WO2024010373A1 - IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024010373A1
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이경림
배해득
조민영
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이화여자대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to antibodies that bind IgE-dependent histamine releasing factor and uses thereof.
  • HRF Histamine-releasing factor
  • TCTP Translationally Controlled Tumor Protein
  • HRF is known to cause late-stage allergic reactions by activating basophils and inducing the release of histamine.
  • basophils In addition to basophils, late-stage allergic reactions are known to occur. It is recognized as an important factor in late-stage allergic reactions because it activates inflammatory cells involved in the reaction and releases various cytokines (MacDonald et al ., Science, 269, 688-690, 1995).
  • HRF causes histamine to be secreted from basophils in the presence of specific IgE, but later on, regardless of the presence of IgE and its receptor Fc ⁇ R, HRF regulates the secretion of histamine, IL-4, and IL-13 from inflammatory cells.
  • Bheekha-Escura et al. suggested the possibility that HRF acts by binding to a specific cell membrane receptor rather than IgE.
  • HRF which can form dimers, secretes histamine and IL-8 from cells, and have proven for the first time that the dimer form of HRF is an allergy-causing substance (Korean Patent No. 100780255) , European Patent No. 1683866, Japanese Patent No. 4564926, US Patent No.
  • HRF is a hydrophilic protein
  • the HRF present in the cell is (Na, K )
  • ATPase alpha subunits it was first identified that it binds to the large cytoplasmic loop CD3 (cytoplasmic domain 3), and it was demonstrated that hypertension was induced in transgenic mice overexpressing intracellular HRF (Korea registered patent no. 10-0457350, European Patent No. 1167526, Japanese Patent No. 4295449, US Patent No. 6710165).
  • a peptide having a transmembrane protein domain function was discovered in HRF (Korean Patent No. 10-0859972).
  • dTBP2 an inhibitor of dimeric HRF, was found to attenuate the systemic anaphylactic response by directly inhibiting the degranulation of mast cells (FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, 2021, v.12, 764321), and that HRF causes type 2 diabetes. It was found that it can be a therapeutic target for obesity and obesity-related metabolic disorders, including (International Journal of Obesity, 2021, v.45 no.7, 1576-1587), and dimeric HRF prevents airway inflammation through activation of airway epithelial cells. It was found that it worsens (Biomedicine and Pharmacotherapy, 2021, v.144, 112316).
  • the present inventors tried to develop antibodies that specifically bind to HRF, which is associated with various diseases, as described above, and in particular, developed antibodies that bind to monomeric and/or dimeric HRF.
  • the anti-HRF antibody according to the present invention was confirmed to inhibit the cytokine-like activity of HRF by specifically binding to HRF with high binding affinity, and is effective in treating allergic diseases, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer, hypertension,
  • the present invention was completed after discovering that it can be usefully used to prevent and develop treatments for HRF-related diseases such as malaria and osteoporosis.
  • One object of the present invention is to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector containing the above polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant into which the expression vector is introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for HRF-related diseases containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting HRF comprising a composition containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing HRF-related diseases using the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF comprising a CDR sequence of a variable light domain or variable heavy chain domain selected from the group consisting of.
  • the invention provides a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an expression vector containing the above polynucleotide.
  • the present invention provides a transformant into which the expression vector is introduced.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating HRF-related diseases, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a kit for diagnosing HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a kit for detecting HRF comprising a composition containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a method for diagnosing HRF-related diseases using the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention relates to an antibody that binds to IgE-dependent histamine releasing factor and its use.
  • the anti-HRF antibody according to the present invention inhibits the cytokine-like activity of HRF by specifically binding to HRF with high binding affinity. As confirmed, it can be usefully used in the prevention and development of treatments for allergic diseases, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, or HRF-related diseases such as cancer, high blood pressure, malaria, and osteoporosis.
  • Figure 1a is a schematic diagram of an expression vector constructed to produce a recombinant HRF protein, that is, an antigen protein, used in the production of the anti-HRF monoclonal antibody of the present invention.
  • Figure 1b is a diagram showing the structure of HRF monomer.
  • Figure 1c is a diagram showing the structure of HRF dimer.
  • Figure 1d is a diagram confirming the expression and purification of HRF monomer by SDS-PAGE.
  • Figure 1e is a diagram confirming the expression and purification of HRF dimer by SDS-PAGE.
  • Figure 2a is a diagram showing the panning experiment method used in the antibody screening process of the present invention.
  • Figure 2b shows 38 clones that tested positive for HRF dimer by performing phage ELISA on 288 clones panned from the scFv phage library.
  • Figure 2c shows 33 clones that tested positive for HRF monomers by performing phage ELISA on 288 clones after panning.
  • Figure 2d is a diagram showing the amino acid sequence of the anti-HRF/TCTP dimeric scFv antibody.
  • Figure 2e is a diagram showing the amino acid sequence of an anti-HRF/TCTP monomeric scFv antibody.
  • Figure 3a is a diagram showing the results of SDS-PAGE under non-reducing conditions after producing an anti-HRF scFv-Fc antibody.
  • Figure 3b is a diagram showing the results of SDS-PAGE under reducing conditions after producing an anti-HRF scFv-Fc antibody.
  • Figure 4a is a comparative analysis of the binding affinity of eight types of anti-HRF scFv-Fc antibodies and antibodies that bind to human HRF dimers.
  • Figure 4b is a comparative analysis of the binding affinity of an anti-HRF scFv-Fc antibody and an antibody that binds to a mouse/rat HRF dimer.
  • Figure 5 is a diagram confirming the ability of anti-HRF scFv-Fc antibody to inhibit IL-8 secretion in bronchial epithelial cells.
  • Figure 6 is a diagram showing the method of producing an asthma mouse model and the timing of anti-HRF scFv-Fc antibody administration.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of measuring the total number of white blood cells in bronchial lavage fluid of asthmatic mice.
  • Figure 8 is a diagram showing the results of measuring the production amounts of IL-4, IL-5, and IL-13 in bronchial lavage fluid of asthmatic mice.
  • Figure 9 is a diagram showing the results of measuring the amount of ovalbumin-specific IgE production in the plasma of asthmatic mice.
  • Figure 10 is a diagram showing the results of analyzing lung tissue of asthmatic mice.
  • the present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to monomeric and/or dimeric HRF.
  • the HRF is an IgE-dependent histamine-releasing factor with histamine-releasing activity, and is a known protein composed of 172 amino acids that exists in all cytoplasm, known as translationally controlled tumor protein (TCTP).
  • TCTP translationally controlled tumor protein
  • the HRF stimulates IgE-sensitized basophils and promotes the release of histamine and interleukin-4 (IL-4), thereby causing late-reaction allergic diseases such as allergic rhinitis, asthma, and atopic dermatitis. It has been reported.
  • the HRF is an active dimer type, and in the structure of the HRF, the flexible loop (FL) domain or the helix 2 (helix 2: H2) domain is a site that binds to the receptor for HRF, and the HRF It is preferable that the specifically binding antibody binds to any one selected from the group consisting of full length and N-terminus deleted.
  • dimeric HRF has 10 N-terminal amino acids deleted.
  • monomeric or dimeric HRF may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 or SEQ ID NO: 83, respectively.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF of the present invention may be selected from the group consisting of (1) to (8) below.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF of the present invention may be selected from the group consisting of (9) to (16) below.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 5.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 31 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 35.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 41 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 45.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 51 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 55.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 61 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 65.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 71 and a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 75.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF of the present invention may be selected from the group consisting of (17) to (24) below.
  • an antibody refers to a polypeptide that specifically binds to and recognizes an antigen such as monomeric and/or dimeric HRF protein.
  • the present invention includes intact antibody forms that bind monomeric and/or dimeric HRF proteins, as well as antigen-binding fragments of such antibody molecules.
  • antibodies may include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • Antibodies are composed of two heavy chains and two light chains, with a variable region whose amino acid sequence varies depending on the type of target antigen and a constant region whose sequence does not change.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be a full-length antibody or an antibody fragment.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention may be a human antibody, humanized antibody, or chimeric antibody.
  • human antibody or “humanized antibody” refers to an antibody produced by a human or a human cell, or an antibody that utilizes human antibody repertoires or other human antibody coding sequences. It possesses an amino acid sequence that corresponds to the amino acid sequence of an antibody derived from a non-human source.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which a portion of the heavy and/or light chain is derived from a particular source or species and the remainder of the heavy and/or light chain is derived from a different source or species. It means antibody.
  • the antigen-binding fragment may be scFv (single-chain variable fragment), Fab, Fab', F(ab') 2 , Fd, and Fv.
  • the antigen-binding fragment is an antigen-binding fragment in the form of scFv-Fc (Fragment, crystallizable).
  • the scFv refers to a protein in which the variable domains of the light and heavy chains of an antibody are connected by a linker consisting of a peptide chain of about 15 amino acids.
