WO2024019542A1 - 초음파 감응형 포피린-리포좀 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2024019542A1
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porphyrin
liposome
cancer
ultrasound
sensitive
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정은아
김대현
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(주)아이엠지티
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    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines

Definitions

  • the present invention relates to ultrasound-sensitive liposomes containing porphyrin, methods for producing the same, and uses thereof.
  • cancer is still an important disease that ranks first and second among the causes of death worldwide.
  • Cancer treatment methods currently used clinically include chemotherapy, radiation, targeted therapy, and surgical resection of the lesion.
  • Representative examples of chemotherapy drugs for cancer treatment that have been used to date include Doxorubicin, Adriamycin, Cisplatin, Taxol, and 5-fluorouracil, and are widely used as chemotherapy for cancer treatment. It is being used extensively. However, the above methods have limitations and cause severe side effects and pain to patients rather than complete cure, so it is important to develop cancer treatment technologies that can minimize side effects.
  • existing anticancer drugs penetrate not only cancer cells but also normal tissues, damaging the function and activity of normal cells, causing side effects such as decreased bone marrow function, gastrointestinal disorders, and alopecia. It presents major problems in cancer treatment, such as multi-drug resistance. Therefore, research is being actively conducted on the development of innovative drug delivery systems that can reduce the non-specific effects of existing anticancer drugs and prevent unexpected side effects.
  • liposomes are vesicles composed of lipid bilayers surrounding an aqueous internal compartment, and the membrane is mainly composed of phospholipids and their derivatives.
  • the membrane is mainly composed of phospholipids and their derivatives.
  • phospholipids and their derivatives When phospholipids and their derivatives are dispersed in aqueous solutions, they spontaneously form endoplasmic reticulum.
  • liposomes can carry water-soluble active ingredients in the aqueous internal space and also can carry hydrophobic active ingredients in the lipid bilayer, they have been used as carriers for therapeutic agents such as drugs, enzymes, and gene sequences in the fields of medicine, pharmaceuticals, and biochemistry. .
  • liposomes developed to date have problems such as changes in the properties of the lipid bilayer due to the encapsulated drug, which impairs the structural stability of the liposome or its sensitivity to stimulation, and the pharmacological effect is halved due to non-specific drug release. There are problems with this or unexpected side effects occurring.
  • Porphyrin-liposomes containing porphyrin and phospholipids maintain high structural stability even when drugs are encapsulated, and can respond sensitively to ultrasound to release drugs. It was completed after confirming that it has the effect of improving drug delivery efficiency to target tissues and enhancing pharmacological activity.
  • the object of the present invention is to provide an ultrasound-sensitive porphyrin-liposome containing porphyrin and phospholipid.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for drug delivery containing the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which contains the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome encapsulated with an anticancer agent as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome.
  • the porphyrin may generate reactive oxygen species when exposed to ultrasound, but is not limited thereto.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may have a lipid bilayer decomposed when exposed to ultrasound, but is not limited thereto.
  • the phospholipids include DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1- Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine) , and POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), but is not limited thereto.
  • DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPC 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • SOPC 1- Stearoyl-2-oleoyl
  • the weight ratio of porphyrin:phospholipid may be 1:20 to 90, but is not limited thereto.
  • the porphyrin is contained at 1 to 10% by dry weight based on the total ultrasound-sensitive porphyrin-liposome, and the phospholipid is contained at 90 to 99% by dry weight based on the total ultrasound-sensitive porphyrin-liposome. It may be, but is not limited to this.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome is DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3- It may further include one or more selected from the group consisting of phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), and cholesterol, but is not limited thereto.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may satisfy one or more characteristics selected from the group consisting of the following, but is not limited thereto:
  • (a) has a particle size of 100 to 200 nm
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may be drug-encapsulated, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome:drug may be 20 to 1:1, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome as an active ingredient.
  • the present invention provides a drug delivery method comprising the step of administering the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome to an individual in need thereof.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may be one in which the drug is encapsulated.
  • the present invention provides a drug delivery use of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome.
  • the present invention provides the use of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome for the production of a drug delivery system.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may be drug-encapsulated, but is not limited thereto.
  • the drug may be an anticancer agent, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, comprising the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome as an active ingredient, wherein the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome is encapsulated with an anticancer agent.
  • a pharmaceutical composition for treatment is provided.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising the step of administering the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome encapsulated with an anticancer agent to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome encapsulated with an anticancer agent for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention provides the use of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome for the production of a drug for treating cancer (anticancer drug).
  • the anticancer agent is doxorubicin, paclitaxel, docetaxel, cisplatin, Gleevec, 5-fluorouracil (5-FU), tamoxifen, carboplatin, topotecan, belotecan, imatinib, irinotecan, and flocsuri.
  • doxorubicin doxorubicin
  • paclitaxel docetaxel
  • cisplatin Gleevec
  • 5-fluorouracil (5-FU) 5-fluorouracil
  • tamoxifen carboplatin
  • topotecan belotecan
  • imatinib irinotecan
  • flocsuri flocsuri.
  • It may be one or more selected from the group consisting of min, chlorambucil, busulfan, doxyfluridine, vinblastine, mitomycin, prednisone, Armitor, and mitoxantrone, but is not limited thereto.
  • the composition may be administered sequentially or simultaneously with ultrasonic treatment, but is not limited thereto.
  • the cancer is breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, cervical cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, and uterine cancer.
  • the present invention includes the steps of (S1) dissolving porphyrin and phospholipid in a first organic solvent; and
  • step (S2) A method for producing an ultrasound-sensitive porphyrin-liposome, comprising the step of hydrating the mixed solution prepared in step (S1) in an aqueous solution and stirring it,
  • the first organic solvent may be one or more selected from the group consisting of dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, chloroform, methanol, ethanol, and ether, but is not limited thereto.
  • the phospholipids include DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl -2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), and POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), but is not limited thereto.
  • DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPC 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • SOPC 1-Stearoyl -2-oleoyl
  • step (S1) includes DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero) in addition to the porphyrin and phospholipid.
  • DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine
  • DSPE-mPEG2000 1,2-distearoyl-sn-glycero
  • cholesterol may be further dissolved in the first organic solvent, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to ultrasound-sensitive porphyrin-liposomes capable of releasing drugs in response to ultrasound.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome of the present invention is characterized in that it contains porphyrin. Porphyrin exposed to ultrasound reacts with water to generate reactive oxygen species (Reactive Oxygen Species) and constitutes a lipid bilayer of the porphyrin-liposome. Phospholipids react to reactive oxygen species generated by porphyrin, causing lipid peroxidation, which can eventually cause the structure of the lipid bilayer to collapse and release the encapsulated drug.
  • Reactive Oxygen Species reactive oxygen species
  • Phospholipids react to reactive oxygen species generated by porphyrin, causing lipid peroxidation, which can eventually cause the structure of the lipid bilayer to collapse and release the encapsulated drug.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention can appropriately control drug release using ultrasound, and also maintains excellent structural stability even when the drug is encapsulated, thereby minimizing non-specific drug delivery.
  • the porphyrin-liposome of the present invention can improve the drug delivery efficiency and pharmacological effect of the drug, and can be used as an excellent drug carrier for various diseases by carrying various drugs.
  • Figure 1 is a TEM image of an ultrasound-sensitive porphyrin-liposome and a general liposome according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of confirming the drug release rate of drug-encapsulated ultrasound-sensitive porphyrin-liposomes or general liposomes depending on whether they were irradiated with ultrasound.
  • Figure 3 shows the results of confirming the cancer cell killing effect of ultrasound-sensitive porphyrin-liposomes and general liposomes each encapsulated with an anticancer agent, depending on whether or not they were irradiated with ultrasound.
  • Figure 4a shows the results of confirming the change in body weight over time after administering free doxorubicin or liposomes with or without ultrasound treatment to a cancer animal model.
  • Figure 4b shows the results of measuring tumor size over time after administering free doxorubicin or liposomes with or without ultrasound treatment to a cancer animal model.
  • Figure 5 is a diagram showing the action mechanism of the porphyrin-liposome according to the present invention with or without ultrasound.
  • the present invention relates to an ultrasound-sensitive porphyrin-liposome containing porphyrin and phospholipid. It was confirmed that the porphyrin-liposome maintains high structural stability even when encapsulated with a drug, and can respond sensitively to ultrasound to release the drug. It is complete. That is, the porphyrin-liposome according to the present invention can improve drug delivery efficiency to target tissues and enhance pharmacological activity, so it can be used as a drug carrier for various drugs.
  • the present invention provides an ultrasound-sensitive porphyrin-liposome comprising porphyrin and phospholipid.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may be briefly referred to as 'porphyrin-liposome'.
  • the porphyrin according to the present invention is characterized in that it reacts with water to generate reactive oxygen species (ROS) when exposed to sound waves, preferably ultrasonic waves. Therefore, porphyrin-liposomes containing porphyrin can generate reactive oxygen species due to porphyrin when exposed to ultrasound, and can result in structural changes due to phospholipids reacting to reactive oxygen species.
  • the porphyrin is a hydrophobic compound, and may be included (loaded, supported, or encapsulated) within the hydrophobic part of the porphyrin-liposome according to the present invention, such as a lipid bilayer membrane, but is not limited thereto.
  • the porphyrin according to the present invention contains iron (Fe) ions. More preferably, the porphyrin according to the present invention has 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 2 hydrogens (H) replaced with N-(2-(2-aminoethylamino)ethyl)butyramide. It could be. Most preferably, the porphyrin according to the present invention may be represented by the following formula (1), but is not limited thereto.
  • porphyrin of the present invention also includes pharmaceutically acceptable salts of porphyrin.
  • pharmaceutically acceptable salt includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means that the benefit/risk ratio is reasonable for use in contact with the tissue of a subject (e.g., a human) without undue toxicity, irritation, allergic reaction, or other problems or complications. It refers to a compound or composition that is suitable for the following and is within the scope of sound medical judgment.
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid. , benzoic acid, malonic acid, gluconic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an excessive amount of aqueous acid and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile. It can also be prepared by heating equimolar amounts of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or suction filtering the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excessive amount of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • an appropriate silver salt eg, silver nitrate
  • the scope of the compound of the present invention may include not only pharmaceutically acceptable salts, but also all isomers, hydrates, and solvates that can be prepared by conventional methods.
  • phospholipid refers to a complex lipid composed of glycerol, two fatty acid tails, and a phosphate-bonded head group.
  • Phospholipids are amphipathic compounds.
  • the hydrophilic head group reacts with the aqueous medium and the hydrophobic tail reacts with the organic solvent, so they are arranged at the interface between the aqueous medium and the organic solvent to spontaneously form a lipid bilayer. can be formed.
  • amphipathic compounds such as phospholipids are mixtures of two immiscible liquids (e.g. water and oil), mixtures of liquids and gases (e.g. gas microbubbles in water), or mixtures of liquids and insoluble particles (e.g. It is a compound that can stabilize mixtures of substances that are normally immiscible in other ways, such as metal nanoparticles in water.
  • the phospholipid according to the present invention is reactive to reactive oxygen species and is a phospholipid that can cause lipid peroxidation when exposed to reactive oxygen species.
  • the porphyrin-liposome according to the present invention is most preferably characterized by comprising one or more phospholipids containing unsaturated fatty acids.
  • porphyrin-liposome when the porphyrin-liposome according to the present invention is exposed to ultrasound, reactive oxygen species are generated by the porphyrin, resulting in lipid peroxidation of the porphyrin-liposome, ultimately destroying the lipid bilayer membrane of the porphyrin-liposome and releasing the encapsulated drug. It can be.
  • the phospholipid containing a carbon-carbon double bond is sufficient as long as it satisfies the above characteristics, and is not limited to specific types, but is preferably DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero) -3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine), and POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol).
  • DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine
  • DOPC 1,2-Dioleoyl
  • the porphyrin-liposome according to the present invention is characterized in that it does not contain specific phospholipids.
  • Specific fatty acids that are not included in the porphyrin-liposome according to the present invention include, for example, phosphatidyl choline (PC), dimyristoyl phospatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidycholine (DPPC), and egg It may be phosphatidyl glycerol (egg phosphatidyl glycerol), etc., but is not limited thereto.
