WO2024090518A1 - イムノクロマト試験片 - Google Patents

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WO2024090518A1
WO2024090518A1 PCT/JP2023/038694 JP2023038694W WO2024090518A1 WO 2024090518 A1 WO2024090518 A1 WO 2024090518A1 JP 2023038694 W JP2023038694 W JP 2023038694W WO 2024090518 A1 WO2024090518 A1 WO 2024090518A1
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WO
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substance
antibody
measured
flu
detection
Prior art date
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PCT/JP2023/038694
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English (en)
French (fr)
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淳 岡本
陽菜 市川
研吾 西村
光佑 柚原
宇洋 枡屋
Original Assignee
東洋紡株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic test strip, a kit including the immunochromatographic test strip, and a method for detecting a substance to be measured.
  • Patent Document 1 discloses a non-specific reaction inhibitor that contains immunoglobulin and rabbit immunoglobulin derived from the same animal species as the animal from which the antibody used in the immunoassay is derived.
  • Patent Document 2 describes the use of immunoglobulins derived from the same animal species as the capture substance and having the same subclass as the capture substance to suppress non-specific reactions.
  • Item 1 A method for detecting a substance to be measured by immunochromatography, comprising: forming a complex between the substance to be measured and a detection antibody that labels a detection particle in the presence of a false positive suppressor; and capturing the complex with a capture antibody, A detection method, wherein the false positive suppressor comprises an immunoglobulin derived from a goat or horse that does not specifically bind to the substance to be measured.
  • Item 2. Item 2. The detection method according to Item 1, wherein the substance to be measured is an antigen derived from a microorganism that causes an infectious disease.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. The method of detecting an upper respiratory tract infection according to Item 3, wherein the causative virus is one or more selected from the group consisting of influenza virus A (Flu-A), influenza virus B (Flu-B), respiratory syncytial virus (RSV), and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).
  • Item 6. The immunochromatographic test piece according to item 5, wherein the membrane has a plurality of capture antibody immobilization sections, and the capture antibodies immobilized at each of the plurality of sections bind to a measurement target substance derived from a pathogenic microorganism of a different infectious disease.
  • An immunochromatography kit comprising the immunochromatography test piece according to item 6, a specimen collection tool, a filter unit, and a measurement sample dilution solution.
  • Item 8. Item 8.
  • Item 9. (1) a sample pad for allowing a measurement sample to penetrate therein; (2) a conjugation pad carrying a detection antibody that labels a detection particle that specifically binds to a substance to be measured; (3) a membrane having a capture antibody immobilization portion in which a capture antibody that specifically binds to a substance to be measured is immobilized in a linear form; (4) an absorbent pad; An immunochromatographic test strip comprising: An immunochromatographic test piece, wherein the sample pad or the conjugation pad carries, as a false positive inhibitor, immunoglobulin derived from a goat or a horse and which does not specifically bind to a substance to be measured.
  • An immunochromatography kit comprising the immunochromatography test piece according to item 9, a specimen collection tool, a filter unit, and a measurement sample dilution solution.
  • the substance to be measured can be detected with high accuracy. In addition, when there are multiple substances to be measured, they can be detected simultaneously with high accuracy.
  • FIG. 1 is a plan view showing an example of an immunochromatographic test piece.
  • FIG. 2 is a side view showing an example of an immunochromatographic test piece. An example of the configuration of the kit is shown below.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for detecting an analyte by immunochromatography.
  • the detection method involves forming a complex between the substance to be measured and a detection antibody that labels a detection particle in the presence of a false positive inhibitor, and capturing the complex with a capture antibody.
  • Immunochromatography is a method for detecting antigens and antibodies on a membrane filter.
  • a sample pad 1 onto which the measurement sample solution is dropped and permeated, a conjugation pad 2 carrying detection antibodies previously labeled with detection particles, and a membrane 3 on which a capture antibody is immobilized are prepared.
  • the sample pad 1, conjugation pad 2, and membrane 3 are connected in this order to prepare an immunochromatographic test piece 100.
  • a sample which is a measurement sample solution, or a mixture of a sample and a buffer is dropped onto the sample pad 1
  • the measurement sample solution permeates through the sample pad 1, conjugation pad 2, and membrane 3 in that order.
  • the substance to be measured and the detection antibody come into contact with each other as the measurement sample solution permeates through the conjugation pad 2, forming a complex between the substance to be measured and the detection antibody.
  • the complex flows on the membrane 3 in accordance with the permeation flow of the measurement sample solution, and is captured by the immobilized capture antibody. As the detection particles are concentrated due to the capture, the complex between the substance to be measured and the detection antibody is visualized.
  • the substance to be measured detected in one immunochromatographic test piece 100 may be one type, but it may also be multiple different types of substances to be measured. In this case, multiple different capture antibodies that bind to the substance to be measured are immobilized at different positions on the membrane 3.
  • the detection antibodies also include detection antibodies that bind to the substance to be measured.
  • Samples include, for example, nasal mucus, pharyngeal scraping, sputum, bronchial scraping, bronchial aspirate, pleural fluid, ascites, urine, blood samples (whole blood, serum, plasma), gastric juice, stool, etc.
  • nasal mucus, pharyngeal scraping, sputum, bronchial scraping, bronchial aspirate, pleural fluid, etc. are preferred.
  • the specimen may be used as the measurement sample solution as it is, or the specimen collected with a cotton swab may be dissolved in a measurement sample dilution solution or the like and used as the measurement sample solution.
  • the measurement sample dilution solution preferably contains a nonionic surfactant that improves the spread of the measurement sample and does not affect the immune reaction.
  • the nonionic surfactant is not particularly limited, but examples thereof include polyoxyethylene alkylphenyl ether (Triton (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene alkyl ether (Brij (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, alkyl glucoside, sucrose fatty acid ester, etc.
  • the surfactant may be used alone or in combination of two or more types.
  • the concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.01 to 5.0% by mass, more preferably 0.05 to 4.0% by mass, and even more preferably 0.1 to 3.0% by mass. If the concentration is lower than 0.01% by mass, downstream spread may be difficult. Furthermore, the spread may be non-uniform, resulting in reduced measurement accuracy. On the other hand, if the concentration is higher than 5.0% by mass, the detection particles and the antibody, and/or the membrane and the antibody, which are physically adsorbed, may separate, and a measurement value may not be obtained. In addition, inorganic salts or a buffer used for adjusting pH may be added to the measurement sample dilution solution.
  • any type of buffer may be used as long as it has sufficient buffering capacity in the target pH range
  • examples of the buffer include tris, phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, and Good's buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, cholamine hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycine amide, and bicine).
  • tris, phosphoric acid, MES, PIPES, TES, and HEPES are preferred, and tris, phosphoric acid, and PIPES are more preferred, because they have sufficient buffering capacity in the optimal pH range of the antibody used in the present invention, around 7.0.
  • the substance to be measured is not limited as long as it is a substance that can be detected by immunochromatography utilizing an antigen-antibody reaction.
  • the substance to be measured include antigens (proteins, lipids, carbohydrates, etc.) derived from infectious disease-causing microorganisms.
  • the pathogenic microorganism of an infectious disease is a virus.
  • a virus a virus causing an upper respiratory tract infection is preferable.
  • examples of the virus causing an upper respiratory tract infection include influenza virus A (Flu-A), influenza virus B (Flu-B) (RSV), respiratory syncytial virus, and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).
  • More preferred antigens include the nucleocapsid protein (N protein) of influenza virus A, the N protein of influenza virus B, the fusion protein (F protein) of respiratory syncytial virus, and the N protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.
  • the detection antibody is intended to be an antibody that binds to the detection particle and is capable of binding to the substance to be measured.
  • the antibody constituting the detection antibody is not limited as long as it binds to the substance to be measured and does not interfere with the binding to the capture antibody.
  • the detection antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the detection antibody may be of any isotype, for example, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, etc., but is preferably IgG.
  • the detection antibody may be a commercially available product or may be produced by a known method.
  • the antibody constituting the detection antibody may be mouse-derived anti-Flu-A N protein monoclonal antibody 1 (3IN5, InA245, manufactured by HyTest Co., Ltd.).
  • the antibody constituting the detection antibody may be mouse-derived anti-Flu-B N protein monoclonal antibody 1 (1131, manufactured by ViroStat Co., Ltd.).
  • the antibody constituting the detection antibody can be mouse-derived anti-RSV F protein monoclonal antibody 1 (3ReS21cc, manufactured by HYTEST).