  • the sequence of light chain variable domain (VL)-linker-heavy chain variable domain (VH) or heavy chain variable domain (VH)-linker-light chain variable domain (VL) is possible, and has the same or similar antigen specificity as the original antibody.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region may be linked with or without a linker, such as a peptide linker.
  • the peptide linker may be a polypeptide consisting of 1 to 100 or 2 to 50 amino acids, and the type of amino acids included is not limited.
  • the peptide linker may include, for example, Gly, Asn, and/or Ser residues, and may also include neutral amino acids such as Thr and/or Ala. Amino acid sequences suitable for peptide linkers are known in the art.
  • the length of the linker can be determined in various ways as long as it does not affect the function of the bispecific antibody.
  • the peptide linker may include a total of 1 to 100, 2 to 50, or 5 to 25 of one or more types selected from the group consisting of Gly, Asn, Ser, Thr, and Ala.
  • the peptide linker is GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 81), an 18-mer linker.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include variants of the amino acid sequence described in the attached sequence list to the extent that it can specifically recognize HRF protein.
  • changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala /Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • the invention provides a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is interpreted to also include a polynucleotide base sequence showing substantial identity to the above-mentioned polynucleotide base sequence.
  • the above substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequences are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequences are analyzed using an algorithm commonly used in the art. refers to a base sequence showing homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc., and can be accessed on the Internet using blastp, blastn, It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn, and tblastx.
  • BLAST can be accessed through the BLAST page on the ncbi website. The sequence homology comparison method using this program can be found on the BLAST help page of the ncbi website.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to monomeric and/or dimeric HRF of the present invention may be selected from the group consisting of (25) to (32) below.
  • the present invention provides an expression vector containing the above polynucleotide.
  • the vector may be capable of replicating and/or expressing the polynucleotide in a cell.
  • the cells may be eukaryotic cells or prokaryotic cells.
  • the eukaryotic cell may be a mammalian cell, a plant cell, a yeast cell, or an insect cell.
  • the mammal may be a human, monkey, rabbit, rat, hamster or mouse.
  • the prokaryotic cell may be a bacterial cell.
  • the bacteria may be Escherichia coli.
  • the vector may be an expression vector.
  • the expression vector may be one in which the polynucleotide is operably linked to an appropriate regulatory region so that the polynucleotide can be expressed in a host cell.
  • the regulatory region may be a promoter, enhancer, or terminator.
  • the vector may also contain a selection marker.
  • the vector may be a phage, plasmid, cosmid, mini-chromosome, virus or retroviral vector.
  • the vector may contain polynucleotides each encoding a heavy chain variable region or a light chain variable region of the antibody, or may contain both polynucleotides encoding a heavy chain variable region or a light chain variable region.
  • the recombinant vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art.
  • Antibodies specific to the HRF surface antigen are preferably selected by applying phage-display technology (Smith, Science, 228, 1315-1317, 1985; and Hoogenboom & Chames, Immunol Today, 21, 371-378, 2000). You can.
  • phage-display technology as follows, a gene expressing the target antibody is fused to a gene (gene III) expressing the epidermal protein of filamentous phage (M13, Fd, and F1), and the fused antibody is Virus particles in the form of antibody-phage exposed on the surface of bacteriophage particles are generated, and biopanning technology is applied using the high specificity and affinity of the exposed antibody and the high infectivity of the phage to extract the virus from the phage library.
  • a desired antibody can be selected (Burton & Barbas, Adv. Immunol., 57, 191-280, 1994; Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12, 433-455, 1994; and Hoogenboom et al. , Immunotechnology, 4, 1-20, 1998; Kim et al., Hybrid Hybridomics, 21, 385-392, 2002).
  • the present invention provides a transformant into which the expression vector is introduced.
  • the transformant into which the expression vector provided by the present invention is introduced is not particularly limited, but includes bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, and Salmonella Typhimurium transformed by introducing the expression vector; yeast cells; Fungal cells such as Pichia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO (chinese hamster ovary cells), SP2/0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, Bow melanoma cells, HT-1080, BHK ( animal cells such as baby hamster kidney cells), HEK (human embryonic kidney cells), and PERC.6 (human retina cells); Or it could be a plant cell.
  • bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, and Salmonella Typhimurium transformed by introducing the expression vector
  • yeast cells Fungal cells such as Pichia pastoris
  • introduction refers to a method of delivering a vector containing a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof to a host cell.
  • introduction includes calcium phosphate-DNA coprecipitation method, DEAE-dextran-mediated transfection method, polybrene-mediated transfection method, electric shock method, fine injection method, liposome fusion method, lipofectamine, and protoplast fusion method. It can be performed by several methods known in the art.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating HRF-related diseases, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the HRF-related disease may be selected from the group consisting of inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer, hypertension, malaria, and osteoporosis.
  • the inflammatory or autoimmune diseases include asthma, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, bronchiectasis, rhinitis, atopic dermatitis, urticaria, hay fever, conjunctivitis, allergic diseases such as anaphylaxis, bronchitis, pneumonia, and arthritis.
  • the above cancers include oral cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin cancer, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, fallopian tube carcinoma, anal cancer, and endometrial carcinoma.
  • vaginal carcinoma vulvar carcinoma
  • Hodgkin's disease esophageal cancer
  • lymph node cancer bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic leukemia, Acute leukemia, lymphocytic lymphoma, renal cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, or pituitary adenoma.
  • IL-8 is used in chronic inflammatory bronchial diseases such as chronic bronchitis (Richman-Eisenstat et al., Am J Physiol, 264, L413-418, 1993) and inflammatory lung diseases such as pneumonia (Erger and Casale, Eur Respir J, 11, 299- 305, 1998; Pease & Sabroe, Am J Respir Med, 1, 19-25, 2002), arthritis or nephritis (Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994), psoriasis (Schulz et al.
  • chronic bronchial diseases such as chronic bronchitis (Richman-Eisenstat et al., Am J Physiol, 264, L413-418, 1993) and inflammatory lung diseases such as pneumonia (Erger and Casale, Eur Respir J, 11, 299- 305, 1998; Pease & Sabroe, Am J Respir Med, 1, 19-25, 2002),
  • cardiovascular diseases such as arteriosclerosis and coronary artery disease (Apostolakis et al., Cardiovasc Res, 84, 353-360, 2009; Boekholdt et al. ., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24, 1503-1508, 2004), chronic liver disease (Zimmermann et al., PLoS ONE, 6, e21381, 2011), Behcet's disease (Behcet's disease, Katsantonis et al., Dermatology, 201, 37-39, 2000), bladder cancer, prostatitis, pyelonephritis or osteomyelitis (Shahzad et al., Int arch med, 3, 11, 2010), thyroid disease (Kobawala et al., J Thyroid Res, 8, 270149, 2011 ), uveitis (Klok et al., Br J Ophthalmol, 82, 871-874, 1998), glomerulone
  • IL-8 has been suggested as a treatment strategy in inflammatory diseases such as lung disease, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, chronic inflammatory skin diseases such as palmoplantar pustulosis, and ocular inflammation (Mukaida, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L566-L577, 2003; Skov et al., J Imm unol, 181, 669-679, 2008; Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994) .
  • inflammatory diseases such as lung disease, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, chronic inflammatory skin diseases such as palmoplantar pustulosis, and ocular inflammation
  • inflammatory diseases such as lung disease, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, chronic inflammatory skin diseases such as palmoplantar pustulosis
  • IL-8 blocking antibodies or treatments that inhibit the gene encoding the IL-8 receptor are effective in treating inflammation (Harada et al., Mol Med Today, 2, 482-489, 1996), for example.
  • inflammation was reduced by administering antibodies against IL-8 (Skov et al., J Immunol, 181, 669-679, 2008).
  • GM-CSF the secretion of which is increased by HRF, is also related to various inflammatory diseases (Hamilton, Trends Immunol, 23, 403-408, 2002), and GM-CSF is also suggested as a target for inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. (Cornish et al., Nat Rev Rheumatol, 5, 554-559, 2009).
  • the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases.
  • IL-8 increased by HRF is associated with asthma or bronchitis (Chanez et al., Int Arch Allergy Immunol, 111, 83-88, 1996) and chronic obstructive pulmonary disease (Nocker et al., Int Arch Allergy Immunol, 109). , 183-191, 1996), bronchiectasis (bronchiectasis, Simpson et al., Thorax, 62, 211-218, 2007), rhinitis (Benson et al., Pediatr Allergy Immunol, 10, 178-185, 1999; Kuna et al.
  • the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating allergic diseases.
  • HRF was known as a tumor-specific protein until the 1980s, and its synthesis was thought to be related to the proliferative stage of the tumor.
  • the 21kDa tumor protein p21 was identified (Chitpatima et al, 1988), and in Ehrlich ascites tumor, protein p23, which is related to cell growth, was found to be identical to HRF (Bohm et al, 1989). Therefore, the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer.