  • the molar ratio (mole %) of total porphyrin:phospholipids constituting the porphyrin-liposome may be 1:500 to 2,000, but is not limited thereto.
  • the molar ratio of porphyrin:phospholipid is 1:500 to 1,800, 1:500 to 1,600, 1:800 to 2,000, 1:1,000 to 2,000, 1:1,200 to 2,000, 1:1,300 to 2,000, 1:1,400 to It may be 2,000, 1:1,400 to 1,800, or 1:1,400 to 1,600, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of total porphyrin:phospholipids constituting the porphyrin-liposome may be 1:20 to 90, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of the porphyrin:phospholipid is 1:20 to 90, 1:20 to 80, 1:20 to 70, 1:20 to 60, 1:20 to 50, 1:30 to 80, and 1:40. It may be 80, 1:30 to 70, 1:30 to 60, 1:40 to 60, or 1:40 to 50, but is not limited thereto.
  • the porphyrin may be included in an amount of 1 to 10% by dry weight based on the total porphyrin-liposome, but is not limited thereto. Specifically, the porphyrin may be included in a dry weight % of 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2 based on the total porphyrin-liposome, but is not limited thereto.
  • the phospholipid may be included in an amount of 90 to 99% by dry weight relative to the total porphyrin-liposome, but is not limited thereto. Specifically, the phospholipid may be included at 90 to 99, 92 to 99, 94 to 99, 96 to 99, or 98 to 99% by dry weight based on the total porphyrin-liposome, but is not limited thereto.
  • porphyrin-liposome is DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene) It may further include one or more selected from the group consisting of glycol2000)), and cholesterol.
  • the phospholipids according to the present invention are DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2- oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine), POPG (1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol)
  • DSPC is an abbreviation for 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), and is a phosphatidylcholine head group (head group). refers to a phospholipid composed of two stearic acids attached to a group.
  • DSPE-mPEG2000 is 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy-poly(ethylene glycol-2000) (1,2-Distearoyl -sn-Glycero-3-Phosphoethanol amine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), refers to the pegylated derivative of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-PE (DSPE) .
  • cholesterol is a type of sterol (modified steroid) and refers to a lipid found in the cell membrane of all animal cells. Cholesterol according to the present invention includes derivatives of cholesterol. Derivatives of cholesterol may be, for example, cystosterol, ergosterol, stigmasterol, 4,22-stigmastadien-3-one, stigmasterol acetate, lanosterol, cycloartenol, or combinations thereof. Cholesterol is located in the lipid bilayer, and the permeability can be lowered or increased by controlling the amount, and can be used regardless of the ratio in the liposome.
  • the porphyrin-liposome further contains DSPC, DSPE-mPEG2000, and cholesterol
  • the DSPC:DSPE-mPEG2000:cholesterol:DOPE is in a weight ratio of 1:1 to 10:0.1 to 1:2 to 20. It may be included, but is not limited to this.
  • the DSPC:DSPE-mPEG2000:Cholesterol:DOPE is used at a weight ratio of 1:1 to 5:0.1 to 1:2 to 15, 1:1 to 10:0.1 to 1:2 to 10, 1:1 to 5:0.1 to 1:2 to 10, 1:1 to 5:0.1 to 0.9:2 to 10, 1:1 to 3:0.1 to 1:2 to 10, 1:1 to 3 : 0.5 to 1 : 2 to 8 by weight, 1 : 1 to 2 : 0.5 to 1 : 4 to 8, or 1 : 1 to 2 : 0.5 to 1 : 5 to 7, but limited thereto. It doesn't work.
  • the DSPC is 1 to 30% by weight relative to the total porphyrin-liposome
  • the DSPE-mPEG2000 is 5 to 40% by weight compared to the total porphyrin-liposome,
  • the cholesterol is 1 to 15% by weight relative to the total porphyrin-liposome, and
  • the DOPE may be included in an amount of 20 to 80% by weight based on the total porphyrin-liposome, but is not limited thereto.
  • the DSPC is 1 to 30% by weight, 1 to 25% by weight, 1 to 20% by weight, 1 to 15% by weight, 1 to 12% by weight, 5 to 30% by weight, 5 to 10% by weight, relative to the total porphyrin-liposome. It may be included at 20% by weight, 5 to 15% by weight, 7 to 12% by weight, 8 to 12% by weight, or 9 to 11% by weight, but is not limited thereto.
  • the DSPE-mPEG2000 is 5 to 40% by weight, 5 to 35% by weight, 5 to 30% by weight, 5 to 25% by weight, 5 to 20% by weight, 5 to 15% by weight, and 10 to 10% by weight, relative to the total porphyrin-liposome. It may be included at 40% by weight, 10 to 30% by weight, 10 to 25% by weight, 10 to 20% by weight, 15 to 30% by weight, 15 to 20% by weight, or 16 to 19% by weight, but is not limited thereto. .
  • the cholesterol is 1 to 15% by weight, 1 to 12% by weight, 1 to 10% by weight, 1 to 8% by weight, 5 to 15% by weight, 5 to 12% by weight, and 5 to 10% by weight relative to the total porphyrin-liposome. %, or 5 to 8 wt%, but is not limited thereto.
  • the DOPE is 20 to 80% by weight, 20 to 75% by weight, 20 to 70% by weight, 20 to 65% by weight, 30 to 80% by weight, 30 to 75% by weight, and 30 to 70% by weight relative to the total porphyrin-liposome.
  • % 30 to 65% by weight, 40 to 80% by weight, 40 to 75% by weight, 40 to 70% by weight, 40 to 65% by weight, 50 to 80% by weight, 50 to 75% by weight, 50 to 70% by weight, 50 to 65% by weight, 55 to 80% by weight, 55 to 75% by weight, 55 to 70% by weight, 55 to 65% by weight, 60 to 80% by weight, 60 to 75% by weight, 60 to 70% by weight, or 60% by weight. It may be included in an amount of 65% by weight, but is not limited thereto.
  • the DSPC:DSPE-mPEG2000:DOPE:cholesterol may be included in a molar ratio (mole%) of 1-50:1-80:5-80:0.1-50, but is not limited to this.
  • Liposomes satisfying the above lipid composition have been confirmed to have particularly excellent drug encapsulation rate, ultrasonic sensitivity, and stability in the blood.
  • the DSPC:DSPE-mPEG2000:DOPE:cholesterol has a molar ratio (mole%) of 1 ⁇ 50:1 ⁇ 80:5 ⁇ 80:0.1 ⁇ 50, 1 ⁇ 30:1 ⁇ 80:5 ⁇ 60:0.1 Molar ratio (mole%) of ⁇ 50, 1 ⁇ 30 : 1 ⁇ 60 : 5 ⁇ 60 : Molar ratio (mole%) of 0.1 ⁇ 30, molar ratio (mole%) of 1 ⁇ 30 : 1 ⁇ 60 : 5 ⁇ 60 : 0.1 ⁇ 10 %), 1 ⁇ 10 : 20 ⁇ 60 : 20 ⁇ 60 : 0.1 ⁇ 10 molar ratio (mole%), 1 ⁇ 15 : 30 ⁇ 50 : 30 ⁇ 50 : 1 ⁇ 5 molar ratio (mole%), 1 ⁇ 8 : 40 ⁇ 60 : 30 ⁇ 50 : molar ratio (mole%) of 1 ⁇ 10, 3 ⁇ 10 : 40 ⁇ 70 : 20 ⁇ 55 : molar ratio (mole%) of 0.1 ⁇ 3, 3 ⁇ 10 : 40 ⁇ 55 :
  • the DSPC is 1 to 20 mole ratio (mole%), 1 to 15 mole ratio (mole%), 1 to 10 mole ratio (mole%), 1 to 9 mole ratio (mole%), 1 to 8 mole ratio compared to the total porphyrin-liposome. (mole%), 1 to 7 mole ratio (mole%), 5 to 20 mole ratio (mole%), 5 to 15 mole ratio (mole%), 5 to 10 mole ratio (mole%), 5 to 9 mole ratio (mole%), It may be included in a mole ratio of 5 to 8 (mole%), or in a mole ratio of 5 to 7 (mole%), but is not limited thereto.
  • the DSPE-mPEG2000 has a molar ratio (mole%) of 10 to 80, a molar ratio (mole%) of 10 to 70, a molar ratio (mole%) of 10 to 65, and a molar ratio (mole%) of 10 to 60 compared to the total porphyrin-liposome.
  • molar ratio (mole%) from 10 to 55, molar ratio (mole%) from 10 to 50, molar ratio (mole%) from 10 to 48, molar ratio (mole%) from 20 to 80, molar ratio (mole%) from 20 to 70 ), molar ratio of 20 to 60 (mole%), molar ratio of 20 to 50 (mole%), molar ratio of 30 to 80 (mole%), molar ratio of 30 to 70 (mole%), molar ratio of 30 to 60 (mole%) ), a molar ratio (mole%) of 30 to 50, a molar ratio (mole%) of 30 to 48, a molar ratio (mole%) of 35 to 50, a molar ratio (mole%) of 40 to 50, or a molar ratio (mole%) of 45 to 50. %), but is not limited thereto.
  • the DOPE has a molar ratio (mole%) of 10 to 80, a molar ratio (mole%) of 10 to 70, a molar ratio (mole%) of 10 to 65, a molar ratio (mole%) of 10 to 60, and a molar ratio (mole%) of 10 to 55.
  • the cholesterol has a molar ratio (mole%) of 1 to 15, a molar ratio (mole%) of 1 to 10, a molar ratio (mole%) of 1 to 8, a molar ratio (mole%) of 1 to 6, and a molar ratio (mole%) of 1 to 5. (mole%), mole ratio of 1 to 4 (mole%), mole ratio of 2 to 10 (mole%), mole ratio of 2 to 8 (mole%), mole ratio of 2 to 5 (mole%), mole ratio of 2 to 4 (mole%), or may be included in a molar ratio (mole%) of 2 to 3, but is not limited thereto.
  • the porphyrin-liposome according to the present invention is an ultrasound-sensitive (ultrasound-sensitive) liposome that responds to ultrasound.
  • Ultrasound-sensitive liposome refers to a liposome whose permeability increases or its structure collapses when exposed to ultrasound. That is, when the porphyrin-liposome of the present invention is exposed to ultrasound, the lipid bilayer or structure of the porphyrin-liposome may collapse and the loaded drug may be released.
  • Ultrasound refers to a sound wave exceeding the frequency of 16 Hz to 20 kHz, which is the frequency of sound waves that the human ear can generally hear, and high-intensity focused ultrasound is a continuous, high-intensity sound wave.
  • focused ultrasonic waves that provide ultrasonic energy to a focal point, it is possible to produce instantaneous thermal effects (65-100°C cavitation effects, mechanical effects, and sonochemical effects) depending on energy and frequency.
  • Ultrasonic waves can produce effects on human tissue.
  • High-intensity ultrasound waves which are not harmful when passing through but form a focus, generate enough energy to cause coagulative necrosis and thermal cauterization effects regardless of the type of tissue.
  • the ultrasonic wave refers to a sound wave with a frequency higher than the audible frequency range of 16 Hz to 20 kHz.
  • the ultrasound may be high intensity focused ultrasound (HIFU), high intensity non-focused ultrasound, or a combination of the two, but is not limited thereto.
  • HIFU refers to ultrasound that focuses high-intensity ultrasound energy in one place and creates a concentrated focus.
