WO2023158242A1 - 탈모 치료 또는 발모 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

탈모 치료 또는 발모 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도 Download PDF

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subject
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hair
hair loss
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김수혁
이동규
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • It relates to a polypeptide having hair loss treatment or hair growth promoting activity and uses thereof.
  • Alopecia areata is an autoimmune disease and is known to be caused by excessive secretion of INF- ⁇ . Jak/Stat inhibitors have been proposed as one of the treatments.
  • the cause of androgenetic alopecia is due to excessive production of dihydrotestosterone (DHT) in the hair follicle, and substances that inhibit DHT synthesis (eg, Propecia, Avodart, etc.) are used as treatments, but Jak/ Stat inhibitors are also known to be effective in treating androgenetic alopecia.
  • DHT dihydrotestosterone
  • Suppressor of cytokine signaling (SOCS) protein is a negative regulator of the Jak/Stat pathway.
  • One aspect provides a polypeptide having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for improving hair loss or inducing or promoting hair growth comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for preventing or improving inflammation comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for inducing or promoting hair growth comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation comprising the above polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating hair loss in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method of inducing or promoting hair growth in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating inflammation in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method of cosmetically applying a cosmetically effective amount of said polypeptide to a subject.
  • the term "identity" in relation to polypeptides or polynucleotides refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptides or polynucleotides determined by comparing the sequences. The identity indicates the degree of sequence relatedness determined by the number of matches between strings of two or more amino acid residues or nucleotide residues. The identity of related polypeptides or polynucleotides can be calculated by known methods. "% identity" as applied to a polypeptide or polynucleotide means that a candidate amino acid sequence or nucleotide sequence is identical to residues in the second sequence, after aligning and, if necessary, introducing gaps, to obtain the maximum percent identity with the second sequence. It is defined as the percentage of residues in a candidate sequence. Methods and programs for the alignment are known. The program may be, for example, BLAST, Smith-Waterman algorithm, or Needleman-Wunsch algorithm.
  • the polypeptide may have sequence identity of at least 82.5%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 95% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminus may be protected with a protecting group.
  • the N-terminus is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group as a protecting group (stearyl group), butoxycarbonyl group, allyloxycarbonyl group (allyloxycarbonyl group), or polyethylene glycol (PEG).
  • cysteine at position 19 may be substituted with acetaminomethyl-L-cysteine.
  • the C-terminus of the polypeptide may be protected with a protecting group.
  • the C-terminus may be bonded to an amino group (amino group, -NH 2 ), a tertiary alkyl group, or azide (-NHNH 2 ) as a protecting group.
  • the alkyl group may have 4 to 20, 4 to 16, 4 to 12, 4 to 8, 5 to 20, 5 to 16, 5 to 12, or 5 to 8 carbon atoms.
  • the N-terminus is protected by an acetyl group
  • the C-terminus is protected by an amino group
  • the cysteine at position 19 may be substituted with acetaminomethyl-L-cysteine.
  • the polypeptide may have an activity promoting activity of hair follicle cells, promoting proliferation of hair follicle cells, or a combination thereof.
  • the polypeptide may have an effect of preventing or treating hair loss.
  • the polypeptide may have hair growth inducing or promoting activity.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for improving hair loss or inducing or promoting hair growth comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for preventing or improving inflammation comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • altering hair loss may include a process or effect of treating, reducing, or alleviating a hair loss condition.
  • “Amelioration of hair loss” may include, for example, regeneration of hair follicle cells or restoration of activity of hair follicle cells.
  • the term “inducing hair growth” or “stimulating hair growth” includes increasing hair growth from hair follicles. "Inducing hair growth” or “promoting hair growth” may be to increase the total amount of hair, such as hair follicle cell proliferation, hair follicle cell activity, or hair follicle cell growth promoting effect.
  • the cosmetic composition may include a cosmetically acceptable carrier.
  • the cosmetic composition may contain a cosmetically effective amount of the polypeptide.
  • the term "cosmetically effective amount” may be an amount sufficient to achieve an effect of improving hair loss or promoting hair growth of the cosmetic composition.
  • the amount may be, for example, 0.001 to 95.0%, 0.001 to 70.0%, 0.001 to 50.0%, or 0.01 to 50.0% based on the weight of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may be prepared in a formulation commonly prepared in the art.
  • the cosmetic composition may be formulated into, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleanser, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation or spray.
  • the cosmetic composition may be prepared in the form of flexible lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • ingredients included in the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the polypeptide and the carrier component as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may include conventional adjuvants such as, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for inducing or promoting hair growth comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation comprising the above polypeptide as an active ingredient.
  • the inflammation may be folliculitis.
  • prevention includes inhibiting or delaying the onset of a disease by administration of the composition.
  • treatment refers to any method that provides, to a subject suffering from or at risk of developing a disease, improvement of the condition of the subject, delay in disease progression, delay in onset of symptoms, or slowing of the progression of symptoms. means a form of treatment.
  • treatment and “prevention” are not intended to mean cure or complete elimination of symptoms.
  • the "subject” means a subject in need of treatment of a disease.
  • the subject may be, for example, mammals such as humans, mice, cats, horses, and cows.
  • Hair loss which is a disease to be prevented or treated by the pharmaceutical composition, means a state in which there is no hair in the area where hair is normally present or a state in which hair is reduced.
  • the hair loss may mean that the hair of the scalp, that is, the thick black hair is lost.
  • the hair loss is alopecia areata, androgenetic alopecia, alopecia totalis, alopecia universalis, alopecia areata transient, patchy alopecia, telogen effluvium , tinea capitis, hypotrichosis, or hereditary hypotrichosis simplex.
  • the hair loss may be caused by various eating habits and environmental influences such as genetic causes, hormonal imbalance, mental stress, exposure to air pollution, and intake of processed foods.
  • the hair loss includes, for example, hereditary androgenic "alopecia or baldness, circular” hair loss, tinea capitis due to fungal infection, telogen "hair loss, hair growth wall, hair production disorders, etc., and scarring" hair loss in which scars are formed is caused by lupus. It may be alopecia, toxic folliculitis, lichen planus pilaris, hair loss caused by burns and trauma.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically effective amount of the polypeptide.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically effective amount” may be an amount sufficient to achieve the efficacy of preventing or treating hair loss of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. may be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 0.0001 to 1000 ug, 0.001 to 1000 ug, 0.01 to 1000 ug, 0.1 to 1000 ug, or 1.0 to 1000 ug per day based on the amount of the polypeptide.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate and response sensitivity.
  • the pharmaceutical composition may include a unit dose form or multiple doses.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating hair loss in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method of inducing or promoting hair growth in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating inflammation in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polypeptide.
  • the inflammation may be folliculitis.
  • the subject may be a mammal.
  • the mammal may be a human, dog, cat, horse or pig.
  • the subject may be an individual suffering from hair loss disease.
  • the hair loss disease includes androgenetic alopecia, telogen effluvium, alopecia areata, tinea capitis, alopecia totalis, hypotrichosis, hereditary hypotrichosis simplex or generalized alopecia.
  • the administration may be administered once to the subject.
  • the administration can be, for example, a single injection or deposition.
  • the administration may be administered once or twice daily to a subject in need thereof for about 2 to about 28 days, or about 7 to about 10 days.
  • the polypeptide may also be administered once or twice daily to a subject 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 times per year, or a combination thereof.
  • the polypeptide may be co-administered with other therapeutic agents.
  • the effective amount of the polypeptide administered to a subject may include the total amount administered during the entire dosage regimen.
  • the polypeptide can be administered to a subject via any means suitable for delivering the polypeptide to a subject's cells, such as dermal, epidermal, dermal papillary cells or hair follicle cells.
  • composition of the present invention can treat or alleviate symptoms associated with hair loss disease when administered to a subject.
  • a therapeutically effective amount of the polypeptide may depend on a number of factors known to those skilled in the art.
  • the dosage of the polypeptide may vary depending on, for example, the identity, body size, condition of the subject or sample being treated, and these amounts can be readily determined by those skilled in the art. All therapeutic applications described herein can be applied to any subject in need of such treatment, including mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, pigs, sheep, goats or humans.
