 발육에 영향을 미치는 모낭을 구성하는 세포로서, 상기 세포의 활성화는 모발의 주기에 영향을 미치며, 이러한 기전을 통해 탈모 개선 효과를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발모 촉진"은 모낭에서 모발이 자라나는 것을 증가시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 모낭 세포의 증식, 모낭 세포의 활성, 또는 모낭 세포의 성장을 촉진하는 효과 등과 같은 모발의 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다. 구체적으로, 모발의 주기는 모발을 성장시키는 성장기 (anagen), 성장을 종료하고 모구부가 축소하는 시기인 퇴화기 (catagen), 모유두가 활동을 멈추고 모발을 두피에 머무르게 하는 시기인 휴지기 (telogen), 모유두가 활동을 시작하거나 새로운 모발을 발생시켜 오래된 모발을 탈모시키는 시기인 활동기로 나눌 수 있다. 상기 모발의 주기에서, 모유두 세포는 모세혈관과 감각신경에 연결되어 있어, 모모 세포에 산소와 영양소를 공급하는 역할을 하며, 모모 세포는 모유두 세포를 둘러싸고 있으며, 끊임없는 세포 분열 및 증식을 통해 성장기의 속도를 결정하는 역할을 한다. 또한, 외모근초 세포는 표피의 기저층과 맞닿아 있는 부분에 위치하는 세포로서, 모발의 각화가 종결되기 전까지 보호하는 역할을 한다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진, 외모근초 세포의 활성화 촉진, 모모 세포의 활성화 촉진, DKK-1 등과 같은 탈모 유발 인자의 발현 억제 효과를 보여주었다. 따라서, 상기 펩타이드는 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
또 다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 개체의 피부 또는 모발에 도포하는 단계를 포함하는 손상모를 개선하는 방법, 탈모를 개선하는 방법, 또는 발모를 촉진하는 방법을 제공한다.
상기 화장료 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "적용하는", "투여하는", 및 "도포하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 실시예에 따른 조성물을 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 것, 또는 투여 경로에 의해 개체 내로 일 실시예에 따른 조성물의 배치하는 것을 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.
상기 "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
상기 약제학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인, "탈모"는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 의미하며, 구체적으로는 두피의 성모 (굵고 검은 머리털)이 빠지는 것을 의미할 수 있다. 탈모의 원인은 제한되지 않으나, 유전적인 원인, 호르몬 불균형, 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취 등의 다양한 식습관 및 환경적 영향으로 인하여 유발될 수 있다. 예를 들어, 탈모는 유전성 안드로겐성　탈모 (대머리), 원형　탈모, 곰팡이 감염에 의한 두부 백선, 휴지기　탈모, 발모벽, 모발생성 장애 질환 등이 있고, 흉터가 형성되는 반흔성　탈모로는 루푸스에 의한　탈모, 독발성 모낭염, 모공성 편평 태선, 화상 및 외상에 의한　탈모를 의미할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진, 외모근초 세포의 활성화 촉진, 모모 세포의 활성화 촉진, DKK-1 등과 같은 탈모 유발 인자의 발현 억제 효과를 보여주었다. 따라서, 상기 펩타이드는 탈모의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 유효성분으로는 전술한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드 자체, 이의 보호기가 도입된 유도체, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 기본 골격으로 하여 말단 영역이 신장된 펩타이드 (예를 들어, 10-mer, 9-mer, 8-mer, 7-mer, 6-mer, 5-mer 펩타이드)가 포함될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 상기 펩타이드의 약제학적 유효량 (pharmaceutically effective amount); 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 약제학적 조성물의 탈모 예방 또는 치료 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체간 중량비는 예를 들어, 500:1 내지 1:500일 수 있으며, 일례로서, 상기 중량비는 450:1 내지 1:450, 400:1 내지 1:400, 350:1 내지 1:350, 300:1 내지 1:300, 250:1 내지 1:250, 200:1 내지 1:200, 150:1 내지 1:150, 100:1 내지 1:100, 80:1 내지 1:80, 60:1 내지 1:60, 40:1 내지 1:40, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 8:1 내지 1:8, 6:1 내지 1:6, 4:1 내지 1:4, 또는 2:1 내지 1:2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 내지 1000 ug(마이크로그램, 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 치료학적 유효량의 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 탈모를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약제학적 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
또 다른 양상은 Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 손상모 개선, 탈모 방지, 또는 발모 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 펩타이드의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 비제한적으로 선택될 수 있으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 첨가할 수 있다. 또한 예를 들어, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 첨가할 수 있다.