  • ultrasound-guided high-intensity focused ultrasound Ultrasound-guided HIFU
  • MRI-guided HIFU magnetic resonance imaging-guided high-intensity focused ultrasound
  • the frequency of ultrasonic waves is, for example, 1 kHz to 100 kHz, 1 kHz to 90 kHz, 1 kHz to 80 kHz, 1 kHz to 70 kHz, 1 kHz to 60 kHz, 1 kHz to 50 kHz, 1 kHz to 40 kHz, 1 kHz to 30 kHz, 1 kHz to 20 kHz, 1 kHz to 10 kHz, 20 kHz to 3.0 MHz, 40 kHz to 2.0 MHz, 60 kHz to 2.0 MHz, 80 kHz to 2.0 MHz, 100 kHz to 2.0 MHz, 150 kHz to 2.0 MHz, 200 kHz to 2.0 MHz, 250 kHz to 2.0 MHz, 300 kHz to 2.0 MHz, 350 kHz to 2.0 MHz, 400 kHz to 2.0 MHz, 450 kHz to 2.0 MHz, 500 kHz to 2.0 MHz, 550 kHz to 2.0 MHz, 600 kHz to 2.0 MHz, 650 k
  • the intensity of ultrasonic waves is 0.1 to 30 W/cm 2 , 0.1 to 25 W/cm 2 , 0.1 to 20 W/cm 2 , 0.1 to 15 W/cm 2 , 0.1 to 10 W/cm 2 , 0.1 to 8 W/cm 2 , 0.1 to 5 W/cm 2 , 0.1 to 3 W/cm 2 , 0.1 to 2 W/cm 2 , 0.5 to 10 W/cm 2 , 0.5 to 8 W/cm 2 , 0.5 to It may be 5 W/cm 2 , 0.5 to 3 W/cm 2 , 0.5 to 2 W/cm 2 , 1 to 5 W/cm 2 , 1 to 3 W/cm 2 , or 1 to 2 W/cm 2 ; It is not limited to this.
  • the porphyrin-liposome according to the present invention may have guaranteed stability.
  • the above stability means that the drug encapsulated in the porphyrin-liposome is not released into the blood when not exposed to ultrasound.
  • the present inventors confirmed that the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention maintains its structure stably even after a storage period of 3 months, and that almost no drug release occurs when not treated with ultrasound, so it has high structural stability. confirmed. In other words, the porphyrin-liposome according to the present invention maintains a stable structure in an environment without ultrasound, so almost no drug is released.
  • the particle size of the porphyrin-liposome according to the invention is, for example, 50 to 500 nm in diameter, 50 to 400 nm, 50 to 300 nm, 50 to 200 nm, 50 to 150 nm, 50 to 130 nm, 50 to 110 nm, 80 nm. It may be from 200 nm, 80 to 150 nm, 80 to 120 nm, 80 to 110 nm, 90 to 120 nm, or 90 to 120 nm, but is not limited thereto.
  • the particle size distribution of porphyrin-liposomes can be measured using Zetasizer Nano ZS (Malvern) using Dynamic Light Scattering (DLS) analysis after diluting the porphyrin-liposomes 10 times.
  • the method for measuring the particle size distribution of porphyrin-liposomes is not limited to this, and can be measured according to other methods known in the art and converted to equivalent values.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention can carry a drug.
  • support may be used interchangeably with the terms “encapsulation” or “loading.”
  • the drug may be bound to the lipid bilayer membrane of the porphyrin-liposome, may be carried inside the heterobilayer, or may be carried in the water-soluble compartment inside the porphyrin-liposome.
  • the drug is supported inside the lipid bilayer of porphyrin-liposome.
  • the mixing ratio of porphyrin-liposome:drug is 20 to 1:1, 15 to 1:1, 10 to 1:1, 20 to 5:1, 15 to 5:1, 10 to 5:1. , 9 to 5:1, or 9 to 7:1 by weight (w/w%), but is not limited thereto, and any ratio that allows the drug to be efficiently encapsulated in the porphyrin-liposome is included without limitation.
  • the ratio of the drug loaded on the porphyrin-liposome compared to the total drug added may be 50 to 100%. That is, the porphyrin-liposome according to the present invention has a drug encapsulation ratio of 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 65% to 100%, and 70% to 100%. , 75% to 100%, 76% to 100%, 77% to 100%, 80% to 100%, 85% to 100%, 87% to 100%, 88% to 100%, 90% to 100%, or It may be 95% to 100%, but is not limited thereto.
  • the encapsulation rate may refer to the loading rate relative to the amount of added drug, but is not limited thereto.
  • the method of measuring the drug encapsulation rate of liposomes can be calculated by processing the drug into liposomes, separating the unencapsulated drug using size exclusive chromatography (SEC), and measuring the absorbance of the encapsulated and unencapsulated drugs. .
  • SEC size exclusive chromatography
  • the method for measuring the drug encapsulation rate is not limited to this, and can be measured according to other methods known in the art and converted to equivalent values.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome encapsulated with the drug has 10% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 65% to 100%, 70% to 100%, Alternatively, it may have a drug release rate of 75% to 100%, but is not limited thereto.
  • the drug release rate may refer to the release rate relative to the amount of drug added, but is not limited thereto.
  • the release rate can be measured by treating the porphyrin-liposome with ultrasound, separating the drug released from the porphyrin-liposome and the porphyrin-liposome from which the drug was released by SEC, and measuring the absorbance of the drug.
  • the method for calculating the drug release rate is not limited to this, and can be measured according to other methods known in the art and converted to equivalent values.
  • the porphyrin-liposome encapsulated with the drug is 0.1% to 100%, 0.1% to 80%, 0.1% to 60%, 0.1% to 40%, 0.1% to 30%, It may have a drug release rate of 0.1% to 20%, 0.1% to 10%, or 30% or less, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a drug delivery composition (i.e., drug delivery vehicle) comprising the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome as an active ingredient.
  • a drug delivery composition i.e., drug delivery vehicle
  • the cells or tissues targeted for drug delivery are not limited to specific types, but are preferably cancer cells or tumor tissues.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome may be one in which a drug is encapsulated.
  • the term “drug” refers to any compound that possesses the desired biological activity.
  • the biological activity of interest includes activity useful in the diagnosis, cure, alleviation, treatment, or prevention of disease in humans or other animals.
  • the drug may be an anticancer agent.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome as an active ingredient, wherein the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome is characterized by encapsulating an anticancer agent. provides.
  • cancer or “tumor” as used in the present invention refers to aggressive characteristics in which cells divide and grow in defiance of normal growth limits, invasive characteristics that infiltrate surrounding tissues, It is a general term for diseases caused by cells with metastatic characteristics that spread to other parts of the body.
  • the type of cancer is not particularly limited as long as it is a malignant tumor known in the art, and includes, for example, breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, and head and neck cancer.
  • cervical cancer skin melanoma, intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer.
  • thyroid cancer parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, may be selected from the group consisting of spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma.
  • anticancer agent is not particularly limited as long as it can exert an anticancer effect, such as inhibiting tumor growth or metastasis of cancer.
  • the content of the drug-encapsulated porphyrin-liposome in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the patient's condition, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight based on the total weight of the composition, or It may be 0.001 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount with the solvent removed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, humectants, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared as powder, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, solutions, eye drops, ellipsis, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese according to conventional methods.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, and calcium. These include phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives to tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, white sugar, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, and phosphoric acid.
  • Excipients such as cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin.
  • binders can be used, Hydroxypropyl methyl cellulose, corn starch, agar powder, methyl cellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, sodium alginate, calcium carboxymethyl cellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, silicic acid anhydride, 1-hydroxy Propylcellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, Disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl
  • soybean oil (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, Macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acids, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, Lubricants such as starch, sodium chloride, sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.
  • Additives for the liquid according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc. can be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, etc. may be used in the syrup according to the present invention, and if necessary, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickening agents, etc. may be used.
  • Purified water can be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. can be used as needed.
  • Suspensions according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Topics may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV solution, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil - sesame oil.
  • solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristic acid, and benzene benzoate
  • Solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nicotinic acid amide, hexamine, and dimethylacetamide
  • Weak acids and their salts acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and buffering agents such as gums
  • Isotonic agents such as sodium chloride
  • Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ) carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N 2 ),
  • Suppositories according to the present invention include cacao oil, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, lecithin, Lanet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydrocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Massaupol, Masupol-15, Neosupostal-
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, vaginal injection. It can be administered by internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined depending on the type of drug as the active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, gender, weight, and severity of the disease.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, gender, and body weight, and is generally administered at 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg, per kg of body weight every day or every other day, or 1 It can be administered in divided doses 1 to 3 times a day.
  • the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, etc. refers to mammals of
  • “administration” means providing a given composition of the present invention to an individual by any suitable method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of the desired disease
  • treatment refers to the improvement or improvement of the desired disease and its associated metabolic abnormalities by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions that are beneficially changed, and “improvement” refers to all actions that reduce parameters related to the desired disease, such as the degree of symptoms, by administering the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a drug delivery kit containing the porphyrin-liposome; and/or a kit for preventing or treating cancer containing a porphyrin-liposome encapsulated with an anticancer agent.
  • the "kit” is not limited to the specific form or type, and any kit commonly used in the art can be used, and can carry out the purpose of the present invention in addition to the porphyrin-liposome of the present invention. It may further include any necessary components. For example, in addition to the porphyrin-liposome of the present invention, it may further include a storage solution, administration tool, drug, suspension for administration, etc., and may further include an instruction sheet containing information about the porphyrin-liposome of the present invention.
  • the present invention includes the steps of (S1) dissolving porphyrin and phospholipid in a first organic solvent; and
  • step (S2) It provides a method for producing the ultrasonic-sensitive porphyrin-liposome, comprising the step of hydrating the mixed solution prepared in step (S1) in an aqueous solution and stirring it.
  • the first organic solvent may be one or more selected from the group consisting of dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, chloroform, methanol, ethanol, and ether, but is not limited thereto.
  • the first organic solvent is ethanol.
  • porphyrin and phospholipid are as described above.
  • the step (S1) may involve dissolving other lipids in addition to porphyrin and DOPE in the first organic solvent.
  • the lipid may preferably be selected from DSPC, DSPE-mPEG2000, cholesterol, etc.
  • the mixing ratio of the above lipids including DOPE is as described above. For example, it may be included in a weight ratio of 1:1 to 10:0.1 to 1:2 to 20, but is not limited thereto.
  • the DSPC is 1 to 30% by weight compared to the total ethanol solution
  • the DSPE-mPEG2000 is 5 to 40% by weight compared to the total ethanol solution
  • the cholesterol is 1 to 15% by weight relative to the total ethanol solution
  • the DOPE may be dissolved in an amount of 20 to 80% by weight based on the total ethanol solution, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of porphyrin:total lipid in the ethanol solution is 1:20 to 90, 1:20 to 80, 1:20 to 70, 1:20 to 60, 1:20 to 50, It may be 1:30 to 80, 1:40 to 80, 1:30 to 70, 1:30 to 60, 1:40 to 60, or 1:40 to 50, but is not limited thereto.
  • the first organic solvent in step (S1) may be one to which polysorbate is added, but is not limited thereto.
  • the aqueous solution may be ammonium sulfate, ammonium citrate, ammonium sulfate, or TEA-SOS, but is not limited thereto, and may be appropriately selected depending on the type of drug carried in the porphyrin-liposome. . Most preferably, the aqueous solution is ammonium sulfate.
  • step (S1) is performed at a temperature of 20 to 80°C, 30 to 80°C, 40 to 80°C, 50 to 80°C, 60 to 80°C, 65 to 80°C, 60 to 75°C, or 65 to 75°C. It may be performed in, but is not limited to this.
  • the production method may further include, but is not limited to, the step of evaporating the organic solvent after step (S2).
  • the production method may further include the step of extruding the hydrated porphyrin-liposome through an extruder after step (S2).
  • the temperature for extrusion of the porphyrin-liposome can be adjusted variously from room temperature to the phase transition temperature range of each material, and the number of extrusion can be repeated an appropriate number of times to make the size of the porphyrin-liposome uniform.
  • porphyrin-liposome preparation prepared according to the production method of the present invention can be used for drug delivery to injections, transdermal, nasal cavity, and lungs.
  • the technology and pharmaceutically appropriate carriers, additives, etc. required for such formulations are widely known to those skilled in the art, and in this regard, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) may be referred to. .
  • the concentration of phospholipids dissolved in the first organic solvent is 10 to 200 mg/mL, 10 to 150 mg/mL, 10 to 100 mg/mL, 10 to 80 mg/mL, and 10 to 60 mg/mL.
  • step (S2) is performed at a temperature of 20 to 80°C, 20 to 70°C, 20 to 65°C, 30 to 80°C, 40 to 80°C, 50 to 80°C, 40 to 70°C, or 50 to 70°C. It may be performed in, but is not limited to this.
  • the manufacturing method may further include adding and mixing a drug to the porphyrin-liposome solution after step (S2).