  • mouse-derived anti-RSV F protein monoclonal antibody 1 3ReS21cc, manufactured by HYTEST.
  • SCV-108 mouse-derived anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibody 1 (SCV-108, manufactured by Toyobo) can be used.
  • Detection particles are particles that visualize the binding between the substance to be measured and the antibody.
  • detection particles include cellulose-based colored microparticles, gold colloid particles, and latex particles.
  • the cellulose-based colored microparticles have a large amount of hydroxyl groups, and therefore can hold many reactive dyes by covalent bonds, and can also maintain stable dispersibility in water even after dyeing.
  • As the cellulose-based colored microparticles regenerated cellulose, purified cellulose, natural cellulose, etc. can be used, and partially derivatized cellulose can also be used. It is preferable that 20 to 90% by mass of the mass of the cellulose-based colored microparticles is derived from cellulose, more preferably 20 to 80% by mass, and even more preferably 20 to 70% by mass.
  • the average particle diameter of the cellulose-based colored microparticles is not particularly limited, but is preferably 100 nm to 1000 nm, and more preferably 200 nm to 800 nm. If the average particle diameter is large, downstream development will be slower, and the measurement time will be longer. In addition, they will be more likely to be captured on the membrane, and the background itself will develop color, making the color development at the capture antibody solid-phase area and the control line unclear. On the other hand, if the average particle diameter is small, the amount of antibody that can be physically adsorbed or chemically bound will decrease, and the measurement sensitivity will decrease.
  • the cellulose-based colored microparticles include colored cellulose nanobeads (NanoAct (registered trademark)) manufactured by Asahi Kasei Corporation.
  • the color of the cellulose-based colored microparticles is not particularly limited, but examples include red, orange, yellow, green, blue, navy blue, purple, black, and fluorescent.
  • red and blue are preferred because the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Red (RE2) is 240, the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Blue (BL2) is 265, the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Green (GR1) is 160, and the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Black (KR1) is 150.
  • the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Red (RE2) is 240
  • the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Blue (BL2) is 265
  • the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Green (GR1) is 160
  • the OD at a particle concentration of 1% by mass of NanoAct (registered trademark) Black (KR1) is 150.
  • each detection antibody when detecting multiple different types of measurement target substances using one immunochromatographic test strip, each detection antibody may be labeled with detection particles of different colors.
  • the method of binding the antibody constituting the detection antibody to the colored cellulose microparticles is publicly known.
  • the antibody constituting the detection antibody and the colored cellulose microparticles can be mixed and left to stand at room temperature to about 37°C for a certain period of time to bind the two.
  • the capture antibody is an antibody that is immobilized on a membrane and captures a complex of the substance to be measured and the detection antibody bound to cellulose-based colored microparticles (hereinafter also referred to as the "detection antibody-substance to be measured complex").
  • the capture antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred.
  • the capture antibody may be of any isotype, for example, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, etc., but IgG is preferred.
  • the capture antibody may be a commercially available product or may be produced by a known method.
  • the antibody constituting the detection antibody may be mouse-derived anti-Flu-A N protein monoclonal antibody 2 (100083, manufactured by Medix Biocamica).
  • the antibody constituting the detection antibody can be mouse-derived anti-Flu-B N protein monoclonal antibody 2 (3IF18/RIF17, R2/3, manufactured by HyTest).
  • the antibody constituting the detection antibody can be mouse-derived anti-RSV F protein monoclonal antibody 2 (C01773M, manufactured by Meridian).
  • the antibody constituting the detection antibody can be mouse-derived anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibody 2 (SCV-109, manufactured by Toyobo).
  • the antibody constituting the detection antibody and the capture antibody may be the same or different, but it is more preferable that they are different.
  • the animals from which the antibodies constituting the detection antibodies and the capture antibodies are obtained are not limited. Examples include rabbits, mice, rats, guinea pigs, pigs, and camels. It is preferable that the animals from which the antibodies constituting the detection antibodies and the capture antibodies are obtained do not include goats and horses.
  • the main component of the false positive suppressor is an immunoglobulin derived from a goat or a horse.
  • the subclass of the immunoglobulin may be any of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. IgG is preferable. The subclass of IgG is not limited. It is preferable that the immunoglobulin does not specifically bind to the measured substance. When the substance to be measured is derived from RS virus, it is preferable to use immunoglobulin derived from a horse.
  • the amount of goat or horse-derived immunoglobulin carried per immunochromatographic test strip is preferably about 25 to 250 ⁇ g, and more preferably about 50 to 100 ⁇ g. If the amount carried is less than 25 ⁇ g, a sufficient false positive suppression effect cannot be obtained. On the other hand, if the amount carried is more than 250 ⁇ g, no further false positive suppression effect can be obtained and there is a risk of a decrease in sensitivity. False positive suppressors may include immunoglobulins derived from goats or horses, as well as blocking agents such as casein, bovine serum albumin (BSA), and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the false positive suppressant may be supported in advance on the sample pad 1. It may also be supported on the conjugation pad 2 together with the detection antibody. Alternatively, it may be supported in the membrane 3 on which the capture antibody is immobilized. When the false positive suppressant is supported in the membrane 3, it is preferable to support it upstream of the capture antibody immobilization section 6 described below.
  • the false positive suppressant may be added to the measurement sample dilution solution.
  • supported refers to the ability of goat or horse-derived immunoglobulins to move along with the flow of water when the water penetrates, and is distinct from solid-phase immobilization.
  • Immunochromatographic Test Strip One embodiment of the present invention relates to an immunochromatographic test strip 100 for detecting a target substance.
  • FIG. 1 shows a plan view of the immunochromatographic test strip 100.
  • Figure 2 shows a side view of the immunochromatographic test strip 100.
  • the side where the measurement sample solution is dropped at the start of the test (the left side in Figs. 1 and 2) is the upstream side.
  • a sample pad 1 having a measurement sample dropping section 20 and into which the measurement sample dropped to the measurement sample dropping section 20 permeates, a conjugation pad 2 carrying a detection antibody, a membrane 3 on which a capture antibody is immobilized, and an absorption pad 4 which absorbs the measurement sample solution that has passed through the membrane 3 are arranged in this order.
  • the membrane 3 is illustratively provided with a first capture antibody solid-phase section 6, a second capture antibody solid-phase section 7, a third capture antibody solid-phase section 8, a fourth capture antibody solid-phase section 9, and a control capture antibody solid-phase section 10.
  • capture antibodies that bind to different substances to be measured are immobilized at multiple locations.
  • Fig. 1 and Fig. 2 each of the capture antibody immobilized parts 6, 7, 8, 9 and the control capture antibody immobilized part 10 are shown linearly by dashed lines and oblique lines, but in an unused immunochromatographic test strip 100, there are no visible boundaries or regions in these parts.
  • the substance to be measured first reacts with the detection antibody bound to the detection particle carried in the conjugation pad 2 to form a detection antibody-substance to be measured complex. Furthermore, the detection antibody-substance to be measured complex permeates into the membrane 3 according to the permeation flow of the measurement sample solution.
  • the substance to be measured reacts with any of the capture antibody immobilized parts 6, 7, 8, 9, the substance to be measured in the detection antibody-substance to be measured complex is bound to the capture antibody in that capture antibody immobilized part and captured.
  • This reaction concentrates the detection particles bound to the detection antibodies, and the capture antibody immobilized parts 6, 7, 8, and 9 corresponding to the substance to be measured are visualized.
  • the color of the visualization depends on the color of the detection particles labeled with each detection antibody.
  • the detection antibodies in the detection antibody-substance to be measured complex are captured by the control capture antibodies provided downstream of the capture antibody immobilized parts 6, 7, 8, and 9, concentrating the detection particles, and the control capture antibody immobilized part 10 is visualized.
  • the control capture antibody is an anti-immunoglobulin antibody or the like corresponding to the animal from which the antibody constituting the detection antibody is derived.
  • the conjugation pad 2 contains detection antibodies that bind to the substance to be measured derived from pathogenic microorganisms of infectious diseases, and when each of the detection particles is labeled with a different color, the colors of these detection particles may mix and show a color different from that of any of the capture antibody immobilized parts 6, 7, 8, and 9.
  • reference numeral 12 indicates the junction between the sample pad 1 and the conjugation pad 2.
  • Reference numeral 23 indicates the junction between the conjugation pad 2 and the membrane 3.
  • Reference numeral 34 indicates the junction between the membrane 3 and the absorbent pad 4.