  • compositions for use according to the present invention may be formulated in a conventional manner using one or more physiologically acceptable carriers or excipients.
  • the therapeutic compositions of the invention can be formulated for a variety of routes of administration, including systemic and topical or localized administration.
  • routes of administration including systemic and topical or localized administration.
  • intramuscular, intravenous, intraperitoneal and subcutaneous injections may be used.
  • the therapeutic compositions of the present invention may be formulated in liquid solutions, such as in physiologically usable buffers such as Hank's solution or Ringer's solution.
  • therapeutic compositions may be formulated in solid form and redissolved or suspended immediately prior to use. A lyophilized form is also included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be at least sterile and pyrogen-free. Such pharmaceutical formulations include formulations for human and veterinary use.
  • Another aspect provides a method of cosmetically applying a cosmetically effective amount of said polypeptide to a subject.
  • the method of applying makeup to the subject may be to improve hair loss or induce or promote hair growth.
  • the method of applying makeup to the subject may be to prevent or improve inflammation of the subject.
  • the inflammation may be folliculitis.
  • the polypeptide may be in the form of the cosmetic composition.
  • the subject may be a mammal.
  • the mammal may be a human, dog, cat, horse or pig.
  • the subject may be an individual suffering from hair loss disease.
  • the hair loss disease includes androgenetic alopecia, telogen effluvium, alopecia areata, tinea capitis, alopecia totalis, hypotrichosis, hereditary hypotrichosis simplex or generalized alopecia.
  • the application may be contacting the polypeptide to an external surface of a subject.
  • the application may include spraying, spreading, or dipping.
  • the outer surface may be an area where there is or has been hair.
  • the external surface may be the scalp or skin.
  • the application may be applied once or multiple times per day.
  • the application may be applied once or twice or more daily for about 2 to about 28 days, or about 7 to about 10 days, to a subject in need thereof.
  • the polypeptide may also be applied to an individual once or twice or more daily, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 times per year, or a combination thereof.
  • the polypeptide can be co-applied with other therapeutic or cosmetic agents.
  • the effective amount of the polypeptide applied to a subject may include the total amount applied during the entire application dosage regimen.
  • the polypeptide can be applied to a subject via any means suitable for delivering the polypeptide to a subject's cells, such as dermal, epidermal, dermal papilla cells or hair follicle cells.
  • the polypeptides of the present invention When applied to a subject, can prevent, treat, or alleviate symptoms associated with hair loss disorders.
  • a cosmetically effective amount of the polypeptide can vary depending on a number of factors known to those skilled in the art.
  • the application amount of the polypeptide may vary depending on, for example, the identity, body size, condition of the subject or sample being treated, and these amounts can be easily determined by those skilled in the art. All cosmetic applications described herein can be applied to any subject in need of such application, including mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, pigs, sheep, goats or humans.
  • Cosmetic compositions for use according to the present invention may be formulated in a conventional manner using one or more physiologically acceptable carriers or excipients.
  • the cosmetic compositions of the present invention can be formulated for a variety of routes of application, including systemic and topical or localized application.
  • the cosmetic composition of the present invention may be formulated in a liquid solution, such as a physiologically usable buffer such as Hank's solution or Ringer's solution.
  • cosmetic compositions may be formulated in solid form and redissolved or suspended immediately prior to use. A lyophilized form is also included.
  • the cosmetic composition of the present invention may be at least sterile and pyrogen-deficient.
  • Such cosmetic formulations include formulations for human and veterinary use.
  • a polypeptide having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be used for the purpose of improving hair loss or inducing or promoting hair growth.
  • a cosmetic composition for improving hair loss or inducing or promoting hair growth comprising the polypeptide according to another aspect as an active ingredient may be used to improve hair loss or induce or promote hair growth.
  • a cosmetic composition for preventing or improving inflammation comprising the above polypeptide as an active ingredient according to another aspect may be used to prevent or improve inflammation.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss, a pharmaceutical composition for inducing or promoting hair growth, or a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation comprising the above-mentioned polypeptide as an active ingredient according to another aspect prevents or treats hair loss in an individual, It can be used to induce or promote hair growth, or to prevent or treat inflammation.
  • a method for preventing or treating hair loss in an object can efficiently prevent or treat hair loss in an object, or efficiently induce hair growth in an object. Induce or promote, or effectively prevent or treat inflammation.
  • a method of applying a cosmetically effective amount of the polypeptide to a subject comprising applying a cosmetically effective amount of the polypeptide to the subject, effectively prevents or treats hair loss in the subject, efficiently induces or promotes hair growth, or effectively reduces inflammation. can be prevented or improved.
  • FIG. 1 is a diagram showing the level of IFN- ⁇ in the medium when PBMC CD8-positive T cells were cultured in the presence of an IS1 polypeptide.
  • Figure 2 is a diagram showing the level of cell proliferation when human hair follicle dermal papilla cells were cultured in the presence of an IS1 polypeptide.
  • Figure 3 is a view showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of DHT, the polypeptide, untreated or a combination thereof, and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF and KGF.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of IFN- ⁇ , the polypeptide, untreated or a combination thereof, and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF and KGF.
  • Figure 5 is a view showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of the polypeptide and untreated or Minoxidil, and measuring the expression levels of Wnt10b, Versican, Noggin, ALP, VEGF, KGF, HGF, LEF and CycD1.
  • Figure 7 is a view showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of the polypeptide-FITC and untreated or scrambled peptide-FITC, and measuring absorbance at 470 nm corresponding to FITC emission.
  • FIG. 8 is a view showing the results of measuring artificial skin permeability of polypeptide IS1 and its fragment S1.
  • 9 and 10 are diagrams showing the results of measuring OD 600 values after culturing Escherichia coli and Staphylococcus aureus in the presence of polypeptide IS1 and its fragment S1, untreated or in the presence of carbenicilin, respectively.
  • 11 and 12 are views showing the results of measuring OD 600 values after culturing Propionibacterium acnes and Candida albicans in the presence of polypeptide IS1 and its fragment S1, untreated or Antibiotic-Antimycotic, respectively.
  • FIGS. 13 and 14 are diagrams showing the values analyzed with ImageJ after treating the hair-removed mice with polypeptide IS1 and DMSO solution, Minoxidil, Tofacitinib, or DHT, respectively, and taking pictures during the experimental period.
  • the polypeptide in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the N-terminus is protected by an acetyl group, the C-terminus is protected by an amino group, and the cysteine at position 19 is substituted with acetaminomethyl-L-cysteine.
  • the polypeptide is hereinafter also referred to as 'IS1'.
  • the polypeptide has two motifs that play independent roles: IMTP8, a cell penetrating peptide (CPP) that imparts cell permeability, and SOCS mimetics PS5, a peptide that negatively regulates the Jak/Stat pathway. contains part
  • the polypeptide can prevent or treat hair loss by promoting hair cell proliferation and hair growth factor production, and additionally prevent or treat hair loss caused by folliculitis due to its antibacterial or antifungal effect.
  • the polypeptide was prepared through chemical synthesis and the experiment was conducted.
  • Example 2 Confirmation of immunosuppressive and dermal papilla cell proliferation or activity promoting effects of polypeptides
  • Hair loss such as alopecia areata (AA) is also considered a cell-mediated autoimmune disease.
  • Autoreactive cytotoxic T cells recognize melanocyte-associated proteins such as tyrosinase.
  • the hair follicle (HF) is a unique miniorgan with its own immune and hormonal microenvironment.
  • the immunosuppressive environment of the anagen hair bulb regulated by immunosuppressive factors, is known as hair follicle immune privilege.
  • Disruption of follicular immune privilege leads to an autoimmune response against follicle autoantigens.
  • Alopecia areata is often caused by viral infections such as influenza that cause excessive production of interferon (IFN).
  • IFN- ⁇ is known as one of the key factors causing the collapse of immune privilege.
  • PBMCs including T cells were cultured in a 48-well plate coated with anti-CD3 antibody and anti-CD8 antibody, and the level of IFN- ⁇ was measured.