  • the mixing ratio of the porphyrin-liposome:drug is 20 to 1:1, 15 to 1:1, 10 to 1:1, 20 to 5:1, 15 to 5:1, 10 to 5:1, 9 to 5:1. It may be 1, or a weight ratio (w/w%) of 9 to 7:1, but is not limited thereto.
  • the mixing may occur for 30 minutes to 5 hours, 30 minutes to 4 hours, 30 minutes to 3 hours, 1 hour to 5 hours, 1 hour to 4 hours, or 1 hour to 3 hours; It may be performed at 100 to 1,000 rpm, 100 to 800 rpm, 100 to 500 rpm, 100 to 400 rpm, 100 to 350 rpm, or 100 to 300 rpm, but is not limited thereto. Additionally, the mixing may be performed at a temperature of 20 to 50°C, 20 to 45°C, 20 to 40°C, 30 to 50°C, 35 to 45°C, or 35 to 40°C, but is not limited thereto.
  • the term "combination thereof" included in the Markushi format expression means a mixture or combination of one or more selected from the group consisting of the components described in the Markushi format expression, It means containing one or more selected from the group consisting of constituent elements.
  • DOX Doxorubicin DOX-liposome or DLL Liposome loaded with doxorubicin DOX-porphyrin-liposome; or DLPL Liposome loaded with doxorubicin and porphyrin US Ultrasound irradiation group
  • DSPC 32.1 mg of DSPC, 57.0 mg of DSPE-mPEG2000, 23.5 mg of cholesterol, 206.6 mg of DOPE, and 3.99 mg of porphyrin were dissolved in ethanol at a total concentration of 256 mg/ml at 70°C.
  • the lipid solution dissolved in a completely transparent solution was mixed with a 250mM aqueous ammonium sulfate solution, and the lipid concentration at this time was maintained at 32mg/mL and the temperature at 60°C. Stirring of the mixed solution was performed for 1 hour to hydrate the phospholipid membrane, and the mixed lipid solution was homogenized using a high-temperature extruder (LIPEX, Evonic).
  • LIPEX high-temperature extruder
  • a polycarbonate filter was manufactured by gradually reducing the size from 0.8 ⁇ m-pore to 0.4 ⁇ m-pore size, and then to 0.2 ⁇ m-pore size. The process was repeated until the size of the prepared porphyrin-liposome reached 100-200 nm.
  • the particle size distribution of porphyrin-liposomes was measured by diluting porphyrin-liposomes 10 times and using Zetasizer Nano ZS (Malvern) using Dynamic Light Scattering (DLS) analysis.
  • the porphyrin-liposome solution whose particle size distribution was controlled by extrusion, was introduced into a dialysis membrane with a molecular weight (MWCO) of 15,000 Dalton and dialyzed in a 10% sucrose, 10mM L-histidine solution for 12 hours.
  • MWCO molecular weight
  • doxorubicin was added to the dialyzed porphyrin-liposome solution and stirred at 200-300 rpm for 2 hours at 37°C. Porphyrin-liposome and doxorubicin were mixed at a weight ratio of 8:1. After stirring for 2 hours, unencapsulated doxorubicin was separated using size exclusive chromatography (SEC). Encapsulated and unencapsulated doxorubicin were quantified by absorbance measurement at a wavelength of 480 nm.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome prepared according to Example 1 and a general liposome were prepared and compared.
  • the diameter of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome of the present invention was measured to be 102 ⁇ 14 nm, and the diameter of the regular liposome was measured to be 103 ⁇ 11 nm. As a result, it was confirmed that there was no significant difference in the size distribution of the two. Subsequently, in order to confirm the shape of each liposome particle, it was photographed and compared with a TEM (Transmission Electron Microscope), and it was confirmed that there was no significant difference in shape or size (Figure 1).
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • the ultrasound sensitivity of the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome encapsulated with doxorubicin and the general liposome were compared. Specifically, this analysis was performed using doxorubicin loaded at 0.1 mg/mL based on doxorubicin, and the doxorubicin loading rate of each liposome and the drug release rate according to ultrasound irradiation were confirmed.
  • doxorubicin-encapsulated porphyrin-liposomes or general liposomes were loaded into a 24 well plate, and then the plate was subjected to 1.5 W/w at the bottom of the plate using an ultrasonic device (SP100, SONIDEL). cm 2 , 50%, and 10 minutes.
  • SP100, SONIDEL ultrasonic device
  • cm 2 50%, and 10 minutes.
  • doxorubicin released from the liposome and the liposome from which doxorubicin was released were separated using size exclusive chromatography (SEC). Quantitative analysis of doxorubicin was performed by measuring absorbance at 480 nm. The results are shown in Figure 2 and Table 2.
  • the drug encapsulation rate (95.8%) of the ultrasonic liposome of the present invention was found to be comparable to that of general liposomes (97.1%).
  • the rate of doxorubicin released from the liposomes was only less than 5% even when irradiated with ultrasound, but in the case of the porphyrin-liposome according to the present invention, the drug release rate was more than 95% when irradiated with ultrasound, and most of the porphyrin -It was confirmed that the liposome responded to ultrasound and released the drug.
  • MTT analysis was performed using 4T1 cells, a cancer cell line.
  • the anticancer effects of doxorubicin-encapsulated porphyrin-liposome, doxorubicin-encapsulated regular liposome (does not contain porphyrin), and free doxorubicin (free DOX) were compared, and each group was divided into an ultrasound irradiation group and an ultrasound untreated group.
  • the 4T1 cell line was appropriately dispensed into each well of a 96-well plate and cultured overnight.
  • Free doxorubicin, ultrasound-irradiated liposomes (+US), or non-ultrasounded liposomes (-US) were added to the cultured cells in the designated wells. Each was processed. Each liposome or free doxorubicin was treated at a concentration of 2 to 10 ⁇ g/mL. Afterwards, all added drugs were removed, the cells were washed, and the degree of proliferation of cancer cells was compared while further cultured with cell culture medium to which MTT was added.
  • the experimental groups were divided into the following: (i) negative control administered saline, (ii) free doxorubicin (Free DOX) without sonication, (iii) DOX-liposome (LIP-DOX) without sonication, ( iv) DOX-Porphyrin-Liposome without sonication (PPR-LIP-DOX), (v) ultrasound treatment only, (vi) free doxorubicin with ultrasound pretreatment (Free DOX+US), (vii) ultrasound pretreatment DOX-liposomes (LIP-DOX+US), and (viii) ultrasound-pretreated DOX-porphyrin-liposomes (PPR-LIP-DOX+US).
  • Each substance was administered a single intravenous injection at a dose of 2 mg/kg (volume 200 ⁇ L) based on doxorubicin, and the mice were monitored for 2 weeks after injection, with body weight and condition recorded on days 3, 6, 9, 12, and 15 after injection. recorded.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention can maintain structural stability even when encapsulating a drug, minimizing the risk of non-specific drug release, and has excellent sensitivity to ultrasound. It was confirmed that release could be appropriately controlled (Figure 5).
  • porphyrin-liposomes loaded with anticancer drugs demonstrated better anticancer effects than free anticancer drugs, confirming that they had excellent drug delivery efficiency. Therefore, the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention can further improve the delivery efficiency and pharmacological effect of the encapsulated drug, and is expected to be useful in the field of treatment of various diseases and drug delivery.
  • the present invention relates to ultrasound-sensitive porphyrin-liposomes capable of releasing drugs in response to ultrasound.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome of the present invention is characterized in that it contains porphyrin. Porphyrin exposed to ultrasound reacts with water to generate reactive oxygen species (Reactive Oxygen Species) and constitutes a lipid bilayer of the porphyrin-liposome. Phospholipids react to reactive oxygen species generated by porphyrin, causing lipid peroxidation, which can eventually cause the structure of the lipid bilayer to collapse and release the encapsulated drug.
  • Reactive Oxygen Species reactive oxygen species
  • Phospholipids react to reactive oxygen species generated by porphyrin, causing lipid peroxidation, which can eventually cause the structure of the lipid bilayer to collapse and release the encapsulated drug.
  • the ultrasound-sensitive porphyrin-liposome according to the present invention can appropriately control drug release using ultrasound, and also maintains excellent structural stability even when the drug is encapsulated, thereby minimizing non-specific drug delivery.
  • the porphyrin-liposome of the present invention can improve the drug delivery efficiency and pharmacological effect of the drug, and can be used as an excellent drug carrier for various diseases by carrying various drugs.

Abstract

본 발명은 초음파에 반응하여 약물을 방출할 수 있는 초음파 감응형 포피린-리포좀에 관한 것이다. 본 발명의 초음파 감응형 포피린-리포좀은 포피린을 포함하여, 초음파에 노출된 포피린은 물과 반응하여 활성산소종을 생성하고, 포피린-리포좀의 지질이중층을 구성하는 인지질은 포피린이 생성한 활성산소종에 반응하여 지질과산화를 일으켜, 결과적으로는 지질이중층의 구조가 붕괴되면서 봉입된 약물이 방출될 수 있다.

Description

초음파 감응형 포피린-리포좀 및 이의 용도
본 발명은 포피린을 포함하는 초음파 감응형 리포좀, 이의 제조방법, 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
본 발명은 2022년 7월 22일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0091126호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 전세계적으로 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 중요한 질환이다.
현재 임상학적으로 사용하고 있는 암 치료 방법은 화학 요법, 방사선, 표적 치료, 및 수술로써 병소를 절제하는 방법 등이 있다. 현재까지 사용되고 있는 항암치료를 위한 화학요법제의 대표적인 예는 독소루비신 (Doxorubicin) 또는 아드리아마이신 (Adriamycin), 시스플라틴 (Cisplatin), 탁솔 (Taxol), 5-fluorouracil 등이 있으며 암치료를 위한 화학치료법으로 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 상기 방법들은 한계가 있으며, 완치되는 경우보다는 환자에게 심한 부작용 및 고통을 수반하고 있어, 부작용을 최소화할 수 있는 암 치료 기술의 개발이 중요한 실정이다.
특히, 기존의 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상조직에도 침투하여 정상 세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고, 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서, 기존 항암제의 비특이적 작용을 줄이고, 예상치 못한 부작용을 예방할 수 있는 혁신적인 약물전달체의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 리포좀 (liposomes)은 수성 내부 구획을 둘러싼 지질 이중층 (lipid bilayers)으로 구성된 소포체(vesicle)로, 상기 막은 주로 인지질 및 이의 유도체로 이루어진다. 인지질 및 이들의 유도체가 수용액 등에 분산되면 자발적으로 소포체를 형성한다. 리포좀은 수성 내부 공간에 수용성 활성성분을 담지할 수 있으며, 또한 지질 이중층 내에 소수성 활성성분을 담지할 수 있으므로, 의학, 제약학 및 생화학 분야에서 약물, 효소, 유전자 서열과 같은 치료제의 담체로 사용되어 왔다. 그러나, 현재까지 개발된 리포좀은 봉입된 약물에 의해 지질 이중층의 성질에 변화가 생겨 리포좀의 구조적 안정성 또는 자극에 대한 감응성이 저해되는 등의 문제가 있으며, 비특이적인 약물 방출에 의해 약리학적 효과가 반감되거나 예상치 못한 부작용 발생하는 문제가 있다.