  • the connecting portions 12, 23, and 34 have an interlocking structure in which the projections and recesses interlock with each other.
  • the reference numeral 11 denotes an adhesive sheet.
  • the reference numeral 5 denotes a backing sheet, which is a support.
  • the sample pad 1, the conjugation pad 2, the membrane 3, and the absorption pad 4 are connected and fixed on the backing sheet 5 by the adhesive sheet 11.
  • the immunochromatographic test piece can be in the form of a long, thin strip measuring 3 to 5 mm wide (preferably about 4 mm) and 40 to 100 mm long (preferably about 60 mm).
  • Figures 1 and 2 show an immunochromatographic test strip 100 for detecting four types of target substances
  • the number of target substances detected in one immunochromatographic test strip 100 can be selected from 1, 2, 3, or 4.
  • the sample pad 1 is not particularly limited as long as it is made of a material that can rapidly absorb the measurement sample and then spread to the downstream conjugation pad, membrane, or absorption pad. Examples include cellulose filter paper or nonwoven fabric, glass filter paper or nonwoven fabric, polyester filter paper or nonwoven fabric, and polyethylene filter paper or nonwoven fabric. Among these, cellulose filter paper is preferred.
  • the thickness of the sample pad 1 is preferably 0.1 to 2.0 mm, and more preferably 0.2 to 1.0 mm. If the thickness is small, the flow of the measurement sample downstream may become uneven, resulting in reduced measurement accuracy. On the other hand, if the thickness is large, downstream spread may be slow and the measurement time may be long. Also, a larger amount of measurement sample is required for downstream spread.
  • the membrane 3 is not particularly limited as long as it can spread the measurement sample uniformly with high accuracy, but examples include membranes made of cellulose, cellulose derivatives, nitrocellulose, cellulose acetate, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, or nylon. Among these, membranes made of nitrocellulose are preferred.
  • the conjugation pad 2 is not particularly limited as long as it is made of a material that can hold the complex between the detection particle and the detection antibody in a dry state and can quickly release the complex as the measurement sample develops downstream.
  • the material include cellulose filter paper or nonwoven fabric, glass filter paper or nonwoven fabric, polyester filter paper or nonwoven fabric, and polyethylene filter paper or nonwoven fabric. Among these, glass filter paper is preferred.
  • the thickness of the conjugation pad 2 is preferably 0.1 mm to 2.0 mm, and more preferably 0.2 mm to 1.0 mm. If the thickness is small, it may not be possible to hold the desired amount of the complex in a dry state. On the other hand, if the thickness is large, downstream development may be slow and the measurement time may be long. In addition, a larger amount of measurement sample is required for downstream development.
  • the absorbent pad 4 is not particularly limited as long as it can quickly absorb the measurement sample developed from the upstream and then hold it so as not to flow back, and examples thereof include cellulose filter paper or nonwoven fabric, glass filter paper or nonwoven fabric, polyester filter paper or nonwoven fabric, and polyethylene filter paper or nonwoven fabric. Among these, cellulose filter paper is preferred.
  • the thickness of the absorbent pad 4 is preferably 0.2 to 5.0 mm, and more preferably 0.5 to 2.0 mm. If the thickness is small, the measurement sample once absorbed in the absorbent pad may flow back to the membrane side depending on the amount of the measurement sample dropped.
  • Immunochromatographic test strip 100 may be stored in a folder 30 molded from, for example, plastic.
  • Immunochromatography Kit One embodiment of the present invention relates to an immunochromatography kit 50 that includes an immunochromatography test strip 100.
  • Figure 3 shows an example of the configuration of the kit.
  • the kit 50 comprises an immunochromatographic test strip 100, a specimen collecting tool 52, a filter unit 54, and a measurement sample dilution solution 56.
  • the kit 50 is used to detect the measurement target substance described in 1 above.
  • the immunochromatographic test strip 100 is stored in a folder 30 .
  • the specimen collection tool 52 is, for example, a cotton swab.
  • the cotton swab is used to collect throat swabs, nasal mucus, nasal swabs, nasal aspirates, bronchial scrapings, etc.
  • the measurement sample dilution liquid 56 is as described in 1. above.
  • the measurement sample dilution liquid 56 is stored in a test tube 58 with a lid 59, for example, of about 1 mL to 2 mL.
  • the test tube 58 has enough elasticity to bring the sides close together when pressed with a human finger.
  • the filter unit 54 is shaped so that it can be attached to the test tube 58, and a filter is provided within the filter unit 54.
  • the filter may be of a single type, but may be a combination of filters made of different materials, pore sizes, or retention particle sizes.
  • the pore size or retention particle size of the filter is preferably 10 to 500 ⁇ m.
  • the pore size or retention particle size of the first filter is preferably 50 to 500 ⁇ m
  • the pore size or retention particle size of the first filter is preferably 10 to 50 ⁇ m.
  • the filter of the test tube 58 is a foam made of polyvinyl alcohol resin
  • the filter on the drip port 55 side is a cellulose filter paper.
  • the pore size or retained particle size can be measured using a perm porometer.
  • the sample collection tool 52 is a cotton swab
  • the sample is collected using the cotton part of the swab.
  • the cotton part of the swab with the sample attached thereto is inserted into the measurement sample dilution liquid 56 in the test tube 58 with the lid 59 removed, and the cotton part is stirred and squeezed out.
  • the test tube 58 can be deformed by pressure from a human finger, so that the cotton part of the swab inside the test tube 58 can be pressed from the outside of the test tube 58 to squeeze out the attached sample from the cotton part.
  • the solution remaining after squeezing out the sample in this test tube 58 becomes the measurement sample solution.
  • the filter unit 54 is set in the test tube 58.
  • the filter unit 54 is provided with a drip port 55, from which the measurement sample solution is dripped into the measurement sample dripping section 20.
  • Example 1 (1) Preparation of a complex of antibody A1 and cellulose-based colored microparticle A 100 ⁇ L of 1.0% by mass blue cellulose-based colored microparticle A (NanoAct (registered trademark), BL2: Dark Navy, average particle size 365 nm, manufactured by Asahi Kasei Corporation), 900 ⁇ L of 10 mM Tris buffer (204-07885, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH 8.0), and 100 ⁇ L of 1.0 mg/mL mouse-derived anti-Flu-A N protein monoclonal antibody 1 (3IN5, InA245, manufactured by HyTest Co., Ltd.) as antibody A1 were added to a 15 mL centrifuge tube and stirred with a vortex.
  • a washing solution (pH 10.0) consisting of 50 mM borate buffer (021-02195, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was treated for 10 seconds with an ultrasonic disperser (UH-50, SMT Co., Ltd.).
  • UH-50, SMT Co., Ltd. an ultrasonic disperser
  • centrifugation was performed at 13,000 ⁇ g for 15 minutes at 25 ° C. to precipitate the antibody-reacted cellulose-based colored microparticles, and the supernatant was removed.
  • a coating solution consisting of 15% by mass of sucrose (196-00015, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.2% by mass of casein (030-01505, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 4.0 mg / mL of horse IgG (SLE-56, manufactured by Equitech-Bio Co., Ltd.) as a false positive inhibitor, and 62 mM borate buffer (021-02195, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was treated for 10 seconds with an ultrasonic disperser (UH-50, manufactured by SMT Co., Ltd.) to obtain a complex 1 of antibody A1 and cellulose-based colored microparticle A.
  • a complex 1 of antibody C1 and cellulose-based colored microparticle A was obtained in the same manner as in (1) Preparation of a complex of antibody A1 and cellulose-based colored microparticle A, except that mouse-derived anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibody 1 (SCV-108, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as antibody C1 instead of antibody A1.
  • SCV-108 mouse-derived anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibody 1
  • Antibody A2 was prepared using 2.0 mg/mL mouse-derived anti-Flu-A N protein monoclonal antibody 2 (100083, Medix).
  • antibody B1 2.0 mg/mL mouse-derived anti-Flu-B N protein monoclonal antibody 2 (3IF18/RIF17, R2/3, manufactured by HyTest) was prepared; as antibody B2, 2.0 mg/mL mouse-derived anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibody 2 (SCV-109, manufactured by Toyobo) was prepared; as antibody C2, 2.0 mg/mL mouse-derived anti-RSV F protein monoclonal antibody 2 (C01773M, manufactured by Meridian) was prepared; and as antibody E, 1.0 mg/mL rabbit-derived anti-mouse IgG polyclonal antibody (A90-117A, manufactured by BETHYL) was prepared.