  • the immunosuppressive activity of the polypeptide was confirmed. Specifically, in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS and 1x antibiotic antimycotic containing the synthesized polypeptide and PBMC at designated concentrations, 2x10 5 cells/well were plated in a 48-well plate coated with anti-CD3 antibody and anti-CD8 antibody.
  • AZD1480 (hereinafter also referred to as "AZD"), a small molecule ATP-competitive JAK2 inhibitor, was used.
  • FIG. 1 is a diagram showing the level of IFN- ⁇ in the medium when PBMC cells were cultured in the presence of an IS1 polypeptide. As shown in Figure 1, the polypeptide reduced IFN- ⁇ levels by CD8 T cells in a concentration dependent manner. This indicates that the polypeptide inhibits IFN- ⁇ production by CD8 T cells.
  • human hair follicle dermal papilla cells were cultured at a density of 1.5x10 3 cells/well in a 96-well plate in a ready-to-use follicle dermal papilla cell growth medium supplemented with 1x antibiotic antimycotic (Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium). Ready to use) (Promocell) was seeded and cultured for 24 hours. After replacing the old medium with 100 uL of the new medium, the polypeptide at a concentration of 10 uM were added and cultured for 1 day.
  • a positive control 0.1 uM and 0.4 uM of Ruxolitinib, a Jak-Stat pathway inhibitor with hair loss treatment activity, were treated, respectively. Afterwards, MTT solution was added to the wells and cells were measured at 570 nm. At the same time, the negative control group, which was not treated at all, and the positive control group treated with Ruxolitinib were also compared by performing MTT analysis.
  • experiment was performed in the same manner as described above, except that 1 uM, 10 uM, and 50 uM of Minoxidil used as a hair loss treatment were used instead of Ruxolitinb.
  • Figure 2 is a diagram showing the cell proliferation level when human dermal papilla cells were cultured in the presence of an IS1 polypeptide, the left graph shows data compared with Ruxolitinb, and the right graph shows data compared with Minoxidil. As shown in Figure 2, the polypeptide promoted cell proliferation compared to the negative control.
  • human hair follicle dermal papilla cells were cultured in 5.6 mL of Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready-to-use (Promocell) supplemented with 1X Antibiotic-Antimycotic in a 60 pie dish. After seeding, they were cultured for 18 hours. After replacing 5.6 mL of the medium with a fresh medium, culture was performed for 2 days in the presence of the polypeptide, androgenetic alopecia inducing DHT, or a combination thereof at a designated concentration. At this time, DHT and the polypeptide were added at concentrations of 100 uM and 10 uM, respectively.
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit and PCR pre-mix (Promega Goscript TM ), and Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, and GAPDH (normalization For) PCR was performed using primers.
  • Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, and KGF are hair growth inducers, hair follicle formation factors, hair growth phase inducers, hair angiogenesis hormones, and hair cell growth hormones, respectively.
  • experiment was performed in the same manner as described above, except that 100 ng/mL of IFN- ⁇ , which causes inflammatory hair loss, was used instead of DHT, which causes androgenetic alopecia.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of DHT, the polypeptide, or a combination thereof, and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, and KGF. As shown in FIG. 3, expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, and KGF, which are factors related to the activity and growth of hair follicle dermal papilla cells, were increased by treatment with DHT and the polypeptide. This indicates that the polypeptide has an effect of preventing or treating hair loss in conditions of male pattern baldness.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of IFN- ⁇ , the polypeptide, or a combination thereof, and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, and KGF.
  • Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF and KGF which are factors related to the activity and growth of hair follicle dermal papilla cells, compared to the case of treatment with IFN- ⁇ alone, by treatment with IFN- ⁇ and the polypeptide level increased.
  • the polypeptide has an effect of preventing or treating hair loss in the condition of inflammatory hair loss.
  • the polypeptide has an effect of inducing or promoting hair growth in the condition of inflammatory hair loss.
  • Minoxidil as a positive control, the activity and growth promoting effects of the polypeptide on dermal papilla cells were compared.
  • human hair follicle dermal papilla cells were cultured in 5.6 mL of Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready-to-use (Promocell) supplemented with 1X Antibiotic-Antimycotic in a 60 pie dish. After seeding, they were cultured for 18 hours. After replacing the old medium with 5.6 mL of a new medium, the medium was cultured for 2 days in the presence of the polypeptide or Minoxidil at a designated concentration. At this time, the polypeptide and Minoxidil were added at a concentration of 10 uM, respectively.
  • RNA was isolated from cells for mRNA measurement cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit and PCR pre-mix (Promega Goscript TM ). PCR was performed using the primers shown in Table 1 for the Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, and GAPDH primers, and the primers shown in Table 2 for the ALP, HGF, LEF, and CycD1 primers. ALP, HGF, LEF, and CycD1 each have activities of inducing hair formation phase, inducing hair follicle formation, promoting hair stem cell proliferation, and promoting hair-follicle cell proliferation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of the polypeptide or Minoxidil and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF, and CycD1.
  • Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF, and CycD1 which are factors related to the activity and growth of hair follicle dermal papilla cells.
  • the cell penetrating peptide (CPP) IMTP8 of amino acid sequence 1 to 15 of SEQ ID NO: 1 is removed, amino acid sequence 16 to 25 of SEQ ID NO: 1, the C terminus is protected with -NH 2 and the N terminus
  • a SOCS1 polypeptide protected with a silver acetyl group (Ac) hereinafter referred to as “fragment S1”
  • fragment S1 fragment S1
  • human follicle dermal papilla cell growth medium ready-to-use (Promocell ) After seeding in 5.6 mL, it was cultured for 18 hours. After replacing the old medium with 5.6 mL of a new medium, it was cultured for 2 days in the presence of a combination of the above polypeptides at a designated concentration. At this time, the polypeptide and its fragment S1 were added at a concentration of 10 uM, respectively.
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit and PCR pre-mix (Promega Goscript TM ). PCR was performed using the primers in Tables 1 and 2 for Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF, CycD1, and GAPDH primers.
  • Figure 6 is a view showing the results of culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of DHT and the polypeptide or its fragment S1, and measuring the expression levels of Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF and CycD1 .
  • the fragment S1 is composed of the sequence of amino acids 16 to 26 of SEQ ID NO: 1, and in the polypeptide fragment S1, the N-terminus is bound to an acetyl group, and the third amino acid cysteine from the N-terminus is It is substituted with acetaminomethyl-L-cysteine, and the C-terminus is bonded to an amino group (amino group, -NH 2 ).
  • the expression levels of factors related to the activity and growth of hair follicle dermal papilla cells were mostly increased by treatment with the polypeptide, compared to treatment with fragment S1 of the polypeptide alone. This indicates that cell permeability is remarkably increased by the cell penetrating peptide having amino acid sequences 1 to 15 of the polypeptide.
  • the polypeptide was not treated, scramble peptide-FITC, or IS1-FITC was used, and absorbance at 470 nm corresponding to FITC emission was measured for the obtained cells.
  • Fig. 7 is a diagram showing the results obtained by culturing human hair follicle dermal papilla cells in the presence of the polypeptide-FITC, untreated or scrambled peptide-FITC, and measuring absorbance at 470 nm corresponding to FITC emission. As shown in FIG. 7 , the fluorescence intensity of the polypeptide-FITC was significantly higher than that of the scrambled peptide-FITC.
  • DPBS containing 1 mM of polypeptides IS1 and S1 and caffeine were prepared at 2.2% (w/v) in DPBS.
  • Artificial skin was attached to the franz diffusion cell of the microetteplus diffusion test system (microetteplus diffusion test system, Hanson Research), 300 uL of prepared polypeptide and caffeine were dripped on it, and while maintaining the transdermal absorption system at 32°C and 400 rpm, Reacted for 16 hours.
  • samples from the receptor chamber of the static diffusion device were collected, and quantitative analysis was performed by measuring the concentrations of permeated polypeptide and caffeine using HPLC analysis.
  • FIG. 8 is a view showing the results of measuring artificial skin permeability of polypeptide IS1 and its fragment S1. As shown in FIG. 8, the polypeptide IS1 showed a significantly higher permeability than fragment S1.