따라서, 약물을 봉입하더라도 구조적 안정성을 유지하면서, 초음파 등의 자극에 반응하여 약물 조절을 방출할 수 있는 리포좀의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 포피린 및 인지질을 포함하는 포피린-리포좀이 약물을 봉입시켜도 높은 구조적 안정성을 유지하고, 초음파에 민감하게 반응하여 약물을 방출할 수 있어, 타겟 조직으로의 약물 전달 효율을 개선하고, 약리학적 활성을 증진시키는 효과가 있음을 확인하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 포피린 및 인지질을 포함하는 초음파 감응형 포피린-리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제가 봉입된 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 포피린 (Porphyrin) 및 인지질을 포함하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀으로서, 상기 인지질은 소수성 꼬리에 탄소=탄소 (C=C) 이중결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 포피린은 초음파 (Ultrasound)에 노출되었을 때 활성산소종을 생성할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 초음파에 노출되었을 때 지질 이중층이 분해되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 인지질은 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 포피린 : 인지질의 중량비는 1 : 20 내지 90일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 포피린은 전체 초음파 감응형 포피린-리포좀 대비 1 내지 10 건조중량%으로 포함되고, 상기 인지질은 전체 초음파 감응형 포피린-리포좀 대비 90 내지 99 건조중량%으로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 100 내지 200 nm의 입도를 가짐; 및
(b) 첨가되는 전체 약물 대비 초음파 감응형 포피린-리포좀에 담지되는 약물의 비율은 50 내지 100%임.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물이 봉입된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀 : 약물의 중량비는 20 내지 1 : 1 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 약물 전달 방법을 제공한다. 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 상기 약물이 봉입된 것일 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 약물 전달 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 약물전달체의 제조를위한 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물이 봉입된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약물은 항암제일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 항암제가 봉입된 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 항암제가 봉입된 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 암의 치료용 약제 (항암제)의 제조를 위한 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 5-플루오로우라실(5-FU), 타목시펜, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 젬시타빈, 류프로리드, 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 류코보린, 옥살리플라틴, 발루비신, 레티노익산, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 빈블라스틴, 마이토마이신, 프레드니손, 아피니토, 및 미토산트론으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 초음파 처리와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 (S1) 포피린 및 인지질을 제1 유기용매에 용해시키는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 제조된 혼합 용액을 수용액에 수화시켜 교반하는 단계를 포함하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀의 제조방법으로서,
상기 인지질은 소수성 꼬리에 탄소=탄소 (C=C) 이중결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제1 유기용매는 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 디메틸술폭시드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 인지질은 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단계 (S1)은 상기 포피린 및 인지질 외에 DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 제1 유기용매에 용해시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 초음파에 반응하여 약물을 방출할 수 있는 초음파 감응형 포피린-리포좀에 관한 것이다. 본 발명의 초음파 감응형 포피린-리포좀은 포피린을 포함하는 것을 특징으로 하는 바, 초음파에 노출된 포피린은 물과 반응하여 활성산소종 (Reactive Oxygen Species)을 생성하고, 포피린-리포좀의 지질이중층을 구성하는 인지질은 포피린이 생성한 활성산소종에 반응하여 지질과산화를 일으켜, 결과적으로는 지질이중충의 구조가 붕괴되면서 봉입된 약물이 방출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀은 초음파를 이용하여 약물 방출을 적절히 조절할 수 있으며, 또한 약물을 봉입하더라도 우수한 구조적 안정성을 유지하므로 비특이적인 약물 전달을 최소화할 수 있다. 특히, 상기 포피린-리포좀에 항암제를 봉입하여 초음파 조사에 따른 항암 효과를 확인한 결과, 종래 리포좀 또는 자유 항암제에 비해 더욱 우수한 항암 효과를 발휘하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 포피린-리포좀은 약물의 전달효율 및 약물의 약리학적 효과를 증진시킬 수 있는 바, 다양한 약물을 담지하여 여러 질환에서 우수한 약물 전달체로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀 및 일반 리포좀을 TEM으로 촬영한 이미지이다.
도 2는 약물이 봉입된 초음파 감응형 포피린-리포좀 또는 일반 리포좀의 초음파 조사 여부에 따른 약물 방출률을 확인한 결과이다.
도 3은 각각 항암제가 봉입된 초음파 감응형 포피린-리포좀 및 일반 리포좀의 초음파 조사 여부에 따른 암세포 사멸효과를 확인한 결과이다.
도 4a는 암 동물모델에 초음파가 처리되거나 처리되지 않은 자유 독소루비신 또는 리포좀을 투여한 후 시간에 따른 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 4b는 암 동물모델에 초음파가 처리되거나 처리되지 않은 자유 독소루비신 또는 리포좀을 투여한 후 시간에 따른 종양 크기를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 포피린-리포좀의 초음파 유무에 따른 작용 매커니즘을 나타낸 그림이다.
본 발명은 포피린 및 인지질을 포함하는 초음파 감응형 포피린-리포좀에 관한 것으로서, 상기 포피린-리포좀은 약물을 봉입시켜도 높은 구조적 안정성을 유지하며, 초음파에 민감하게 반응하여 약물을 방출할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 즉, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 타겟 조직으로의 약물 전달 효율을 개선하고, 약리학적 활성을 증진시킬 수 있는 바, 다양한 약물의 약물 전달체로 활용 가능하다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 서술한다.
본 발명은 포피린 및 인지질을 포함하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀을 제공한다. 본 명세서에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 간략히 '포피린-리포좀'으로 표기될 수 있다.
본 발명에 있어서, "포피린 (Porphyrin)"은 메틴기 (methane bridges; =CH-)를 통해 α 탄소 원자에 상호 연결된 4개의 피롤 (Pyrrole)로 구성된 거대고리 화합물 (Macrocyclic compounds) 또는 이의 유도체를 지칭한다. 포피린은 내부에 2가 또는 3가의 금속 이온 (예를 들어, Fe(II), Fe(III), Mn(II), Pd(II) 등)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 포피린은 음파 (Sound wave), 바람직하게는 초음파 (Ultrasound)에 노출되었을 때 물과 반응하여 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)을 생성하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 포피린을 포함하는 포피린-리포좀은 초음파에 노출되었을 때 포피린에 의해 활성산소종을 생성할 수 있으며, 활성산소종에 반응한 인지질에 의해 결과적으로 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 포피린은 소수성 화합물로서, 본 발명에 따른 포피린-리포좀의 소수성 부분, 예컨대 지질 이중층 막 내부에 포함 (적재, 담지, 혹은 봉입)될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 포피린은 철 (Fe) 이온을 포함하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 포피린은 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 2개의 수소 (H)가 N-(2-(2-aminoethylamino)ethyl)butyramide로 치환된 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 포피린은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
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본 발명의 포피린의 범위에는 포피린의 약학적으로 허용가능한 염도 포함된다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물 또는 조성물을 의미한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, "인지질 (phospholipid)"은 글리세롤, 2개의 지방산 꼬리 (fatty acid tails), 및 인산염이 결합된 헤드 그룹 (head group)으로 구성된 복합지질을 지칭한다. 인지질은, 양친매성 (amphipathic)을 갖는 화합물로서, 친수성인 헤드 그룹은 수성 매질과 반응하고, 소수성의 꼬리는 유기용매와 반응하기 때문에, 수성 매질 및 유기용매 간의 계면에 배열되어 자발적으로 지질 이중층을 형성할 수 있다. 즉, 인지질과 같은 양친매성 화합물은 비혼화성인 두 가지의 액체 (예: 물과 오일)의 혼합물, 액체와 기체의 혼합물 (예: 물중에 기체 마이크로버블) 또는 액체와 불용성 입자의 혼합물 (예. 물중에 금속 나노 입자)과 같이 다른 방법으로는 통상적으로 섞일 수 없는 물질의 혼합물을 안정화시킬 수 있는 화합물이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인지질은 활성산소종에 대한 반응성이 있는 것으로서, 활성산소종에 노출되었을 때 지질과산화 (lipid peroxidation)를 일으킬 수 있는 인지질이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 탄소-탄소간 이중결합 (C=C 이중결합)을 포함하는 인지질을 포함한다. 즉, 상기 인지질은 불포화 지방산을 포함하는 인지질이다. 달리 말하면, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은, 가장 바람직하게는, 불포화 지방산을 포함하는 1종 이상의 인지질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 불포화 지방산을 포함하는 인지질은 꼬리의 C=C 이중결합으로 인해 포화 지방산에 비해 구조적 안정성이 낮으므로, 활성산소종과 반응하여 지질과산화가 더욱 활발히 일어나는 특징이 있다. 따라서, 불포화 지방산을 포함하는 인지질로 구성된 지질 이중층 기반의 포피린-리포좀은, 활성산소종에 노출되었을 때 불포화 지방산의 이중결합이 재배열됨에 따라 이중층이 분해 (붕괴)되어 결과적으로 포피린-리포좀의 구조가 분해될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 초음파에 노출되었을 때 포피린에 의해 활성산소종이 생성됨에 따라 포피린-리포좀의 지질과산화가 일어나 궁극적으로는 포피린-리포좀의 지질 이중층 막이 파괴되면서 봉입되어 있던 약물이 방출될 수 있다.
본 발명에 따른, 탄소-탄소간 이중결합을 포함하는 인지질은 상기 특성을 만족하는 것이면 충분하고, 구체적인 종류에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 특정 인지질을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 포피린-리포좀에 포함되지 않는 특정 지방산은, 예컨대, 포스파티딜콜린 (phosphatidyl choline, PC), 디미리스토일 포스파티딜콜린 (dimyristoyl phospatidylcholine, DMPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (dipalmitoyl phosphatidycholine, DPPC), 및 에그 포스파티딜 글리세롤 (egg phosphatidyl glycerol) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 포피린-리포좀을 구성하는 전체 포피린 : 인지질의 몰비 (mole %)는 1 : 500 내지 2,000일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 포피린 : 인지질의 몰비는 1 : 500 내지 1,800, 1 : 500 내지 1,600, 1 : 800 내지 2,000, 1 : 1,000 내지 2,000, 1 : 1,200 내지 2,000, 1 : 1,300 내지 2,000, 1 : 1,400 내지 2,000, 1 : 1,400 내지 1,800, 또는 1 : 1,400 내지 1,600 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또는, 상기 포피린-리포좀을 구성하는 전체 포피린 : 인지질의 중량비는 1 : 20 내지 90일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 포피린 : 인지질의 중량비는 1 : 20 내지 90, 1 : 20 내지 80, 1 : 20 내지 70, 1 : 20 내지 60, 1 : 20 내지 50, 1 : 30 내지 80, 1 : 40 내지 80, 1 : 30 내지 70, 1 : 30 내지 60, 1 : 40 내지 60, 또는 1 : 40 내지 50 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 포피린은 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 10 건조중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 포피린은 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 건조중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 인지질은 전체 포피린-리포좀 대비 90 내지 99건조중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 인지질은 전체 포피린-리포좀 대비 90 내지 99, 92 내지 99, 94 내지 99, 96 내지 99, 또는 98 내지 99 건조중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 인지질은 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, "DSPC"는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)의 약어로, 포스파티딜콜린 헤드기 (head group)에 부착된 2 개의 스테아르산으로 구성된 인지질을 지칭한다.
본 발명에 있어서, "DSPE-mPEG2000"는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-메톡시-폴리(에틸렌글리콜-2000) (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanol amine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000))의 약어로, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-PE (DSPE)의 페길화된 유도체를 지칭한다.