일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 모낭을 구성하는 모유두세포, 모모 세포, 외모근초 세포의 증식 또는 활성을 촉진시키고, 탈모 관련 인자인 DKK-1의 발현을 억제함으로써, 손상모 개선, 탈모 개선, 발모 촉진, 및 모발 성장 촉진 등에 적용할 수 있다.
일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 상기 펩타이드는 손상모 개선, 탈모 개선 또는 발모 촉진을 위한 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 세포 증식 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 세포 증식 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 ERK 및 AKT의 인산화를 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 ERK 및 AKT의 인산화를 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 베타-카테닌의 세포질에서 핵으로의 이동을 확인한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 베타-카테닌의 세포질에서 핵으로의 이동을 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 베타-카테닌 활성화 기작의 하류 표적 유전자인 c-Myc, 및 cyclin D1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 베타-카테닌 활성화 기작의 하류 표적 유전자인 LEF-1, c-Myc, 및 cyclin D1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 탈모 유발 인자인 DKK-1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모낭 모유두세포에 첨가한 후, 탈모 유발 인자인 DKK-1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 Peptide-1을 외모근초 세포에 첨가한 후, 외모근초 세포의 활성화 인자인 Ha3-II, Keratin 14, 및 Keratin 19의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 Peptide-2를 외모근초 세포에 첨가한 후, 외모근초 세포의 활성화 인자인 Ha3-II, Keratin 5, Keratin 14, 및 Keratin 19의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 Peptide-1을 모모 세포에 첨가한 후, 모모 세포의 활성화 인자인 HOXC13, MSX2 및 FOXN1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 Peptide-2를 모모 세포에 첨가한 후, 모모 세포의 활성화 인자인 MSX2 및 FOXN1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 조성물(실시예 1)을 인간 모발에 적용한 후, 시간 경과에 따른 모발 인장력을 측정한 결과이다.
도 16은 일 실시예에 따른 조성물(실시예 2)을 인간 모발에 적용한 후, 시간 경과에 따른 모발 인장력을 측정한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 조성물(실시예 1)을 인모 위그에 적용한 후 디지털카메라를 사용하여 촬영한 결과이다.
도 18은 일 실시예에 따른 조성물(실시예 2)을 인모 위그에 적용한 후 디지털카메라를 사용하여 촬영한 결과이다.
도 19는 일 실시예에 따른 조성물(실시예 1)을 인간 모발에 적용한 후 전자 현미경을 통해 시간 경과에 따른 모발의 거칠기(큐티클)를 관찰한 결과이다.
도 20은 일 실시예에 따른 조성물(실시예 2)을 인간 모발에 적용한 후 전자 현미경을 통해 시간 경과에 따른 모발의 거칠기(큐티클)를 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 펩타이드의 합성
자동 펩타이드 합성기 (Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1㎜ Х 100㎜, 1.7㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000001
실험예 2. 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성 촉진 효과 확인
2-1. 모낭 모유두 세포의 증식 촉진 효과 확인
본 실험예에서는 인간 모낭 모유두세포 (human hair follicle dermal papilla cell:　HFDPC)의 생존율 변화를 평가함으로써, 인간 모낭 모유두세포의 증식에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 모낭 모유두세포를 96-웰 플레이트에 4×103 cells/well의 밀도로 시딩한 후, 상기 세포를 mesenchymal stem cell complete media에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포의 배양 배지를 무혈청 배지 (serum free mesenchymal stem cell complete media)로 교체한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 일 실시예에 따른 펩타이드를 500mM, 5μM, 또는 50μM씩 분주하고, 이를 37℃ 조건에서 72시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양물을 PBS로 세척한 후, 여기에 5mg/ml의 MTT 용액을 10μL씩 각 웰에 분주하였다. 상기 배양물을 CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, 100μL의 DMSO (Dimethyl sulfoxide)를 첨가하고, 이를 10분간 교반하였다. 이후, Spectrophotometer를 이용하여 540nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 1μM의 EGF를 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 모유두세포의 증식이 촉진됨을 확인하였다.