  • HRF is known to cause hypertension by inhibiting the sodium/potassium APTase pump action, affecting the responsiveness and contractility of vascular smooth muscle and heart muscle, and neurotransmitter secretion in the brain (Korean Patent Publication 10-2004) -0111051). Therefore, the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating high blood pressure.
  • artemisinin an antimalarial drug, acts by binding to HRF, a malaria protein (Bhisutthibhan et al., J Biol Chem, 273, 16192-16198, 1998).
  • HRF a malaria protein
  • IL-8 is also secreted in malaria patients (Friedland et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 87, 54-55, 1993), and it has been reported that malaria HRF promotes IL-8 secretion (MacDonald et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10829-32, 2001). Therefore, the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for prevention and treatment.
  • the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating osteoporosis.
  • the HRF antibody of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating respiratory diseases caused by viruses.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers and diluents.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated for human or veterinary use and administered through various routes.
  • the route of administration may be oral, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intradermal.
  • it is formulated and administered as an injection.
  • Injections include aqueous solvents such as physiological saline solution and Ringer's solution, non-aqueous solvents such as vegetable oil, higher fatty acid esters (e.g., ethyl oleate, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • the pharmaceutical composition can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to produce a preventive or therapeutic effect and an amount that does not cause side effects or a serious or excessive immune response.
  • the exact administration concentration is determined by the patient's age, weight, health, and other factors. It can be easily determined by a person skilled in the art depending on factors well known in the medical field, such as gender, patient's sensitivity to the drug, administration route, and administration method, and administration is possible from one time to several times. In general, 0.1 mg to 100 mg per kg of body weight, preferably 0.5 mg to 10 mg, can be administered at 2- or 4-week intervals. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of disease, gender, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a composition for diagnosing HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof and HRF-related diseases are as described above.
  • the present invention provides a kit for diagnosing HRF-related diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • kit for diagnosing HRF-related diseases may further include a composition, solution, or device containing one or more other components suitable for the analysis method.
  • the present invention provides a kit for detecting HRF comprising a composition containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • kit may further include a composition, solution, or device containing one or more other components suitable for the analysis method.
  • the present invention provides information for HRF-related diseases, including the step of detecting HRF protein in an isolated biological sample of an individual suspected of having an HRF-related disease using the antibody or antigen-binding fragment thereof through antigen-antibody reaction. Provides a method.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, body fluids (e.g., blood, serum, lymph, etc.) obtained from a patient to be diagnosed, and may be separated from a living body.
  • the subject may be selected from mammals, including primates including humans and monkeys, and rodents including mice and rats.
  • the antigen-antibody reaction can be performed through various methods known in the art. For example, it can be measured through conventional enzyme reactions, fluorescence, luminescence, and/or radiation detection, specifically, immunochromatography, immunohistochemistry, and enzyme linked immunosorbent analysis.
  • immunosorbent assay ELISA
  • radioimmunoassay RIA
  • enzyme immunoassay EIA
  • fluorescence immunoassay FIA
  • luminescence immunoassay LIA
  • Western blotting It may be measured by a method selected from the group consisting of blotting, microarray, surface plasmon resonance (SPR), etc., but is not limited thereto.
  • HRF protein as a monomer and/or dimer was synthesized, separated, and purified (see FIGS. 1A to 1E).
  • scFv phage library which is a human antibody
  • phages that specifically bind to the monomer and/or dimer of HRF were obtained (see Figure 2a), and 38 clones with high binding affinity to the HRF dimer and HRF monomer were obtained. Thirty-three clones with high binding affinity were selected (see Figures 2b and 2c).
  • the amino acid sequence of the scFv antibody of the clone selected above was confirmed (see FIGS.
  • BEAS-2B cells a human bronchial epithelial cell line
  • HRF dimer to induce activation of BEAS-2B cells
  • IL-8 an inflammatory mediator
  • the anti-HRF antibody of the present invention has an effect of suppressing inflammation, and can be usefully used as a treatment for HRF-related diseases.
  • an expression vector was constructed such that 10 N-terminal amino acids were deleted to produce HRF dimers.
  • the pRSET A (Invitrogen) expression vector into which the HRF gene was inserted was transformed into E. coli BL21(DE3)pLysS (Promega) and cultured to induce the synthesis of the recombinant protein ( Figures 1b and 1c).
  • the culture medium was collected by eluting His-tagged HRF protein bound to Ni 2+ using His ⁇ Bind resin (Novagen) using an elution buffer.
  • secondary protein purification was performed.
  • a panning experiment was performed using a human antibody single-chain variable fragment (scFv) phage library to increase the number of phages that specifically bind to the HRF antigen.
  • scFv human antibody single-chain variable fragment
  • HRF antigen 5 ⁇ g was added to 2 ml of PBS, placed in an immunotube, and left overnight at 4°C to adsorb the antigen to the surface of the test tube. The next day, the cells were washed three times with PBS-T (phosphate buffered saline-Tween20) and blocked for 2 hours at room temperature using 3% skim milk diluted with PBS. Afterwards, it was washed three times with PBS-T. To select phages that bind to antigens, 3 ml of a solution containing 10 12 PFU of an antibody phage library was added and reacted for 2 hours. Afterwards, the solution in the test tube was discarded and washed 10 times with PBS-T.
  • PBS-T phosphate buffered saline-Tween20
  • the scFv gene sequence of the positive phage clone selected in Example 3 was analyzed using an ABI Prism 3730XL genetic analyzer (Applied Biosystems) to confirm the amino acid sequence of the antibody.
  • the scFv gene was inserted into the scFv-Fc expression vector, and then transformed into HEK293F cells to induce antibody expression. Afterwards, the culture medium was centrifuged to obtain antibodies secreted outside the cells, and the supernatant was recovered. The obtained culture medium was filtered and the antibodies were purified using protein G column, an affinity chromatography. To confirm the produced and purified antibodies, SDS-PAGE analysis was performed. More specifically, reducing sample buffer and non-reducing sample buffer were added to 4 ⁇ g of purified antibody, respectively, and then loaded on a 10% acrylamide gel. After electrophoresis was performed, the protein was stained using Coomassie blue.
  • HRF antigen was dispensed in coating buffer (50 mM sodium carbonate, pH 9.6) to a concentration of 1 ⁇ g/ml in a 96-well plate, and then the antigen was coated at 4°C overnight. Then, the plate was washed three times with PBS-T to remove unbound antigen. Afterwards, the plate was blocked with 3% skim milk at room temperature for 1 hour, and washed again three times with PBS-T. Then, diluted anti-HRF monoclonal antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • coating buffer 50 mM sodium carbonate, pH 9.6
  • the binding affinity to human HRF dimer was in the following order: JEW-D195 ⁇ JEW-M449 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 It was confirmed that it was high.
  • the binding affinity for mouse/rat HRF dimer was JEW-M449 ⁇ JEW-D195 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 It was confirmed that the order was high.
  • BEAS-2B cells a human bronchial epithelial cell line
  • HRF dimer was treated, and after a certain period of time, an anti-HRF monoclonal antibody was produced by confirming the increased production of IL-8, an inflammatory mediator contained in the cell supernatant. The efficacy was tested.
  • BEAS-2B cells were cultured in DMEM medium at 37°C in the presence of 5% carbon dioxide, and when the cells had grown to about 80%, they were transferred to a 48-well plate and grown for 24 hours. When the cells grew to 80-90%, they were washed twice with DMEM medium. Each monoclonal antibody (30 ⁇ g/ml) was premixed with HRF (2 ⁇ g/ml), and then 60 minutes later, this mixture was applied to the cells. Treated and cultured for 18 hours. The amount of IL-8 produced in the cell supernatant was quantified using a commercially available ELISA kit (Biolegend).
  • ovalbumin thick egg ovalbumin
  • mice 7-8 week old female BALB/c mice were used as experimental animals, and to induce allergic asthma, 50 ⁇ g ovalbumin (Sigma) and 1 mg Alum were mixed in 0.2 ml of PBS and injected intraperitoneally into the mice. .
  • immune boosting was induced through the second systemic sensitization using the same method.
  • mice were sensitized by inhalation by intranasally administering 20 ⁇ l of PBS containing ovalbumin (200 ⁇ g) dissolved in it.
  • an anti-HRF scFv-Fc antibody the antibody dosage was set at 100 and 200 ⁇ g/mouse. As shown in Figure 6, the antibody was administered intraperitoneally 15 minutes before ovalbumin inhalation sensitization. A total of 4 doses were administered once every two days, and the experimental animals were sacrificed 48 hours after the last antibody dose.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal injection of zoletil and lumpun. After anesthesia, the thoracotomy was performed, the airway area was incised, and a 20-gauge intravascular tube catheter was inserted into the airway.