본 발명에 있어서, "콜레스테롤 (cholesterol)"은 스테롤 (sterol; 변형된 스테로이드)의 하나로, 모든 동물세포의 세포막에서 발견되는 지질을 지칭한다. 본 발명에 따른 콜레스테롤은 콜레스테롤의 유도체를 포함한다. 콜레스테롤의 유도체는, 예를 들면, 시스토스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, 4,22-스티그마스타디엔-3-온, 스티그마스테롤 아세테이트, 라노스테롤, 시클로아르테놀, 또는 이들의 조합일 수 있다. 콜레스테롤은 지질 이중층에 위치하며, 그 양을 조절함에 따라 투과도를 낮추거나 높일 수 있으며, 리포좀 내 비율에 관계 없이 사용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 포피린-리포좀이 DSPC, DSPE-mPEG2000, 및 콜레스테롤을 더 포함하는 경우, 상기 DSPC : DSPE-mPEG2000 : 콜레스테롤 : DOPE는 1 : 1 내지 10 : 0.1 내지 1 : 2 내지 20의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 DSPC : DSPE-mPEG2000 : 콜레스테롤 : DOPE는 1 : 1 내지 5 : 0.1 내지 1 : 2 내지 15의 중량비, 1 : 1 내지 10 : 0.1 내지 1 : 2 내지 10의 중량비, 1 : 1 내지 5 : 0.1 내지 1 : 2 내지 10의 중량비, 1 : 1 내지 5 : 0.1 내지 0.9 : 2 내지 10의 중량비, 1 : 1 내지 3 : 0.1 내지 1 : 2 내지 10의 중량비, 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 1 : 2 내지 8의 중량비, 1 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1 : 4 내지 8의 중량비, 또는 1 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1 : 5 내지 7의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 DSPC는 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 30 중량%,
상기 DSPE-mPEG2000은 전체 포피린-리포좀 대비 5 내지 40 중량%,
상기 콜레스테롤은 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 15 중량%, 및
상기 DOPE는 전체 포피린-리포좀 대비 20 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 DSPC는 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 30 중량%, 1 내지 25 중량 %, 1 내지 20 중량%, 1 내지 15 중량%, 1 내지 12 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 15 중량%, 7 내지 12 중량%, 8 내지 12 중량%, 또는 9 내지 11 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 DSPE-mPEG2000은 전체 포피린-리포좀 대비 5 내지 40 중량%, 5 내지 35 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 25 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 15 중량%, 10 내지 40 중량%, 10 내지 30 중량%, 10 내지 25 중량%, 10 내지 20 중량%, 15 내지 30 중량%, 15 내지 20 중량%, 또는 16 내지 19 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 콜레스테롤은 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 15 중량%, 1 내지 12 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 8 중량%, 5 내지 15 중량%, 5 내지 12 중량%, 5 내지 10 중량%, 또는 5 내지 8 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 DOPE는 전체 포피린-리포좀 대비 20 내지 80 중량%, 20 내지 75 중량%, 20 내지 70 중량%, 20 내지 65 중량%, 30 내지 80 중량%, 30 내지 75 중량%, 30 내지 70 중량%, 30 내지 65 중량%, 40 내지 80 중량%, 40 내지 75 중량%, 40 내지 70 중량%, 40 내지 65 중량%, 50 내지 80 중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70 중량%, 50 내지 65 중량%, 55 내지 80 중량%, 55 내지 75 중량%, 55 내지 70 중량%, 55 내지 65 중량%, 60 내지 80 중량%, 60 내지 75 중량%, 60 내지 70 중량%, 또는 60 내지 65 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 DSPC : DSPE-mPEG2000 : DOPE : 콜레스테롤은 1~50 : 1~80 : 5~80 : 0.1~50의 몰비 (mole%)로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 지질 조성을 만족하는 리포좀은 특히 우수한 약물 봉입률, 초음파 감음성, 및 혈중 안정성을 보유하는 것으로 확인된 바 있다.
보다 구체적으로, 상기 DSPC : DSPE-mPEG2000 : DOPE : 콜레스테롤은 1~50 : 1~80 : 5~80 : 0.1~50의 몰비 (mole%), 1~30 : 1~80 : 5~60 : 0.1~50의 몰비 (mole%), 1~30 : 1~60 : 5~60 : 0.1~30의 몰비 (mole%), 1~30 : 1~60 : 5~60 : 0.1~10의 몰비 (mole%), 1~10 : 20~60 : 20~60 : 0.1~10의 몰비 (mole%), 1~15 : 30~50 : 30~50 : 1~5의 몰비 (mole%), 1~8 : 40~60 : 30~50 : 1~10의 몰비 (mole%), 3~10 : 40~70 : 20~55 : 0.1~3의 몰비 (mole%), 3~10 : 40~55 : 40~50 : 1~5의 몰비 (mole%), 또는 3~8 : 43~52 : 43~46 : 1~3의 몰비 (mole%)로 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 DSPC는 전체 포피린-리포좀 대비 1 내지 20 몰비 (mole%), 1 내지 15 몰비 (mole%), 1 내지 10 몰비 (mole%), 1 내지 9 몰비 (mole%), 1 내지 8 몰비 (mole%), 1 내지 7 몰비 (mole%), 5 내지 20 몰비 (mole%), 5 내지 15 몰비 (mole%), 5 내지 10 몰비 (mole%), 5 내지 9 몰비 (mole%), 5 내지 8 몰비 (mole%), 또는 5 내지 7 몰비 (mole%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 DSPE-mPEG2000은 전체 포피린-리포좀 대비 10 내지 80의 몰비 (mole%), 10 내지 70의 몰비 (mole%), 10 내지 65의 몰비 (mole%), 10 내지 60의 몰비 (mole%), 10 내지 55의 몰비 (mole%), 10 내지 50의 몰비 (mole%), 10 내지 48의 몰비 (mole%), 20 내지 80의 몰비 (mole%), 20 내지 70의 몰비 (mole%), 20 내지 60의 몰비 (mole%), 20 내지 50의 몰비 (mole%), 30 내지 80의 몰비 (mole%), 30 내지 70의 몰비 (mole%), 30 내지 60의 몰비 (mole%), 30 내지 50의 몰비 (mole%), 30 내지 48의 몰비 (mole%), 35 내지 50의 몰비 (mole%), 40 내지 50의 몰비 (mole%), 또는 45 내지 50의 몰비 (mole%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 DOPE는 10 내지 80의 몰비 (mole%), 10 내지 70의 몰비 (mole%), 10 내지 65의 몰비 (mole%), 10 내지 60의 몰비 (mole%), 10 내지 55의 몰비 (mole%), 10 내지 50의 몰비 (mole%), 10 내지 48의 몰비 (mole%), 10 내지 46의 몰비 (mole%), 20 내지 80의 몰비 (mole%), 20 내지 70의 몰비 (mole%), 20 내지 60의 몰비 (mole%), 20 내지 50의 몰비 (mole%), 20 내지 48의 몰비 (mole%), 30 내지 80의 몰비 (mole%), 30 내지 70의 몰비 (mole%), 30 내지 60의 몰비 (mole%), 30 내지 50의 몰비 (mole%), 30 내지 48의 몰비 (mole%), 35 내지 50의 몰비 (mole%), 40 내지 50의 몰비 (mole%), 또는 43 내지 48의 몰비 (mole%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 콜레스테롤은 1 내지 15의 몰비 (mole%), 1 내지 10의 몰비 (mole%), 1 내지 8의 몰비 (mole%), 1 내지 6의 몰비 (mole%), 1 내지 5의 몰비 (mole%), 1 내지 4의 몰비 (mole%), 2 내지 10의 몰비 (mole%), 2 내지 8의 몰비 (mole%), 2 내지 5의 몰비 (mole%), 2 내지 4의 몰비 (mole%), 또는 2 내지 3의 몰비 (mole%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 포피린-리포좀은 초음파에 반응하는, 초음파 감응형 (초음파 감응성) 리포좀이다. 초음파 감응형 리포좀이란 초음파에 노출되는 경우, 투과성이 증가하거나 그 구조가 붕괴되는 리포좀을 의미한다. 즉, 본 발명의 포피린-리포좀이 초음파에 노출되는 경우, 상기 포피린-리포좀의 지질이중층 내지 구조가 붕괴되어 담지되어 있던 약물이 방출될 수 있다.
본 발명에 있어서, "초음파 (Ultrasound)"는 일반적으로 사람의 귀가 들을 수 있는 음파의 주파수인 16 Hz~20 kHz의 주파수를 넘는 음파 (Sound wave)를 의미하며, 고강도 집중초음파는 연속적이고 고강도인 초음파 에너지를 초점에 제공하는 집속형 초음파를 도입하여 에너지와 진동수에 따라 순간 열 효과 (65-100 ℃공동화 (cavitation) 효과, 기계적 효과 및 음향화학적 (sonochemical) 효과를 낼 수 있다. 초음파는 인체조직을 통과할 때 해롭지 않으나 초점을 형성하는 고강도의 초음파는 조직의 종류에 상관없이 응고괴사 및 열소작 효과를 일으킬 수 있을 만큼 충분한 에너지를 발생한다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파는 가청 주파수의 범위인 16 Hz 내지 20 kHz 보다 주파수가 큰 음파를 말한다. 초음파는 고강도 집중 초음파 (high intensity focused ultrasound: HIFU), 고강도 비집중 초음파, 또는 이 둘의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. HIFU는 고강도의 초음파 에너지를 한 곳에 모아 집중된 초점을 만드는 초음파를 말한다. 어떤 영상을 보면서 고강도 집중 초음파 치료를 하는가에 따라서, 초음파 유도 고강도 집중 초음파 (Ultrasound-guided HIFU)와 자기공명영상 유도 고강도 집중 초음파 (MRI-guided HIFU)가 있다. 초음파의 주파수는 예를 들면, 1 kHz 내지 100 kHz, 1 kHz 내지 90 kHz, 1 kHz 내지 80 kHz, 1 kHz 내지 70 kHz, 1 kHz 내지 60 kHz, 1 kHz 내지 50 kHz, 1 kHz 내지 40 kHz, 1 kHz 내지 30 kHz, 1 kHz 내지 20 kHz, 1 kHz 내지 10 kHz, 20 kHz 내지 3.0 MHz, 40 kHz 내지 2.0 MHz, 60 kHz 내지 2.0 MHz, 80 kHz 내지 2.0 MHz, 100 kHz 내지 2.0 MHz, 150 kHz 내지 2.0 MHz, 200 kHz 내지 2.0 MHz, 250 kHz 내지 2.0 MHz, 300 kHz 내지 2.0 MHz, 350 kHz 내지 2.0 MHz, 400 kHz 내지 2.0 MHz, 450 kHz 내지 2.0 MHz, 500 kHz 내지 2.0 MHz, 550 kHz 내지 2.0 MHz, 600 kHz 내지 2.0 MHz, 650 kHz 내지 2.0 MHz, 700 kHz 내지 2.0 MHz, 750 kHz 내지 2.0 MHz, 800 kHz 내지 2.0 MHz, 850 kHz 내지 2.0 MHz, 900 kHz 내지 2.0 MHz, 950 kHz 내지 2.0 MHz, 600 kHz 내지 1.5 MHz, 650 kHz 내지 1.5 MHz, 700 kHz 내지 1.5 MHz, 750 kHz 내지 1.5 MHz, 800 kHz 내지 1.5 MHz, 850 kHz 내지 1.5 MHz, 900 kHz 내지 1.5 MHz, 950 kHz 내지 1.5 MHz, 1 MHz 내지 1.5 MHz, 600 kHz 내지 1.3 MHz, 650 kHz 내지 1.3 MHz, 700 kHz 내지 1.3 MHz, 750 kHz 내지 1.3 MHz, 800 kHz 내지 1.3 MHz, 850 kHz 내지 1.3 MHz, 900 kHz 내지 1.3 MHz, 950 kHz 내지 1.3 MHz, 600 kHz 내지 1.1 MHz, 650 kHz 내지 1.1 MHz, 700 kHz 내지 1.1 MHz, 750 kHz 내지 1.1 MHz, 800 kHz 내지 1.1 MHz, 850 kHz 내지 1.1 MHz, 900 kHz 내지 1.1 MHz, 950 kHz 내지 1.1 MHz, 600 kHz 내지 1 MHz, 650 kHz 내지 1 MHz, 700 kHz 내지 1 MHz, 750 kHz 내지 1 MHz, 800 kHz 내지 1 MHz, 850 kHz 내지 1 MHz, 900 kHz 내지 1 MHz, 또는 950 kHz 내지 1 MHz 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혹은, 본 발명에 있어서 초음파의 세기는 0.1 내지 30 W/cm2, 0.1 내지 25 W/cm2, 0.1 내지 20 W/cm2, 0.1 내지 15 W/cm2, 0.1 내지 10 W/cm2, 0.1 내지 8 W/cm2, 0.1 내지 5 W/cm2, 0.1 내지 3 W/cm2, 0.1 내지 2 W/cm2, 0.5 내지 10 W/cm2, 0.5 내지 8 W/cm2, 0.5 내지 5 W/cm2, 0.5 내지 3 W/cm2, 0.5 내지 2 W/cm2, 1 내지 5 W/cm2, 1 내지 3 W/cm2, 또는 1 내지 2 W/cm2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 포피린-리포좀은 안정성 (stability)이 확보된 것일 수 있다. 상기 안정성이라 함은 초음파에 노출되지 않은 상태에서는 혈중 포피린-리포좀 내 봉입된 약물이 방출되지 않는 것을 의미한다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀은 3개월의 보관 기간 후에도 구조를 안정적으로 유지하는 것을 확인하였으며, 초음파를 처리하지 않을 때에는 약물 방출이 거의 이루어지지 않은 바, 높은 구조적 안정성을 갖는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 초음파가 없는 환경에서는 안정적인 구조를 유지하므로 약물이 거의 방출되지 않는다.