  • the antibody C2 was applied at a coating amount of 1.0 ⁇ L/cm to a position 5 mm from the upstream side of the membrane part of a 60 mm x 300 mm membrane card (Hi-Flow Plus 120 Membrane Cards, HF120, Millipore) consisting of a 20 mm x 300 mm adhesive tape part on the upstream side, a 25 mm x 300 mm membrane part in the center, and a 15 mm x 300 mm adhesive tape part on the downstream side.
  • a dispensing platform XYZ3060, BIODOT
  • BHQHR-XYZ, BIODOT BioJet nozzle
  • the antibody B2 was applied at a coating amount of 1.0 ⁇ L/cm at a position 8 mm from the downstream side
  • the antibody A2 was applied at a coating amount of 1.0 ⁇ L/cm at a position 11 mm from the upstream side of the membrane part
  • the antibody D2 was applied at a coating amount of 1.0 ⁇ L/cm at a position 14 mm from the upstream side of the membrane part
  • the antibody E was applied at a coating amount of 1.0 ⁇ L/cm at a position 17 mm from the upstream side of the membrane part, and then dried at 45°C for 30 minutes to form a capture antibody immobilized part and a control line with a line width of about 1 mm, thereby obtaining a membrane card 1 for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2.
  • a 20 mm x 300 mm absorbent pad (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, manufactured by Millipore) was attached to the 15 mm x 300 mm adhesive tape portion downstream of the membrane card 1 for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 so as to overlap the membrane portion by 5 mm.
  • a guillotine cutting module (CM5000, manufactured by BIODOT) was used to cut the membrane into a strip shape having a width of 4 mm and a length of 60 mm, thereby obtaining an immunochromatographic test piece 1 for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2.
  • the obtained immunochromatographic test piece 1 for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 was stored in a housing case (K007, manufactured by Shengfeng Plastics Co., Ltd.) to obtain an immunochromatographic device I for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2.
  • Flu-A samples were obtained by diluting commercially available Flu-A N protein (610171, Medix) with the measurement sample dilution solution to 50 ng/mL.
  • Flu-B samples were obtained by diluting commercially available Flu-B N protein (610172, Medix) with the measurement sample dilution solution to 20 ng/mL.
  • RSV samples were obtained by diluting commercially available RSV antigen (8175, Meridian) with the measurement sample dilution solution to 5 ⁇ g/mL.
  • a commercially available SARS-CoV-2 N protein (230-30164, manufactured by RayBiotech) was diluted to 2 ng/mL with the measurement sample dilution solution to obtain a SARS-CoV-2 sample.
  • the four capture antibody immobilized portions on the membrane were visually judged, and the ratio of any line that was visible, that is, the appearance of a false positive, was calculated as the false positive rate, and only 0% was judged to be good. As a result, the false positive rate was 0%, and it was therefore determined that there were no false positives with the device of Example 1.
  • the reflection absorbance (mAbs) of the four capture antibody immobilized parts on the membrane was measured using an immunochromato reader (C10060-10, measurement mode: Gold Colloid, Line (when measuring red line) or Latex, Line (when measuring blue or green line), manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • the reflection absorbance (mAbs) of the four capture antibody immobilized parts obtained was compared with that of the immunochromato device V for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 in Comparative Example 1, and a device in which the reflection absorbance (mAbs) could be maintained at 80% or more was judged to be excellent, and a device in which the reflection absorbance (mAbs) could be maintained at 70-80% was judged to be good.
  • all four capture antibody immobilized portions had a sensitivity retention rate of 80% or more, and therefore it was determined that there was no inhibition of sensitivity by the false positive inhibitor in the device of Example 1.
  • Example 2 (13) Preparation of false positive inhibitor-supported sample pads
  • a 15 mm x 300 mm sample pad (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore) was coated with a coating solution (pH 9.2) consisting of 2.0 mg / mL horse IgG (SLE-56, Equitech-Bio) and 62 mM borate buffer (021-02195, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) as a false positive inhibitor, uniformly coated in an amount of 60 ⁇ L / cm on the entire surface of the sample pad (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, Millipore). Then, the coating solution was dried at 45 ° C. for 30 minutes to obtain a false positive inhibitor-supported sample pad 1.
  • An immunochromatographic device II for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 was obtained in the same manner as in Comparative Example 1, except that the false positive inhibitor-loaded sample pad 1 was used instead of the 15 mm x 300 mm sample pad (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS, CFSP002000, manufactured by Millipore). The evaluation results of the obtained device are shown in Table 1.
  • Example 3 An immunochromatographic device III for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 was obtained in the same manner as in Example 1, except that 4.0 mg/mL goat IgG (SLG-56, manufactured by Equitech-Bio) was used instead of 4.0 mg/mL horse IgG (SLE-56, manufactured by Equitech-Bio) as a false positive inhibitor.
  • the evaluation results of the obtained device are shown in Table 1.
  • Example 4 An immunochromatographic device IV for detecting Flu-A, Flu-B, RSV, and SARS-CoV-2 was obtained in the same manner as in Example 2, except that 2.0 mg/mL goat IgG (SLG-56, manufactured by Equitech-Bio) was used instead of 2.0 mg/mL horse IgG (SLE-56, manufactured by Equitech-Bio) as a false positive inhibitor.
  • the evaluation results of the obtained device are shown in Table 1.