  • Staphylococcus aureus Escherichia coli, Propionibacterium acnes, and Candida albicans were each purchased from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and used in this experiment. .
  • E. coli is diluted with DMEM High Glucose (WELGENE, Fresh Media TM ) to a bacterial count of 1x10 6 cells/1 mL, and 100 ⁇ l is dispensed into a 96-well plate, and then the polypeptide IS1, the polypeptide S1, and It was cultured in the presence or absence of carbenicillin (PC) (GOLDBIO).
  • PC carbenicillin
  • the minimum growth inhibitory concentration (MIC) was measured by measuring the absorbance under a wavelength of 600 nm using an absorbance analyzer while culturing with shaking in a 37° C. incubator for 24 hours.
  • Staphylococcus aureus was diluted in a medium containing 0.2 g/L of Yeast Extract (gibco, Bacto TM ) in RPMI1640 (WELGENE, Fresh Media TM ) to a bacterial count of 1x10 6 cells/1 mL, and - After dispensing 100 ⁇ l each into a well plate, culture was performed in the presence or absence of the polypeptide IS1, carbenicillin (PC) (GOLDBIO), and the polypeptide S1 at designated concentrations. The minimum growth inhibitory concentration (MIC) was measured by measuring the absorbance under a wavelength of 600 nm using an absorbance analyzer while culturing with shaking in a 37° C. incubator for 24 hours.
  • MIC minimum growth inhibitory concentration
  • Propionibacterium acnes were diluted to a bacterial count of 1x10 6 cells/1 mL in a medium containing 0.2 g/L of Yeast Extract (Gibco, Bacto TM ) added to RPMI1640 (WELGENE, Fresh Media TM ), and 96-well After distributing 100 ⁇ l each to the plate, the polypeptide IS1, the polypeptide S1, and 1x AA (Antibiotic-atimycotic, Gibco) were cultured in the presence or absence of these at designated concentrations.
  • Yeast Extract Gibco, Bacto TM
  • RPMI1640 WELGENE, Fresh Media TM
  • 1x AA Antibiotic-atimycotic, Gibco
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Candida albicans was diluted to a bacterial count of 2,000 CFU/mL in a medium in which 10 g/L of glucose was added to DMEM/F12 (WELGENE, Fresh Media TM ), and 100 ⁇ l in a 96-well plate. After dividing, the cells were cultured in the presence or absence of the polypeptide IS1, the polypeptide S1, and 2x AA (Antibiotic-atimycotic, Gibco) at designated concentrations. The minimum growth inhibitory concentration (MIC) was measured by measuring the absorbance under a wavelength of 600 nm using an absorbance analyzer while culturing with shaking in a 36° C. incubator for 24 hours.
  • MIC minimum growth inhibitory concentration
  • polypeptide IS1 has antibacterial or antifungal activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, and Candida albicans.
  • DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, and DHT 10 uM were prepared, and 4 control groups and 2 groups of the polypeptide IS1 were used in a total of 6 groups, 6 animals in each group.
  • Minoxidil 5%, and DHT were dissolved in 40% DMSO in DPBS in the same solution as the polypeptide.
  • Tofacitinib 2% was dissolved in 40% DMSO in ethanol.
  • mice On days 0, 3, 7, 10, and 14, mice were anesthetized and pictures were taken at the same camera position. Then, the data was analyzed by scoring the black dots using the ImageJ program.
  • Figure 13 shows that polypeptide IS1, DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, and DHT 10 uM were applied to the back of hairless mice, and after 10 days, pictures were taken using a camera and black dots were obtained using the ImageJ program. After analyzing the data by scoring, the values of these ImageJ differences were averaged for each group, and the graph was shown.
  • the Y-axis of FIG. 13 shows the average value of the relative values 10 days after the start of the test when the time before hair removal is set as 100% and the time immediately after hair removal is set as 0%.
  • Figure 14 shows that polypeptide IS1, DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, and DHT 10 uM were applied to the back of hairless mice, and pictures were taken using a camera until day 14, and black dots were obtained using the ImageJ program. After analyzing the data by scoring, the data obtained up to the 14th day was analyzed by AUC (Area Under the Curve) and displayed as a graph.
  • AUC rea Under the Curve
  • the X-axis of FIG. 14 means the experimental group, and the Y-axis is calculated using the relative values of the 3rd, 7th, 10th, and 14th days and the test date when the immediately before hair growth is 100% and the immediately after hair growth is 0%. Mean value of AUC values.
  • 0.5% of the polypeptide IS1 exhibits similar efficacy to Minoxidil 5% and superior efficacy to Tofacitinib 2%.

Abstract

탈모 치료 또는 발모 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도를 제공한다.

Description

탈모 치료 또는 발모 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도
탈모 치료 또는 발모 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다.
원형 탈모증(alopecia areata)은 자가면역 질환으로서 INF-γ 과다 분비에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 치료법 중 하나로 Jak/Stat 저해제가 제안되고 있다. 안드로겐형 탈모(androgenetic alopecia, 남성형 탈모)의 원인은 모낭에서의 디히드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT) 과다 생산에 의한 것으로서 DHT 합성 저해 물질(예: 프로페시아, 아보다트 등)을 치료제로 사용하고 있으나, Jak/Stat 저해제도 안드로겐형 탈모 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, Jak/Stat 경로의 이상은 염증, 산화적 스트레스(oxidative stress) 등의 질환과 관련된 것으로 알려져 있다. SOCS(suppressor of cytokine signalling) 단백질은 Jak/Stat 경로의 음성적 조절자(negative regulator)이다.
현재까지, Jak/Stat 경로 저해를 이용한 탈모 치료는 대부분 소분자 저해제(small molecule inhibitor)가 사용되어 왔다. 따라서, Jak/Stat 경로 저해제로서 폴리펩티드에 대한 요구가 있다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 발모 유도 또는 촉진용 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 탈모를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 발모를 유도 또는 촉진하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 화장품학적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 적용하는 단계를 포함하는, 개체를 화장하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 용어 "동일성(identity)"은 서열을 비교하여 결정되는 2 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열 사이의 관계를 나타낸다. 상기 동일성은 2 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기의 스트링(string) 사이의 매칭의 수에 의하여 결정되는 서열 관련도(sequence relatedness)의 정도를 나타낸다. 관련 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 동일성은 알려진 방법에 의하여 계산될 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 적용되는 "% 동일성"은 후보 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 제2 서열과 최대 퍼센트 동일성을 얻기 위하여, 정렬하고(aligning), 필요하다면 갭을 도입한 후 제2 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 중의 잔기의 백분율로서 정의된다. 상기 정렬을 위한 방법 및 프로그램은 알려져 있다. 상기 프로그램은 예를 들면, BLAST, Smith-Waterman algorithm, 또는 Needleman-Wunsch algorithm일 수 있다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 82.5% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드에 있어서, N-말단은 보호기로 보호된 것일 수 있다. 상기 N-말단은 보호기로서 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 알릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)과 결합된 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드에 있어서, 19번 위치의 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환된 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드의 C-말단은 보호기로 보호된 것일 수 있다. 상기 C-말단은 보호기로서 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 또는 아자이드(azide, -NHNH2)와 결합된 것일 수 있다. 상기 삼차 알킬기에 있어서, 알킬기는 탄소수 4 내지 20, 4 내지 16, 4 내지 12, 4 내지 8, 5 내지 20, 5 내지 16, 5 내지 12, 또는 5 내지 8을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, N-말단은 아세틸기로 보호되어 있고, C-말단은 아미노기로 보호되어 있고, 19번 위치의 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환된 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 모낭 세포의 활성 촉진, 모낭 세포의 증식 촉진, 또는 이들의 조합된 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 탈모 예방 또는 치료 효능을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 발모 유도 또는 촉진 활성을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "탈모 개선"은 탈모 상태를 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그 효과를 포함할 수 있다. "탈모 개선"은 예를 들면, 모낭 세포의 재생, 또는 모낭 세포의 활성 회복을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "발모 유도" 또는 "발모 촉진"은 모낭에서 모발이 자라나는 것을 증가시키는 것을 포함한다. "발모 유도" 또는 "발모 촉진"은 모낭 세포의 증식, 모낭 세포의 활성, 또는 모낭 세포의 성장을 촉진하는 효과 등과 같은 모발의 총량을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount)의 상기 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상기 화장료 조성물의 탈모 개선 또는 발모 촉진 효능을 달성하는 데 충분한 양일 수 있다. 상기 양은 예를 들면, 상기 화장료 조성물 중량 기준으로 0.001 내지 95.0%, 0.001 내지 70.0%, 0.001 내지 50.0%, 또는 0.01 내지 50.0%일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형으로 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이로 제형화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 폴리펩티드와 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 발모 유도 또는 촉진용 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 염증은 모낭염일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.