본 발명에 따른 포피린-리포좀의 입도는 예를 들면 직경 50 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 50 내지 300 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 130 nm, 50 내지 110 nm, 80 내지 200 nm, 80 내지 150 nm, 80 내지 120 nm, 80 내지 110 nm, 90 내지 120 nm, 또는 90 내지 120 nm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 포피린-리포좀의 입도 분포는 포피린-리포좀을 10배 희석한 후 Dynamic Light Scattering (DLS) 분석법으로 Zetasizer 나노 ZS (Zetasizer Nano ZS, Malvern)를 이용하여 측정할 수 있다. 그러나 포피린-리포좀의 입도 분포 측정 방법은 이에 제한되지 않으며, 당업계 공지된 다른 방법에 따라 측정할 수 있고, 동등한 수준의 값으로 변환될 수 있다.
본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물을 담지할 수 있다. 상기 "담지"는 용어 "봉입" 또는 "적재"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 약물은 포피린-리포좀의 지질 이중층 막에 결합하거나, 상기 이질 이중층 내부에 담지될 수도 있고, 혹은 포피린-리포좀 내부의 수용성 구획에 담지될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약물은 포피린-리포좀의 지질 이중층 내부에 담지된다.
본 발명에 있어서, 상기 포피린-리포좀 : 약물의 혼합 비율은 20 내지 1 : 1, 15 내지 1 : 1, 10 내지 1 : 1, 20 내지 5 : 1, 15 내지 5 : 1, 10 내지 5 : 1, 9 내지 5 : 1, 또는 9 내지 7 : 1의 중량비 (w/w%) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 약물이 포피린-리포좀에 효율적으로 봉입될 수 있는 비율이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에 따른 포피린-리포좀에 약물을 담지하기 위하여 약물을 포피린-리포좀에 처리하였을 때, 첨가된 전체 약물 대비 포피린-리포좀에 담지되는 약물의 비율은 50 내지 100%일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 포피린-리포좀은 약물을 봉입률이 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 65% 내지 100%, 70% 내지 100%, 75% 내지 100%, 76% 내지 100%, 77% 내지 100%, 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 87% 내지 100%, 88% 내지 100%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100% 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 봉입률은 첨가한 약물의 양에 대한 적재율을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 리포좀의 약물 봉입률 측정 방법은 약물을 리포좀에 처리한 후, 봉입되지 않은 약물을 size exclusive chromatography (SEC) 방법을 이용하여 분리하고, 봉입된 약물과 봉입되지 않은 약물의 흡광도를 측정함으로써 계산할 수 있다. 그러나 약물 봉입률 측정 방법은 이에 제한되지 않으며, 당업계 공지된 다른 방법에 따라 측정할 수 있고, 동등한 수준의 값으로 변환될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물이 봉입된 초음파 감응형 포피린-리포좀은 초음파 처리시 10% 내지 100%, 50 % 내지 100%, 60% 내지 100%, 65% 내지 100%, 70% 내지 100%, 또는 75% 내지 100%의 약물 방출률을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물 방출률은 첨가한 약물의 양에 대한 방출률을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 방출률 측정 방법은 포피린-리포좀에 초음파를 처리한 후, 포피린-리포좀으로부터 방출된 약물 및 약물이 방출된 포피린-리포좀을 SEC 방법으로 분리하고, 약물의 흡광도를 측정함으로써 정량할 수 있다. 그러나 약물 방출률 계산 방법은 이에 제한되지 않으며, 당업계 공지된 다른 방법에 따라 측정할 수 있고, 동등한 수준의 값으로 변환될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물이 봉입된 포피린-리포좀은 초음파 미처리 상태에서는 혈중에서 0.1% 내지 100%, 0.1% 내지 80%, 0.1% 내지 60%, 0.1% 내지 40%, 0.1% 내지 30%, 0.1% 내지 20%, 0.1% 내지 10%, 또는 30% 이하의 약물 방출률을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물 (즉, 약물전달체)을 제공한다. 상기 약물 전달의 타겟이되는 세포 또는 조직은 구체적인 종류로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 암세포 또는 종양 조직일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물이 봉입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약물"은 목적한 생물학적 활성을 지닌 임의의 화합물을 지칭한다. 목적한 생물학적 활성은 사람 또는 다른 동물에서 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방에 유용한 활성을 포함한다. 바람직하게는, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암 (cancer)" 또는 "종양 (tumor)"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적 (invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 (metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 당업계에 악성 종양으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 항암제는 종양의 성장을 억제하거나, 암의 전이를 억제하는 등, 항암 효과를 발휘할 수 있는 것이라면 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 5-플루오로우라실(5-FU), 타목시펜, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 젬시타빈, 류프로리드, 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 류코보린, 옥살리플라틴, 발루비신, 레티노익산, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 빈블라스틴, 마이토마이신, 프레드니손, 아피니토, 및 미토산트론으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 약물이 봉입된 포피린-리포좀의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 포피린-리포좀을 포함하는 약물 전달용 키트; 및/또는 항암제가 봉입된 포피린-리포좀을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "키트 (kit)"는 구체적인 형태나 종류에 제한이 없으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있고, 본 발명의 포피린-리포좀 외에 본 발명의 목적을 수행하는데 필요한 임의의 구성 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 포피린-리포좀 외에 보관 용액, 투여 도구, 약물, 투여용 현탁액 등을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 포피린-리포좀에 관한 정보가 기재된 지시서를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (S1) 포피린 및 인지질을 제1 유기용매에 용해시키는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 제조된 혼합 용액을 수용액에 수화시켜 교반하는 단계를 포함하는, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 유기용매는 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 디메틸술폭시드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 제1 유기용매는 에탄올이다.
포피린 및 인지질에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
바람직하게는, 상기 단계 (S1)은 포피린 및 DOPE 외에 기타 지질을 함께 제1 유기용매에 용해시키는 것일 수 있다. 상기 지질은, 바람직하게는 DSPC, DSPE-mPEG2000, 및 콜레스테롤 등으로부터 선택될 수 있다. DOPE를 포함한 상기 지질들의 혼합비율은 상술한 바와 같다. 예컨대, 1 : 1 내지 10 : 0.1 내지 1 : 2 내지 20의 중량비 로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
혹은, 상기 DSPC는 전체 에탄올 용액 대비 1 내지 30 중량%,
상기 DSPE-mPEG2000은 전체 에탄올 용액 대비 5 내지 40 중량%,
상기 콜레스테롤은 전체 에탄올 용액 대비 1 내지 15 중량%, 및
상기 DOPE는 전체 에탄올 용액 대비 20 내지 80 중량%로 용해될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서 상기 에탄올 용액 중의 포피린 : 전체 지질의 중량비는 1 : 20 내지 90, 1 : 20 내지 80, 1 : 20 내지 70, 1 : 20 내지 60, 1 : 20 내지 50, 1 : 30 내지 80, 1 : 40 내지 80, 1 : 30 내지 70, 1 : 30 내지 60, 1 : 40 내지 60, 또는 1 : 40 내지 50 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계의 제1 유기용매는 폴리소르베이트가 첨가된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 수용액은 황산암모늄, 시트르산암모늄, 암모늄 설페이트, 또는 TEA-SOS일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 포피린-리포좀에 담지되는 약물의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 수용액은 암모늄 설페이트이다.
또한, 상기 단계 (S1)는 20 내지 80℃, 30 내지 80℃, 40 내지 80℃, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 65 내지 80℃, 60 내지 75℃, 또는 65 내지 75℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 단계 (S2) 후 상기 유기용매를 증발시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 제조방법은 상기 단계 (S2) 후 수화된 포피린-리포좀을 압출기를 통해 압출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 포피린-리포좀의 압출을 위한 온도는 상온에서 각 물질의 상전이 온도 범위까지 다양하게 조절할 수 있으며, 압출 횟수는 포피린-리포좀의 크기를 균일하게 하기 위하여, 적절한 횟수로 반복 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 포피린-리포좀 제제는 주사제, 경피, 경비, 및 폐로의 약물송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)를 참조할 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 제1 유기용매에 용해된 인지질의 농도는 10 내지 200 mg/mL, 10 내지 150 mg/mL, 10 내지 100 mg/mL, 10 내지 80 mg/mL, 10 내지 60 mg/mL, 10 내지 50 mg/mL, 10 내지 40 mg/mL, 15 내지 40 mg/mL, 20 내지 40 mg/mL, 25 내지 40 mg/mL, 30 내지 40 mg/mL, 또는 30 내지 35 mg/mL 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 (S2)는 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 65℃, 30 내지 80℃, 40 내지 80℃, 50 내지 80℃, 40 내지 70℃, 또는 50 내지 70℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 제조방법은 상기 단계 (S2) 이후에 포피린-리포좀 용액에 약물을 첨가하여 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 포피린-리포좀 : 약물의 혼합 비율은 20 내지 1 : 1, 15 내지 1 : 1, 10 내지 1 : 1, 20 내지 5 : 1, 15 내지 5 : 1, 10 내지 5 : 1, 9 내지 5 : 1, 또는 9 내지 7 : 1의 중량비 (w/w%)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 혼합은 30분 내지 5시간, 30분 내지 4시간, 30분 내지 3시간, 1시간 내지 5시간, 1시간 내지 4시간, 또는 1시간 내지 3시간 동안 이루어질 수 있고; 100 내지 1,000 rpm, 100 내지 800 rpm, 100 내지 500 rpm, 100 내지 400 rpm, 100 내지 350 rpm, 또는 100 내지 300 rpm에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 혼합은 20 내지 50℃, 20 내지 45℃, 20 내지 40℃, 30 내지 50℃, 35 내지 45℃, 또는 35 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 명세서에서 사용된 약어의 의미는 하기 표 1에 기재된 것과 같다.
약어 의미
DOX 독소루비신 (Doxorubicin)
DOX-리포좀; 또는 DLL 독소루비신이 담지된 리포좀
DOX-포피린-리포좀; 또는 DLPL 독소루비신 및 포피린이 담지된 리포좀
US 초음파 조사군
실시예 1. 초음파 감응형 포피린-리포좀의 제조 및 약물의 봉입
먼저, DSPC 32.1mg, DSPE-mPEG2000 57.0mg, 콜레스테롤 23.5mg, DOPE 206.6mg 및 포피린 3.99 mg을 전체 256mg/ml의 농도로 에탄올에 70℃에서 용해시켰다. 완전히 투명한 용액으로 용해된 지질 용액을 250mM의 암모늄 설페이트 수용액에 혼합하였으며, 이 때의 지질 농도는 32mg/mL, 온도는 60℃를 유지하였다. 혼합액의 stirring을 1시간동안 수행하여 인지질막을 수화시키고, 혼합된 지질 용액은 고온 압출기 (LIPEX, Evonic)를 사용하여 균질화를 진행하였다. 고온압출기 내부에 폴리카보네이트 필터를 0.8 μm-pore부터 0.4 μm-pore size, 및 0.2 μm-pore size로 단계별 감소를 진행하며 제조하였다. 제조된 포피린-리포좀의 크기가 100~200nm가 될 때까지 반복적으로 진행하였다.
포피린-리포좀의 입도 분포는 포피린-리포좀을 10배 희석하여 Dynamic Light Scattering (DLS) 분석법으로 Zetasizer 나노 ZS (Zetasizer Nano ZS, Malvern)를 이용하여 측정하였다. 압출에 의해 입도분포가 조절된 포피린-리포좀 용액을 분자량 (MWCO) 15,000 Dalton인 투석막에 투입하고 10%-수크로즈, 10mM L-히스티딘 용액에서 12시간 동안 투석하였다.
리포좀에 독소루비신을 봉입하기 위하여, 투석된 포피린-리포좀 용액에 독소루비신을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 200-300rpm으로 교반하였다. 포피린-리포좀과 독소루비신은 8:1의 중량비로 혼합하였다. 2시간 교반 후, 봉입되지 않은 독소루비신은 size exclusive chromatography (SEC)방법을 이용하여 분리하였다. 봉입된 독소루비신과 봉입되지 않은 독소루비신은 480nm 파장의 흡광도 측정으로 정량하였다.