2-2. 모낭 모유두 세포의 증식 관련 인자의 활성화 효과 확인
본 실험예에서는 인간 모낭 모유두세포의 증식 관련 인자의 활성화에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 모낭 모유두　세포를 4×105　세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후, 상기 세포를 mesenchymal stem cell complete media에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 일 실시예에 따른 펩타이드를 500mM, 5μM, 또는 50μM씩 분주하고, 이를 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양물을 PBS로 세척한 후, 100μL의 용해 버퍼를 처리하여 세포 용해물을 준비하였다. 이후, BCA (Bicinchoninic Acid)를 정량하여 동량의 단백질 샘플을 준비한 뒤, 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전기영동을 진행하였다. 이후, 상기 SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 PVDF membrane으로 transfer한 뒤, 5% skim milk를 이용하여 30분 동안 실온에서 반응을 blocking시켰다. 이후, phospho-AKT 와 phospho-ERK (cell signaling, USA) 항체를 1:1000으로 3% BSA에 희석한 후, 4℃에서 상기 blocking된 PVDF membrane과 16시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응물을 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS)로 15분씩 3회 세척하고, 2차 항체를 1:2000으로 5% skim milk와 희석하여, 이를 상기 반응물과 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응물을 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS)로 15분씩 3회 세척하고, ECL 용액 (GE Healthcare, USA)을 처리한 후, 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 1μM의 Minoxidil를 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 모낭 모유두 세포의 증식과 관련된 인자인 ERK 및 AKT의 인산화가 유도됨을 확인하였다.
2-3. 모낭 모유두 세포의 증식 기전 촉진 효과 확인
본 실험예에서는 인간 모낭 모유두세포의 증식 기전에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2-2와 동일한 방식으로 인간 모낭 모유두　세포를 배양하고, 일 실시예에 따른 펩타이드를 처리한 뒤, 상기 배양물을 대상으로 nuclear protein extraction kit (Thermo scientific, USA)을 이용하여 nuclear protein 분리하였다. 이후, beta-catenin (cell signaling, USA), HDAC1 (santa cruz, USA) 항체를 사용하여, 상기 실험예 2-2와 동일한 방식으로 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 10 ng/mL의 rhWnt-3a (recombinant human Wnt-3a protein)(R&D systems (USA, MN))를 처리한 군을 사용하였다.
또한, 상기 베타-카테닌의 활성화 기작에 의한 하류 표적 유전자(downstream target gene)인 LEF-1 (Lymphoid enhancer-binding factor-1), c-Myc, 또는 cyclin D1의 수준 변화를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 실험예 2-2와 동일한 방식으로 인간 모낭 모유두　세포를 배양하고, 일 실시예에 따른 펩타이드를 처리하였다. 이후, 상기 배양물을 PBS로 세척한 후, 300μL의 easy blue (intron, Korea)를 처리하여 RNA를 분리하였다. 이후, 상기 분리한 RNA를 Nano drop으로 정량한 후, 상기 RNA 주형에 대하여, cDNA synthesis kit (enzynomics, Korea)을 이용하여 cDNA 합성을 진행하였다. 이후, 하기 표 2의 프라이머와 PCR premix (enzynomics, Korea)를 이용하여 PCR 반응을 진행한 뒤, 1.5% agarose gel 에 전기영동을 진행하고, Bio-Rad gel image system을 통해, RNA 수준에서의 유전자 발현을 확인하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000002
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 베타-카테닌의 세포질에서 핵으로의 이동이 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 베타-카테닌이 활성화되고, 이에 따라, 이의 하류 표적 유전자인, LEF-1, c-Myc, 및/또는 cyclin D1의 발현이 증가됨을 확인하였다.