  • the present invention provides an immunochromatographic test strip capable of simultaneously and highly sensitively detecting the N protein of Flu-A, the N protein of Flu-B, the F protein of RSV, and the N protein of SARS-CoV-2.

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Abstract

測定対象物質を高精度に検出し得る検出方法を提供することを一課題とする。　偽陽性抑制剤の存在下で、測定対象物質と、検出粒子を標識した検出抗体との複合体を形成させること、及び前記複合体を捕捉抗体により捕捉することを含む、イムノクロマトグラフィーによる測定対象物質の検出方法であって、前記偽陽性抑制剤は、ヤギまたはウマに由来し測定対象物質に特異的に結合しないイムノグロブリンを含む、検出方法により、課題を解決する。

Description

イムノクロマト試験片
　本発明は、イムノクロマト試験片、およびイムノクロマト試験片を含むキット、及び測定対象物質の検出方法に関する。
　特許文献１には、免疫測定に用いる抗体が由来する動物と同一の動物種に由来する免疫グロブリン及びウサギ免疫グロブリンを含有する非特異反応抑制剤が開示されている。
　特許文献２には、捕捉物質と同一の産生動物種由来でありかつ同一のサブクラスを有する免疫グロブリンを使用して非特異的反応を抑制することが記載されている。
特開２０１０－０２５８６６号公報 特開２００９－１３３７３９号公報
　本発明は、測定対象物質を高精度に検出し得る検出方法、イムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットを提供することを一課題とする。また本発明は、複数種の異なる測定対象物質を同時かつ高精度に検出し得る検出方法、イムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とする。
　本発明の代表例として以下の実施形態を含む。
項１．
　偽陽性抑制剤の存在下で、測定対象物質と、検出粒子を標識した検出抗体との複合体を形成させること、及び
　前記複合体を捕捉抗体により捕捉すること
を含む、イムノクロマトグラフィーによる測定対象物質の検出方法であって、
　前記偽陽性抑制剤は、ヤギまたはウマに由来し測定対象物質に特異的に結合しないイムノグロブリンを含む、検出方法。
項２．
　前記測定対象物質が、感染症の原因微生物に由来する抗原である、項１に記載の検出方法。
項３．
　前記感染症の原因微生物が、上気道感染症の原因ウイルスである、項２記載の検出方法。
項４．
　上気道感染症の原因ウイルスが、インフルエンザウイルスＡ（Ｆｌｕ－Ａ）、インフルエンザウイルスＢ（Ｆｌｕ－Ｂ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）よりなる群から選択される１または複数種である、項３に記載の検出方法。
項５．
　測定対象物質に特異的に結合する捕捉抗体を線状に固相化した捕捉抗体固相化部を備えるメンブレンと、測定試料滴下部と、を備える、項１に記載の検出方法に使用するためのイムノクロマト試験片。
項６．
　前記メンブレンは捕捉抗体固相化部を複数箇所備え、前記複数箇所の各箇所に固相化される捕捉抗体はそれぞれ異なる感染症の病原微生物に由来する測定対象物質と結合する、項５に記載のイムノクロマト試験片。
項７．
　項６に記載のイムノクロマト試験片、検体採取具、フィルターユニット、測定試料希釈液を備える、イムノクロマトキット。
項８．
　測定試料希釈液が、偽陽性抑制剤を含む、項７に記載のイムノクロマトキット。
項９．
　（１）測定試料を浸透させるサンプルパッドと、
　（２）測定対象物質と特異的に結合する検出粒子を標識した検出抗体を担持したコンジュゲーションパッドと、
　（３）測定対象物質と特異的に結合する捕捉抗体を線状に固相化した捕捉抗体固相化部を備えるメンブレンと、
　（４）吸収パッドと、
から構成されるイムノクロマト試験片であって、
　前記サンプルパッド又は前記コンジュゲーションパッドは偽陽性抑制剤としてヤギまたはウマに由来し測定対象物質に特異的に結合しないイムノグロブリンを担持する、イムノクロマト試験片。
項１０．
　項９に記載のイムノクロマト試験片、検体採取具、フィルターユニット、測定試料希釈液を備える、イムノクロマトキット。
　測定対象物質を高精度に検出し得る。また、測定対象物質が複数であるとき、これらを同時に高精度に検出し得る。
イムノクロマト試験片の一例を示す平面図である。 イムノクロマト試験片の一例を示す側面図である。 キットの構成の一例を示す。
１．イムノクロマトグラフィーによる測定対象物質の検出方法
　本発明のある実施形態は、イムノクロマトグラフィーによる測定対象物質の検出方法に関する。
　検出方法は、偽陽性抑制剤の存在下で、測定対象物質と、検出粒子を標識した検出抗体との複合体を形成させること、及び前記複合体を捕捉抗体により捕捉することを含む。　イムノクロマトグラフィーは、メンブレンフィルター上で、抗原や抗体を検出する方法である。
　より具体的には、例えば、測定試料溶液を滴下、浸透させるサンプルパッド１と、あらかじめ検出粒子を標識した検出抗体を担持させたコンジュゲーションパッド２と、捕捉抗体を固相化したメンブレン３を準備する。サンプルパッド１、コンジュゲーションパッド２、メンブレン３の順に連接し、イムノクロマト試験片１００を作製する。測定試料溶液である検体、又は検体とバッファーの混合液をサンプルパッド１に滴下すると、測定試料溶液がサンプルパッド１、コンジュゲーションパッド２、メンブレン３の順に浸透する。検体に測定対象物質が含まれる場合、測定試料溶液がコンジュゲーションパッド２に浸透していく過程において、測定対象物質と検出抗体とが接触し、測定対象物質と検出抗体の複合体が形成される。複合体は、測定試料溶液の浸透していく流れにしたがってメンブレン３上を流れ、固相化した捕捉抗体に捕捉される。捕捉に伴う検出粒子の濃縮に伴って測定対象物質と検出抗体の複合体が可視化される。
　１つのイムノクロマト試験片１００において検出される測定対象物質は、１種であってもよいが、複数種の異なる測定対象物質であってもよい。この場合、メンブレン３の異なる位置に、複数種の異なる捕捉抗体であって、測定対象物質に対応して結合する捕捉抗体が固相化される。また、検出抗体も、測定対象物質に対応して結合する検出抗体を含む。
　検体は、例えば、鼻汁、咽頭擦過物、喀痰、気管支擦過物、気管支吸引物、胸水、腹水、尿、血液試料（全血、血清、血漿）、胃液、便等である。中でも、鼻汁、咽頭擦過物、喀痰、気管支擦過物、気管支吸引物、胸水等が好ましい。
　検体はそのまま測定試料溶液として使用してもよいが、綿棒で採取した検体を測定試料希釈液等に溶解し、測定試料溶液として使用してもよい。測定試料希釈液として、測定試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しないノニオン性界面活性剤を含むことが好ましい。前記ノニオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。ノニオン性界面活性剤の濃度としては、０．０１～５．０質量％が好ましく、０．０５～４．０質量％がより好ましく、０．１～３．０質量％がさらに好ましい。濃度が０．０１質量％より低いと、下流への展開が困難となることがある。また、展開が不均一となり測定精度が低下することがある。一方、濃度が５．０質量％より高いと、物理的に吸着している、検出粒子と抗体、および／またはメンブレンと抗体が乖離し、測定値が得られないことがある。また、前記測定試料希釈液は、無機塩類やｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）が挙げられる。これらの中でも、本発明に用いる抗体の至適ｐＨ範囲である７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳがより好ましい。
　測定対象物質は、抗原抗体反応を利用するイムノクロマトグラフィーにより検出可能な物質である限り制限されない。測定対象物質として、例えば感染症の原因微生物に由来する抗原（タンパク質、脂質、糖質等）を挙げることができる。好ましくは、感染症の病原微生物としてウイルスを挙げることができる。ウイルスとして、好ましくは上気道感染症の原因ウイルスである。上気道感染症の原因ウイルスとして、例えば、インフルエンザウイルスＡ（Ｆｌｕ－Ａ）、インフルエンザウイルスＢ（Ｆｌｕ－Ｂ）（ＲＳＶ）、ＲＳウイルス、および重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ　Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を挙げることができる。より好ましい抗原として、インフルエンザウイルスＡのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、インフルエンザウイルスＢのＮタンパク質、ＲＳウイルスの融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のＮタンパク質を挙げることができる。
　検出抗体は、検出粒子と結合し、かつ測定対象物質と結合可能な抗体を意図する。
　検出抗体を構成する抗体は、測定対象物質と結合し、かつ捕捉抗体との結合を妨げない限り制限されない。前記検出抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。前記検出抗体は、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等であることができるが、ＩｇＧが好ましい。また、前記検出抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。例えば、測定対象物質が、インフルエンザウイルスＡのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）の場合、検出抗体を構成する抗体としてマウス由来抗Ｆｌｕ－ＡのＮタンパク質モノクローナル抗体１（３ＩＮ5、ＩｎＡ２４５、ＨｙＴｅｓｔ社製）等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、インフルエンザウイルスＢのＮタンパク質の場合、検出抗体を構成する抗体としてマウス由来抗Ｆｌｕ－ＢのＮタンパク質モノクローナル抗体１（１１３１、ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、ＲＳウイルスの融合タンパク質（Ｆタンパク質）の場合、検出抗体を構成する抗体として、マウス由来抗ＲＳＶのＦタンパク質モノクローナル抗体１（３ＲｅＳ２１ｃｃ、ＨＹＴＥＳＴ社製)等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のＮタンパク質である場合、マウス由来抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質モノクローナル抗体１（ＳＣＶ－１０８、東洋紡社製）等を使用することができる。
　検出粒子は、測定対象物質と抗体の結合を可視化するための粒子である。検出粒子として、例えばセルロース系着色微粒子、金コロイド粒子、ラテックス粒子等を挙げることができる。
　前記セルロース系着色微粒子は、大量の水酸基を有するため、多くの反応性染料を共有結合により保持することができるだけでなく、濃染化した後も水などへの安定分散性を保持することができる。セルロース系着色微粒子として、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース等を用いることができるし、一部誘導体化されたセルロースを用いてもよい。前記セルロース系着色微粒子の質量の２０～９０質量％はセルロース由来であることが好ましく、２０～８０質量％がより好ましく、２０～７０質量％がさらに好ましい。
　前記セルロース系着色微粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１００ｎｍ～１０００ｎｍが好ましく、２００ｎｍ～８００ｎｍがより好ましい。平均粒子径が大きいと、下流への展開が遅くなり、測定時間が長くなる。また、メンブレン上に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことで捕捉抗体固相化部およびコントロールラインでの発色が不明瞭になる。一方、平均粒子径が小さいと、物理吸着または化学結合できる抗体量が低下し、測定感度が低下する。
　前記セルロース系着色微粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられる。前記セルロース系着色微粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤、橙、黄、緑、青、紺、紫、黒、蛍光が挙げられる。特に、ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）赤（ＲＥ２）の粒子濃度１質量％でのＯＤは２４０、ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）青（ＢＬ２）の粒子濃度１質量％でのＯＤは２６５、ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）緑（ＧＲ１）の粒子濃度１質量％でのＯＤは１６０、ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）黒（ＫＲ１）の粒子濃度１質量％でのＯＤは１５０であるため、赤および青が好ましい。
　例えば、１つのイムノクロマト試験片において複数種の異なる測定対象物質を検出する場合、各検出抗体に互いに異なる色の検出粒子を標識してもよい。