상기 "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 상기 개체는 예를 들면, 사람, 마우스, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물일 수 있다.
상기 약제학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인, "탈모"는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태 또는 감소된 상태를 의미한다. 상기 탈모는 두피의 성모 즉 굵고 검은 머리털이 빠지는 것을 의미할 수 있다. 상기 탈모는 원형탈모증, 안드로겐성 탈모증(androgenetic alopecia), 전두탈모증(alopecia totalis), 전신 탈모증(alopecia universalis), 일시적인 원형 탈모증(alopecia areata transient), 패치형 탈모증(patchy alopecia), 휴지기 탈모증(telogen effluvium), 머리 백선(tinea capitis), 감모증(hypotrichosis), 또는 유전성 단순 감모증(hereditary hypotrichosis simplex)일 수 있다. 상기 탈모는 유전적인 원인, 호르몬 불균형, 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취 등의 다양한 식습관 및 환경적 영향으로 인하여 유발될 수 있다. 상기 탈모는 예를 들면, 유전성 안드로겐성　탈모 또는 대머리, 원형　탈모, 곰팡이 감염에 의한 두부 백선, 휴지기　탈모, 발모벽, 모발 생성 장애 질환 등이 있고, 흉터가 형성되는 반흔성　탈모로는 루푸스에 의한　탈모, 독발성 모낭염, 모공성 편평 태선, 화상 및 외상에 의한　탈모일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 상기 폴리펩티드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)을 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 약제학적 조성물의 탈모 예방 또는 치료 효능을 달성하는 데 충분한 양일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 상기 폴리펩티드의 양을 기준으로 1일당 0.0001 내지 1000 ug, 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있다. 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 단위 용량 형태 또는 다용량을 포함할 수 있다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 탈모를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 발모를 유도 또는 촉진하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 치료적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 염증은 모낭염일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말 또는 돼지일 수 있다. 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다.
상기 방법에 있어서, 상기 투여는 개체에 한번 투여할 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 단일 주사 또는 침적(deposition)일 수 있다. 상기 투여는 이를 필요로 하는 개체에게 약 2 내지 약 28일간, 또는 약 7 내지 약 10일간, 매일 1회 또는 2회 투여할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한, 연간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회, 또는 이의 조합으로 개체에게 매일 1회 또는 2회 투여할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 다른 치료제와 공동-투여할 수 있다. 투약 요법(dosage regimen)은 다중 투여를 포함하는 경우, 개체에게 투여되는 상기 폴리펩티드의 유효량은 전체 투약 요법 동안 투여되는 총량을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 진피, 표피, 진피 유두상 세포 또는 모낭 세포 등의 개체의 세포에 상기 폴리펩티드를 전달하는데 적합한 임의 수단을 통해 개체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개체에 투여되는 경우 탈모 질환과 관련된 증상을 치료 또는 경감시킬 수 있다.
상기 폴리펩티드의 치료학적 유효량은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다. 상기 폴리펩티드의 투여량은, 예컨대 정체(identity), 신체 크기, 치료 중인 개체 또는 샘플의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이들 함량은 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 본원에 기술된 모든 치료학적 적용은 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 돼지, 양, 염소 또는 인간 등의 포유동물을 비롯하여, 이러한 치료가 필요한 임의 개체에 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 기존 방식으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 전신 및 국소 또는 국지화된 투여 등의, 다양한 투여 경로용으로 제형화할 수 있다. 전신 투여의 경우, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하 등의 주사일 수 있다. 주사의 경우, 본 발명의 치료 조성물은, 액체 용액 중에, 예컨대 행크 용액 또는 링거액 등의 생리학적으로 사용가능한 완충액 중에 제형화할 수 있다. 아울러, 치료 조성물은 고체 형태로 제형화하고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁할 수 있다. 동결건조된 형태도 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 무균성 및 발열원-결핍인 것일 수 있다. 이러한 약제학적 제형은 인간 및 수의학적 용도를 위한 제형을 포함한다.
다른 양상은 화장품학적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 적용하는 단계를 포함하는, 개체를 화장하는 방법을 제공한다.
상기 개체를 화장하는 방법은, 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진하는 것일 수 있다.
또한, 상기 개체를 화장하는 방법은, 개체의 염증을 예방 또는 개선하는 것일 수 있다. 상기 염증은 모낭염일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 상기 화장료 조성물의 형태일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말 또는 돼지일 수 있다. 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다.
상기 방법에 있어서, 상기 적용은 개체의 외부 표면에 상기 폴리펩티드를 접촉시키는 것일 수 있다. 상기 적용은 분무, 도포, 또는 침적을 포함할 수 있다. 외부 표면은 체모가 있거나 있었던 부위일 수 있다. 상기 외부 표면은 두피, 또는 피부일 수 있다. 상기 적용은 1일에 한번 또는 복수 회 적용할 수 있다. 상기 적용은 이를 필요로 하는 개체에게 약 2 내지 약 28일간, 또는 약 7 내지 약 10일간, 매일 1회 또는 2회 이상 적용할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한, 연간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회, 또는 이의 조합으로 개체에게 매일 1회 또는 2회 이상 적용할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 다른 치료제, 또는 화장료와 공동-적용할 수 있다. 적용 요법(application dosage regimen)은 다중 적용을 포함하는 경우, 개체에게 적용되는 상기 폴리펩티드의 유효량은 전체 적용 요법 동안 적용되는 총량을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 진피, 표피, 진피 유두상 세포 또는 모낭 세포 등의 개체의 세포에 상기 폴리펩티드를 전달하는데 적합한 임의 수단을 통해 개체에게 적용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 개체에 적용되는 경우 탈모 질환과 관련된 증상을 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있다.
상기 폴리펩티드의 화장품학적 유효량은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다. 상기 폴리펩티드의 적용량은, 예컨대 정체(identity), 신체 크기, 치료 중인 개체 또는 샘플의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이들 함량은 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 본원에 기술된 모든 화장품학적 적용은 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 돼지, 양, 염소 또는 인간 등의 포유동물을 비롯하여, 이러한 적용이 필요한 임의 개체에 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화장품학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 기존 방식으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 화장 조성물은 전신 및 국소 또는 국지화된 적용 등의, 다양한 적용 경로용으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 화장 조성물은, 액체 용액 중에, 예컨대 행크 용액 또는 링거액 등의 생리학적으로 사용가능한 완충액 중에 제형화할 수 있다. 아울러, 화장 조성물은 고체 형태로 제형화하고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁할 수 있다. 동결건조된 형태도 포함된다. 본 발명의 화장료 조성물은 적어도 무균성 및 발열원-결핍인 것일 수 있다. 이러한 화장품학적 제형은 인간 및 수의학적 용도를 위한 제형을 포함한다.
일 양상에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진 용도로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진용 화장료 조성물은 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 염증 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 상기한 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 발모 유도 또는 촉진용 약제학적 조성물, 또는 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 개체에서 탈모를 예방 또는 치료하거나, 발모를 유도 또는 촉진하거나, 염증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체에서 탈모를 예방 또는 치료하는 방법, 개체에서 발모를 유도 또는 촉진하는 방법, 및 개체에서 염증을 예방 또는 치료하는 방법은 개체에서 탈모를 효율적으로 예방 또는 치료하거나, 발모를 효율적으로 유도 또는 촉진하거나, 염증을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
다른 양상은 따른 화장품학적 유효량의 상기 폴리펩티드를 개체에 적용하는 단계를 포함하는, 개체를 화장하는 방법은 개체에서 탈모를 효율적으로 예방 또는 치료하거나, 발모를 효율적으로 유도 또는 촉진하거나, 염증을 효율적으로 예방 또는 개선할 수 있다.