  • Washing solution was recovered by injecting and aspirating 0.8 ml of PBS three times.
  • the recovered bronchoalveolar lavage fluid was centrifuged at 4°C and 2,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was stored at -70°C.
  • the cell sediment was redispersed in 200 ⁇ l of PBS and the number of inflammatory cells, that is, the total number of white blood cells, was measured.
  • the cell sediment redispersed using Cytospin was spread on a glass slide and stained using Diff-Quick (Baxter Healthcare). Afterwards, the total number of white blood cells was measured and compared under a microscope.
  • IL-4, IL-5, and IL-13 levels were measured using a commercially available ELISA kit (Biolegend) to determine Th2 immune reactivity as an indicator of allergic inflammatory response. did.
  • the levels of IL-4, IL-5, and IL-13 increased in the allergy group compared to the normal control group, and decreased in a dose-dependent manner in the antibody treatment group compared to the allergy group. did.
  • ovalbumin-specific IgE in plasma was not detected in the normal control group, and was confirmed to increase in the allergic group.
  • the amount of ovalbumin-specific IgE production decreased in a dose-dependent manner in the antibody treatment group compared to the allergy group.
  • Bronchoalveolar lavage fluid was collected from each group, and some lung tissues were fixed in 10% formalin solution.
  • the fixed tissues were dehydrated to create paraffin blocks, and sections were 5 ⁇ m thick and subjected to hematoxylin & eosin (H&E) staining and periodic acid-Schiff (PAS) staining. Stained lung tissue sections were histopathologically examined using an optical microscope.

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Abstract

본 발명은 IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항-HRF 항체는 HRF에 특이적으로 높은 결합력을 가지고 결합함으로써, HRF의 활성을 억제하는 것을 확인한 바, 알레르기 질환, 염증성 질환, 자가면역질환 또는 암, 고혈압, 말라리아, 골다공증과 같은 HRF 관련 질환의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도
본 발명은 IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
히스타민방출인자 (histamine-releasing factor, HRF, Translationally Controlled Tumor Protein, TCTP, 이하 HRF로 칭함)는 호염구 (basophil)를 활성화시키고 히스타민의 방출을 유도하여 후기 알러지 반응을 유발한다고 알려져 있으며, 호염구 외에도 후기 알러지 반응에 관여하는 염증세포를 활성화시켜 다양한 사이토카인을 유리시키기 때문에 후기 알러지 반응에 중요한 인자로 인식되고 있다 (MacDonald et al., Science, 269, 688-690, 1995).
HRF는 특정 IgE가 존재할 경우 호염구에서 히스타민을 분비하게 하는 것으로 알려졌으나, 이후 IgE와 이의 수용체인 FcεR 존재 유무에 상관없이 HRF가 염증세포에서 히스타민, IL-4 및 IL-13 등의 분비를 조절하는 것이 관찰됨으로써 Bheekha-Escura 등은 HRF가 IgE가 아닌 특이적 세포막 수용체에 결합하여 작용할 것이라는 가능성이 제시되었다.
본 발명자들은 선행연구를 통해 이량체를 형성할 수 있는 HRF가 세포에서 히스타민 및 IL-8 분비함을 규명하여, HRF의 이량체형이 알레르기를 유발하는 물질임을 최초로 증명하였고 (대한민국 등록특허 제100780255호, 유럽 등록 특허 제1683866호, 일본 등록특허 제4564926호, 미국 등록특허 제7772368호), HRF가 친수성 단백질임에도 불구하고, 세포막을 건너갈 수 있다는 사실과, 세포내 존재 하는 HRF는 (Na,K)ATPase 알파서브유닛 중 대형 세포질 루프(large cytoplasmic loop) CD3 (cytoplasmic domain 3)에 결합한다는 사실을 최초로 규명하였고, 세포내 HRF을 과발현하는 형질전환 마우스에서 고혈압이 유발됨을 입증하였다 (대한민국 등록특허 제10-0457350호, 유럽 등록 특허 제1167526호, 일본 등록 특허 제4295449호, 미국 등록 특허 제6710165호). 또한, HRF에서 막투과 단백질 도메인 기능을 갖는 펩타이드를 발견하였다 (대한민국 등록특허 제10-0859972호). 또한, 이량체 HRF를 타겟으로 하여 이를 제어함으로써 항알레르기 효능을 갖는 펩타이드 약물(dTBP2)을 자체적으로 개발하였으며, 알레르기 질환과 류마티스성 관절염에서 억제 효능을 입증하였다 (대한민국 등록특허 제10-1830838호). 또한, HRF 구조 부위로서 세포막에 존재하는 HRF의 수용체에 결합하는 유연성 루프(flexible loop) 도메인 (대한민국 등록특허 제101804291호)또는 헬릭스 2(helix 2) 도메인 (대한민국 등록특허 제101843051)및 C-말단 (대한민국 등록특허 제101804285호)을 규명하였으며, 이들에 대한 결합 물질이 IL-8의 분비능을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 항알레르기제로서 디히드로코스터스 락톤 (Phytomedicine 2018), 카다모닌(cardamonin)이 이량체 HRF를 억제하여 항염증 효과를 발휘함을 규명하였고 (FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, 2021, v.12, 765521), 단량체와 이량체 HRF가 류마티스 관절염의 질환 활성에 밀접한 관련이 있다는 것을 확인하였고, HRF가 류마티스 관절염의 진단 및 치료를 위한 새로운 바이오마커이자 치료 대상임이 확인하였다(EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE, 2021, 67-80). 이에 더하여, 이량체 HRF의 저해제인 dTBP2은 비만 세포의 탈과립을 직접적으로 억제하여 전신 아나필락시스 반응을 약화시킴을 규명하였고 (FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, 2021, v.12, 764321), HRF가 제2형 당뇨병을 포함한 비만 및 비만 관련 대사 장애의 치료 표적이 될 수 있음을 규명하였으며 (International Journal of Obesity, 2021, v.45 no.7, 1576-1587), 이량체 HRF가 기도 상피세포의 활성화를 통해 기도염을 악화시킴을 규명하였다 (Biomedicine and Pharmacotherapy, 2021, v.144, 112316).
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같이 다양한 질병과 연관이 있는 HRF에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 노력하였으며, 특히 단량체 및/또는 이량체 HRF에 결합하는 항체를 개발하였다. 본 발명에 따른 항-HRF 항체는 HRF에 특이적으로 높은 결합력을 가지고 결합함으로써, HRF의 사이토카인 유사 활성을 억제하는 것을 확인하였으며, 알레르기 질환, 만성 염증성 질환, 자가면역질환, 또는 암, 고혈압, 말라리아, 골다공증과 같은 HRF 관련 질환의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 HRF 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 HRF 관련 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(i) 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3;
(ii) 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 13으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 17로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 18로 기재된 중쇄 CDR3;
(iii) 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 23으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 24로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 26으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 28로 기재된 중쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 32로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 33으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 34로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 36으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 37로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR3;
(v) 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 46으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 47로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 48로 기재된 중쇄 CDR3;
(vi) 서열번호 52로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 53으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 54로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 56으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 57로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 58로 기재된 중쇄 CDR3;
(vii) 서열번호 62로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 63으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 64로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 66으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 67로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 68로 기재된 중쇄 CDR3; 및
(viii) 서열번호 72로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 73으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 74로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 76으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 77로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 78로 기재된 중쇄 CDR3;
으로 구성된 군으로부터 선택되는 가변 경쇄 도메인 또는 가변 중쇄 도메인의 CDR 서열을 포함하는 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 HRF 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 HRF 관련 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항-HRF 항체는 HRF에 특이적으로 높은 결합력을 가지고 결합함으로써, HRF의 사이토카인 유사 활성을 억제하는 것을 확인한 바, 알레르기 질환, 만성 염증성 질환, 자가면역질환, 또는 암, 고혈압, 말라리아, 골다공증과 같은 HRF 관련 질환의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 항-HRF 단일클론 항체의 제조에 사용된 재조합 HRF 단백질, 즉 항원 단백질을 제작하기 위해 구축한 발현 벡터의 모식도이다.
도 1b는 HRF 단량체의 구조를 나타낸 도이다.
도 1c는 HRF 이량체의 구조를 나타낸 도이다.
도 1d는 HRF 단량체를 발현 정제한 것을 SDS-PAGE로 확인한 도이다.
도 1e는 HRF 이량체를 발현 정제한 것을 SDS-PAGE로 확인한 도이다.
도 2a는 본 발명의 항체 스크리닝 과정에서 이용되는 패닝 (panning) 실험법을 나타낸 도이다.
도 2b는 scFv 파지 라이브러리로부터 패닝된 288개의 클론에 대하여 파지 ELISA를 진행하여, HRF 이량체에 대하여 양성반응을 보인 38개의 클론을 나타낸 것이다.