실험예 3. 탈모 관련 인자의 발현 억제 효과 확인
본 실험예에서는 탈모 유발 인자인 DKK-1 (Dickkopf-1)의 발현에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2-2와 동일한 방식으로 인간 모낭 모유두　세포를 배양하고, 여기에 일 실시예에 따른 펩타이드를 500mM, 5μM, 또는 50μM씩 분주하면서, DKK-1의 발현 유도 물질인 다이하이드로테스토스테론 (Dihydrotestosterone: DHT)을 첨가하였다. 이후, DKK-1 (cell signaling, USA) 항체를 사용하여, 상기 실험예 2-2와 동일한 방식으로 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 5 μM의 Finasteride를 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 탈모 유발 인자인 DKK-1의 발현을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 외모근초 세포의 활성화 촉진 효과 확인
본 실험예에서는 인간 외모근초 세포 (human hair outer root sheath cell: HHORSC)의 활성화와 연관된 사이토케라틴인 Ha3-II (type I cuticular Ha3-±, Keratin 5, Keratin 14, 및 Keratin 19의 발현에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 외모근초 세포를 4×105　세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후, 상기 세포를 mesenchymal stem cell complete media에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포의 배양 배지를 무혈청 배지 (serum free mesenchymal stem cell complete media)로 교체한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 일 실시예에 따른 펩타이드를 500mM, 5μM, 또는 50μM씩 분주하고, 이를 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 하기 표 3의 프라이머를 사용하여, 상기 실험예 2-3과 동일한 방식으로, RNA 수준에서의 유전자 발현을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 50nM의 EGF를 처리한 군을 사용하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000003
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 외모근초 세포의 활성화 인자인 Ha3-II, Keratin 14, 및 Keratin 19의 발현이 증가됨을 확인하였다.
실험예 5. 모모 세포의 활성화 촉진 효과 확인
본 실험예에서는 인간 모모 세포 (human hair Germinal matrix cell: HHGMC)의 활성화와 연관된 전사인자인 HOXC13 (Homeobox protein Hox-C13), MSX2 (Msh homeobox 2) 및 FOXN1 (Forkhead box protein N1)의 발현에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 모모 세포를 4×105　세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후, 상기 세포를 mesenchymal stem cell complete media에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포의 배양 배지를 무혈청 배지 (serum free mesenchymal stem cell complete media)로 교체한 후, 다시 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 일 실시예에 따른 펩타이드를 500mM, 5μM, 또는 50μM씩 분주하고, 이를 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 하기 표 4의 프라이머를 사용하여, 상기 실험예 2-3과 동일한 방식으로, RNA 수준에서의 유전자 발현을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 비처리군, 양성 대조군으로는 50nM의 EGF를 처리한 군을 사용하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000004
그 결과, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 Peptide-1 또는 Peptide-2에 의해, 모모 세포의 활성화 인자인 HOXC13, MSX2 및 FOXN1의 발현이 증가됨을 확인하였다.
실험예 6. 손상모 개선용 조성물의 제조
본 실험예에서는 일 실시예에 따른 펩타이드(Peptide-1)를 유효성분으로 포함하는 손상모 개선용 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 5에 기재된 성분 및 함량에 따라 미스트 제형의 실시예 1 조성물을 당업계 공지의 방식을 채용하여 제조하였다. 또한, 하기 표 6에 기재된 성분 및 함량에 따라 에멀젼 제형의 실시예 2 조성물을 당업계 공지의 방식을 채용하여 제조하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000005
[표 6]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000006
실험예 7. 손상 모발 인장력 개선 효과 확인
본 실험예에서는 손상 모발의 인장력(탄력)에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 23명의 피실험자를 대상으로 하였으며, 피실험자는 3일동안 1일 1회 샴푸 후 모발을 건조한 뒤 실시예 1의 조성물 또는 실시예 2의 조성물을 모발에 고르게 도포하여 마사지한 뒤 빗질하고 5분간 적용하였다. 이후, 피실험자의 후두 부위에서 모발을 채취한 뒤, MTT175(Miniature Tensile Tester, Diastron Ltd., UK)를 사용하여 시간 경과에 따른 Break Load (모발이 끊어질 때의 힘의 강도, gmf)값을 측정하였다.