도 1은 IS1 폴리펩티드 존재하에서 PBMC의 CD8 양성 T 세포를 배양한 경우, 배지 중 IFN-γ 수준을 나타낸 도면이다.
도 2는 IS1 폴리펩티드 존재하에서 인간 모낭 모유두 세포를 배양한 경우, 세포 증식 수준을 나타낸 도면이다.
도 3은 인간 모낭 모유두　세포를 DHT, 상기 폴리펩티드, 비처리 또는 이들의 조합의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 모낭 모유두　세포를 IFN-γ, 상기 폴리펩티드, 비처리 또는 이들의 조합의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 인간 모낭 모유두　세포를 상기 폴리펩티드 및 비처리 또는 Minoxidil의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Versican, Noggin, ALP, VEGF, KGF, HGF, LEF 및 CycD1의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 인간 모낭 모유두　세포를 상기 폴리펩티드 및 비처리 또는 상기 폴리펩티드 IS1의 단편 S1의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Versican, Noggin, ALP, VEGF, KGF, HGF, LEF 및 CycD1의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 인간 모낭 모유두　세포를 상기 폴리펩티드-FITC 및 비처리, 또는 스크램블 펩티드-FITC의 존재하에서 배양하고, FITC 발광에 해당하는 470nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 폴리펩티드 IS1 및 그의 단편 S1의 인공피부 투과율을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9 및 10은 폴리펩티드 IS1 및 그의 단편 S1, 비처리 또는 Carbenicilin의 존재하에서 대장균 및 스태필로코쿠스 아우레우스를 각각 배양한 후 OD600 값을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 및 12는 폴리펩티드 IS1 및 그의 단편 S1, 비처리, 또는 Antibiotic-Antimycotic의 존재하에서 프로피오니박테리움 아크네, 및 칸디다 알비칸스를 각각 배양한 후 OD600 값을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 및 14는 폴리펩티드 IS1 및 DMSO 용액, Minoxidil, Tofacitinib, 또는 DHT를 제모한 마우스에 실험기간 동안 각각 처리하고 사진을 촬영한 후, ImageJ로 분석한 값을 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리펩티드의 합성
본 실시예에서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단은 아세틸기로 보호되어 있고, C-말단은 아미노기로 보호되어 있고, 19번 위치의 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환된 폴리펩티드를 합성하였다. 상기 폴리펩티드는 이하 'IS1'이라고도 한다. 상기 폴리펩티드는 독립적인 역할을 하는 2개의 모티프 즉, 세포투과능을 부여하는 세포투과 펩티드(CPP, cell penetration peptide)인 IMTP8 부분과 Jak/Stat 경로를 음성적으로 조절하는 펩티드인 SOCS 유사체(mimetics) PS5 부분을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 모발 세포 증식 및 모발 생성인자 생성을 촉진시킴으로써 탈모를 예방 또는 치료하고, 부가적으로 항균 또는 항진균 효과로 인해 모낭염에 의해 유발되는 탈모를 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 화학 합성을 통해 준비하여 실험을 진행하였다.
실시예 2: 폴리펩티드의 면역억제 및 모유두 세포 증식 또는 활성 촉진 효과 확인
1. 면역억제 활성의 확인
원형 탈모(alopecia areata, AA)와 같은 탈모는 세포-매개 자가면역(cell-mediated autoimmune) 질병으로 고려되기도 한다. 자가반응성 세포독성 T 세포는 티로시나제와 같은 멜라노사이트-연관 단백질을 인식한다. 모낭(hair follicle, HF)은 자신의 면역 및 호로몬 미세환경을 가진 독특한 미니기관(miniorgan)이다. 면역억제성 인자에 의하여 조절된 성장기 헤어 벌브의 면역억제성 환경은 모낭 면역 특권(hair follicle immune privilege)으로 알려져 있다. 모낭 면역 특권의 붕괴는 모낭 자가항원에 대한 자가면역 반응을 야기한다. 원형 탈모는 종종 인터페론(IFN)의 과도한 생산을 야기하는 인플루엔자와 같은 바이러스 감염에 의하여 유발된다. IFN-γ는 면역특권의 붕괴를 야기하는 핵심인자 중 하나로 알려져 있다.
따라서, 본 절에서는 상기 폴리펩티드 IS1의 존재하에서 T 세포를 포함한 PBMC를 항-CD3 항체와 항-CD8 항체가 코팅되어 있는 48 웰 플레이트(well plate)에 배양하고 IFN-γ의 수준을 측정하여, 상기 폴리펩티드의 면역억제 활성을 확인하였다. 구체적으로, 지정된 농도의 상기 합성된 폴리펩티드 및 PBMC를 함유하는 10% FBS 및 1x Antibiotic antimycotic이 보충된 RPMI 1640 배지에서 항-CD3 항체와 항-CD8 항체를 코팅한 48 웰 플레이트에 2x105 세포/웰을 넣어주고 37℃로 설정한 CO2 인큐베이터에서 3일 동안 배양하고, 배양물 중 IFN-γ의 양을 ELISA(DuoSet Human IFN-gamma, R&D Systems)에 의하여 측정하였다). 양성 대조군으로서, 소분자 ATP-경쟁적(competitive) JAK2 저해제인 AZD1480 (이하 "AZD"라고도 함)을 사용하였다.
도 1은 IS1 폴리펩티드 존재하에서 PBMC 세포를 배양한 경우, 배지 중 IFN-γ 수준을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 농도 의존적으로 CD8 T 세포에 의한 IFN-γ 수준을 감소시켰다. 이는 상기 폴리펩티드가 CD8 T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 억제한다는 것을 나타낸다.
2. 모유두 세포(dermal papilla cell)의 증식 촉진 효과 확인
합성된 상기 폴리펩티드의 모낭 세포의 증식 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 모낭 모유두　세포(Human hair follicle dermal papilla cells)를 1.5x103　세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 중 1x Antibiotic antimycotic이 보충된 즉시 사용 모낭 모유두　세포 성장 배지(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready to use) (Promocell)에 시딩한 후 24 시간 동안 배양하였다. 기존배지를 새로운 상기 배지 100 uL로 교체한 후, 상기 폴리펩티드를 10 uM 농도로 첨가하고 1일간 배양하였다. 이때, 양성 대조군으로 탈모 치료 활성이 있는 Jak-Stat 경로 저해제인 Ruxolitinib 0.1 uM 및 0.4 uM을 각각 처리하였다. 이후, MTT 용액을 웰에 첨가하고 세포를 570nm에서 측정하였다. 동시에 아무 처리하지 않은 음성 대조군과, Ruxolitinib을 처리한 양성 대조군 또한 MTT 분석을 실시하여 비교하였다.
또한, 상기한 Ruxolitinb 대신 탈모 치료제로 사용되는 Minoxidil 1 uM, 10 uM, 및 50 uM을 각각 사용한 것을 제외하고, 상기한 바와 동일하게 실험하였다.
도 2는 IS1 폴리펩티드 존재하에서 사람 모유두 세포를 배양한 경우, 세포 증식 수준을 나타낸 도면이며, 왼쪽 그래프는 Ruxolitinb와 비교한 데이터, 오른쪽 그래프는 Minoxidil과 비교한 데이터이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 음성 대조군에 비하여 세포 증식을 촉진하였다.