도 2c는 패닝 후 288개의 클론에 대하여 파지 ELISA를 진행하여 HRF 단량체에 대하여 양성반응을 보인 33개의 클론을 나타낸 것이다.
도 2d는 항-HRF/TCTP 이량체 scFv 항체의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2e는 항-HRF/TCTP 단량체 scFv 항체의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 3a는 항-HRF scFv-Fc 항체 제작 후 비환원조건에서 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 항-HRF scFv-Fc 항체 제작 후 환원조건에서 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 8종의 항-HRF scFv-Fc 항체와 사람 HRF 이량체에 결합하는 항체의 결합력을 비교분석한 도이다.
도 4b는 항-HRF scFv-Fc 항체와 마우스/랫트 HRF 이량체에 결합하는 항체의 결합력을 비교분석한 도이다.
도 5는 기관지 상피세포에서 항-HRF scFv-Fc 항체의 IL-8 분비 억제능을 확인한 도이다.
도 6은 천식 마우스 모델 제작 방법과 항-HRF scFv-Fc 항체 투여 시기를 나타낸 도이다.
도 7은 천식 마우스의 기관지페포세척액에서 총 백혈구 세포수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 천식 마우스의 기관지페포세척액에서 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 천식 마우스의 혈장에서 오발부민 특이적인 IgE 생성량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 천식 마우스의 폐 조직을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 HRF는 히스타민 유리활성이 있는 IgE 의존적 히스타민 방출 인자로, 번역 제어 종양 단백질 (translationally controlled tumor protein, TCTP)로 알려진, 모든 세포질에 존재하는 172개의 아미노산으로 구성되어 있는 공지의 단백질이다. 상기 HRF는 IgE-감작된(sensitized) 호염구(basophil)를 자극하여 히스타민 및 인터루킨-4 (IL-4)의 유리를 촉진시킴으로써 알레르기성 비염, 천식 및 아토피성 피부염과 같은 후기반응 알레르기 질환을 일으킨다고 보고되어 있다.
상기 HRF는 이량체형(dimer)이 활성형이고 상기 HRF의 구조 중에서 유연성 루프 (flexible loop: FL) 도메인 또는 헬릭스 2 (helix 2: H2) 도메인이 HRF에 대한 수용체와 결합하는 부위이며, 상기 HRF에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 및 N-말단이 결실된 것으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 결합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시태양에서 이량체 HRF는 N-말단의 아미노산 10개가 결실된 것이다. 본 발명의 일 실시태양에서 단량체 또는 이량체 HRF는 각각 서열번호 82 또는 서열번호 83의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (1) 내지 (8)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
(1) 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(2) 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 13으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 17로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 18로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(3) 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 23으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 24로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 26으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 28로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(4) 서열번호 32로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 33으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 34로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 36으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 37로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(5) 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 46으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 47로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 48로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(6) 서열번호 52로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 53으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 54로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 56으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 57로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 58로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(7) 서열번호 62로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 63으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 64로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 66으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 67로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 68로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(8) 서열번호 72로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 73으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 74로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 76으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 77로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 78로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (9) 내지 (16)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
(9) 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(10) 서열번호 11로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(11) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(12) 서열번호 31로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 35로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(13) 서열번호 41로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 45로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(14) 서열번호 51로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 55로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(15) 서열번호 61로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 65로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(16) 서열번호 71로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 75로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (17) 내지 (24)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
(17) 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(18) 서열번호 19로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(19) 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(20) 서열번호 39로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(21) 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(22) 서열번호 59로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(23) 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(24) 서열번호 79로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명에서 항체(Antibody)는 단량체 및/또는 이량체 HRF 단백질과 같은 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명은 단량체 및/또는 이량체 HRF 단백질에 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.
본 발명에서 항체는 단일클론항체, 다클론항체 및 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체)를 모두 포함할 수 있다. 항체는 2개의 중쇄 (heavy chain)와 2개의 경쇄 (light chain)로 구성되며, 대상 항원의 종류에 따라 아미노산 서열이 달라지는 가변 영역 (variable region)과 서열이 달라지지 않는 불변 영역 (constant region)을 갖는다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장항체 (Full-lenght antibody) 또는 항체 단편일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 항체는 단일클론항체일 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체(human antibody)" 또는 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인 간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하 는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.
본원에서 사용된 용어 "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종 (species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
상기 항원 결합 단편은 scFv (single-chain variable fragment), Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv 일 수 있다. 일 실시태양에서 상기 항원 결합 단편은 scFv-Fc (Fragment, crystallizable) 형태의 항원 결합 단편이다.
상기 scFv는 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변도메인을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 링커 (linker)로 연결한 단백질을 지칭한다. 경 쇄가변도메인 (VL)-링커-중쇄가변도메인 (VH), 또는 중쇄가변도메인 (VH)-링커-경쇄가변도메인 (VL)의 순서 모두 가능하며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원 특이성을 가진다.
상기 단량체 및/또는 이량체 HRF에 대한 항체의 항원 결합 단편, 예컨대, 항 HRF scFv에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 펩타이드 링커는 18-mer 링커인, GGSSRSSSSGGGGSGGGG (서열번호 81)이다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, HRF 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신 과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아 미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
또한, 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기한 폴리뉴클레오티드 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 염기 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 염기 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482(1981)]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970)]; [Pearson and Lipman, Methods inMol. Biol. 24: 307-31(1988)]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237- 44(1988)]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989)]; [Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881- 90(1988)]; [Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992)] 및 [Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)] 등에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 단량체 및/또는 이량체 HRF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (25) 내지 (32)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
(25) 서열번호 10으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(26) 서열번호 20으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(27) 서열번호 30으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(28) 서열번호 40으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(29) 서열번호 50으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(30) 서열번호 60으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(31) 서열번호 70으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(32) 서열번호 80으로 기재된 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 세포에서 상기　폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현 할 수 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 상기 진핵세포는 포유류 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포일 수 있다. 상기 포유류는 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스일 수 있다. 상기 원핵세포는 박테리아 세포일 수 있다. 상기 박테리아는 대장균일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡 터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 상기 폴리뉴클레오티드가 적절한 조절 영역에 작동 가능하도록 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 벡터는 또한 선별마커를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 상기　항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는　폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 것, 또는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는　폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 HRF 표면 항원에 특이적인 항체는 바람직하게는 파아지-디스플레이 기술(Smith, Science, 228, 1315-1317,1985; 및 Hoogenboom & Chames, Immunol Today, 21, 371-378, 2000)을 응용하여 선별할 수 있다. 다음과 같이 파아지-디스플레이 기술을 응용하여, 필라멘트(filamentous) 파아지(M13, Fd 및 F1) 표피 단백질을 발현하는 유전자(gene III)에 목적하는 항체를 발현하는 유전자를 융합시켜, 상기 융합된 항체가 박테리오 파아지 입자의 표면에 노출된 항체-파아지 형태의 바이러스 입자를 생성시키고, 상기 노출된 항체의 높은 특이도 및 친화도, 파아지의 높은 감염성을 이용하여 바이오패닝 (biopanning) 기법을 응용하여 파아지 라이브러리로부터 원하는 항체를 선별할 수 있다 (Burton & Barbas, Adv. Immunol., 57, 191-280, 1994; Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12, 433-455, 1994; 및 Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20, 1998; Kim et al., Hybrid Hybridomics, 21, 385-392, 2002).