실시예 1 및 2의 결과를 각각 하기 표 7 및 8에 나타내었으며, 피실험자 중 1인에 대한 실시예 1 및 2의 결과를 각각 도 15 및 16에 나타내었다. Break Load 값이 증가할수록 모발의 인장력이 개선되었음을 의미한다.
[표 7]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000007
[표 8]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000008
그 결과, 표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 조성물을 처리한 경우 평균 Break Load 값이 1회 사용 직후 15.81 %, 3일 사용 후 33.86 % 증가하였으며, 실시예 2의 조성물을 처리한 경우 1회 사용 직후 18.22 %, 3일 사용 후 38.96 % 증가하였음을 확인하였다. 실시예 1 및 실시예 2의 모두 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후 및 3일 사용 후 모두 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (p<0.001).
상기 결과를 통해, 일 실시예에 따른 펩타이드가 손상 모발 인장도(탄력) 개선에 효과를 가짐을 확인하였다.
실험예 8. 모발 윤기 개선 효과 확인
본 실험예에서는 손상 모발의 윤기(엔젤링)에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 20개의 인모 위그를 대상으로 하였으며, 상기 인모 위그를 샴푸 후 건조시킨 뒤 실시예 1의 조성물 또는 실시예 2의 조성물을 상기 인모 위그에 고르게 도포하여 마사지한 뒤 빗질하고 5분간 적용하였다. 이후, 광택계(Multi Gloss 268 PLUS, Konica Minolta, Japan)를 사용하여 광택계의 60°에서의 Gloss Unit 값을 측정하였다.
실시예 1 및 2의 결과를 각각 하기 표 9 및 10에 나타내었으며, Gloss Unit 값이 증가할수록 모발의 윤기가 개선되었음을 의미한다. 또한, 인모 위그 중 1개의 실시예 1 및 2의 적용 후 디지털카메라 촬영 결과를 각각 도 17 및 18에 나타내었다.
[표 9]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000009
[표 10]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000010
그 결과, 그 결과 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 조성물을 처리한 경우 평균 Gloss Unit 값이 1회 사용 직후 78.61 % 증가하였으며, 실시예 2의 조성물을 처리한 경우 1회 사용 직후 82.15 % 증가하였음을 확인하였다. 실시예 1 및 실시예 2의 모두 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (p<0.001).
상기 결과를 통해, 일 실시예에 따른 펩타이드가 손상 모발 윤기(엔젤링) 개선에 효과를 가짐을 확인하였다.
실험예 9. 손상 모발 거칠기 개선 효과 확인
본 실험예에서는 손상 모발의 거칠기(큐티클)에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실험예 7과 동일한 방법으로 23명의 피실험자에게 실시예 1의 조성물 또는 실시예 2의 조성물을 적용하였다. 이후, 주사전자현미경(S-4700, Hitachi, Japan)을 이용하여 피실험자의 후두부위 모발을 촬영하고, 700배 확대하여 이미지 분석프로그램(Image J, National Institutes of Health, USA)을 이용하여 시간 경과에 따른 모발 표면의 거칠기를 나타내는 변수값 Ra(㎛)를 측정하였다.
실시예 1 및 2의 결과를 각각 하기 표 11 및 12에 나타내었으며, Ra 값이 감소할수록 모발 큐티클 및 모발 거칠기가 개선되었음을 의미한다. 또한, 피실험자 중 1인의 실시예 1 및 2의 처리에 따른 전자 현미경의 촬영 결과를 각각 도 19 및 20에 나타내었다.