3. 모유두 세포의 활성 및 성장 촉진 효과 확인
상기 폴리펩티드의 모낭 세포의 활성 및 생장 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 인간 모낭 모유두　세포를 1.232x105　세포를 60 파이 접시에 1X Antibiotic-Antimycotic로 보충된 즉시 사용 모낭 모유두　세포 성장 배지(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready-to-use)(Promocell) 5.6 mL에 시딩한 후 18시간 동안 배양하였다. 상기 배지 5.6 mL을 새로운 배지로 교체한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드, 남성형 탈모를 야기하는 DHT 또는 이들의 조합의 존재하에서 2일간 배양하였다. 이때 DHT 및 상기 폴리펩티드는 각각 100 uM 및 10 uM의 농도로 첨가하였다. mRNA 측정을 위해 세포에서 총 RNA를 분리 후, cDNA 합성 키트 및 PCR pre-mix(Promega GoscriptTM)를 이용하여 cDNA 합성하고 하기 표 1에 나타낸 Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, 및 GAPDH (normalization 용) 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF는 각각 모발생장 유도인자, 모낭형성 인자, 모발생장기 유도 인자, 모발혈관 형성 호르몬 및 모발세포 성장 호르몬이다.
또한, 상기한 남성형 탈모를 야기하는 DHT 대신 염증성 탈모를 야기하는 IFN-γ 100 ng/mL를 사용한 것을 제외하고, 상기한 바와 동일하게 실험하였다.
프라이머명 서열번호
Wnt10b 정방향 2
역방향 3
Noggin 정방향 4
역방향 5
Versican 정방향 6
역방향 7
VEGF 정방향 8
역방향 9
KGF 정방향 10
역방향 11
GAPDH 정방향 12
역방향 13
도 3은 인간 모낭 모유두　세포를 DHT, 상기 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, DHT 및 상기 폴리펩티드 처리에 의해, 모낭 모유두 세포의 활성 및 성장과 관련된 인자인 Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준이 증가하였다. 이는 남성형 탈모 조건에서 상기 폴리펩티드가 탈모 예방 또는 치료 효능을 갖는 것을 나타낸다. 또한, 남성형 탈모 조건에서 상기 폴리펩티드가 발모 유도 또는 촉진 효능을 갖는 것을 나타낸다. 도 4는 인간 모낭 모유두　세포를 IFN-γ, 상기 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 상기 폴리펩티드 처리에 의해, IFN-γ 단독으로 처리된 경우에 비하여, 모낭 모유두 세포의 활성 및 성장과 관련된 인자인 Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF의 발현 수준이 증가하였다. 이는 염증성 탈모 조건에서 상기 폴리펩티드가 탈모 예방 또는 치료 효능을 갖는 것을 나타낸다. 또한, 염증성 탈모 조건에서 상기 폴리펩티드가 발모 유도 또는 촉진 효능을 갖는 것을 나타낸다.
4. 모유두 세포의 활성 및 성장 촉진 효과의 비교
(4.1) 상기 폴리펩티드와 Minoxidil의 비교
본 절에서는 Minoxidil을 양성 대조군으로 하여, 상기 폴리펩티드의 모유두 세포의 활성 및 성장 촉진 효과를 비교하였다.
구체적으로, 인간 모낭 모유두　세포를 1.232x105　세포를 60 파이 접시에 1X Antibiotic-Antimycotic로 보충된 즉시 사용 모낭 모유두　세포 성장 배지(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready-to-use)(Promocell) 5.6 mL에 시딩한 후 18시간 동안 배양하였다. 새로운 배지 5.6 mL로 기존 배지를 교체한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드 또는 Minoxidil 의 존재하에서 상기 배지에서 2일간 배양하였다. 이때 상기 폴리펩티드 및 Minoxidil은 각각 10 uM의 농도로 첨가하였다. mRNA 측정을 위해 세포에서 총 RNA를 분리 후, cDNA 합성 키트 및 PCR pre-mix(Promega GoscriptTM)를 이용하여 cDNA 합성하였다. Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF 및 KGF, GAPDH 프라이머는 표 1에 기재된 프라이머, ALP, HGF, LEF 및 CycD1 프라이머에 대하여는 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. ALP, HGF, LEF 및 CycD1는 각각 모발형성기 유도, 모낭형성 유도, 모발 줄기세포 증식 촉진, 모발-모낭 세포 증식 촉진 활성을 갖는다.
프라이머명 서열번호
ALP 정방향 14
역방향 15
HGF 정방향 16
역방향 17
LEF 정방향 18
역방향 19
CycD1 정방향 20
역방향 21
도 5는 인간 모낭 모유두　세포를 상기 폴리펩티드, 또는 Minoxidil의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF 및 CycD1의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드 처리에 의해, 모낭 모유두 세포의 활성 및 성장과 관련된 인자인 Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF 및 CycD1의 발현 수준이 Minoxidil을 처리한 경우에 비하여 유사하거나 증가하였다. 이는 상기 폴리펩티드가 발모 유도 또는 촉진 효능을 갖는 것을 나타낸다.
(4.2) 상기 폴리펩티드와 그의 세포투과 펩티드가 제거된 단편의 비교
또한, 상기 폴리펩티드에서, 서열번호 1의 1 내지 15번 아미노산 서열의 세포 투과성 펩티드 (CPP) IMTP8이 제거된, 서열번호 1의 16 내지 25번 아미노산 서열로서, C 말단은 -NH2로 보호되고 N 말단은 아세틸기(Ac)로 보호된 SOCS1 폴리펩티드(이하 "단편 S1"이라 함)와 상기 폴리펩티드 IS1의 모유두 세포의 활성 및 성장 촉진 효과를 비교하였다.
구체적으로, 인간 모낭 모유두　세포를 1.232x105　세포를 60 파이 디시(phi dish)에 1x Antibiotic-Antimycotic로 보충된 즉시 사용 모낭 모유두　세포 성장 배지(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium ready-to-use)(Promocell) 5.6 mL에 시딩한 후 18시간 동안 배양하였다. 새로운 배지 5.6 mL으로 기존배지를 교체한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드의 조합의 존재하에서 2일간 배양하였다. 이때 상기 폴리펩티드 및 그의 단편 S1은 각각 10 uM의 농도로 첨가하였다. mRNA 측정을 위해 세포에서 총 RNA를 분리 후, cDNA 합성 키트 및 PCR pre-mix (Promega GoscriptTM)를 이용하여 cDNA 합성하였다. Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF 및 CycD1, GAPDH 프라이머는 표 1, 및 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다.
도 6는 인간 모낭 모유두　세포를 DHT 및 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편 S1의 존재하에서 배양하고, Wnt10b, Noggin, Versican, VEGF, KGF, ALP, HGF, LEF 및 CycD1의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
상기 단편 S1은 서열번호 1의 16 내지 26번 아미노산 서열로 구성되며, 상기 폴리펩티드 단편 S1에 있어서, N-말단은 아세틸기(acetyl group)와 결합되어 있고, N-말단에서 3번째 아미노산인 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환되어 있고, C-말단은 아미노기(amino group, -NH2)와 결합된 것이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드 처리에 의해, 상기 폴리펩티드의 단편 S1 단독으로 처리된 경우에 비하여, 모낭 모유두 세포의 활성 및 성장과 관련된 인자의 발현 수준이 대부분 증가하였다. 이는 상기 폴리펩티드의 1 내지 15번 아미노산 서열의 세포 투과 펩티드에 의하여 세포 투과성이 현저하게 증가되는 것을 나타내는 것이다.
또한, 상기한 실험에서 상기 폴리펩티드를 처리하지 않거나, 스크램블 펩티드-FITC, 또는 IS1-FITC를 사용하여 수행하고, 얻어진 세포에 대하여 FITC 발광에 해당하는 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 인간 모낭 모유두　세포를 상기 폴리펩티드-FITC, 비처리, 또 스크램블 펩티드-FITC의 존재하에서 배양하고, FITC 발광에 해당하는 470 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드-FITC는 스크램블 펩티드-FITC에 비하여 형광 강도가 현저하게 높았다.
인공피부(Start-M® Membrane, Transdermal Diffusion Test Model, 25 mm, Milipore 사)를 이용하여 카페인, 폴리펩티드 IS1, 또는 단편 S1의 존재하에서 각 성분의 투과도를 확인하였다.