　検出抗体を構成する抗体とセルロース系着色微粒子との結合方法は公知である。検出抗体を構成する抗体とセルロース系着色微粒子を混合し、室温～３７℃程度で一定時間静置することにより、両者を結合させることができる。
　捕捉抗体は、メンブレンに固相化され、測定対象物質とセルロース系着色微粒子と結合した検出抗体との複合体（以下、「検出抗体－測定対象物質複合体」とも呼ぶ）を捕捉する抗体である。捕捉抗体は、測定対象物質と結合し、かつ検出抗体との結合を妨げない限り制限されない。前記捕捉抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。前記捕捉抗体は、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等であることができるが、ＩｇＧが好ましい。また、前記捕捉抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。例えば、測定対象物質が、インフルエンザウイルスＡのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）の場合、検出抗体を構成する抗体としてマウス由来抗Ｆｌｕ－ＡのＮタンパク質モノクローナル抗体２（１０００８３、Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃａｍｉｃａ社製）等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、インフルエンザウイルスＢのＮタンパク質の場合、検出抗体を構成する抗体としてマウス由来抗Ｆｌｕ－ＢのＮタンパク質モノクローナル抗体２（３ＩＦ１８／ＲＩＦ１７、Ｒ２／３、ＨｙＴｅｓｔ社製）等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、ＲＳウイルスのＦタンパク質の場合、検出抗体を構成する抗体として、マウス由来抗ＲＳＶのＦタンパク質モノクローナル抗体２（Ｃ０１７７３Ｍ、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）等を使用することができる。例えば、測定対象物質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２のＮタンパク質である場合、マウス由来抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質モノクローナル抗体２（ＳＣＶ－１０９、東洋紡社製）等を使用することができる。
　検出抗体を構成する抗体と捕捉抗体は、同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることがより好ましい。
　検出抗体を構成する抗体と捕捉抗体を取得する動物は、制限されない。例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット（ギニアピッグ）、ブタ、ラクダ等を挙げることができる。検出抗体を構成する抗体と捕捉抗体を取得する動物には、ヤギ、ウマを含まないことが好ましい。
　偽陽性抑制剤の主成分は、ヤギまたはウマに由来するイムノグロブリンである。イムノグロブリンのサブクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのいずれであってもよい。好ましくはＩｇＧである。ＩｇＧのサブクラスは制限されない。前記イムノグロブリンは、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合しないことが望ましい。
　また、測定対象物質がＲＳウイルスに由来する時には、ウマに由来するイムノグロブリンを使用することが好ましい。
　ヤギまたはウマに由来するイムノグロブリンの担持量は、イムノクロマト試験片１本当たり２５～２５０μｇ程度を担持するのが好ましく、５０～１００μｇ程度を担持するのがより好ましい。担持量が２５μｇより少ないと、十分な偽陽性抑制効果は得られない。一方、担持量が２５０μｇより多くしても、これ以上の偽陽性抑制効果は得られず、かつ感度が低下する恐れがある。
　偽陽性抑制剤は、ヤギまたはウマに由来するイムノグロブリンのほかに、カゼイン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤を含んでいてもよい。
　偽陽性抑制剤は、サンプルパッド１にあらかじめ担持させておいてもよい。また、検出抗体と共に、コンジュゲーションパッド２に担持させておいてもよい。あるいは、捕捉抗体を固相化したメンブレン３内に担持させておいてもよい。メンブレン３内に偽陽性抑制剤を担持させる場合、後述する捕捉抗体固相化部６より上流側に担持させることが好ましい。偽陽性抑制剤は、測定試料希釈液に添加されていてもよい。
　ここで、担持とは、水分が浸透してきた際に、ヤギまたはウマに由来するイムノグロブリンが浸透してきた水分の流れに沿って移動できることを意図し、固相化とは区別される。
２．イムノクロマト試験片
　本発明のある実施形態は、測定対象物質を検出するためのイムノクロマト試験片１００に関する。
　図１及び図２を参照しながら、イムノクロマト試験片１００の構成について説明する。図１は、イムノクロマト試験片１００の平面図を示す。図２は、イムノクロマト試験片１００の側面図を示す。
　例えば、イムノクロマト試験片１００は、測定試料溶液を検査開始時に滴下する側（図１及び図２の左側）を上流側とする。図１及び図２では、上流側から順に、測定試料滴下部２０を有し測定試料滴下部２０に滴下された測定試料が浸透するサンプルパッド１、検出抗体を担持したコンジュゲーションパッド２、捕捉抗体を固相化したメンブレン３、メンブレン３を通過した測定試料溶液を吸収する吸収パッド４の順に連接配置されている。メンブレン３には、例示的に、第１の捕捉抗体固相化部６、第２の捕捉抗体固相化部７、第３の捕捉抗体固相化部８、及び第４の捕捉抗体固相化部９及びコントロール捕捉抗体固相化部１０が備えられている。各捕捉抗体固相化部６，７，８，９には、異なる測定対象物質と結合する捕捉抗体が複数箇所に固相化されている。図１及び図２において、各捕捉抗体固相化部６，７，８，９及びコントロール捕捉抗体固相化部１０は破線と斜線により線状に表されているが、未使用のイムノクロマト試験片１００ではこの部分には目視できる境界や領域はない。測定試料溶液が、測定試料滴下部２０に滴下され、サンプルパッド１、コンジュゲーションパッド２、メンブレン３の順に浸透する際、測定試料溶液中に測定対象物質があれば、測定対象物質は、はじめにコンジュゲーションパッド２内に担持されている検出粒子が結合した検出抗体と反応し検出抗体－測定対象物質複合体を形成する。さらに検出抗体－測定対象物質複合体は、測定試料溶液の浸透の流れにしたがって、メンブレン３内に浸透する。測定対象物質が各捕捉抗体固相化部６，７，８，９のいずれかと反応する場合、その捕捉抗体固相化部において検出抗体－測定対象物質複合体中の測定対象物質が捕捉抗体に結合し捕捉される。この反応により、検出抗体と結合している検出粒子が濃縮され、測定対象物質に対応する捕捉抗体固相化部６，７，８，９が可視化される。可視化の際の色は、各検出抗体に標識された検出粒子の色に依存する。最後に、捕捉抗体固相化部６，７，８，９の下流に備えられたコントロール捕捉抗体に検出抗体－測定対象物質複合体中の検出抗体が捕捉されることにより検出粒子が濃縮され、コントロール捕捉抗体固相化部１０が可視化される。コントロール捕捉抗体は、検出抗体を構成する抗体が由来する動物に対応した抗イムノグロブリン抗体等である。また、コントロール捕捉抗体固相化部１０は、例えば、コンジュゲーションパッド２内に、感染症の病原微生物に由来する測定対象物質と結合する検出抗体が含まれている場合であって、それぞれに異なる色の検出粒子が標識されている場合、これらの検出粒子の色が混じり合って、各捕捉抗体固相化部６，７，８，９のいずれの色とも異なる色を呈することがある。
　図１において、符号１２は、サンプルパッド１とコンジュゲーションパッド２の連接部を示す。符号２３は、コンジュゲーションパッド２とメンブレン３の連接部を示す。符号３４は、メンブレン３と吸収パッド４の連接部を示す。
　図２に示すように、連接部１２，２３，３４は、互いの凹凸が噛み合う噛み合わせ構造を有する。
　図２において、符号１１は、粘着シートを示す。符号５は、支持体であるバッキングシートを示す。サンプルパッド１、コンジュゲーションパッド２、メンブレン３、及び吸収パッド４は、粘着シート１１によりバッキングシート５上に連接して固定される。
　イムノクロマト試験片は、幅３～５ｍｍ（好ましくは、４ｍｍ程度）、長さ４０～１００ｍｍ（好ましくは６０ｍｍ程度）の細長い短冊状の形態であり得る。
　図１、及び図２では４種の測定対象物質を検出するためのイムノクロマト試験片１００を示したが、１つのイムノクロマト試験片１００において検出される測定対象物質の数は、１、２、３、４から選択できる。
　サンプルパッド１は、測定試料を速やかに吸収した後、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへ展開できる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記サンプルパッド１の厚さは、０．１～２．０ｍｍが好ましく、０．２～１．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、下流での測定試料の流れが不均一となり測定精度が低下することがある。一方、厚さが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。
　メンブレン３は、測定試料を精度よく均一に展開できるものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロン製のメンブレンが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース製のメンブレンが好ましい。
　コンジュゲーションパッド２は、検出粒子と検出抗体との複合体を乾燥状態で保持でき、かつ測定試料の下流への展開と共に前記複合体を速やかに放出することができる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、ガラス製のろ紙が好ましい。また、前記コンジュゲーションパッド２の厚さは、０．１ｍｍ～２．０ｍｍが好ましく、０．２ｍｍ～１．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、目的量の前記複合体を乾燥状態で保持できないことがある。一方、厚さが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。
　吸収パッド４は、上流より展開してきた測定試料を速やかに吸収した後、逆流しないよう保持できるものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記吸収パッド４の厚さは、０．２～５．０ｍｍが好ましく、０．５～２．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、測定試料の滴下量によっては一度吸収パッドに吸収された測定試料がメンブレン側に逆流することがある。一方、厚さが大きいと、イムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を覆うハウジングケースのサイズも大きくなり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。
　イムノクロマト試験片１００は、例えば、プラスチック等から成形されたフォルダー３０に格納されていてもよい。
３．イムノクロマトキット
　本発明のある実施形態は、イムノクロマト試験片１００を含む、イムノクロマトキットに５０に関する。図３にキットの構成の一例を示す。
　キット５０は、イムノクロマト試験片１００、検体採取具５２、フィルターユニット５４、測定試料希釈液５６を備える。キット５０は、上記１．において説明した測定対象物質を検出するために使用される。
　図３の例では、イムノクロマト試験片１００は、フォルダー３０に格納されている。
　検体採取具５２は、例えば、綿棒である。綿棒は、咽頭拭い液、鼻汁、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、気管支擦過物等の採取に使用される。測定試料希釈液５６は上記１．において説明したとおりである。測定試料希釈液５６は、例えば、１ｍＬ～２ｍＬ程度の蓋５９付きの試験チューブ５８に格納されている。試験チューブ５８には、ヒトの指により側面を圧迫した際に側面同士が近接する程度の弾力を備えている。フィルターユニット５４は、試験チューブ５８に装着可能な形状をとり、フィルターユニット５４内には、フィルターが備えられている。
　前記フィルターはメンブレンの目詰まりや偽陽性およびフィルター自身の目詰まりを防ぐため、１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせてもよい。
　前記フィルターの孔径又は保留粒子径、１０～５００μｍが好ましい。なお、フィルターに孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせる場合は、孔径又は保留粒子径の大きなフィルターを上流側に、小さなフィルターを下流側に、両フィルターが重なるように配置することが、ろ過時における検体試料の目詰まりを回避する上で好ましい。例えば、２つのフィルターを組み合わせる場合、１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径が大きいフィルターを用い、２段目のフィルターに孔径が小さいフィルターを用いることが好ましい。具体的には１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径は５０～５００μｍが好ましく、１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径は１０～５０μｍが好ましい。