[표 11]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000011
[표 12]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000012
그 결과, 표 11 및 표 12에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 조성물을 처리한 경우 평균 Ra 값이 1회 사용 직후 20.04 %, 3일 사용 후 35.64 % 감소하였으며, 실시예 2의 조성물을 처리한 경우 1회 사용 직후 23.59 %, 3일 사용 후 37.94 % 감소하였음을 확인하였다. 실시예 1 및 실시예 2의 모두 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후 및 3일 사용 후 모두 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (p<0.001).
상기 결과를 통해, 일 실시예에 따른 펩타이드가 손상 모발 거칠기(큐티클) 개선에 효과를 가짐을 확인하였다.
실험예 10. 손상 모발 마찰력 개선 효과 확인
본 실험예에서는 손상 모발의 마찰력에 일 실시예에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 20개의 인모 피스(탈색모)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실험예 8과 동일한 방법으로 인모 피스(탈색모)에 대해 실시예 1의 조성물 또는 실시예 2의 조성물을 적용하였다. 이후, 상기 인모 피스에 대해, MTT175 (Miniature Tensile Tester, Dia-stron Ltd., UK)를 사용하여 인모 피스(탈색모)를 모근부위의 모발의 평균 수평 마찰력을 나타내는 Mean Horizontal Force Out 값(gmf/mm)을 측정하였다.
실시예 1 및 2의 결과를 각각 하기 표 13 및 14에 나타내었다. Mean Horizontal Force Out 값이 감소할수록 모발의 마찰력이 개선되었음을 의미한다.
[표 13]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000013
[표 14]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000014
그 결과, 표 13 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 조성물을 처리한 경우 평균 Mean Horizontal Force Out 값이 1회 사용 직후 26.94 % 감소하였으며, 실시예 2의 조성물을 처리한 경우 1회 사용 직후 31.06 % 감소하였음을 확인하였다. 실시예 1 및 실시예 2의 모두 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (p<0.001).
상기 결과를 통해, 일 실시예에 따른 펩타이드가 손상 모발 마찰력 개선에 효과를 가짐을 확인하였다.
실험예 11. 피부이상 반응 평가
상기 실험예 7의 23명의 피실험자에 대해, 상기 조성물 적용 후 피부 이상 반응 발생 여부를 관찰하였다. 그 결과, 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis) 또는 자극성 접촉 피부염(irritant contact dermatitis)에 대한 이상반응은 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 피실험자에게 홍반(붉어짐), 부종(부어오름), 인설(각질), 가려움, 자통(통증), 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림에 대해 보고하도록 하였으며, 그 결과 보고된 피부 이상반응이 없음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 일 실시예에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물이 피부 적용에 적합함을 확인하였다.
제형예 1. 펩타이드 나노좀의 제조
상기 실시예 1의 펩타이드 50mg을 증류수 500ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3ml, 에탄올 50ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후，총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음， 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100nm 정도의 펩타이드 나노좀을 제조하였다.　
제형예 2. 화장수
일 실시예에 따른 펩타이드를 포함하며, 하기의 조성으로 이루어진 화장수를 당업계 공지의 방식을 채용하여 제조하였다.
[표 15]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000015
제형예 3. 영양 크림
일 실시예에 따른 펩타이드를 포함하며, 하기의 조성으로 이루어진 영양 크림을 당업계 공지의 방식을 채용하여 제조하였다.
[표 16]
Figure PCTKR2023017241-appb-img-000016
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기 (acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기 (fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기 (formyl group), 팔미토일기 (palmitoyl group), 미리스틸기 (myristyl group), 스테아릴기 (stearyl group), 부톡시카르보닐기 (butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기 (allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기 (amino group, -NH2), 삼차 알킬기 (tertiary alkyl group) 및 아자이드 (azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것인, 펩타이드:
    (a) 모낭 모유두 세포의 증식 또는 활성화 촉진;
    (b) 외모근초 세포의 활성화 촉진;
    (c) 모모 세포의 활성화 촉진; 및
    (d) DKK-1 (Dickkopf-related protein 1)의 발현 억제.
  5. Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 손상모 개선용 화장료 조성물.
  6. Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  7. Arg(R)-Cys(C)-Cys(C)-Gly(G) 또는 Glu(E)-Glu(E)로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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