구체적으로, 폴리펩티드 IS1과 S1이 1 mM로 포함된 DPBS와, 카페인은 DPBS에 2.2 % (w/v)으로 준비하였다. 경피흡수시스템 (microetteplus diffusion test system, Hanson Research)의 정적확산장치 (franz diffusion cell)에 인공피부를 장착하고 그 위에 준비한 폴리펩티드 및 카페인을 300 uL 점적하고 경피흡수시스템을 32℃, 400 rpm으로 유지하면서 16시간 동안 반응시켰다. 반응을 시작한지 6 시간과 16 시간 지난 시간에 각각, 정적확산장치의 수용체 챔버 (receptor chamber)의 시료를 수거하여, HPLC 분석법을 이용해 투과된 폴리펩티드 및 카페인의 농도를 측정하여 정량분석을 수행하였다.
도 8은 폴리펩티드 IS1 및 그의 단편 S1의 인공피부 투과율을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드 IS1은 단편 S1에 비하여 현저하게 높은 투과율을 보였다.
5. 폴리펩티드 IS1의 항균 활성 및 항진균 활성
스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 각각 한국생명공학연구원에서 분양받아 본 실험에 이용하였다.
대장균을 DMEM High Glucose (WELGENE, Fresh MediaTM)로 1x106 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드 IS1, 상기 폴리펩티드 S1, 및 카르베니실린(PC)(GOLDBIO)의 존재하에서 또는 이들의 부존재하에서 배양하였다. 37℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕배양을 하면서 흡광도 분석장치를 이용하여 600 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다.
또한, 스태필로코쿠스 아우레우스를 RPMI1640 (WELGENE, Fresh MediaTM)에 Yeast Extract (gibco, BactoTM)을 0.2 g/L 첨가한 배지에 1x106 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드 IS1, 카르베니실린(PC) (GOLDBIO), 및 상기 폴리펩티드 S1의 존재하에서 또는 이들의 부존재하에서 배양하였다. 37℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕배양을 하면서 흡광도 분석장치를 이용하여 600 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다.
또한, 프로피오니박테리움 아크네를 RPMI1640 (WELGENE, Fresh MediaTM)에 Yeast Extract (Gibco, BactoTM)을 0.2 g/L 첨가한 배지에 1x106 세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드 IS1, 상기 폴리펩티드 S1, 및 1x AA (Antibiotic-atimycotic, Gibco)의 존재하에서 또는 이들의 부존재하에서 배양하였다. AnaeroGenTM 3.5L를 넣은 상자에 플레이트를 넣고, 이 상자를 36℃ 배양기에 넣어 48시간 동안 배양하고, 흡광도 분석장치를 이용하여 배양액을 600 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다.
또한, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 DMEM/F12 (WELGENE, Fresh MediaTM)에 글루코오스를 10 g/L 첨가한 배지에 2,000 CFU/mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 지정된 농도의 상기 폴리펩티드 IS1, 상기 폴리펩티드 S1, 및 2x AA (Antibiotic-atimycotic, Gibco)의 존재하에서 또는 이들의 부존재하에서 배양하였다. 36℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕배양을 하면서 흡광도 분석장치를 이용하여 600 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다.
도 9, 10, 11 및 12는 폴리펩티드 IS1의 존재하에서 스태필로코쿠스 아우레우스, 대장균, 프로피오니박테리움 아크네, 및 칸디다 알비칸스를 각각 배양한 후 OD600 값을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 9, 10, 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드 IS1은 스태필로코쿠스 아우레우스, 대장균, 프로피오니박테리움 아크네, 및 칸디다 알비칸스에 대하여 항균 또는 항진균 활성을 가지고 있다.
6. 폴리펩티드 IS1의 발모 촉진 효능
7주령의 C57BL/6 마우스 암컷을 사용하였으며, C57BL/6 마우스가 두 번째 퇴행기(catagen) 시기로 진입하는 생 후 49 ~ 51일째에 왁스를 이용하여 등의 털을 완전히 제거하였다. 상기 폴리펩티드 IS1의 모발생장촉진 효과를 확인하기 위하여, 14일 동안 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) 중 40% DMSO 상기 폴리펩티드 IS1 0.5% 혹은 0.2%를 마우스 당 0.1 ml를 1~5일차와 8~12일차에 1회씩 도포하였다.
대조군으로 DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, 및 DHT 10 uM을 준비하였고, 대조군 4개 군에 상기 폴리펩티드 IS1 2개 군으로 총 6개 군에 각 군마다 6마리씩 진행하였다. Minoxidil 5%, 및 DHT는 폴리펩티드와 같은 용액 DPBS 중 40% DMSO에 용해시켰다. Tofacitinib 2%는 에탄올 중 40% DMSO에 용해된 것이다.
0일차, 3일차, 7일차, 10일차, 및 14일차에 마우스를 마취한 뒤 동일 카메라 위치에서 사진을 촬영하였다. 이후, ImageJ 프로그램을 이용하여 검은색 점을 점수화하여 데이터를 분석하였다.
도 13은 폴리펩티드 IS1, DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, 및 DHT 10 uM를 털이 제거된 생쥐의 등에 도포하고 10일 후 카메라를 이용하여 사진을 촬영하고, ImageJ 프로그램을 이용하여 검은색 점을 점수화하여 데이터를 분석한 후, 이들 ImageJ 차의 값을 군마다 평균처리하여 그래프를 나타낸 도면이다. 도 13의 Y 축은 제모하기 전을 100%로 두고, 제모한 직후를 0%으로 뒀을 때 시험 시작 후 10일 후의 상댓값의 평균값을 나타낸다.
도 14는, 폴리펩티드 IS1, DMSO, Minoxidil 5%, Tofacitinib 2%, 및 DHT 10 uM를 털이 제거된 생쥐의 등에 도포하고 14일까지 카메라를 이용하여 사진을 촬영하고, ImageJ 프로그램을 이용하여 검은색 점을 점수화하여 데이터를 분석한 후, 14일차까지 얻은 데이터를 AUC (Area Under the Curve) 분석하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 14의 X 축은 실험군을 의미하며, Y 축은 발모 직전을 100%, 발모 직후를 0%으로 두었을 때, 3일차, 7일차, 10일차, 14일차의 상대값과 시험일자를 이용하여 계산한 AUC 값의 평균값을 의미한다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, Minoxidil 처리군과 Tofacitinib 처리군, 상기 폴리펩티드 IS1 처리군은 10일차에 DMSO 대조군이나 DHT 대조군에 비해 값이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이 값이 높다는 것은 10일 차에 검은색 점이 많다는 말로, 털이 빠르게 자라났다는 의미이다. 이는, 상기 폴리펩티드 IS1 0.5% 혹은 0.2%가 발모 효능이 있는 Minoxidil 5%과 비교하여 우수하거나 동등한 효과가 있다는 것을 나타낸다. 또한, 원형탈모 개선 효능이 있다고 알려진 Tofacitinib 2%와 상기 폴리펩티드 IS1 0.5%를 비교하면 폴리펩티드 IS1이 더 우수한 효과를 보였다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드 IS1 0.5%는 Minoxidil 5%와 비슷한 효능을 보이고 Tofacitinib 2%에 비해선 우수한 효능을 보인다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐메톡시카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 부톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기 또는 폴리에틸렌글리콜과 결합된 것인 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 19번 위치의 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환된 것인 폴리펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 또는 아자이드(azide, -NHNH2)와 결합된 것인 폴리펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단은 아세틸기로 보호되어 있고, C-말단은 아미노기로 보호되어 있고, 19번 위치의 시스테인은 아세타미노메틸-L-시스테인으로 치환된 것인 폴리펩티드.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진용 화장료 조성물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 발모 유도 또는 촉진용 약제학적 조성물.
  10. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 염증은 모낭염인 것인 조성물.
  12. 치료적 유효량의 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 탈모를 예방 또는 치료하는 방법.
  13. 치료적 유효량의 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 발모를 유도 또는 촉진하는 방법.
  14. 치료적 유효량의 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 염증을 예방 또는 치료하는 방법.
  15. 화장품학적 유효량의 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 개체에 적용하는 단계를 포함하는, 개체를 화장하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 개체에서 탈모 개선 또는 발모 유도 또는 촉진하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 개체의 염증을 예방 또는 개선하는 것인 방법.
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