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO (중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0 (생쥐 골수종), 인간 림프아구 (human lymphoblastoid), COS, NSO (생쥐 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK (베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK (인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6 (인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어 "도입"은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 HRF 관련 질환은 염증성 질환, 자가면역질환, 암, 고혈압, 말라리아 및 골다공증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 염증성 질환 또는 자가면역질환은 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 비염, 아토피 피부염, 두드러기, 건초열, 결막염, 아나필락시스의 알레르기 질환, 기관지염, 폐렴, 관절염. 신장염, 건선, 피부염, 크론병, 장염, 치은염, 동맥경화증, 관상동맥염, 간염, 베체트병, 방광암, 전립선염, 신우신염, 사구체신염, 골수염, 갑상선염, 포도막염, 복강염, 수막염, 폐섬유화증 및 류마티스 관절염으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
IL-8은 만성기관지염 등 만성 염증성 기관지 질환(Richman-Eisenstat et al., Am J Physiol, 264, L413- 418, 1993), 폐렴 등 염증성 폐질환(Erger and Casale, Eur Respir J, 11, 299-305, 1998; Pease & Sabroe, Am J Respir Med, 1, 19-25, 2002), 관절염 또는 신장염(Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994), 건선(Schulz et al., J Immunol, 151, 4399-4406, 1993; Bruch-Gerharz et al., J Exp Med, 184, 2007-2012, 1996), 피부염(Sticherling et al., Arch Dermatol Res, 284, 82-85, 1992), 크론병(Izutani et al., Inflamm Bowel Dis, 1, 37-47, 1995), 염증성 장질환(Mitsuyama et al., Clin Exp Immunol, 96, 432-436, 1994), 치은 염(Haake & Huang, Clinical Periodontology, 9th Edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co. 2002. page 162), 동맥경화증, 관상동맥질환 등 심혈관계 질환(Apostolakis et al., Cardiovasc Res, 84, 353-360, 2009; Boekholdt et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24, 1503-1508, 2004), 만성간질환(Zimmermann et al., PLoS ONE, 6, e21381, 2011), 베체트병(Behcet's disease, Katsantonis et al., Dermatology, 201, 37-39, 2000), 방광암, 전립선염, 신우신염 또는 골수염(Shahzad et al., Int arch med, 3, 11, 2010), 갑상선질환 (Kobawala et al., J Thyroid Res, 8, 270149, 2011), 포도막염(uveitis, Klok et al., Br J Ophthalmol, 82, 871-874, 1998), 사구체 신염, 복강염, 수막염 및 폐섬유화증(Harada et al., Mol Med Today, 2, 482-489, 1996)의 다양한 염증성 질환에 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 폐질환, 류머티스성 관절염, 염증성 장질환, 건선, 수장족저농포증(palmoplantar pustulosis) 등 만성 염증성 피부질환, 안구 염증 등 염증성 질환에서 IL-8을 저해하는 것이 치료 전략으로 제시되었다(Mukaida, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L566-L577, 2003; Skov et al., J Imm unol, 181, 669-679, 2008; Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994). IL-8의 차단항체(blocking antibody)나 IL-8 수용체를 코딩하는 유전자를 저해하는 치료법은 염증 치료 효과가 있으며(Harada et al., Mol Med Today, 2, 482-489, 1996), 일례로 만성 염증성 피부질환 환자에서 IL-8에 대한 항체를 투여하여 염증이 감소되었다(Skov et al., J Immunol, 181, 669-679, 2008). HRF에 의해 분비가 증가하는 GM-CSF도 다양한 염증성 질환과 관련성이 있어(Hamilton, Trends Immunol, 23, 403-408, 2002), GM-CSF 또한 류머티스성 관절염 등의 염증성 질환의 타겟으로 제시되고 있다(Cornish et al., Nat Rev Rheumatol, 5, 554-559, 2009). 따라서, HRF 활성 억제제가 IL-8 분비 억제에 관여하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 HRF 활성 억제제가 상기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 이론이 확실한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 HRF 항체는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, HRF에 의해 증가되는 IL-8은 천식 또는 기관지염 (Chanez et al., Int Arch Allergy Immunol, 111, 83-88, 1996), 만성폐쇄성폐질환 (Nocker et al., Int Arch Allergy Immunol, 109, 183-191, 1996), 기관지 확장증 (bronchiectasis, Simpson et al., Thorax, 62, 211-218, 2007), 비염 (Benson et al., Pediatr Allergy Immunol, 10, 178-185, 1999; Kuna et al., J Allergy Clin Immun, 97, 104-112, 1996), 아토피성 피부염 (Kimata & Lindley, Arch Dis Child 70,119-122, 1994), 두드러기 (urticaria, Choi et al., J Clin Immunol, 28, 244-249, 2008), 건초열 (hay fever, Ciprandi et al., Otolaryngol Head Neck Surg, 133, 429-435, 2005), 결막염 (Miyoshi et al., Cornea, 20, 743-747, 2001) 아나필락시스 (anaphylaxis) 등의 여러 알레르기 질환에 관여한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 HRF 항체는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, HRF는 1980년대까지 종양에 관련된 단백질 (tumor-specific protein)로 알려져 왔으며, 그 합성은 종양의 증식 단계 (proliferative stage)와 관련이 있을 것으로 생각되어 왔다. 마우스 적백혈병 (erythroleukemia) 세포에서는 21kDa의 종양 단백질 p21으로 밝혀졌고 (Chitpatima et al,1988), 에를리히 복수 암(Ehrlich ascites tumor)에서 세포성장과 관련이 있는 단백질 p23이 HRF와 동일한 것으로 밝혀졌다 (Bohm et al, 1989). 따라서 본 발명의 HRF 항체는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, HRF는 나트륨/칼륨 APT아제 펌프 작용을 저해하여 혈관 평활근 근육 및 심장 근육의 반응도와 수축도, 그리고 뇌의 신경전달물질 분비에 영향을 미쳐 고혈압을 유발한다고 알려져 있다 (대한민국 공개특허 10-2004-0111051). 따라서 본 발명의 HRF 항체는 고혈압의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 1998년 항말라리아제인 아르테미시닌 (Artemisinin)이 말라리아 단백질인 HRF에 결합하여 작용하는 것이 밝혀진 바 있다 (Bhisutthibhan et al., J Biol Chem, 273, 16192-16198, 1998). IL-8은 말라리아 환자에서도 분비되며(Friedland et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 87, 54-55, 1993), 말라리아의 HRF가 IL-8 분비를 촉진시킨다고 보고되었다 (MacDonald et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10829-32, 2001). 따라서 본 발명의 HRF 항체는 방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, HRF가 뼈를 없애는 파골세포의 분화 시 유도되며, HRF가 과발현된 마우스에서 골량이 감소하고 파골세포가 증가함이 알려져있다 (SW Choi et al., FEBS letters, 588(21), 4026-31,　2004). 따라서 본 발명의 HRF 항체는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
건강한 성인 기증자의 단핵백혈구에 호흡기 바이러스인 인플루엔자 (influenza) 또는 호흡기세포융합바이러스 (respiratory syncytial virus)를 시험관 내에서 노출 시 HRF 생성을 유도하며, 생성된 HRF는 호염기구 탈과립 (basophil degranulation)을 유발하여 바이러스 유발성 기관지 경련을 일으킬 수 있다 (Chonmaitree et al., J Infect Dis, 164(3), 592-4, 1991). 따라서 본 발명의 HRF 항체는 바이러스로 인한 호흡기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제를 더 포함할 수 있다. 일례로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔 (예, 올레인산에칠 등), 알코올류 (예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌 글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이때, 용어 "약제학적 유효량"이란 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내 지 수회 투여가 가능하다. 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 2주 또는 4주 간격으로 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 HRF 관련 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HRF 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 HRF 관련 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 HRF 관련 질환의 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 HRF 검출용 키트를 제공한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 HRF 관련 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 HRF 관련 질환이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 HRF 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는 HRF 관련 질환을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 진단 대상 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 림프액, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로 마토그래피 (Immunochromatography), 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석 (luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅 (Western blotting), 마이크로어레이, 표면 플라즈몬 공명법 (surface plasmon resonance: SPR) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 단량체 및/또는 이량체인 HRF 단백질을 합성하여 분리 및 정제하였다 (도 1a 내지 도 1e 참조). 인간항체인 scFv 파지 라이브러리를 이용하여 상기 단량체 및/또는 이량체인 HRF에 특이적으로 결합하는 파지를 획득하였으며 (도 2a 참조), HRF 이량체에 대하여 높은 결합력을 가지는 38개의 클론 및 HRF 단량체에 대하여 높은 결합력을 가지는 33개의 클론을 선별하였다 (도 2b 및 도 2c 참조). 또한, 상기에서 선별된 클론의 scFv 항체의 아미노산 서열을 확인하였고 (도 2d 및 도 2e 참조), 상기 항체를 scFv-Fc 형태로 전환하여 제작하였다 (도 3a 내지 도 3b). 상기 제작된 항-HRF scFv-Fc 항체 중에서, 항원 결합력이 우수한 항체를 확인한 결과, 사람 HRF 이량체에 대한 결합력은 JEW-D195 ≥ JEW-M449 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 순으로 높았고, 마우스/랫트 HRF 이량체에 대한 결합력은 JEW-M449 ≥ JEW-D195 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 순으로 높음을 확인하였다 (도 4a 및 4b 참조). 또한, 인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B 세포에 HRF 이량체를 처리하여 BEAS-2B 세포의 활성화를 유도하고, 본 발명의 항-HRF 단일클론 항체를 처리한 후, 염증성 매개물질인 IL-8이 억제됨을 확인하였다 (도 5 참조). 또한, 천식 및 비염 동물 모델에 본 발명의 항-HRF scFv-Fc 항체를 투여하여 총 백혈구 세포수가 감소하는 것을 확인하였고 (도 7 참조), IL-4, IL-5 및 IL-13 수준이 감소함을 확인하였으며 (도 8a 내지 도 8c 참조), 혈장 내 오발부민 특이적인 IgE 생산량도 감소함을 확인하였으며 (도 9 참조), 염증세포 침윤과 점액질 분비가 감소함을 확인하였다 (도 10 참조). 따라서 본 발명의 항-HRF 항체는 염증을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, HRF 관련 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1> HRF의 발현, 분리 및 정제
HRF 단량체 또는 이량체를 제작하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 도 1a에 나타낸 바와 같이, HRF 이량체를 생산하기 위해 N-말단의 아미노산 10개가 결실되도록 발현 벡터를 제작하였다. 이후, HRF 유전자가 삽입된 pRSET A (Invitrogen) 발현 벡터를 E. coli BL21(DE3)pLysS (Promega)에 형질전환 (transformation)시키고 배양하여 재조합 단백질의 합성을 유도하였다 (도 1b 및 도 1c). 배양액은 His · Bind resin (Novagen)을 이용하여 Ni2+과 결합한 His-tagged HRF 단백질을 용출 완충액 (elution buffer)을 이용하여 용출시켜 수거하였다. His-tag column으로 분리 및 정제한 재조합 HRF의 정제도를 높이기 위해 2차 단백질 정제를 실시하였다. 2차 단백질 정제는 음이온 교환 칼럼 (anion exchange column)인 Mono Q HR 5/5 column (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 재정제하였다. 보다 자세하게, Mono Q HR 5/5 column은 3차 증류수를 약 5분간 흘려주어 세척한 후 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.4)을 약 40분간 흘려보내 안정화시켰다. 앞에서 1차 정제한 단백질을 칼럼 (column)에 로딩 (loading)하고 다시 0~400 mM의 NaCl을 흘려보내 농도구배별로 1ml/min씩 샘플 (sample)을 받았다. 이 분획들을 SDS-PAGE 한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 (coomassie brilliant blue) 염색을 하여 HRF가 용출되는 분획만 선별하였다 (도 1d 및 도 1e). 이를 vivaspin (vivascience)을 사용하여 버퍼 조성을 PBS로 치환하면서 농축하였다.