　前記フィルターの材質は例えば、２つのフィルターを組み合わせる場合、試験チューブ５８のフィルターをポリビニルアルコール樹脂製の発泡体とし、滴下口５５側をセルロース製のろ紙とすることが好ましい。なお、孔径又は保留粒子径はパームポロメーターを用いて測定することができる。
　測定対象物質の検出を行う際には、検体採取具５２が綿棒である時、綿棒の綿部分により検体を採取する。続いて、蓋５９を外した試験チューブ５８内の測定試料希釈液５６に検体が付着した綿棒の綿部分を挿入し、攪拌、絞り出しを行う。試験チューブ５８は、ヒトの指による圧迫により、変形可能であるため、試験チューブ５８の外側から試験チューブ５８内の綿棒の綿部分を圧迫し、綿部分から、付着した検体を絞り出すことができる。この試験チューブ５８において絞り出しを行った後に残る溶液が測定試料溶液となる。絞り出しを行った後に、綿棒を除去し、試験チューブ５８にフィルターユニット５４をセットする。フィルターユニット５４には、滴下口５５が備えられており、この滴下口５５から測定試料滴下部２０に測定試料溶液を滴下する。
　以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）抗体Ａ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体の調製
　１．０質量％の青色のセルロース系着色微粒子Ａ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ　Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、富士フィルム和光純薬社製）（ｐＨ８．０）９００μＬ、抗体Ａ１として１．０ｍｇ／ｍＬのマウス由来抗Ｆｌｕ－ＡのＮタンパク質モノクローナル抗体１（３ＩＮ5、ＩｎＡ２４５、ＨｙＴｅｓｔ社製）１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃で１２０分間静置した。次いで、１．０質量％のカゼイン（０３０－０１５０５、富士フィルム和光純薬社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、富士フィルム和光純薬社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）を用い、１３，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体と反応させたセルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、富士フィルム和光純薬社製）からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）を用い、１３，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体反応させたセルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５質量％のスクロース（１９６－０００１５、富士フィルム和光純薬社製）、０．２質量％のカゼイン（０３０－０１５０５、富士フィルム和光純薬社製）、偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）、６２ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、富士フィルム和光純薬社製）からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、抗体Ａ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体１を得た。
（２）抗体Ｂ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体の調製
　抗体Ａ１の代わりに抗体Ｂ１としてマウス由来抗Ｆｌｕ－ＢのＮタンパク質モノクローナル抗体１（１１３１、ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）を、青色のセルロース系着色微粒子Ａの代わりに赤色のセルロース系着色微粒子Ｂ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２：Ｄａｒｋ　Ｒｅｄ、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）を、それぞれ使用する以外は（１）抗体Ａ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体の調製と同様の方法で、抗体Ｂ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体１を得た。
（３）抗体Ｃ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体の調製
　抗体Ａ１の代わりに抗体Ｃ１としてマウス由来抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質モノクローナル抗体１（ＳＣＶ－１０８、東洋紡社製）を使用する以外は（１）抗体Ａ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体の調製と同様の方法で、抗体Ｃ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体１を得た。
（４）抗体Ｄ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体の調製
　抗体Ｂ１の代わりに抗体Ｄ１としてマウス由来抗ＲＳＶのＦタンパク質モノクローナル抗体１（３ＲｅＳ２１ｃｃ、ＨＹＴＥＳＴ社製)を使用する以外は（２）抗体Ｂ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体の調製と同様の方法で、抗体Ｄ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体１を得た。
（５）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質検出用メンブレンカードの作製
　抗体Ａ２として２．０ｍｇ／ｍＬのマウス由来抗Ｆｌｕ－ＡのＮタンパク質モノクローナル抗体２（１０００８３、Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃａｍｉｃａ社製）、抗体Ｂ２として２．０ｍｇ／ｍＬのマウス由来抗Ｆｌｕ－ＢのＮタンパク質モノクローナル抗体２（３ＩＦ１８／ＲＩＦ１７、Ｒ２／３、ＨｙＴｅｓｔ社製）、抗体Ｃ２として２．０ｍｇ／ｍＬのマウス由来抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質モノクローナル抗体２（ＳＣＶ－１０９、東洋紡社製）、抗体Ｄ２として２．０ｍｇ／ｍＬのマウス由来抗ＲＳＶのＦタンパク質モノクローナル抗体２（Ｃ０１７７３Ｍ、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）、抗体Ｅとして１．０ｍｇ／ｍＬのウサギ由来抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ａ９０－１１７Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を準備した。
　次いで、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、ＢｉｏＪｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、上流側に２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部、中央に２５ｍｍ×３００ｍｍのメンブレン部、下流側に１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部から構成される６０ｍｍ×３００ｍｍのメンブレンカード（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　１２０　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｃａｒｄｓ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のメンブレン部の上流側から５ｍｍの位置に前記抗体Ｃ２を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、メンブレン部の上流側から８ｍｍの位置に前記抗体Ｂ２を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、メンブレン部の上流側から１１ｍｍの位置に前記抗体Ａ２を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、メンブレン部の上流側から１４ｍｍの位置に前記抗体Ｄ２を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、メンブレン部の上流側から１７ｍｍの位置に、前記抗体Ｅを１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍの捕捉抗体固相化部およびコントロールラインを形成することで、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用メンブレンカード１を得た。
（６）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用コンジュゲーションパッドの作製
　抗体Ａ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体１、抗体Ｂ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体１、抗体Ｃ１とセルロース系着色微粒子Ａとの複合体１、抗体Ｄ１とセルロース系着色微粒子Ｂとの複合体１を等量混合したのち、１０ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ　ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ　ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、ＡｉｒＪｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記混合液を３０μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃で３０分間乾燥し、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用コンジュゲーションパッド１を得た。
（７）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片およびデバイスの作製
　前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用メンブレンカード１の上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用コンジュゲーションパッド１を貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドと３ｍｍ重なるよう１５ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用メンブレンカード１の下流側の１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と５ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍの吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、ギロチン式カッティングモジュール（ＣＭ５０００、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍの短冊状にカットすることで、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片１を得た。得られたＦｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片１をハウジングケース（Ｋ００７、Ｓｈｅｎｇｆｅｎｇ　Ｐｌａｓｔｉｃ社製）に収納することでＦｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＩを得た。
（比較例１）
　偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を添加しない以外は実施例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＶを得た。
（８）測定試料希釈液の調製
　１００ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、富士フィルム和光純薬社製）（ｐＨ８．５）１Ｌ、塩化ナトリウム（１９１－０１６６５、富士フィルム和光純薬社製）８．７７ｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１６６－２１２１３、富士フィルム和光純薬社製）２ｇ、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル：ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）－１００（１６０－２４７５１、富士フィルム和光純薬社製）９ｇを１Ｌガラス瓶に加え、溶解することで測定試料希釈液を調製した。