실시예 2. 초음파 감응형 포피린-리포좀의 특성 확인
본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀의 특성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에 따라 제조된 초음파 감응형 포피린-리포좀 및 일반 리포좀 (포피린을 포함하지 않은 DOPE 리포좀)을 준비하여 비교하였다. 일반 리포좀은 포피린을 포함하지 않는 것 외에 기타 특성은 본 발명의 포피린-리포좀과 동일하다. 먼저, 입도분석기 (Dynamic light scattering, DLS)로 각 리포좀의 크기 분포를 확인한 결과, 본 발명의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 직경은 102±14 nm로, 일반 리포좀의 직경은 103±11 nm로 측정된 바, 둘의 크기 분포에 큰 차이가 없는 것으로 확인됐다. 이어서, 각 리포좀 입자의 모양을 확인하기 위해 TEM (Transmission Electron Microscope)으로 촬영하여 비교한 결과, 모양이나 크기에 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 1). 또한, 리포좀 입자의 안정성을 확인하기 위해, 최대 3개월까지 포피린-리포좀을 보관한 후 다시 크기를 측정하였을 때에도 크기에 유의미한 변화가 없어, 3개월 후에도 포피린-리포좀 입자가 안정적인 구조를 유지하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 초음파 감응형 포피린-리포좀의 초음파 조사 여부에 따른 약물 방출 효과 확인
이어서, 본 발명에 따른 포피린-리포좀의 초음파 조사에 따른 약물 방출 효과를 확인하기 위해, 독소루비신이 봉입된 초음파 감응형 포피린-리포좀 및 일반 리포좀 각각의 초음파 감도를 비교하였다. 구체적으로, 본 분석은 독소루비신 기준으로 0.1mg/mL의 독소루비신이 적재된 것을 사용하여 수행하였으며, 각 리포좀의 독소루비신 적재율 및 초음파 조사에 따른 약물 방출률을 확인하였다. 초음파 조사에 따른 약물 방출률의 경우, 독소루비신이 각각 봉입된 포피린-리포좀 또는 일반 리포좀을 24 웰 플레이트 (24 well plate)에 로딩한 후 상기 플레이트를 초음파장치 (SP100, SONIDEL)로 플레이트 하부에서 1.5 W/cm2, 50% 및 10분간 조사하였다. 이어서, 리포좀으로부터 방출된 독소루비신과 독소루비신이 방출된 리포좀을 size exclusive chromatography (SEC) 방법을 이용하여 분리하였다. 독소루비신의 정량분석은 480nm의 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 결과는 도 2 및 표 2에 나타냈다.
Material Loading efficiency (%) Release ratio (%)
DLL 97.1% 4.4%
DLPL 95.8% 86.4%
상기 표에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명의 초음파-리포좀의 약물 봉입률 (95.8%)은 일반 리포좀의 약물 봉입률 (97.1%)에 상응하는 수준인 것으로 나타났다. 일반 리포좀의 경우 초음파를 조사하더라도 리포좀으로부터 방출된 독소루비신의 비율은 5% 미만에 불과하였으나, 본 발명에 따른 포피린-리포좀의 경우 초음파를 조사하였을 때 약물 방출률이 95% 이상으로 나타난 바, 대부분의 포피린-리포좀이 초음파에 반응하여 약물을 방출하였음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 본 발명에 따른 포피린-리포좀에 초음파를 인가하면, 포피린으로부터 생성된 ROS가 포피린-리포좀의 구성 물질인 DOPE의 이중 결합에 지질과산화를 일으켜 지질 파괴를 일으킴에 따라, 포피린-리포좀이 붕괴되어 약물이 방출될 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 초음파 감응형 포피린-리포좀의 암세포 사멸효과 확인 ( in vitro )
다음으로, 항암제가 담지된 포피린-리포좀의 초음파 조사 유무에 따른 암세포 사멸효과를 확인하기 위해, 암세포주인 4T1 세포를 이용하여 MTT 분석을 수행하였다. 독소루비신이 봉입된 포피린-리포좀, 독소루비신이 봉입된 일반 리포좀 (포피린을 함유하지 않음), 및 자유 독소루비신 (free DOX)의 항암 효과를 비교하였으며, 각 그룹을 초음파 조사군과 초음파 미처리 군으로 나누었다. 4T1 세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰에 적절히 분주한 후, 밤새 배양하였으며, 배양을 마친 세포에 자유 독소루비신, 초음파를 조사한 리포좀 (+US), 또는 초음파를 조사하지 않은 리포좀 (-US)을 지정된 웰에 각각 처리하였다. 각 리포좀 혹은 자유 독소루비신은 2 내지 10 μg/mL의 농도로 처리하였다. 이후, 첨가된 약물은 모두 제거한 후 세포를 세척하고, MTT가 첨가된 세포 배양액으로 추가 배양하면서 암세포의 증식 정도를 비교하였다.
결과는 도 3에 나타냈다. 먼저 자유 독소루비신 처리군의 경우 초음파 유무에 관계 없이 암세포 생존율이 감소하였다. 초음파에 노출되지 않은 리포좀 (포피린-리포좀 및 일반 리포좀) 처리군은 세포 활성 (cell viability)에 특별한 감소가 없었으며, 두 그룹 간에도 유의미한 차이가 없는 것으로 나타난 바, 초음파를 처리하지 않으면 리포좀의 구조가 안정적으로 유지되어 약물이 방출되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면 초음파가 전처리된 리포좀을 비교하였을 때, 일반 리포좀은 여전히 세포 활성에 큰 변화가 없었으나, 포피린-리포좀의 세포 사멸 효과가 현저히 증가하여 자유 독소루비신에 상응하는 수준임을 확인하였다. 예컨대, 동일한 리포좀 처리 농도 (6 μg/mL)에서 세포 활성을 비교한 결과, 초음파가 전처리된 포피린-리포좀은 암세포 생존율을 50% 이상 억제한 반면, 일반 리포좀은 초음파 처리에도 불구하고 세포 생존율에 별다른 변화가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀이 암세포에 대해 우수한 항암 효과를 가지며, 이는 초음파 조사를 통해 적절히 조절할 수 있음을 입증한다.
실시예 5. 초음파 감응형 포피린-리포좀의 암세포 사멸효과 확인 ( in vivo )
다음으로, 항암제가 담지된 포피린-리포좀의 초음파 조사 유무에 따른 항암 효과를 검증하기 위해, 암 동물모델을 제작하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6 내지 8주령의 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 허벅지에 1Х106개 4T1-WT 세포를 주입하였으며, 종양 부피가 약 50 mm3에 도달했을 때 물질을 투여하고 항암 효과를 확인하였다. 실험군은 다음과 같이 나누었다: (i) 식염수를 투여한 음성 대조군, (ii) 초음파를 처리하지 않은 자유 독소루비신 (Free DOX), (iii) 초음파를 처리하지 않은 DOX-리포좀 (LIP-DOX), (iv) 초음파를 처리하지 않은 DOX-포피린-리포좀 (PPR-LIP-DOX), (v) 초음파 단독 처리, (vi) 초음파가 전처리된 자유 독소루비신 (Free DOX+US), (vii) 초음파가 전처리된 DOX-리포좀 (LIP-DOX+US), 및 (viii) 초음파가 전처리된 DOX-포피린-리포좀 (PPR-LIP-DOX+US). 각 물질을 독소루비신을 기준으로 2 mg/kg (부피 200 μL)의 용량으로 단일 정맥 주사하였고, 주사 후 2주 동안 마우스를 모니터링하면서 주사 후 3, 6, 9, 12 및 15일차에 체중 및 상태를 기록했다.
그 결과, 마우스의 체중에는 그룹 간에 유의미한 변화가 없었으나 (도 4a), 종양 성장 정도는 초음파가 전처리된, 독소루비신이 봉입된 포피린-리포좀 처리군에서 가장 낮아, 항암 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다 (도 4b). 특히, 초음파가 전처리된 포피린-리포좀 처리군의 종양 크기는 자유 독소루비신 처리군에 비해 확연히 낮은 바, 본 발명의 포피린-리포좀을 통해 종래 독소루비신보다 더욱 우수한 항암 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물을 봉입하더라도 구조적 안정성을 유지할 수 있어 비특이적인 약물 방출의 위험을 최소화할 수 있으며, 초음파에 대한 감응성이 뛰어나 초음파 처리에 따라 약물 방출을 적절히 조절할 수 있음을 확인하였다 (도 5). 특히, 초음파 처리시 항암제가 담지된 포피린-리포좀은 자유 항암제에 비해 더욱 우수한 항암 효과를 발휘한 바, 약물 전달 효율이 뛰어난 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 초음파 감응성 포피린-리포좀은 봉입된 약물의 전달 효율 및 약리학적 효과를 더욱 증진시킬 수 있는 바, 다양한 질환의 치료 및 약물 전달 분야에서 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명은 초음파에 반응하여 약물을 방출할 수 있는 초음파 감응형 포피린-리포좀에 관한 것이다. 본 발명의 초음파 감응형 포피린-리포좀은 포피린을 포함하는 것을 특징으로 하는 바, 초음파에 노출된 포피린은 물과 반응하여 활성산소종 (Reactive Oxygen Species)을 생성하고, 포피린-리포좀의 지질이중층을 구성하는 인지질은 포피린이 생성한 활성산소종에 반응하여 지질과산화를 일으켜, 결과적으로는 지질이중충의 구조가 붕괴되면서 봉입된 약물이 방출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 초음파 감응형 포피린-리포좀은 초음파를 이용하여 약물 방출을 적절히 조절할 수 있으며, 또한 약물을 봉입하더라도 우수한 구조적 안정성을 유지하므로 비특이적인 약물 전달을 최소화할 수 있다. 특히, 상기 포피린-리포좀에 항암제를 봉입하여 초음파 조사에 따른 항암 효과를 확인한 결과, 종래 리포좀 또는 자유 항암제에 비해 더욱 우수한 항암 효과를 발휘하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 포피린-리포좀은 약물의 전달효율 및 약물의 약리학적 효과를 증진시킬 수 있는 바, 다양한 약물을 담지하여 여러 질환에서 우수한 약물 전달체로 활용될 수 있다.

Claims (27)

  1. 포피린 (Porphyrin) 및 인지질을 포함하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀으로서, 상기 인지질은 소수성 꼬리에 탄소=탄소 (C=C) 이중결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포피린은 초음파 (Ultrasound)에 노출되었을 때 활성산소종을 생성하는 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 초음파에 노출되었을 때 이의 지질 이중층이 분해되는 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인지질은 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 포피린 : 인지질의 중량비는 1 : 20 내지 90인 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 포피린은 전체 초음파 감응형 포피린-리포좀 대비 1 내지 10 건조중량%로 포함되고,
    상기 인지질은 전체 초음파 감응형 포피린-리포좀 대비 90 내지 99 건조중량%로 포함된 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것인, 초음파 감응형 포피린-리포좀:
    (a) 100 내지 200 nm의 입도를 가짐; 및
    (b) 첨가되는 전체 약물 대비 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀에 담지되는 약물의 비율은 50 내지 100%임.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀 : 약물의 중량비는 20 내지 1 : 1인 것을 특징으로 하는, 초음파 감응형 포피린-리포좀.
  11. 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
  14. 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 초음파 감응형 포피린-리포좀은 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 5-플루오로우라실(5-FU), 타목시펜, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 젬시타빈, 류프로리드, 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 류코보린, 옥살리플라틴, 발루비신, 레티노익산, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 빈블라스틴, 마이토마이신, 프레드니손, 아피니토, 및 미토산트론으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 초음파 처리와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. (S1) 포피린 및 인지질을 제1 유기용매에 용해시키는 단계; 및
    (S2) 상기 단계 (S1)에서 제조된 혼합 용액을 수용액에 수화시켜 교반하는 단계를 포함하는, 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 제조방법으로서,
    상기 인지질은 소수성 꼬리에 탄소=탄소 (C=C) 이중결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제1 유기용매는 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 디메틸술폭시드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 인지질은 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SOPC (1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (S1)은 상기 포피린 및 인지질 외에 DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine), DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine with conjugated methoxyl poly(ethylene glycol2000)), 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 제1 유기용매에 용해시키는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  22. 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 약물 전달 용도.
  23. 약물전달체의 제조를 위한, 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 용도.
  24. 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 약물 전달 방법.
  25. 항암제가 봉입된 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법.
  26. 암의 예방 또는 치료를 위한, 항암제가 봉입된 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 용도.
  27. 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 항암제가 봉입된 제1항의 초음파 감응형 포피린-리포좀의 용도.
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