<실시예 2> 패닝(panning)에 의한 특이적인 항체들의 선별
인간항체인 단쇄가변분절 (single-chain variable fragment; scFv) 파지 라이브러리를 이용하여 패닝 실험을 진행하여 HRF 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 증가시켰다.
구체적으로, 5 μg의 HRF 항원을 2 ml의 PBS에 가한 다음 면역 시험관 (immunotube)에 넣고 4℃에서 하룻밤 방치시켜 시험관 표면에 항원을 흡착시켰다. 다음날 PBS-T(phosphate buffered saline-Tween20)로 3회 세척하고 PBS로 희석한 3% 스킴 밀크 (skim milk)를 사용하여 상온에서 2시간 동안 차단 (blocking)하였다. 이후, PBS-T로 3회 세척하였다. 항원에 결합하는 파지를 선별하기 위해 1012 PFU의 항체 파지 라이브러리가 포함된 용액 3 ml를 가하여 2시간 동안 반응시켰고, 이후 시험관 안의 용액을 버리고 PBS-T로 10회 세척하였다. 항원에 결합한 scFv 파지 항체를 용리하여 수거하기 위해 0.1 M glycine/HCl (pH 2) 1 ml을 넣고 상온에서 10분간 방치하여 파지를 용리시켰다. 이후, 2M Tris-base 50 μl를 넣어 중화시켰다. 이와 같은 패닝 (panning) 과정을 3회 반복함으로써 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 획득 및 증가시켰다 (도 2a).
<실시예 3> 양성 클론(clone)의 선별 및 확인
HRF 항원에 높은 결합력을 가지는 항-HRF 단일클론 항체를 선별하기 위하여, 96-well plate의 well에 각각 200 μl의 SB-carbenicillin 배지를 넣고, scFv 유전자가 포함된 ER2537 E. coli 단일 콜로니를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 각각의 well에 접종하고 배양 (37 ℃, 4 시간) 후 VCSM13 헬퍼 파지를 넣어 감염시켰다. 헬퍼 파지 감염 후 대장균을 원심 분리하여 감염되지 않은 헬퍼 파지를 제거한 후 침전된 대장균을 250 μl의 배지에 현탁하였다. 이후 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층에 부유한 파지 용액을 회수하여 ELISA를 시행하였다.
항원에 결합하는 파지 클론을 확인하기 위해 96-well plate에 항원 100 ng을 하룻밤 코팅하였다. PBS-T로 항원을 코팅한 plate는 PBS로 3회 세척하였다. 이후 3% 스킴밀크로 상온에서 플레이트를 1시간 동안 블라킹 (blocking)시켰다. 이후 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 다음 파지 용액을 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, HRF가 결합되어 있는 항-M13-HRF를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그리고 TMB 기질을 첨가하고 10분 동안 반응시켜 발색시킨 후에, 2 N 염산 용액을 첨가하여 발색 반응을 종료시켰다. 흡광도 평판 판독기를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하여 평가하였다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 288개의 클로니에서 항원인 HRF 이량체에 대하여 양성반응을 보이는 38개의 클로니를 선별하였다. 또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, 항원인 HRF 단량체에 대하여 양성반응을 가지는 33개의 클로니를 선별하였다.
<실시예 4> 항-HRF 단클론 항체의 아미노산 서열 확인
실시예 3에서 선별된 양성 파지 클론의 scFv 유전자 서열은 ABI 프리즘 3730XL 유전자 분석기 (Applied Biosystems)로 분석하여 항체의 아미노산 서열을 확인하였다.
그 결과, 도 2d 및 도 2e에 나타난 바와 같이, 서로 다른 아미노산을 가지고 있는 8종의 항-HRF scFv 항체를 획득하였다.
<실시예 5> 항-HRF 단일클론 항체의 제작 및 정제
실시예 4를 통해 확인한 항-HRF 단클론 항체를 scFv-Fc 형태로 전환하기 위해, scFv 유전자를 scFv-Fc 발현 벡터에 삽입하였고, 이후 HEK293F 세포에 형질전환하여 항체 발현을 유도하였다. 이후, 세포 밖으로 분비되는 항체를 얻기 위해 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 획득한 배양액은 여과 과정을 거친 후 친화성 크로마토그래피인 protein G column을 이용하여 항체를 정제하였다. 제작 및 정제한 항체를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 보다 자세하게는, 정제된 항체 4 μg에 각각 환원 샘플버퍼 (reducing sample buffer)와 비환원 샘플버퍼 (Non-reducing sample buffer)를 첨가한 후에, 10% 아크릴아미드 겔 (acrylamid gel)에 로딩하였다. 이후 전기영동을 실시한 다음, 이후 쿠마시 블루를 이용하여 단백질을 염색하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 순도 95% 이상의 항-HRF 단일클론 항체가 제작 및 정제되었음을 확인하였다.
<실험예 1> 항-HRF 단일클론 항체의 항원 결합력
실시예 5에서 제작 및 정제된 항-HRF scFv-Fc 항체 중에서 항원 결합력이 우수한 단일클론 항체를 선별하기 위하여 ELISA binding 실험을 실시하였다.
구체적으로, 코팅 버퍼 (coating buffer, 50 mM의 sodium carbonate, pH 9.6)에 HRF 항원을 96-well plate에 1 μg/ml의 농도가 되도록 분주한 다음, 항원을 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 그리고 PBS-T를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 항원을 제거하였다, 이후 3% skim milk로 plate를 실온에서 1시간 동안 blocking 하였고, PBS-T로 3회 이용하여 다시 세척하였다. 그리고 항-HRF 단일클론 항체를 희석하여 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 항원-항체 결합 1시간 후에 PBS-T를 이용하여 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거해 준 후에, HRF가 결합되어 있는 검출용 항체 (HRF conjugated anti-human IgG)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하여 결합되지 않은 검출용 항체를 제거하였다. 그리고 TMB 기질을 첨가하고 10분 동안 반응시켜 발색을 유도시킨 다음, 2 N의 염산 용액을 첨가하여 발색 반응을 종료시켰다. 흡광도 평판 판독기를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하여, 항원 결합력이 우수한 항체를 확인하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 사람 HRF 이량체에 대한 결합력은 JEW-D195 ≥ JEW-M449 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 순으로 높음을 확인하였다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 마우스/랫트 HRF 이량체에 대한 결합력은 JEW-M449 ≥ JEW-D195 > JEW-D121 > JEW-D4 > JEW-M353 > JEW-M357 > JEW-D199 > JEW-M491 순으로 높음을 확인하였다.
<실험예 2> 기관지 상피세포의 IL-8 분비 억제 효능 확인
항원 결합력인 우수한 단일클론 항체의 in vitro 효능을 확인하기 위해, 인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B 세포를 이용하였다. BEAS-2B 세포의 활성화를 유도하기 위하여 HRF 이량체를 처리하였고, 일정 시간이 경과한 뒤 세포 상등액에 포함된 염증성 매개물질인 IL-8의 증가된 생성량을 확인하여 제작한 항-HRF 단일클론 항체의 효능을 검정하였다.