（９）Ｆｌｕ－Ａ試料、Ｆｌｕ－Ｂ試料、ＲＳＶ試料およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２試料の調製
　市販のＦｌｕ－ＡのＮタンパク質（６１０１７１、Ｍｅｄｉｘ社製）を、前記測定試料希釈液にて５０ｎｇ／ｍＬに希釈することでＦｌｕ－Ａ試料を得た。市販のＦｌｕ－ＢのＮタンパク質（６１０１７２、Ｍｅｄｉｘ社製）を、前記測定試料希釈液にて２０ｎｇ／ｍＬに希釈することでＦｌｕ－Ｂ試料を得た。市販のＲＳＶ抗原（８１７５、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）を、前記測定試料希釈液にて５μｇ／ｍＬに希釈することでＲＳＶ試料を得た。市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質（２３０－３０１６４、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を、前記測定試料希釈液にて２ｎｇ／ｍＬに希釈することでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料を得た。
（１０）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片の評価：非特異吸着の評価
　前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスIを水平な台に設置した。次いで、前記測定試料希釈液１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１５分間静置した。次いで、メンブレン上の４本の捕捉抗体固相化部を目視判定し、全て視認できないものを良好と判断した。
　結果、４本の捕捉抗体固相化部は全て視認できなかったため、実施例１のデバイスでは非特異吸着はないと判断した。
（１１）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片の評価：偽陽性の評価
　前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスIを水平な台に設置した。次いで、１００名のボランティアからメンティップ、日本綿棒社製で鼻咽頭ぬぐ液検体を採取し、前記測定試料希釈液４５０μＬに懸濁した後、内１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１５分間静置した。次いで、メンブレン上の４本の捕捉抗体固相化部を目視判定し、いずれかのラインが視認できた、つまり偽陽性が出現した比率：偽陽性率を算出し、０％のみを良好と判断した。
　結果、偽陽性率は０％であったため、実施例１のデバイスでは偽陽性はないと判断した。
（１２）Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマト試験片の評価：感度阻害の評価
　前記Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスIを水平な台に設置した。次いで、前記Ｆｌｕ－Ａ試料、Ｆｌｕ－Ｂ試料、ＲＳＶ試料、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１５分間静置した。次いで、メンブレン上の４本の捕捉抗体固相化部の反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｇｏｌｄ　Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ（赤色ライン測定時）またはＬａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ（青色または緑色ライン測定時）、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。得られた４本の捕捉抗体固相化部の反射吸光度（ｍＡｂｓ）を、比較例１のＦｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＶと比較し、反射吸光度（ｍＡｂｓ）が全て８０％以上維持できたデバイスを優良と、７０～８０％維持できたデバイスを良好と判断した。
　結果、４本の捕捉抗体固相化部は全て感度保持率８０％以上であったため、実施例１のデバイスでは偽陽性抑制剤による感度阻害はないと判断した。
（実施例２）
（１３）偽陽性抑制剤担持サンプルパッドの作製
　１５ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、ＡｉｒＪｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、偽陽性抑制剤として２．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）、６２ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、富士フィルム和光純薬社製）からなる塗布液（ｐＨ９．２）を６０μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃で３０分間乾燥し、偽陽性抑制剤担持サンプルパッド１を得た。
　１５ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の代わりに、前記偽陽性抑制剤担持サンプルパッド１を使用する以外は比較例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスIIを得た。　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（実施例３）
　偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、４．０ｍｇ／ｍＬのヤギＩｇＧ（ＳＬＧ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスIIIを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（実施例４）
　偽陽性抑制剤として２．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、２．０ｍｇ／ｍＬのヤギＩｇＧ（ＳＬＧ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例２と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＩＶを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例２）
　偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、４．０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（ＳＬＭ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＶＩを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例３）
　偽陽性抑制剤として２．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、２．０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（ＳＬＭ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例２と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＶＩＩを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例４）
　偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、４．０ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ（ＳＬＲ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＶＩＩＩを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例５）
　偽陽性抑制剤として２．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、２．０ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ（ＳＬＲ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例２と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＩＸを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例６）
　偽陽性抑制剤として４．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、４．０ｍｇ／ｍＬのウシＩｇＧ（ＳＬＢ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例１と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＸを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
（比較例７）
　偽陽性抑制剤として２．０ｍｇ／ｍＬのウマＩｇＧ（ＳＬＥ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）の代わりに、２．０ｍｇ／ｍＬのウシＩｇＧ（ＳＬＢ－５６、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）を使用する以外は実施例２と同様にして、Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用イムノクロマトデバイスＸＩを得た。
　得られたデバイスの評価結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明により、Ｆｌｕ－ＡのＮタンパク質、Ｆｌｕ－ＢのＮタンパク質、ＲＳＶのＦタンパク質、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を同時かつ高感度に検出し得るイムノクロマト試験片を提供することができる。
１００：イムノクロマト試験片
１：サンプルパッド
２：コンジュゲーションパッド
３：メンブレン
４：吸収パッド
５：バッキングシート
６～９：捕捉抗体固相化部
１０：コントロールライン
１１：粘着シート

Claims (10)

  1. 　偽陽性抑制剤の存在下で、測定対象物質と、検出粒子を標識した検出抗体との複合体を形成させること、及び
    　前記複合体を捕捉抗体により捕捉すること
    を含む、イムノクロマトグラフィーによる測定対象物質の検出方法であって、
    　前記偽陽性抑制剤は、ヤギまたはウマに由来し測定対象物質に特異的に結合しないイムノグロブリンを含む、検出方法。
  2. 　前記測定対象物質が、感染症の原因微生物に由来する抗原である、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記感染症の原因微生物が、上気道感染症の原因ウイルスである、請求項２記載の検出方法。
  4. 　上気道感染症の原因ウイルスが、インフルエンザウイルスＡ（Ｆｌｕ－Ａ）、インフルエンザウイルスＢ（Ｆｌｕ－Ｂ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）よりなる群から選択される１または複数種である、請求項３に記載の検出方法。
  5. 　測定対象物質に特異的に結合する捕捉抗体を線状に固相化した捕捉抗体固相化部を備えるメンブレンと、測定試料滴下部と、を備える、請求項１に記載の検出方法に使用するためのイムノクロマト試験片。
  6. 　前記メンブレンは捕捉抗体固相化部を複数箇所備え、前記複数箇所の各箇所に固相化される捕捉抗体はそれぞれ異なる感染症の病原微生物に由来する測定対象物質と結合する、請求項５に記載のイムノクロマト試験片。
  7. 　請求項６に記載のイムノクロマト試験片、検体採取具、フィルターユニット、測定試料希釈液を備える、イムノクロマトキット。
  8. 　測定試料希釈液が、偽陽性抑制剤を含む、請求項７に記載のイムノクロマトキット。
  9. 　（１）測定試料を浸透させるサンプルパッドと、
    　（２）測定対象物質と特異的に結合する検出粒子を標識した検出抗体を担持したコンジュゲーションパッドと、
    　（３）測定対象物質と特異的に結合する捕捉抗体を線状に固相化した捕捉抗体固相化部を備えるメンブレンと、
    　（４）吸収パッドと、
    から構成されるイムノクロマト試験片であって、
    　前記サンプルパッド又は前記コンジュゲーションパッドは偽陽性抑制剤としてヤギまたはウマに由来し測定対象物質に特異的に結合しないイムノグロブリンを担持する、イムノクロマト試験片。
  10. 　請求項９に記載のイムノクロマト試験片、検体採取具、フィルターユニット、測定試料希釈液を備える、イムノクロマトキット。
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