보다 자세하게는, BEAS-2B 세포는 37℃, 5% 이산화탄소 존재하에 DMEM 배지에서 배양하였으며, 세포가 약 80% 성장했을 때 48-well plate로 옮겨 24시간 동안 성장시켰다. 세포가 80~90% 성장했을 때 DMEM 배지로 2회 세척하였고, 각각의 단일클론 항체 (30 μg/ml)는 HRF (2 μg/ml)와 미리 혼합한 다음, 60분 후 이 혼합물을 세포에 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 시판용 ELISA kit (Biolegend)를 이용하여 세포 상등액 내에 존재하는 IL-8의 생성량을 정량하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, BEAS-2B 세포에 HRF만 처리한 경우 세포 활성화를 유도하여 세포 상등액에 포함된 염증성 매개물질인 IL-8의 증가된 생성량을 확인하였다. 반면에 항-HRF 단일클론 항체 (JEW-M449, JEW-D121, JEW-D4, JEW-D195)를 처리한 경우 IL-8 생성량이 억제되는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 천식 모델에서 항-HRF 단클론 항체의 항염증 효능
질병 모델에서 항-HRF scFv-Fc 항체의 효능을 확인하기 위해 오발부민(chicken egg ovalbumin)으로 천식 및 비염 동물 모델을 도 6에 나타낸 바와 같이 유도하였다.
구체적으로, 실험동물은 7~8주령의 암컷 BALB/c 마우스을 이용하였으며, 알러지성 천식의 유도하기 위해 오발부민 50 ㎍ (Sigma)과 1 mg Alum을 PBS 0.2 ml에 혼합하여 마우스의 복강 내 주사하였다. 1차 전신감작 (sensitization) 후 14일째에 동일한 방법으로 2차 전신감작을 통해 면역 부스팅 (boosting)을 유도하였다. 1차 전신감작 후 28, 30, 32, 34일째에 오발부민(200 ㎍)을 녹인 PBS 20 ㎕를 마우스의 비강 내 투여하여 흡입감작시켰다. 항-HRF scFv-Fc 항체인 JEW-M449의 약효를 평가하기 위해 항체 투여양을 100, 200 ㎍/mouse로 설정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항체 투여 시기는 오발부민 흡입감작 15분 전에 복강 내 투여하였다. 이틀에 한 번 총 4회 투여하였고, 마지막 항체 투여 48시간 후 실험동물을 희생하였다.
오발부민의 반복적인 감작에 의한 알러지성 천식 동물 모델의 기관지폐포세척액에서는 호산구를 포함한 염증세포와 염증성 사이토카인이 증가한다. 따라서, 본 발명자들은 항-HRF 단클론 항체의 항염증성 효능을 확인하기 위해 기관지폐포세척액을 채취하였다. 구체적으로, 각 군별로 마지막 오발부민 흡입감작 48시간 후 마우스의 복강 내 졸레틸과 럼푼을 썩어 주사하여 마취시켰다. 마취 후 개흉한 다음 기도 부위를 절개하여 기도 내로 20 게이지의 혈관 내 튜브카테터를 삽입하였다. PBS 0.8 ml를 주입하고 흡입하기를 3회 반복하여 세척액을 회수하였다. 회수한 기관지폐포세척액은 4℃, 2,000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 상층액은 -70℃에 보관하였다. 세포침전물은 PBS 200 ㎕로 재분산하여 염증성 세포수, 즉 총 백혈구 세포수를 측정하였다. Cytospin을 사용하여 재분산한 세포침전물을 슬라이드 글라스에 도말한 후 Diff-Quick(Baxter Healthcare)을 사용하여 염색하였다. 이후 현미경 하에서 총 백혈구 세포수를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 총 백혈구 세포수는 정상대조군 (Control)에 비교하여 알러지 유발군(OVA)에서 증가하였고, 알러지 유발군에 비해 항체 치료군(Anti-HRF)은 용량 의존적으로 총 백혈구 세포수가 감소하는 것을 확인하였다.
다음으로, 기관지폐포세척액을 원심 분리한 상층액에서 알러지 염증반응의 지표로, Th2의 면역 반응도를 보기 위해 IL-4, IL-5 및 IL-13 수준을 시판용 ELISA kit (Biolegend)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 8a 내지 8c에 나타낸 바와 같이, IL-4, IL-5 및 IL-13 수준은 정상대조군에 비교하여 알러지 유발군에서 증가하였고, 알러지 유발군과 비교하여 항체 치료군에서 용량 의존적으로 감소하였다.
각 군별로 혈장 내 오발부민 특이적인 IgE 생성량을 확인하기 위해 마우스의 혈액 채취하였다. 구체적으로, 마지막 오발부민 흡입감작 48시간 후 마취 상태인 마우스의 심장에서 ~0.5 ml의 혈액을 채취한 다음, 4℃, 1,000 x g에서 15분간 원심분리하여 혈장을 얻었다. 혈장 내 오발부민 특이적인 IgE 생산량은 시판용 ELISA kit (Biolegend)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 혈장 내 오발부민 특이적인 IgE는 정상대조군에서는 검출되지 않았고, 알러지 유발군에서 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 오발부민 특이적인 IgE 생성량은 알러지 유발군과 비교하여 항체 치료군에서 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
각 군별로 기관지폐포세척액 채취한 다음, 폐 조직 일부를 10% 포르말린 용액에 고정하였다. 고정된 조직은 탈수과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였고, 5 ㎛ 두께로 절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 periodic acid-Schiff (PAS) 염색을 실시하였다. 염색한 폐 조직 절편은 광학현미경을 이용하여 병리조직학적 검사를 하였다.
염증세포 침윤 정도를 관찰하기 위해 폐 조직을 H&E 염색한 결과와 점액질 분비 정도를 측정하기 위해 PAS 염색한 결과를 도 10에 제시하였다. 정상대조군에서는 이상 소견이 관찰되지 않은 반면, 알러지 유발군에서는 기도 협착과 기도벽의 두께가 증가되고 다량의 염증세포가 침윤된 것이 확인되었고, PAS 양성세포의 양이 증가는 것으로 관찰되었다. 반면, 항체 치료군의 폐 조직 염색 결과, 알러지 유발군에 비해 염증세포 침윤과 PAS 양성세포 양이 용량 의존적으로 감소하는 것으로 관찰되었다.

Claims (14)

  1. (i) 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3;
    (ii) 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 13으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 17로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 18로 기재된 중쇄 CDR3;
    (iii) 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 23으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 24로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 26으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 28로 기재된 중쇄 CDR3;
    (iv) 서열번호 32로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 33으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 34로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 36으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 37로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR3;
    (v) 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 46으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 47로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 48로 기재된 중쇄 CDR3;
    (vi) 서열번호 52로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 53으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 54로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 56으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 57로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 58로 기재된 중쇄 CDR3;
    (vii) 서열번호 62로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 63으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 64로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 66으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 67로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 68로 기재된 중쇄 CDR3; 및
    (viii) 서열번호 72로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 73으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 74로 기재된 경쇄 CDR3; 서열번호 76으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 77로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 78로 기재된 중쇄 CDR3;
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 가변 경쇄 도메인 (variable light chain domain, VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (variable heavy chain domain, VH)의 CDR 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단량체 HRF (histamine releasing factor), 이량체 HRF 및 이들 모두에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. (i) 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역;
    (ii) 서열번호 11로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역;
    (iii) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역;
    (iv) 서열번호 31로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 35로 기재된 중쇄 가변영역;
    (v) 서열번호 41로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 45로 기재된 중쇄 가변영역;
    (vi) 서열번호 51로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 55로 기재된 중쇄 가변영역;
    (vii) 서열번호 61로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 65로 기재된 중쇄 가변영역; 및
    (viii) 서열번호 71로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 75로 기재된 중쇄 가변영역;
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단량체 HRF (histamine releasing factor), 이량체 HRF 및 이들 모두에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv (single-chain variable fragment), Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv-Fc (Fragment, crystallizable) 형태인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 HRF 관련 질환은 알르레기 질환, 염증성 질환, 자가면역질환, 암, 고혈압, 말라리아, 바이러스성 호흡기 감염질환 및 골다공증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 염증성 질환 또는 자가면역질환은 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 비염, 아토피 피부염, 두드러기, 건초열, 결막염, 아나필락시스의 알레르기 질환, 기관지염, 폐렴, 관절염. 신장염, 건선, 피부염, 크론병, 장염, 치은염, 동맥경화증, 관상동맥염, 간염, 베체트병, 방광암, 전립선염, 신우신염, 사구체신염, 골수염, 갑상선염, 포도막염, 복강염, 수막염, 폐섬유화증 및 류마티스 관절염으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, HRF 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, HRF 관련 질환의 진단용 조성물.
  12. 제11항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, HRF 관련 질환의 진단용 키트.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, HRF 검출용 키트.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 HRF 관련 질환이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 HRF 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, HRF 관련 질환의 진단 방법.
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